KR100209654B1 - 전기화학식 면역 바이오센서 - Google Patents

Abstract

다종 분석물질의 동시측정을 위한 전기화학식 면역 바이오센서에 관한 것으로, 절연성 기판상의 일정영역에 형성되는 다수개의 전극들, 전극들에 연결되어 절연성 기판상에 일정간격으로 형성되는 다수개의 도전경로, 절연성 기판상에 선택적으로 형성되는 절연층, 절연성 기판 전면에 형성되는 외부막으로 이루어진 전극부와, 측정물질과 리포좀파괴인자로 구성된 접합체가 흡착된 상층부, 측정물질에 결합하는 항체를 결합시킨 경쟁층, 전기화학적 활성물질을 담고 있는 리포좀이 고정되어 있는 신호발생층을 포함하는 다수개의 적층부, 각 적층부를 격벽으로 각각 격리시키는 하우징으로 이루어지고 전극부의 전극영역에 형성되는 면역반응부로 구성됨으로써, 짧은 시간에 임상적으로 중요한 여러 가지 물질에 대한 분석이 가능하고, 항원-항체 반응의 효율을 높일 수 있으며, 스트립 형태의 센서에서 관찰되는 전개양상의 난잡함이 줄어들게 되고, 깨끗한 신호를 얻을 수 있다.

Description

전기화학식 면역 바이오센서

본 발명은 전기화학식 면역 바이오센서에 관한 것으로, 특히 다종 분석물질의 동시측정을 위한 전기화학식 면역 바이오센서에 관한 것이다.

일반적으로, 항원과 항체간의 면역적 반응은 고도의 특이성과 강한 결합력으로 이루어지므로 이 반응은 극히 낮은 농도로 존재하는 생리활성 물질을 분석하는데 있어 매우 유용하다.

따라서, 현재 이러한 면역반응을 이용한 바이오센서(면역바이오센서)의 개발에 많은 관심이 집중되고 있는 실정이다.

기존의 면역바이오센서들은 주로 광학적 현상을 이용하는 것으로서 광섬유 끝에 고정된 항체와 측정대상물질(항원)과의 상호작용 결과에 따라 변화되는 빛의 강도를 측정하는 방법과 압전소자위에 항체를 고정하고 이것이 대상물질(항원)과 결합될 때, 유발되는 질량변화를 전기적 신호로 바꾸는 방법, 그리고 금속과 액체 계면에서 발생하는 표면 플라즈마 공명현상이 금속위에 고정된 항체와 분석대상 물질(항원)의 결합에 의해 변화되는 것을 감지하는 방법 등이 있다.

전기화학적 방법을 이용한 것으로는 기존의 복잡하고 많은 시간이 걸리는 면역분석법, 예를 들면 효소면역측정법 등을 이용하여 그 마지막 단계에서 전기화학적 활성물질을 발생시킨 후 이것을 분리하여 면역분석과는 독립적인 측정시스템으로 옮긴 후 전기화학적으로 측정하는 방법이 있다.

또한, 새롭게 각광받고 있는 면역분석 방법으로 리포좀(liposome)을 이용하는 것이 있는데 이는 표지물질을 리포좀안에 가두었다가 면역반응이 끝난 후, 리포좀을 파괴하여 표지물질을 방출시켜 측정물질의 농도와 상관관계가 있는 신호를 발생시키는 방법이다.

리포좀은 인지질이 주성분인데, 세포의 생체막과 같이 내부에 친수성 혹은 소수성인 물질을 포획하거나 이중막의 성질에 따라 포획된 물질의 통과여부를 조절할 수 있는 성질이 있어 약물운반체로서의 기능이 있다.

최근 이러한 리포좀을 면역 측정법에 응용하려는 연구가 많이 진행되고 있으나, 이를 센서로 응용한 사례는 아직까지는 그리 많지 않은 실정이다.

광학적 현상을 이용하는 종래의 면역 바이오센서들은 측정시스템이 복잡하고 그에 소요되는 비용이 비싼 단점이 있다.

그에 비해 전기화학의 원리를 도입한 면역 바이오센서의 경우는 우선 측정시스템이 매우 단순하고 전극의 제작, 또한 간단하다는 잇점이 있다.

기존에 소개된 전기화학적 측정방법을 이용한 면역분석법이 있기는 하지만, 이것은 전기화학식 면역 바이오센서라기 보다는 기존의 면역분석 시스템을 그대로 이용하고 최종적인 분석 단계에서만 전기화학적 측정을 수행하므로 여전히 긴 분석시간이 요구되고, 여러 가지 번거로운 과정들을 거쳐야 하므로 일상적으로 간편히 사용할 수 있는 것이 아니다.

진정한 의미의 전기화학식 면역 바이오센서의 개발이 이렇듯 부진한 이유는 항원-항체의 결합 자체로부터 바로 전기화학적으로 측정가능한 신호를 끌어낼 수가 없다는 문제 때문이다.

즉, 효소를 이용한 전기화학식 센서의 경우는 전극상에 고정된 효소의 반응결과로 전극활성 물질이 전극상에 바로 생기고 이것을 산화 또는 환원시켜 전류를 발생시키는데 비해, 항체를 전극에 고정시키고 측정하고자 하는 물질(항원)과 반응을 시킬 경우, 아무런 전극활성 물질이 생겨나지 않는다.

이러한 문제는 효소활성을 갖는 항체의 도입으로 일부 해결될 수 있으며 실제 이를 이용한 전위차식 면역 바이오센서를 구현한 사례도 있기는 하다.

그러나, 이러한 경우 측정하고자 하는 특정한 물질들의 여기상태 유사체를 일일이 합성하여 이로부터 항체를 얻어내야 하므로 일반적인 면역분석에 쓰이기는 많은 문제가 따른다.

또한, 리포좀을 이용한 면역분석법과 이것을 센서로 응용하는 것도 번거롭기는 마찬가지인데, 그것은 면역분석의 경우 각 단계별로 필요한 재료들을 순차적으로 넣어주어야 한다는 점 때문이고, 최근에 소개된 리포좀을 이용한 면역 바이오센서의 경우도 시료만을 투입하는 것이 아니라, 리포좀이 들어 있는 별도의 재료까지 다루어야 한다.

뿐만 아니라, 전기화학적인 측정을 수행하기 위해서는 리포좀을 깨뜨려야 하는데, 이 또한 부가적인 시료의 첨가에 의해서 이루어지기 때문에 결코 간편하다고 할 수가 없는 것이다.

이러한 문제점들을 해결하기 위하여 본 출원인은 전기화학식 면역 바이오센서에 관한 특허를 이미 출원한 바 있다.(특허출원 제 95-14522호)

또한, 항원-항체 반응의 효율성을 높이고 면역반응부와 전극부의 인터페이싱(interfacing)을 개선시키기 위해 기본적인 원리는 특허출원 제 95-14522호와 유사하나 그 구조와 측정방법을 달리한 발명을 출원하였다.(특허출원 제 96-28336호)

그러나, 상기 특허출원 발명의 바이오센서의 구조는 단일한 측정대상물질만을 측정할 수 있고, 두 가지 이상의 대상물질을 동시에 측정하는 것은 불가능하였다.

본 발명은 이와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 단일한 센서를 이용하여 동일한 시료내에 존재하는 두 가지 이상의 물질을 동시에 측정할 수 있는 전기화학식 면역바이오센서를 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서의 전극부를 보여주는 평면도 및 단면도

도 2는 본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서의 면역반응이 일어나는 적층부를 보여주는 단면도

도 3은 본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서의 면역반응부를 보여주는 단면도

도 4는 본 발명에 따른 전기 화학식 면역 바이오센서를 보여주는 사시도

도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1a,1b : 기준전극 2a,2b : 지시전극

3 : 절연성 기판 4 : 도전경로

5 : 절연층 6 : 외부막

7 : 하우징 8 : 최상층

9 : 경쟁층 10 : 신호발생층

11 : 격벽 12a,12b : 시료투입구

본 발명에 따른 전기화학식 면역바이오센서는 절연성 기판상의 일정영역에 형성되는 다수개의 전극들, 전극들에 연결되어 절연성 기판상에 일정간격으로 형성되는 다수개의 도전경로, 절연성 기판상에 선택적으로 형성되는 절연층, 절연성 기판 전면에 형성되는 외부막으로 이루어진 전극부와, 측정물질과 리포좀파괴인자로 구성된 접합체가 흡착된 상층부, 측정물질에 결합하는 항체를 결합시킨 경쟁층, 전기화학적 활성물질을 담고 있는 리포좀이 고정되어 있는 신호발생층을 포함하는 다수개의 적층부, 각 적층부를 격벽으로 각각 격리시키는 하우징으로 이루어지고 전극부의 전극영역에 형성되는 면역반응부로 구성됨을 특징으로 한다.

상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 전기화학식 면역 바이오센서를 첨부된 도면을 참조하여 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서의 구성은 크게 두 가지로 나뉠 수 있는데, 하나는 후막공정을 이용하여 절연성 기판위에 형성시킨 전극이 있는 전극부이고, 다른 하나는 이 전극과 수직방향으로 구성되어 있는 적층구조를 통하여 시료를 투여하면 중력과 확산에 의해 시료가 전극방향으로 이동하며 면역반응을 일으키는 면역반응부이다.

도 1은 본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서의 전극부를 보여주는 평면도 및 단면도이고, 도 2는 본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서의 면역반응이 일어나는 적층부를 보여주는 단면도이며, 도 3은 본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서의 면역반응부를 보여주는 단면도이고, 도 4는 본 발명에 따른 전기 화학식 면역 바이오센서를 보여주는 사시도이다.

먼저, 전극부는 도 1에 도시된 바와 같이, 일반적인 후막공정을 이용하여 기준전극(1a,1b)과 지시전극(2a,2b)으로 구성된 이전극계를 기본으로 하여 측정하고자 하는 대상물질의 수에 따라 각기 그에 대응하는 독립된 기준전극-지시전극쌍(1a-2a,1b-2b)을 한 절연성 기판(3)위에 구성해 주었으나, 기준전극(1a,1b)은 공용으로 하고 지시전극(2a,2b)만을 독립적으로 구성해 줄 수도 있다.

이때, 기준전극(1a,1b)에 대한 일정한 전압을 지시전극(2a,2b)에 인가하면 지시전극(2a,2b)상에서 전극활성 물질의 산화 또는 환원 반응이 일어난다.

이 전극부는 고분자로 된 절연성 기판(3)상에 은(Ag)페이스트로 인쇄된 도전 경로(4), 카본(carbon)페이스트로 인쇄된 지시전극(2a,2b)과 Ag/AgCl 기준전극(1a,1b), 절연층(5)으로 구성된다.

또한, 도 2에 도시된 면역 반응이 일어나는 적층부와 접하는 기준전극(1a,1b)과 지시전극(2a,2b)영역에 히드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethyl cellu- lose)와 같은 강한 친수성 물질로 이루어진 외부막(6)을 구성하여 면역반응부로부터 수용액이 전해지면 쉽게 전극상에 전해질계가 형성된다.

면역반응부는 도 3에 도시된 바와 같이, 셀룰로오스(cellulose), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 등 액상의 시료를 투과시킬 수 있는 재질로, 각각의 재질 또는 이들의 조합을 일정한 크기로 잘라 하우징(housing)(7)내에 위치시킨 적층부를 갖는다.

이 적층부의 최상층(8)에는 측정물질-리포좀파괴인자로 구성된 접합체(conjugate)를 흡착시키고, 경쟁층(9)에는 측정물질에 결합하는 항체를 공유결합시켜 이동할 수 없게 한 후, 신호발생층(10)에는 전기화학적 활성 물질을 담고 있는 리포좀(liposome)을 고정한다.

이때, 측정하고자 하는 대상물질의 수에 따라 격벽(11)에 의해 분리되는 적층부를 단일한 하우징(7)에 구성한다.

이러한 적층부는 기본적으로 시료와 매트릭스상에 흡착된 측정물질-리포좀파괴인자 접합체를 이동시키면서 면역반응이 일어나는 역할과 함께 전극에 전해질(electrolyte)을 제공해 주는 기능을 갖는다.

본 발명에 의한 면역 바이오센서는 도 4에 도시된 바와 같이, 격벽(11)을 갖는 하우징(7)내에 있는 적층부가 절연층(5)에 의해 선택적으로 노출된 기준전극(1a,1b)과 지시전극(2a,2b)영역상에 일치되도록 서로 접합시킨다.

하우징(7)과 전극(1a,1b,2a,2b)이 접하는 부분을 밀봉하여 면역반응의 결과가 각각 독립된 적층부로부터 방출된 전극활성물질들이 확산에 의해 서로 섞이지 않도록 한다.

이때, 하우징(7)의 격벽(11)은 전극부의 절연층(5)과 접합된다.

이와 같이, 구성된 본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서의 동작을 설명하면 다음과 같다.

예를 들어, 동일 시료내에 존재하는 세오필린(theophylline)과 젠타미신(gentamicin)을 동시에 측정하는 경우, 먼저, 측정물질이 들어 있는 액상시료 일정량을 면역반응부상에 구성된 독립된 시료투입구(12a,12b)에 떨어뜨리면, 각 시료투입구(12a,12b)에 투여된 시료는 독립적인 과정을 겪게된다.

즉, 최상층(8)에 흡착되어 있던 측정물질-리포좀파괴인자(예를 들면 메리틴(melittin))접합체와 섞이게 되고, 시료의 액체를 운반체로 하여 시료내의 측정물질과 함께 중력과 확산에 의해 전극쪽으로 이동을 시작한다.

이때, 분석하고자 하는 물질에 특이적으로 결합하는 항체가 고정되어 있는 경쟁층(9)에 다다르게 되면 이 항체의 결합자리를 두고 시료내의 측정대상물질과 측정물질-리포좀파괴인자 접합체가 경쟁을 하게된다.

따라서, 시료내에 측정하고자 하는 물질이 많은 경우, 보다 많은 측정물질-리포좀파괴인자가 경쟁층을 통과해 신호발생층(10)에 고정되어 있는 리포좀에 도달하여 리포좀을 깨뜨리게 된다.

격벽(11)에 의해 분리되어 독립적으로 존재하는 두 적층부의 구조는 완전히 동일하나 세오필린 측정부는 최상층(8)에 세오필린-멜리틴 접합체가 흡착되었고, 경쟁층(9)에는 세오필린에 선택적으로 결합하는 항체가 고정되어 있으며, 젠타미신 측정부는 최상층(8)에 젠타미신-멜리틴 접합체가 흡착되었고, 경쟁층(9)에는 젠타미신에 선택적으로 결합하는 항체가 고정되어 있다.

이와 같이, 동일한 시료내에 존재하는 상이한 분석대상물질은 독립적인 면역반응을 겪게되어 시료용액내에 존재하는 각 측정물질의 농도에 비례하여 리포좀안의 전극활성 물질이 방출되며, 방출된 전극활성 물질은 한 기판위에 각 측정부에 대해 독립적으로 구성된 기준전극-지시전극쌍(1a-2a, 1b-2b)으로 도달하게 된다.

이때, 기준전극(1a,1b)에 대한 일정전압이 인가된 지시전극(2a,2b)상에서 전극활성 물질이 산화 또는 환원되면서 결국 동일 시료용액내에 존재하는 각 측정물질의 농도에 비례하는 독립된 전류값을 얻게 되므로 서로 다른 분석대상물질에 대한 동시측정이 가능하게 되는 것이다.

따라서, 본 발명에 의한 다종 분석물질의 동시측정을 위한 전기화학식 면역 바이오센서를 활용하면 종합병원 뿐만 아니라, 개인병원내 의사진료실에서도 피진료자에 대한 복합적인 임상분석을 즉석에서 수행할 수 있게 되어, 피진료자 개개인에 대한 유용한 임상정보를 얻게 되고 이에 근거한 양질의 진료 행위를 할 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명에 따른 전기화학식 면역 바이오센서에 있어서는 다음과 같은 효과가 있다.

첫째, 동일 시료내에 존재하는 서로 다른 종류의 분석대상물질을 동시에 측정할 수 있으므로, 짧은 시간에 임상적으로 중요한 여러 가지 물질에 대한 분석이 가능하다.

둘째, 면역반응부의 적층구조화의 결과로 시료투과성의 불연속성을 도입할 수 있게 되어 필요에 따라 시료의 이동시간을 조절함으로써, 항원-항체 반응의 효율을 높일 수 있다.

셋째, 전극과 연속되는 시료전달 매질의 면적을 줄임으로써, 스트립 형태의 센서에서 관찰되는 전개양상의 난잡함이 줄어들게 된다.

넷째, 친수성 외부막을 면역반응부와 전극간에 구성함으로써, 이들간의 인터페이싱을 개선하여 보다 깨끗한 신호를 얻을 수 있다.

Claims (5)

1. 절연성 기판상의 일정영역에 형성되는 다수개의 전극들과, 상기 전극들에 연결되어 상기 절연성 기판상에 일정간격으로 형성되는 다수개의 도전경로와, 상기 절연성 기판상에 선택적으로 형성되는 절연층과, 상기 전극영역에 형성되는 외부막으로 이루어진 전극부;

   측정물질과 리포좀파괴인자로 구성된 접합체가 흡착된 상층부, 상기 측정물질에 결합하는 항체를 결합시킨 경쟁층, 전기화학적 활성물질을 담고 있는 리포좀이 고정되어 있는 신호발생층을 포함하는 다수개의 적층부와, 상기 각 적층부를 격벽으로 각각 격리시키는 하우징으로 이루어지고 상기 전극부의 전극영역에 형성되는 면역반응부를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 하우징은 전극에 수직한 방향으로 형성됨을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 하우징은 전극부의 전극영역에 밀봉되어 접합됨을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 적층부는 측정하고자 하는 대상물질의 수에 따라 증가됨을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 하우징의 격벽은 상기 전극부의 절연층과 접합됨을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.

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