JP2003294679A - 電気化学式バイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 電気化学的に活性でない物質を、簡便で安価
な電気化学的方法により測定することを可能にする電気
化学式バイオセンサーを提供すること。 【解決手段】 本発明に係る電気化学式バイオセンサー
は、測定すべき物質の抗体に基質との反応により電気化
学的に活性な物質を生成する酵素を結合させた酵素結合
抗体を含む第一層と、前記酵素結合抗体と結合する物質
が、少なくとも測定すべき物質よりも多い量、固定され
た第二層と、前記酵素との反応により電気化学的に活性
な物質を生成する基質を含有する第三層と、電極とを備
え、前記第一層から測定すべき物質を含有する試液を導
入し、第一層に導入された試液が、第二層を通過して第
三層に導入され、第三層での電気化学的な反応を前記電
極を介して測定することができるように構成したことを
特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、電気化学式バイオ
センサーに関し、特に、電気化学的に活性な物質を介し
て間接的に試液中に存在する測定対象物質の量を測定し
得る電気化学式バイオセンサーに関する。

【０００２】

【従来の技術】アルブミン等のたんぱく質は通常、腎臓
で吸収され尿にはわずかな量しか排泄されないが、腎不
全や腎機能障害になると、腎臓でアルブミンを再吸収で
きなくなるため尿中に排泄されるアルブミンの量が増加
する。このため、腎疾患の診断のために尿中のアルブミ
ンを測定することは重要である。特に、糖尿病では合併
症により腎疾患に至る可能性があるため尿中に排泄され
ているアルブミンの量の測定は重要である。上記したア
ルブミン測定方法としては、アルブミン抗体が固定され
た膜に、尿を滴下し、尿中に含まれるアルブミンと膜に
固定されたアルブミン抗体との相互作用を、光の強度変
化として検出できる物質とさらにカップリングさせるこ
とで検出する光学的測定方法が一般的に用いられてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記した光学
的測定方法は、測定システムが煩雑で費用が多くかかる
という問題点があり、より簡便で、より低費用な測定方
法の開発が市場では求められている。簡便で、より低費
用な測定方法としては、物質の化学反応を電気信号とし
て取り出す電気化学的測定方法が挙げられるが、アルブ
ミンは、電気的に活性な物質ではないので、アルブミン
そのものを、この電気化学的測定方法を用いて測定する
ことはできないという問題がある。上記した問題は、ア
ルブミンに限らず、電気化学的に活性でない物質に共通
する問題である。発明者等は、上記した従来の問題点に
着目し、電気化学的に活性でない物質を、より簡便で、
より低費用で測定する方法を研究し、本発明を発明する
に至った。本発明は、電気化学的に活性でない物質を、
簡便で安価な電気化学的方法により測定することを可能
にする電気化学式バイオセンサーを提供することを目的
としている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記した目的を達成する
ために、本発明に係る電気化学式バイオセンサーは、測
定すべき物質の抗体に基質との反応により電気化学的に
活性な物質を生成する酵素を結合させた酵素結合抗体を
含む第一層と、前記酵素結合抗体と結合する物質が、少
なくとも測定すべき物質よりも多い量、固定された第二
層と、前記酵素との反応により電気化学的に活性な物質
を生成する基質を含有する第三層と、電極とを備え、前
記第一層から測定すべき物質を含有する試液を導入し、
第一層に導入された試液が、第二層を通過して第三層に
導入され、第三層での電気化学的な反応を前記電極を介
して測定することができるように構成したことを特徴と
するものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下に添付図面に示した幾つかの
実施例を参照しながら本発明に係る電気化学式バイオセ
ンサーの実施の形態について説明していく。図１は、本
発明に係る電気化学式バイオセンサーの概略斜視図を示
している。図中符号１は基板を示しており、この基板１
上には、電極２がスクリーン印刷されている。電極２の
上部には、３つの層が積層されている。以下の説明で
は、これら３つの層を試液が通る順番に従って酵素結合
抗体層３、競合反応層４及び電気化学反応層５と称す
る。酵素結合抗体層３は、本願発明の第一層を形成する
最上部に位置する層であり、この酵素結合抗体層３に
は、測定すべき物質の抗体に、基質との反応により電気
化学的に活性な物質を生成する酵素を結合させた物質が
含まれている。ここで、基質との反応により電気化学的
に活性な物質を生成する酵素とは、例えば、基質がパラ
アミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧの場合に
は、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）であり、ま
た、例えば、基質がグルコースの場合には、グルコース
オキシダーゼであり得る。さらにまた、第三層には、酵
素反応に伴って共役的に酸化還元を行う電気化学的に活
性なフェリシアナイド若しくはフェロセン及びおよびそ
の誘導物質、又はキノン等の酸化還元物質を含ませるこ
ともできる。また、本明細書では、この測定すべき物質
の抗体に酵素を結合した物質のことを酵素結合抗体と称
する。この酵素結合抗体層３に含まれる酵素結合抗体の
量は、測定すべき物質に応じて適宜変更され得るが、競
合反応層での試液の展開中に測定すべき物質と競合反応
する量より多くしておく必要がある。例えば、β−ガラ
クトシダーゼ標識アルブミン抗体2.5μgが酵素結合抗体
層３に含まれ得る。競合反応層４は、本発明に係る第二
層を形成する層であり、酵素結合層３の下流に位置す
る。この競合反応層４には、酵素結合抗体層３に含まれ
た酵素結合抗体と結合し得る物質が固定されている。こ
の物質は、測定対象物質と同じ物質であり得るが、これ
に限定されることなく、酵素結合抗体層３に含まれてい
る酵素結合抗体と結合し得る物質であれば任意の物質で
よい。この競合反応層４に固定される物質の量は、測定
すべき物質の量と、酵素結合抗体層３に含まれる酵素結
合抗体の量とに応じて適宜決められ得るが、少なくと
も、酵素結合抗体層３において測定すべき物質が結合し
なかった余剰な酵素結合抗体と競合反応するのに充分な
量に設定される。電気化学反応層５は、本発明に係る第
三層を形成する層であり、最下流に位置し、電極２と直
接接触している。この電気化学反応層５には、酵素結合
抗体層３に含まれた酵素結合抗体における酵素と反応し
て電気化学的に活性な物質を生成する基質が含まれてい
る。具体的には、例えば、酵素がβ−ガラクトシダーゼ
（β−Ｇａｌ）の場合には基質はパラアミノフェニルガ
ラクトピラノシドＰＡＰＧであり、酵素がグルコースオ
キシダーゼの場合には基質はグルコースになる。この電
気化学反応層５に含まれている基質の量は、第一層と同
様、測定すべき物質の量より多くしておく必要がある。

【０００６】上記したように構成された電気化学式バイ
オセンサーの作用を説明する。以下の説明では、一例と
して、測定対象物質をアルブミンＡｌｂ、抗体をアルブ
ミン抗体Ａｂ、酵素をβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａ
ｌ）、基質をパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰ
ＡＰＧとして説明していく。酵素結合抗体層３から試液
として尿を導入すると、酵素結合抗体層において、尿中
にアルブミン抗体とβ−ガラクトシダーゼとを結合させ
た酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌが溶け出す。尿中に溶け出
した酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌは、尿中のアルブミンＡ
ｌｂと結合して、β−ガラクトシダーゼが結合したアル
ブミン−抗体複合体（以下、酵素結合型アルブミン−抗
体結合体と称する。）となり競合反応層４に入る。競合
反応層４に入った尿には、酵素結合型アルブミン−抗体
結合体と、アルブミンＡｌｂと結合できなかった酵素結
合抗体Ａｂ＋Ｇａｌが含まれている。競合反応層４に
は、酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌと結合する物質としてア
ルブミンＡｌｂが予め固定されているので、余剰な酵素
結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌは、競合反応層４に固定されたア
ルブミンＡｌｂと結合して競合反応層４に止まる。従っ
て、競合反応層４で競合反応により測定物質であるアル
ブミンと結合しない酵素結合抗体Ａｌ＋Ｇａｌは尿中か
ら取り除かれ、電気化学反応層５には、測定すべきアル
ブミンから生成された酵素結合型アルブミン−抗体結合
体だけが入る。電気化学反応層５には、β−ガラクトシ
ダーゼＧａｌの基質であるパラアミノフェニルガラクト
ピラノシドＰＡＰＧが含まれているので、尿中に含まれ
ている酵素結合型アルブミン−抗体結合体のβ−ガラク
トシダーゼ（β−Ｇａｌ）とパラアミノフェニルガラク
トピラノシドＰＡＰＧとの酵素反応によりパラアミノフ
ェノールＰＡＰが生成される。ここで生成されるパラア
ミノフェノールＰＡＰは電気化学的に活性な物質なの
で、それが生成された量を電気信号として取り出すこと
ができる。従って電極１で電気化学反応層５で生成され
たパラアミノフェノールＰＡＰの量を電気信号として取
り出し、不図示の測定装置に出力することが可能にな
る。そして、この電気化学反応層で生成されるパラアミ
ノフェノールＰＡＰの量は、尿中に含まれているアルブ
ミンＡｌｂの量と比例関係を持つので、測定装置で、パ
ラアミノフェノールＰＡＰの量から尿中に含まれている
アルブミンＡｌｂの量を算出することが可能になる。

【０００７】次に、図２〜図６を参照して本発明に係る
電気化学的バイオセンサーの第二の実施例について説明
していく。図２は電気化学的バイオセンサーの第二実施
例の概略上面図、図３は図２に示した電気化学的バイオ
センサーの一部断面概略斜視図、図４は図２のＡ−Ａ断
面図、図５は図２のＢ−Ｂ断面図を各々示している。図
中符号１０は絶縁性プラスチックフィルムからなる基板
を示しており、この基板１０上には、導電性ペーストイ
ンク材料をスクリーン印刷してなる作用極１１及び測定
極１２が設けられている。上記した二つの電極１１及び
１２は電極部分及び端子部分を除いて絶縁性レジスト膜
１３で被覆されている。上記したように構成された電極
１１及び１２の上には、酵素結合抗体層１４、競合反応
層１５及び電気化学反応層１６が図３〜図５に示すよう
に設けられる。以下に、これら各層１４〜１６のレイア
ウトについて説明する。電気化学反応層１６は電極１１
及び１２の上に設けられ、電極部分と直接接触するよう
に構成されている。競合反応層１５は、ラテラルフロー
メンブレンから成り、基板１０の後方（図２における左
側）から基板１０の前方（図２における右側）に向かっ
て伸び、電気化学反応層１６の上を微細な隙間１７をあ
けて通過して、電気化学反応層１６より前方で、基板１
０上に形成されているレジスト膜１３に接触するように
湾曲され、その先端が前記レジスト膜１３に固定され
る。前記競合反応層１５は、その露出している上面部分
が液密にコーティングされている。また、競合反応層１
５とレジスト膜１３の結合部分は、外側（電極の端子
側）には液が漏れないが、内側（電極部分側）には液が
漏れ出るようにコーティングされている。酵素結合抗体
層１４は、競合反応層１５の上流部分に、競合反応層１
５と直接接触するように設けられる。尚、図中、符号１
８はスペーサを示している。上記したように構成された
酵素結合抗体層１４には酵素結合抗体が、競合反応層１
５には抗体と結合する物質が、電気化学反応層１６には
酵素に対応する基質が各々含有又は固定されている。こ
れらの物質の種類や量については第一実施例で説明した
ので、ここでは、詳細な説明は省略する。

【０００８】次に、上記したように構成された電気化学
式バイオセンサーの作用について図６を参照しながら説
明していく。尚、各層における化学的又は電気化学的な
反応については既に第一実施例で説明しているので重複
する説明は省略し、ここでは、試液の流れについてのみ
説明していく。図６は図３の一部断面斜視図に試液の流
れを矢印で示した説明図である。酵素結合抗体層１４に
導入された試液は、競合反応層１５に流入する。競合反
応層１５はセンサーの前後方向に試液が流れるように配
置されたラテラルフローメンブレンで形成されているの
で、競合反応層１５に流入した試液は、競合反応層１５
の先端に向かって流れる。競合反応層１５の先端に到達
した試液は、競合反応膜１５の先端から内側に漏れ出
し、毛細管現象により、電極リード部を形成することで
任意に基板１０上に生じさせた段部に沿って電極１１及
び１２の電極部分に向かって流れ、さらに、競合反応膜
１５と電気化学反応層１６との間に形成された微細な間
隙１７に引き込まれ、電気化学反応層１６の上面から均
一に、電気化学反応層１６に入り込むようになる。上記
したように構成することにより、ラテラルフローメンブ
レンを使用しているにもかかわらず試液が電気化学反応
層１６により均一に流入するようになり、より良好な測
定結果を得ることが可能になる。

【０００９】上記したように構成された電気化学式バイ
オセンサーを用いて実際に試液中に含まれるアルブミン
の量を測定した結果を図７に示す。この実験では、酵素
結合抗体層１４に、アルブミン抗体とβ−ガラクトシダ
ーゼ（β−Ｇａｌ）とを結合させた酵素結合抗体Ａｂ＋
Ｇａｌを2.5μg含ませ、競合反応層１５に、アルブミン
Ａｌｂを20μg/cm²固定し、電気化学反応層１６に、パ
ラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧを22μg
含ませ、予め１〜１０００ｍｇ／Ｌのアルブミンを含ま
せた試液を酵素結合抗体層１４から導入して電極での出
力電流量を測定した。図７の実験結果から、上記したよ
うに構成された電気化学式バイオセンサーを用いれば電
気化学的に不活性なアルブミン等の物質でも電気化学的
に測定することが可能になることがわかる。

【００１０】尚、上記した実施例では、電気化学式バイ
オセンサーを、酵素結合抗体層、競合反応層及び電気化
学反応層の三つの層から形成しているが、必要に応じ
て、第一層を構成する酵素結合抗体層の上部に、試液中
に含まれる電気化学的に酸化されやすい物質を、予め酸
化して除去することができる物質を積層してもよい。こ
れにより、試液中に含まれていて電気的に酸化され易い
ので測定に影響を及ぼす可能性があるアスコルビン酸、
尿酸、アセトアミノフェン等の物質を予め除去しておく
ことが可能になる。この電気化学的に酸化されやすい物
質を、予め酸化して除去することができる物質として
は、例えば、二酸化鉛や二酸化すず等がある。

【００１１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明に係る電気
化学式バイオセンサーは、測定すべき物質の抗体に基質
との反応により電気化学的に活性な物質を生成する酵素
を結合させた酵素結合抗体を含む第一層と、前記酵素結
合抗体と結合する物質が、少なくとも測定すべき物質よ
りも多い量、固定された第二層と、前記酵素との反応に
より電気化学的に活性な物質を生成する基質を含有する
第三層と、電極とを備え、前記第一層から測定すべき物
質を含有する試液を導入し、第一層に導入された試液
が、第二層を通過して第三層に導入され、第三層での電
気化学的な反応を前記電極を介して測定することができ
るように構成しているので、電気化学的に不活性な物質
でも電気化学的に活性な物質を生成する酵素と基質との
化学反応を介して電気化学的に測定することが可能にな
るという効果を奏する。そして、これにより、従来、高
価な光学的手法に頼らざるをえなかった様々な物質の測
定を安価な電気化学的手法により測定することが可能に
なるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明に係る電気化学式バイオセンサーの概
略斜視図である。

【図２】 電気化学的バイオセンサーの第二実施例の概
略上面図である。

【図３】 図２に示した電気化学的バイオセンサーの一
部断面概略斜視図である。

【図４】 図２のＡ−Ａ断面図である。

【図５】 図２のＢ−Ｂ断面図である。

【図６】 図３の一部断面斜視図に試液の流れを矢印で
示した説明図である。

【図７】 図２〜図６に示した電気化学式バイオセンサ
ーを用いて実際に試液中のアルブミン量を測定した実験
結果を示すグラフである。

【符号の説明】

１ 基板 ２ 電極 ３ 酵素結合抗体層 ４ 競合反応層 ５ 電気化学反応層 １０ 基板 １１ 作用極 １２ 測定極 １３ レジスト膜 １４ 酵素結合抗体層 １５ 競合反応層 １６ 電気化学反応層 １７ 隙間 １８ スペーサ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｇ (72)発明者 織笠 正人 神奈川県横浜市都筑区仲町台５丁目５番１ 号 株式会社テクノメデイカ内 (72)発明者 鈴木 秀規 広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬 株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA15 CB03 DA38 FB01 FB03 FB05

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】測定すべき物質の抗体に基質との反応によ
   り電気化学的に活性な物質を生成する酵素を結合させた
   酵素結合抗体を含む第一層と、 前記酵素結合抗体と結合する物質が、少なくとも測定す
   べき物質よりも多い量、固定された第二層と、 前記酵素との反応により電気化学的に活性な物質を生成
   する基質を含有する第三層と、 電極と を備え、 前記第一層から測定すべき物質を含有する試液を導入
   し、第一層に導入された試液が、第二層を通過して第三
   層に導入され、第三層での電気化学的な反応を前記電極
   を介して測定することができるように構成したことを特
   徴とする電気化学式バイオセンサー。
2. 【請求項２】前記酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、 前記基質がパラアミノフェニルガラクトピラノシドであ
   ることを特徴とする請求項１に記載の電気化学式バイオ
   センサー。
3. 【請求項３】前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
   り、 前記基質がグルコースであることを特徴とする請求項１
   に記載の電気化学式バイオセンサー。
4. 【請求項４】前記第三層に、酵素反応に伴って共役的に
   酸化還元を行う電気化学的に活性なフェリシアナイド若
   しくはフェロセン及びおよびその誘導物質、又はキノン
   等の酸化還元物質を含むことを特徴とする請求項３に記
   載の電気化学式バイオセンサー。
5. 【請求項５】前記測定すべき物質が尿中に含まれたアル
   ブミンであり、 前記抗体がアルブミン抗体であり、 酵素と基質との反応を介して間接的に尿中のアルブミン
   量を測定することができるようにしたことを特徴とする
   請求項１〜４の何れか一項に記載の電気化学式バイオセ
   ンサー。
6. 【請求項６】第一層の上部に試液中に含まれる電気化学
   的に酸化されやすい物質をあらかじめ除去（酸化）する
   物質を積層したことを特徴とする請求項１〜５の何れか
   一項に記載の電気化学式バイオセンサー。