KR20000007958A - 친수성 폴리우레탄을 사용한 바이오센서의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신호감지부와 신호변환부 (transducer)로 구성된 바이오센서 (biosensor)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 바이오센서의 신호감지부에 사용되는 생체 활성물질인 효소, 항체, 항원, 세포 또는 그 밖의 분자 수용체 등을 친수성 폴리우레탄 (polyurethane)과 직접 혼합하여 전극 또는 고분자 막 등의 신호변환부에 고정화하는 직접 고정화 방법을 이용하여 바이오센서를 제조하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 방법에 의해 기존의 바이오센서 제조시 사용되는 가교화 (cross-linking) 방법에서의 가교화와 같은 여러단계의 화학반응 및 세척과정을 거치지 않고 친수성 폴리우레탄을 이용하여 간편하게 바이오센서를 제조할 수 있어 소형 고체상 전극으로의 제작 및 대량생산이 용이할 뿐만 아니라, 본 발명의 방법으로 형성된 친수성 폴리우레탄 효소층이 장시간동안 안정하고 신호변환부인 전극막에 대한 방해작용을 일으키지 않아 선택성, 감도 및 전극의 안정성 측면에서 우수한 성질을 가지는 바이오센서를 제조할 수 있다.

Description

친수성 폴리우레탄을 사용한 바이오센서의 제조 방법
본 발명은 신호감지부와 신호변환부로 구성된 바이오센서를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 바이오센서의 신호감지부에 사용되는 생체 활성물질인 효소, 항체, 항원, 세포 또는 그 밖의 분자 수용체 등을 친수성 폴리우레탄과 직접 혼합하여 전극 또는 고분자 막 등의 신호변환부에 고정화하는 직접 고정화 방법을 이용하여 바이오센서를 제조하는 방법에 관한 것이다.
바이오센서는 화학센서 중에서 분석대상 물질 또는 신호발생 과정에서 생화학 물질이 중심이 되는 것으로 신호감지부와 신호변환부로 구성된다. 신호감지부에서는 특정 생화학 물질에 대한 감지능력이 있는 효소, 항체 및 세포 등의 생체 활성물질이 측정하고자 하는 특정 생체물질과 반응하여 물리적 또는 화학적 변화를 발생시키고, 신호변환부에서는 분광기 및 전극 등과 같은 물리 또는 화학적 변환장치를 이용하여 신호감지부에서 발생된 신호를 정량화한다. 신호변환부의 변환장치에 이용되는 방법으로서는 빛의 세기 (optical density), 형광 (fluorescence) 및 흡광도 (absorbance)를 측정하는 방법; 전압전류법 (voltammetry), 전위차법 (potentiometry) 또는 전도도법 (conductometry) 등의 전기화학적 변화를 측정하는 방법; 열량계적인 변화를 측정하는 방법 (thermometry); 그리고 기계적인 변화를 측정하는 방법 (surface acoustic wave sensor) 등이 있다. 특히, 전기화학적 방법을 이용한 바이오센서는 요소 (urea), 포도당 (glucose), 콜레스테롤 (cholesterol), 유산염 (lactate), 크레아티닌 (creatinine), 아미노산 (amino acid) 등 다양한 생체물질을 빠르고 정확하게 측정하는 장치로서, 포도당 바이오센서가 1970년대 후반에 당뇨병 환자를 위해서 가정용으로 상용화된 이후, 현재 임상이나 약물실험 및 검출 등의 의약·진단 분야, 식품과 위생감시 분야, 환경 분야, 그리고 생산공정 분야 등의 광범위한 분야에서 응용되고 있다.
바이오센서의 분석을 위한 가장 중요한 요소로서는 분석 대상물질에 대한 선택특이성 (specificity)과 감도 (sensitivity)를 들 수 있다. 대상물질에 대한 선택특이성은 생체 활성물질의 생화학적 특성에 의해 결정되는 요소이고, 감도는 감응소자의 인식특성 효율과 제조된 바이오센서에서의 신호감지 및 변환장치의 성능에 의해 결정되는 요소이다. 바이오센서는 상기 생체 활성물질의 분자인식 (molecular recognition) 반응을 통해 대상물질에 대한 우수한 선택특이성과 높은 감도를 가질 수 있게 되며, 이는 화학센서와는 다른 바이오센서 특유의 장점이라고 할 수 있다.
그러나 바이오센서는 그 분석 대상물질이 주로 생화학적 특성, 분자량 등이 크게 다른 미량의 물질이고, 복잡한 반응 과정에 의해 신호가 발생되므로 신뢰성이 높고 정확한 분석 결과를 얻기가 매우 어렵다는 문제점이 있다. 그러므로 바이오센서의 감도를 극대화하고 분석 대상물질의 효율적인 검출을 위해서는, 생체 활성물질이 전극표면 등에 고정될 때 기질과의 상호반응이 최대가 될 수 있는 상태로 고정되어져야 하며, 고정된 효소 본래의 생화학적 활성이 저하되거나 소멸되지 않고 장기간 안정된 상태를 유지하여야 한다. 따라서 특정 분석물질을 인지하거나 촉매반응을 일으키는 다양한 효소 및 단백질 등의 생체 활성물질을 적당한 지지체에 고정화시키는 방법은 바이오센서의 연구에 있어서 중요한 분야를 차지해 왔다. 또한, 최근에는 이와같은 바이오센서를 소형화 및 대량생산이 용이한 고체형 전극 (solid-state electrode)에 도입하려는 연구가 활달히 진행되고 있다.
바이오센서에 주로 사용되는 생체 활성물질의 고정화 방법은 물리적인 방법과 화학적인 방법, 그리고 이 두가지 방법을 모두 이용한 방법 등이 있다. 물리적인 고정화 방법으로는 생체 활성물질을 물에 녹지 않는 운반체에 흡착 (adsorption)시키는 방법과 물에 녹지 않는 고분자 겔 (polymeric gel)에 가두어 두는 포접 (entrapment) 방법 등이 있으며, 화학적인 고정화 방법으로는 공유결합을 이용한 방법 및 가교화를 이용한 방법 등이 있다.
흡착을 이용한 생체물질의 고정화 방법은 친수성, 소수성 및 이온간의 상호작용을 이용해서 효소, 항체, 세포 등의 생체 활성물질을 막이나 필름에 고정화시키는 방법으로서, 바이오센서 표면에 생체 활성물질을 고정화하기 위해 사용된 가장 오래된 방법이지만, 흡착에 의해 고정된 분자들은 신호변환부로부터 쉽게 탈착 (deadsorption)될 수 있다는 단점을 가지고 있다.
포접 방법은 생체 활성물질을 막이나 필름에 물리적으로 가두어 두는 방법으로서, 비화학적 처리 (non-chemical treatment)나 온화한 반응조건에서 일반적으로 사용되며 활동도 (activity)를 잃거나 저하되기 쉬운 불안정한 생체 활성물질을 고정화하는 가장 적합한 방법이지만, 결합력이 약하여 생체 활성물질이 신호변환부의 막으로부터 쉽게 떨어지게 되므로 바이오센서의 성능을 저하시킬 수 있다.
공유결합을 이용한 화학적 고정화 방법은 펩티드 결합 또는 티올 (thiol), 아민 (amine), 에폭시 (epoxy) 등의 활성화된 표면 그룹과의 결합 등과 같은 화학적 반응을 이용하여 신호변환부의 표면에 생체 활성물질을 고정화시키는 방법으로서, 이 방법을 이용하여 얻어진 바이오센서의 표면은 비교적 pH나 이온세기 (ionic strength) 및 온도변화에 대해 안정하지만, 공유결합으로 고정화된 분자, 특히 효소 또는 수용체 (receptor)와 같은 불안정한 생체 활성물질의 활동도를 저하시킨다는 단점을 가지고 있다.
가교화를 이용한 고정화 방법은 포접 방법과 공유결합법을 모두 이용한 방법으로 가교화제 (cross-linking reagent)를 사용하여 부가적인 화학 결합을 형성함으로써 생체 활성물질을 막이나 필름에 고정화하는 방법이다. 이때 가교화제로는 글루타르알데히드 또는 헥사메틸렌 디이소시아네이트 (hexamethylene diisocyanate) 등이 사용될 수 있다.
현재 이용되고 있는 가장 일반적인 고정화 방법은 글루타르알데히드를 가교화제로 사용하여 효소를 고분자인 폴리 비닐클로라이드 (poly vinyl chloride, 이하 "PVC"로 약칭함)에 결합시키는 방법이다. 그러나 이러한 고정화 방법은 소수성 성질의 고분자 막에 대한 효소층의 접착력이 떨어져 바이오센서의 성능을 저하시키고 수명이 짧아지는 등의 여러 가지 문제점을 가지고 있었다.
최근에 이러한 문제점을 해결하고 고체상 바이오센서로의 응용을 위해, 얇은 효소층과 고분자 이온 선택성 막 (ion-selective membrane)으로 이루어진 비대칭 (asymmetry) 막이 제조되었다. 상기 비대칭 막은 폴리우레탄을 지지체로 하는 막으로서, 가소제 (plasticizer)와 적당한 이온선택성 물질 (ionophore 또는 ion carrier)이 포함된 폴리우레탄 막 위에 얇은 친수성 폴리우레탄 막을 입혀서 제조된다. 친수성 폴리우레탄 막 표면에 생체 활성물질을 도입하는 방법으로는 글루타르알데히드를 가교화제로 사용하는 가교화 방법이 이용된다. 가교화 방법을 수행하기 위해서는 폴리우레탄 막 표면에 아민기를 도입하여야 하므로 아민 (amine) 기능기를 가지고 있는 폴리라이신(polylysine)과 친수성 폴리우레탄을 혼합하여 아민기를 지닌 친수성 폴리우레탄 막을 만든 후, 글루타르알데히드 가교화 반응을 이용하여 친수성 폴리우레탄 막의 표면에 효소를 공유결합시켜 효소층을 얻는다. 이렇게 제조된 효소층은 이온 선택성 막과의 접착력이 우수하기 때문에 고체상 바이오센서로 제조하기에 용이하다. 그러나 이 방법은 여러 단계의 복잡한 반응과정과 세척과정을 거쳐야 하므로 제조 과정 측면에서 볼 때 상업화에는 어려움이 따른다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 전술한 바이오센서 제조과정의 문제점을 해결하고자 연구한 결과, 기존의 가교화 방법에서의 가교화와 같은 부가적인 화학반응 등을 거치지 않고 친수성 폴리우레탄을 이용하여 안정성이 우수하고 수명이 연장된 바이오센서를 간편하게 제조할 수 있는 새로운 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신호감지부 및 신호변환부로 구성되는 바이오센서를 제조할 때, 감응물질인 생체 활성물질을 신호변환부에 쉽고 간편하게 고정화함으로써 바이오센서를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1a 는 전위차법 바이오센서의 재래식 전극의 단면도이고,
도 1b 는 전위차법 바이오센서의 전선 (wire)형 고체상 전극의 단면도이고,
도 1c 는 전위차법 바이오센서의 평면형 고체상 전극의 단면도이고,
도 2a 는 신호변환부가 암모늄 이온 선택성 막이고 효소로서 우레아제 (urease)를 사용한 요소센서의 암모늄이온에 대한 감응곡선을 나타낸 그래프이고,
도 2b 는 신호변환부가 암모늄 이온 선택성 막이고 효소로서 우레아제를 사용한 요소센서의 요소에 대한 감응곡선을 나타낸 그래프이고,
(ㄱ) : 효소층이 도입되지 않은 암모늄 이온 선택성 막에서의 감응곡선
(ㄴ) : 친수성 폴리우레탄 A에 가교화제로서 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 사용하여 우레아제를 가교화시킨 효소층이 도입된 바이오센서에서의 감응곡선
(ㄷ) : 친수성 폴리우레탄 A에 직접 고정화 방법을 이용하여 우레아제를 고정화한 효소층이 도입된 바이오센서에서의 감응곡선
(ㄹ) : 친수성 폴리우레탄 B에 직접 고정화 방법을 이용하여 우레아제를 고정화한 효소층이 도입된 바이오센서에서의 감응곡선
(ㅁ) : 친수성 폴리우레탄 C에 직접 고정화 방법을 이용하여 우레아제를 고정화한 효소층이 도입된 바이오센서에서의 감응곡선
도 3 은 신호변환부가 암모늄 이온 선택성 막이고 친수성 폴리우레탄에 직접 고정화 방법을 이용하여 우레아제를 고정화한 효소층이 도입된 비대칭 요소센서의 고체상 전극에서의 요소에 대한 감응곡선을 나타낸 그래프이고,
(ㄱ) : 전선형 고체상 전극
(ㄴ) : 평면형 고체상 전극
도 4a 는 신호변환부가 암모늄 이온 선택성 막이고 친수성 폴리우레탄에 직접 고정화 방법을 이용하여 아데노신 디아미나제 (adenosine deaminase)를 고정화한 효소층이 도입된 아데노신 (adenosine) 센서의 전선형 고체상 전극에서의, 효소층의 두께 변화에 따른 암모늄 이온에 대한 감응곡선을 나타낸 그래프이고,
도 4b 는 신호변환부가 암모늄 이온 선택성 막이고 친수성 폴리우레탄에 직접 고정화 방법을 이용하여 아데노신 디아미나제를 고정화한 효소층이 도입된 아데노신 센서의 전선형 고체상 전극에서의, 효소층의 두께 변화에 따른 아데노신에 대한 감응곡선을 나타낸 그래프이고,
(ㄱ) : 얇은 효소층을 도입한 전극에서의 감응곡선
(ㄴ) : 두꺼운 효소층을 도입한 전극에서의 감응곡선
도 5 는 신호변환부가 수소 이온 선택성 막이고 친수성 폴리우레탄에 직접 고정화 방법을 이용하여 포도당 산화효소 (glucose oxidase)를 고정화한 효소층이 도입된 포도당 (glucose) 센서의 전선형 고체상 전극에서의 포도당에 대한 감응곡선을 나타낸 그래프이다.
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명*
(10) : 전극몸체 (20) : 고정체
(30) : 내부 기준전극 (Ag/AgCl) (40) : 내부 기준용액
(50) : 이온 선택성 막 (60) : 효소층
(70) : 은 (Ag) (80) : 절연체
(90) : 알루미나 판
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 신호감지부를 구성하는 생체 활성물질을 친수성 폴리우레탄과 직접 혼합하여 바이오센서의 신호변환부에 고정화하는 직접 고정화 방법을 이용하여 바이오센서를 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 우선, 신호감지부와 신호변환부로 구성된 바이오센서의 제조방법에 있어서, 감지부를 구성하는 감응물질을 친수성 폴리우레탄과 직접 혼합하여 신호변환부에 고정화시키는 직접 고정화 방법을 이용하여 바이오센서를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서는 생체 활성물질의 고정화 방법으로 완충용액에 녹인 생체 활성물질과 유기용매에 녹인 친수성 폴리우레탄을 혼합한 후, 혼합한 용액을 전극 또는 막 위에 성형·건조시켜 고정화하여 바이오센서를 제조한다.
또한, 본 발명에서는 신호감지부를 구성하는 생체 활성물질과 친수성 폴리우레탄을 혼합하는 것에 더하여, 막의 투과성을 높이기 위하여 폴리라이신을 첨가하여 신호변환부에 고정화시키는 바이오센서의 제조방법을 제공한다. 폴리라이신은 흡습성이 큰 물질로, 막의 구성물질로 첨가되어 친수성과 다공성을 조절하는 역할을 한다.
상기 생체 활성물질로는 효소, 항체, 항원, 세포 또는 분자 수용체 등이 사용될 수 있다.
상기 친수성 폴리우레탄은 친수성의 정도를 조절하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 [poly(etylene glycol), 이하 "PEG"로 약칭함]과 폴리프로필렌 글리콜 [poly(propylene glycol), 이하 "PPG"로 약칭함]의 비율을 조절하여 제조된다. 사용될 수 있는 PEG와 PPG의 비율은 몰 (mol) 비로서 1:10 ~ 10:1 의 범위이며, 바람직하게는 1:5 ~ 5:1의 범위이다.
상기 친수성 폴리우레탄을 녹일 수 있는 유기용매는 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofurane, 이하 "THF"로 약칭함), 메탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
상술한 바이오센서의 신호변환부에 이용되는 방법으로는 전위차법, 전압전류법 및 전도도법 등이 있으며, 신호변환부에 사용되는 고분자물질은 실리콘 러버 (silicone rubber), 폴리 비닐클로라이드 [poly(vinyl chloride)] 및 이들의 유도체, 방향족 폴리우레탄, 지방족 폴리우레탄 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 바이오센서로 분석할 수 있는 대상물질은 요소, 콜레스테롤, 포도당, 크레아티닌, 아데노신, 유산염 및 아미노산 등의 생체물질이다.
본 발명에서는 재래식 전극과 고체상 전극을 이용하여 전위차법 바이오센서를 제조할 수 있다 (도 1 참조). 고체상 전극을 이용한 바이오센서는 재래식 전극과는 달리 내부 기준용액을 사용하지 않고 고분자 막을 직접 전극 표면에 도입하여 제조할 수 있으므로, 이러한 고체상 전극을 사용하면 바이오센서를 소형화할 수 있으며, 이로 인해 소량 시료의 측정이 가능하고 낮은 가격으로 바이오센서를 대량 생산할 수 있다.
본 발명에서는 바이오센서의 구체적인 예로 요소, 아데노신 및 포도당에 대한 바이오센서를 제조하는 방법을 제공한다.
요소에 대한 바이오센서의 제조과정에서는 생체 활성물질로서 요소의 가수분해를 촉진시켜 이산화탄소와 암모니아를 생성시키는 우레아제 (urease)와, 친수성 폴리우레탄으로서 다양한 비율의 PEG와 PPG를 포함하는 폴리우레탄을 혼합하여 직접 고정화 방법에 의해 효소층을 제조한다.
상기에서 제조된 바이오센서에 대해 다양한 폴리우레탄의 사용에 따른 감응성 변화 실험을 수행한 결과, 각각의 친수성 폴리우레탄과 우레아제를 혼합하여 얻은 효소층을 도입한 비대칭성 전극막의 암모늄 이온에 대한 감응성과 감응한계 (detection limit)가 효소층이 도입되지 않은 전극막에서의 감응성과 감응한계와 유사하여, 친수성 폴리우레탄 층이 신호감지부 고분자 막의 전기화학적 성질에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다. 반면에 기존의 글루타르알데히드를 이용한 가교화에 의해 형성된 비대칭성 전극막에서는 효소층이 친수성 폴리우레탄, 폴리라이신 및 효소의 세 층으로 이루어져 있어서 암모늄 이온에 대한 감응시간이 친수성 폴리우레탄에 효소를 직접 고정화한 경우에 비해 상대적으로 느린 감응성을 보인다. 같은 이유로 효소를 가교화한 전극막이 효소를 직접 고정시킨 전극막에 비해 요소에 대한 감응시간이 느린 결과를 보인다. 이상의 결과로부터 바이오센서에 효소를 도입하기 위해 사용된 친수성 폴리우레탄은 각각의 특성이 다르지만 서로 유사한 감응특성을 나타내며, 상기 친수성 폴리우레탄이 바이오센서의 분석에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
한편, 고체상 전극의 형태에 따른 감응성의 변화를 알아보기 위하여 신호변환부가 암모늄 이온 선택성 막이고 우레아제가 직접 고정화 방법에 의해 친수성 폴리우레탄에 고정화된 효소층을 가지는 비대칭 요소센서를 제조한다. 전선형 및 평면형 고체상 전극에서의 요소에 대한 감응곡선은 사용한 고체상 전극의 형태에 관계없이 요소에 대하여 재래식 형태의 바이오센서의 감응곡선과 유사한 감응 경향을 보이며, 상기 직접 고정화 방법을 이용하여 제조된 고체상 요소센서는 요소에 대한 감응성이 초기값의 80 %이상을 유지하는 기간이 2주 이상이 되어, 그 수명이 가교화법을 이용한 요소센서의 수명과 유사하다.
또한, 아데노신에 대한 바이오센서의 제조과정에서는, 생체 활성물질로서 아데노신의 가수분해를 촉진시켜 이노신(inosine)과 암모늄 이온을 생성시키는 아데노신 디아미나제 (adenosine deaminase)와 친수성 폴리우레탄을 사용하여 직접 고정화 방법에 의해 효소층을 제조한다. 상기와 같이 제조된 아데노신센서의 전선형 고체상 전극에서, 효소층의 두께 변화에 따른 암모늄 이온과 아데노신에 대한 감응성의 변화를 알아본 결과, 얇은 효소층을 갖는 센서가 암모늄 이온과 아데노신에 더 빠른 감응 결과를 보여, 효소층이 얇을수록 신호가 더 빠르게 통과한다고 할 수 있다.
또한, 포도당에 대한 바이오센서의 제조과정에서는 생체 활성물질로서 포도당 산화효소를 사용하여 효소층을 제조하는데 막의 투과성을 높이기 위해 포도당 산화효소 (glucose oxidase)가 고정화된 친수성 폴리우레탄 막에 폴리라이신을 소량 첨가하며, 이 때의 신호변환부는 전선형 고체상 전극막으로 수소 이온 선택성 막을 사용한다. 포도당 산화효소는 포도당으로부터 글루크론산 (gluconic acid)을 생성하고, 신호변화부에서는 그 결과 변화되는 pH를 감지하여 포도당을 측정한다. 약한 완충작용의 전해질 용액하에서 포도당에 대한 감응성을 조사한 결과, 포도당 센서의 포도당에 대한 감응곡선이 매우 느린 감응성을 보이는데 그 이유는 막을 통과하는 포도당의 확산이 느리고 pH 감응부위에서의 완충용액의 pH 변화가 느리기 때문이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.
<실시예 1> 전위차법을 이용한 바이오센서의 제조
바이오센서를 제조하기 위해 먼저, 친수성 폴리우레탄을 유기용매로 녹인 후, 생체 활성물질과 혼합하여 효소층을 제조하였다. 생체 활성물질이 우레아제 또는 아데노신 디아미나제인 경우 THF 또는 메탄올이 섞인 유기용매로 녹인 친수성 폴리우레탄을 혼합하여 효소층을 제조하였으며, 포도당 산화효소인 경우는 THF로 녹인 친수성 폴리우레탄을 혼합하여 효소층을 제조하였다. 이는 포도당 산화효소의 용매에 따른 활성도 실험 결과 THF와 메탄올이 섞인 유기용매에서는 포도당 산화효소의 활동도가 떨어지지만 THF 용매하에서는 포도당 산화효소의 활동도가 유지되는 현상을 보였기 때문이다.
1) 요소 센서의 제조 및 다양한 폴리우레탄의 사용에 따른 감응성의 변화 조사
요소에 대한 바이오센서의 제조과정에서는 생체 활성물질로서 요소의 가수분해를 촉진시켜 이산화탄소와 암모니아를 생성시키는 우레아제와, 친수성 폴리우레탄으로서 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 비율을 조절하여 합성한 세 종류의 폴리우레탄을 혼합하는 직접 고정화 방법에 의해 효소층을 제조하여 다양한 폴리우레탄의 사용에 따른 감응성의 변화를 조사하였다. 사용한 폴리우레탄의 조성은 하기 표 1 과 같으며, 이 때 제조된 친수성 폴리우레탄 A, B, C의 친수성의 정도는 물 흡습성으로 나타내어 각각 42 중량%, 100 중량%, 206 중량% 였다.
친수성 폴리우레탄의 조성
친수성 폴리우레탄 A 친수성 폴리우레탄 B 친수성 폴리우레탄 C
PEG 0.005 mol 0.01 mol 0.015 mol
PPG 0.015 mol 0.01 mol 0.005 mol
Desmodur Wa 0.052 mol 0.052 mol 0.052 mol
에틸렌글리콜 0.03 mol 0.03 mol 0.03 mol
PEG:PPG 1:3 1:1 3:1
a : 메틸렌 비스(4-시클로헥실 이소시아네이트) [Methylene bis (4-cyclo hexyl isocyanate)]
도 2 는 재래식 전극을 사용하여 제조된 요소센서의 암모늄 이온 (도 2a)과 요소 (도 2b)에 대한 감응 특성을 나타낸 곡선이다. (ㄱ)은 효소층이 없는 암모늄 이온 선택성 막에서의 감응곡선, (ㄴ)은 친수성 폴리우레탄 A에 가교화제로서 글루타르알데히드를 사용하여 우레아제를 가교화시킨 효소층이 도입된 비대칭성 전극막에서의 감응곡선, (ㄷ)은 친수성 폴리우레탄 A에 직접 고정화 방법을 이용하여 우레아제를 고정화한 효소층이 도입된 비대칭성 전극막에서의 감응곡선, (ㄹ)은 친수성 폴리우레탄 B에 직접 고정화 방법을 이용하여 우레아제를 고정화한 효소층이 도입된 비대칭성 전극막에서의 감응곡선, (ㅁ)은 친수성 폴리우레탄 C에 직접 고정화 방법을 이용하여 우레아제를 고정화한 효소층이 도입된 비대칭성 전극막에서의 감응곡선이다. 도 2a 에 나타난 바와 같이, 다양한 친수성 폴리우레탄을 사용해 효소층이 도입된 비대칭성 전극막에서의 암모늄 이온에 대한 감응성 및 감응한계는 효소층이 도입되지 않은 전극막에서의 감응성 및 감응한계와 유사한 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 친수성 폴리우레탄 층이 신호감지부 고분자 막의 전기화학적 성질에 영향을 주지 않는다는 것을 보여 주는 것이다. 글루타르알데히드를 이용한 가교화에 의해 형성된 비대칭성 전극막에서는 효소층이 친수성 폴리우레탄, 폴리라이신 및 효소의 세 층으로 이루어져 있어서 암모늄 이온에 대한 감응시간이 친수성 폴리우레탄에 효소를 직접 고정시킨 전극막에 비해 상대적으로 느린 것으로 나타났다. 같은 이유로 효소를 가교화한 전극막이 효소를 직접 고정시킨 전극막에 비해 요소에 대한 감응시간이 느린 결과를 보였다. 이상의 결과로 바이오센서에 효소를 도입하기 위해 사용된 세가지 친수성 폴리우레탄은 각각의 특성이 다르지만 서로 유사한 감응특성을 나타내며, 이들 폴리우레탄이 바이오센서의 분석에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
2) 요소 센서의 제조 및 전극의 형태에 따른 감응성의 변화 조사
전극 형태가 전선형 및 평면형 고체상 전극인 요소 센서를 상술한 방법에 의해 제조하여 전극의 형태에 따른 감응성의 변화를 조사하였다.
도 3 은 신호변환부가 암모늄 이온 선택성 막이고 친수성 폴리우레탄에 직접 고정화 방법을 이용하여 우레아제를 고정화한 효소층이 도입된 비대칭 요소센서의 전선형 및 평면형 고체상 전극에서의 요소에 대한 감응곡선을 나타낸 것이다. 도 3 에 나타난 바와 같이, 요소센서에 사용한 고체상 전극의 형태에 관계없이 요소에 대하여 재래식 형태의 바이오센서와 유사한 감응 경향을 보였고, 요소농도 10-5에서 10-2M 영역에서 감응곡선의 기울기가 각각 전선형 고체상 전극의 경우 52 mV/decade, 평면형 고체상 전극의 경우 55 mV/decade 였다. 또한, 직접 고정화 방법을 이용하여 제조된 고체상 요소센서는 요소에 대한 감응성이 초기값의 80 %이상을 유지하는 기간이 2주 이상이 되어, 그 수명이 가교화법을 이용한 요소센서의 수명과 유사한 것으로 나타났다.
3) 아데노신 센서의 제조 및 효소층의 두께에 따른 암모늄 이온과 아데노신에 대한 감응성의 변화 조사
아데노신에 대한 바이오센서의 제조과정에서는, 생체 활성물질로서 아데노신의 가수분해를 촉진시켜 이노신과 암모늄 이온을 생성시키는 아데노신 디아미나제를 사용하여 폴리우레탄을 혼합하는 직접 고정화 방법에 의해 효소층을 제조하여, 효소층의 두께에 따른 암모늄 이온과 아데노신에 대한 감응성의 변화를 조사하였다.
도 4 는 신호변환부가 암모늄 이온 선택성 막이고 친수성 폴리우레탄에 직접 고정화 방법을 이용하여 아데노신 디아미나제를 고정화한 효소층이 도입된 아데노신센서의 전선형 고체상 전극에서의, 효소층의 두께 변화에 따른 암모늄 이온 (가)과 아데노신 (나)에 대한 감응곡선이다. (ㄱ)은 얇은 효소층을 도입하였을 때, (ㄴ)은 두꺼운 효소층을 도입하였을 때의 감응곡선을 나타내는데, 신호가 외부 용액과 이온선택성 막 표면 사이를 통과할 때 효소층이 얇을수록 더 빠르게 통과할 수 있으므로 (ㄱ)의 얇은 효소층을 갖는 센서가 암모늄 이온과 아데노신에 더 빠른 반응을 보였다. 그러나 아데노신에 대한 감응성을 보면 10-5- 10-2M 범위에서 두꺼운 막을 도입한 경우는 54 mV/decade의 감응기울기를 나타내었고 얇은 막을 도입한 경우는 46 mV/decade의 감응기울기를 나타내었다.
4) 포도당 센서의 제조 및 포도당에 대한 감응성 조사
포도당에 대한 바이오센서의 제조과정에서는 생체 활성물질로서 포도당 산화효소를 사용하여 효소층을 제조하였는데, 막의 투과성을 높이기 위해 포도당 산화효소가 고정화된 친수성 폴리우레탄 막에 폴리라이신을 소량 첨가하였으며, 이 때의 신호변환부는 전선형 고체상 전극으로서 수소 이온 선택성 막을 사용하였다. 약한 완충작용의 전해질 용액하에서 포도당에 대한 감응성 실험을 한 결과, 신호변화부에서는 포도당으로부터 생성된 글루크론산에 의해 변화된 pH를 감지하며 그 결과로부터 포도당에 대한 감응곡선을 얻을 수 있다. 그 결과, 도 5 에 나타난 바와 같이 포도당 센서는 매우 느린 감응성을 보였는데 그 이유는 막을 통과하는 포도당의 확산이 느리고 pH 감응부위에서의 완충용액의 pH 변화가 느리기 때문이다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 직접 고정화 방법을 이용한 바이오센서의 제조 방법은 기존의 가교화 방법에서의 가교화와 같은 여러 단계의 화학반응 및 세척과정을 거치지 않고 친수성 폴리우레탄을 이용하여 간편하게 바이오센서를 제조할 수 있으며, 본 발명의 직접 고정화 방법을 이용하여 얻어진 친수성 폴리우레탄 효소층이 장시간동안 안정하고 신호변환부인 전극막에 대한 방해작용이 없어 선택성, 감도 및 전극의 안정성 측면에서 우수한 성질을 가지는 바이오센서를 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 직접 고정화 방법을 이용하여 제조한 바이오센서는 소형화와 대량생산이 가능한 고체상 바이오센서로의 응용이 가능하다.

Claims (8)

  1. 신호감지부와 신호변환부로 구성된 바이오센서 (biosensor)의 제조방법에 있어서, 감지부를 구성하는 감응물질을 친수성 폴리우레탄과 직접 혼합하여 신호변환부에 고정화시키는 직접 고정화 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 감응물질은 생체 활성물질로서 효소, 항체, 항원, 세포 및 분자수용체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 친수성 폴리우레탄은 폴리에틸렌 글리콜 [poly(etylene glycol)]과 폴리프로필렌 글리콜 [poly(propylene glycol)]을 몰 (mol)비로서 1:10 ~ 10:1 범위로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 친수성 폴리우레탄은 테트라히드로퓨란 (THF), 메탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 유기용매에 녹여서 사용하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 신호변환부는 전위차법 (potentiometry), 전압전류법 (voltammetry) 또는 전도도법 (conductometry)을 이용하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 신호변환부는 실리콘 러버 (silicone rubber), 폴리비닐 클로라이드 [poly(vinyl chloride)], 이의 유도체, 방향족 폴리우레탄, 지방족 폴리우레탄 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 바이오센서는 재래식 전극과 고체상 전극으로 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 신호감지부를 구성하는 감응물질을 친수성 폴리우레탄과 혼합하는 것에 더하여, 폴리라이신 (polylysine)을 혼합하여 신호변환부에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
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