CN1142867A - 电化学测量方法和仪器 - Google Patents
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Abstract
采用薄层电化学测量装置，优选毛细填充装置，进行电化学测定水溶液中还原糖含量的方法，其中，该装置的内表面涂有可溶性氧化还原介体，该装置包括能在其内部产生碱性环境的手段。在所优选的方法中，氧化还原介体含有能在饱和溶液中提供铁氰根离子的铁氰化钾和提供过量1-3摩尔氢氧离子的氢氧化锂。本发明还提供了一种在参比电极和工作电极之间具有屏蔽电极的毛细填充装置。
Description
发明领域
本发明涉及进行电化学测量的方法和仪器，且在一个方面涉及水溶液中还原糖含量的电化学测量，可具体用于但并不局限于测量农场青贮饲料液中还原糖的含量。
发明背景
众所周知，青贮饲料必须在特殊的条件下处理和贮存，以便尽可能保持冬季供料中的营养成分。在贮存期间，会发生许多化学变化，因此了解青贮饲料的许多营养参数可能是重要的，例如，迅速地确定青贮饲料何时可以备好使用。还原糖含量是最重量的参数之一。通常在人和动物消耗的食物和饮料以及其它生物液体的生产中，在许多情况下，能很快地确定还原糖含量很有是秀价值的。
回到青贮饲料的话题，已知有一种分析装置，它能测定通过挤压青贮饲料样品而得汁液中的各种营养参数，其中包括游离糖含量。但是，这种装置比较昂贵、复杂，而且有赖于湿化学。在GB 2202637A中描述了这样的装置。
在生物传感器领域，从EP 0170375A中获知有一种毛细填充装置(CFD)。这种通用型装置包括以足够小的间隙隔开的两块板，通过毛吸作用可将液体吸入间隙中。两块板的内表面上带有印刷电极，也可以带有例如通过丝网印刷沉积的试剂层。这种试剂层是充分考虑到被吸进去的液体而选择的，以便进行特定的检验。EP0255291A公开了一种CFD，它包含一种对于待检测的特定糖有特效的氧化酶，例如，用于测定一种液体例如血液样品中葡萄糖浓度的葡萄糖氧化酶。因此该装置对一种特定的糖是有特效的，所以一次只能检测一种特定的糖。
已知利用糖的还原性来测定溶液中糖类的含量，例如涉及铁氰根离子转变成亚铁氰根离子的还原作用。产生的亚铁氰根离子随后用一种简便的方法，例如分光光度法或电化学方法检测，不过一般优选分光光度法(例如当采用亚铁氰根离子体系时，测量溶液黄颜色的减褪)。在传统上，这是在热溶液中有催化剂(如Ni2+，Co2+)存在时，在碱性pH例如pH9～12下进行的。这种方法为用户提供一个结果，通常要花费大约30分钟。
利用糖类的还原性定量地测定糖类也已在酸性pH下进行；不过在这种情况下检测的产物是通过不同的途径使糖水解产生的。总还原糖的测量，通常采用分光光度法，偶而也使用电位测量法测定所产生的还原态反应化合物的浓度，例如亚铁氰根离子的浓度进行的。
利用常规分光光度法测定溶液中还原糖的含量，需要一些试验室装备和训练有素的试验人员。测定溶液中糖类总含量所惯用的方法和技术往往也是既费时费力的。
另一种已知的糖类测定方法是脉冲电流检测法，正如“Triple-PulseAmperometris detection of Carbohydrates after Chromatographic separation”一文所述，该文由Hughes和Johnson发表在Analytica Chimica Acta，149(1983)，1-10中。这一技术包括在工作电极上直接氧化样品中的糖。这种技术非常普遍地用于测定单糖类(如从色谱柱上洗脱样品时分析单糖的例子)，并且是唯一适用于测定相当少量(毫微摩尔级)糖的方法。这种技术也有缺点，它要求对检测装置施加几种不同的电压，因而要求分几个不同的步骤执行该方法。该方法也只适合于在分析试验室使用，而且还需要使用昂贵的设备和配备熟练的操作人员。
提供一种简单的方法和装置，在现场测定水溶液中的糖含量，并与该溶液中存在何种糖无关，这不仅对检测青贮饲料液非常有利，而且对检测与食品和饮料生产有关的各种水溶液也是非常有利的，特别是对测定溶液中还原糖总含量这一目的更为有利。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了一种测定水溶液中还原糖含量的方法，该方法包括在可溶性氧化还原介体存在下，在碱性环境中，使待检测溶液形成一个薄层；并用电化学方法测量氧化还原介体还原产物的数量。
应当指出，这种氧化还原介体，并非对任何一种糖都是有效的，在装置中所发生的反应是非酶反应。然而在有氧化还原剂存在时，为避免糖的水解，碱性环境是必须的。例如，这可利用在介体中包含能产生碱性的可溶性物质，例如可溶性的氢氧化物来实现。另一种方法，碱性环境也可以利用WO 94/15207所公开的技术就地产生。
本方法可在一个薄层电化学测量装置，例如CFD中方便地进行，其内表面敷有至少由一种可溶性氧化还原介体构成的涂层，其中可能含有产生碱性的可溶性物质，例如碱金属氢氧化物。
采用薄层电化学测量装置，可用电位测量法或电量测量法进行测量，在本发明的实际应用中，这两种测量方法都可以采用。在电化学生物传感器领域内，这两种方法是众所周知的，对此不再详述。只不过电位测量法是测量工作电极相对于参比电极的电位变化；而电量测量法是测量工作电极上通过的电荷或电流。
无论采用哪种测量方法，都已发现，离子向工作电极扩散可能对测量的准确度产生不利影响。测量的准确度取决于靠近工作电极的液体体积内所产生的离子计数。被还原离子在工作电极上又重新被有效地氧化，因此，释放电子的总量就表示所要求的测量值。如果上述体积之外的被还原离子扩散进入该体积中并被测量，则该测定值是不正确的。
因此，根据本发明的另一个方面，提供一种电化学测量装置，在其接受流体的内表面上有一个工作电极和一个参比电极，其中在工作电极和参比电极之间有一个屏蔽电极，保持其电位基本上与工作电极的电位相同。
在应用中，屏蔽电极所起的作用，是防止被还原的离子扩散进入测量所依赖的、工作电极附近的液体中去。因此，在这种情况下，根据本发明的第一方面，氧化还原介体的氧化还原对的那些被还原的离了倾向于向工作电极迁移，当这些离子达到屏蔽电极时就被氧化，屏蔽电极连接在与工作电极不同的电路里，因而防止了错误地增加所测量的电压或电流。然而，应当清楚，根据本发明第二方面的屏蔽电极，虽然在根据本发明第一方面的方法中是特别有用的，但并不限于在本方法中使用，还可在其它方法和其它用途所采用的薄层电化学测量装置中使用。
本发明的第一方面与采用薄层电化学传感器测量水溶液中，例如青贮饲料液中还原糖的含量密切相关。毛细填充装置(CFD)是一种优选的薄层电化学传感器。
CFDs包含两块板，如陶瓷、玻璃或塑料，板间隔开的间隙很小。在一块板的内表面上，沉积一个参比电极，在此表面上还有一个与它隔开的工作电极。工作电极保持相当高的电位。在另一块板的内表面上，可以用丝网印刷印上适合于液体样品中待检测物质的试剂层。当该装置在使用时，电极上的炭质接触垫片能把测量传感器连接在测量电路中，以检测工作电极上相对于参比电极的电压或电流。这种形式的CFDs本身已为人们所知，例如在EP 170375 A中已经公开，并且已被应用于各种目的，例如测量pH值、测量血液和血浆样品中的葡萄糖含量、测量乳酸浓度以及测量磷酸盐或硝酸盐浓度。在测量血液样品中的葡萄糖含量时，所依赖的化学过程是葡萄糖与大量过量存在的铁氰化物的反应，该反应由葡萄糖氧化酶催化。该反应所产生的亚铁氰化物通过监测反电极和工作电极之间的电流测定。
然而，在上述所有情况下，所进行的检测都是对一个相当简单的样品中的单一物质进行的，所用的试剂通常是被检测物质专用的一种酶。
相反，本发明提出在碱性环境中使用一种氧化还原介体形式的试剂，目的在于测定含有多种糖类的水溶液中还原糖的总含量。例如青贮饲料液，虽然通常主要含有葡萄糖和果糖，但也可能会含有其它糖类，例如木糖和阿拉伯糖。
本发明中所用的氧化还原介体要求符合许多标准，其中的大部分标准，根据氧化还原介体以前在酶催化系统中的用法，通常是它知的。在CFD的情况下，为了实施本发明，连同其他必须的标准一道，氧化还原介体能迅速地溶解、与被分析物反应快、能生成氧化还原对，该氧化还原对能与适合在CFD中实际应用的工作电极发生迅速而可逆的电化学反应。虽然六胺化钌作为氧化还原介体是有可能的，但铁氰根离子更便宜，并已证实可用在CFD中检测血液样品。
因此，在本发明的一个优选实例中，氧化还原剂是铁氰根离子，其存在量，以溶解时能形成基本上饱和的溶液(约1摩尔)为优选量，氢氧化锂是一种优选的产生碱性的物质，其使用浓度为1～3摩尔，优选浓度约为2.5摩尔，不过任何其它的碱金属氢氧化物，如氢氧化钠也可以使用。如果合适的话，可以向氧化还原剂和产生碱性的物质中加入一种适宜的粘合剂。
在此应当清楚，人们已经知道利用铁氰根离子和氢氧化钠作试剂的氧化还原反应，以烧杯规模测定水溶液中糖类的含量。然而，通常必须将温度提高到约80℃以促进所需的反应，即使这样，完成测定也需要大约30分钟。通过检测亚铁氰化物的生成量进行分析。这通常是用分光光度法测定的。
然而，值得提出的是，在本发明中这种方法可在CFD中于室温下进行，一般大约在1分钟内完成测定，总是少于2分钟。
发生的正常反应是果糖的催化氧化作用，例如，与铁氰化物在碱性条件下的反应是：
虽然发生反应的机理尚不十分清楚，但由于在本发明的方法中采用了薄层电化学传感器，所需要的反应不仅在室温下进行得非常快，而且释放出的电子比预期的多得多。在CFD有限的空间里，大量过量或高浓度的铁氰根离子和碱与薄层样品迅速的反应动力学，对加强所发生的反应起重要作用是可能的。试验似乎表明，当有高浓度的糖类存在时，反应速率明显变慢，因而铁氰根和氢氧离子的浓度相对地较低。因此，该方法看来最适合于糖浓度为0-25mM的溶液。这样的浓度常见于青贮饲料液和许多其它生物体液中。
本发明方法的另一个预想不到的优点是可以“调节”定量测定还原糖的电化学反应的灵敏度，这取决于在待检测样品中还原糖的浓度。例如，如果在待检测溶液中含有较大量的还原糖，则可在产生碱性物质的浓度较低的条件下进行测定。当样品中还原糖的浓度足够高时，在薄层测量装置中所用的产生碱性的物质的浓度甚至可以低于1摩尔。与此相反，如果预料样品中还原糖的含量较低时，则可以在产生碱性的物质的浓度比较高(例如4-5摩尔)的条件下进行测定，因而，对于样品中给定量的还原糖，可产生较大的电流。在测定较大量的糖时，电测量值不得“超出刻度”，作为代替，可在产生碱性的物质浓度较低的条件下进行测定。因此，本发明的优点是，可以用来分析所含还原糖的浓度范围比以前更宽的样品。
本方法另外的优点是，如果用一种已知的方法把样品中的非还原糖转变成还原糖，本方法就可以用来测定水溶液中的总糖量。这一转化可以当作预处理而方便地进行。例如，适宜的预处理可以包括例如采用合适的酶，把非还原糖类转化成还原糖类。这样的方法容易被本领域的技术人员熟悉。
然后，可按上述方法测定样品中还原糖的含量。
虽然该装置中流体样品薄层的厚度并不是关键性的，但当CFD两板之间的间距小于1mm、优选小于0.5mm、最优选0.1～0.2mm时，上述反应似乎被加强。该反应体系的动力学在CFD中无论如何都是很快的，而且当流体层的厚度减小时，还可以进一步加快。
在薄层电化学装置中电极材料的选择也是重量的。对参比电极的主要要求是，它对被分析物应当尽可能不敏感。在本发明中，优选的参比电极是银/氯化银电极。另一方面，为了恢复氧化还原对，工作电极对被分析物必须是高度敏感的。在本发明中，优选采用碳或金参比电极，最优选的是金电极。当使用屏蔽电极时，其材料优选与工作电极的材料相同。
对于许多种含有还原糖的水溶液，上述的CFD已被成功地用于实施本发明的方法。然而，业已发现，当要求做准确的定量测定时，该装置对不同类型糖的灵敏度会有些变化。虽然对单糖类和二糖类很敏感，但对某些糖类例如对蔗糖的灵敏度，在定量测定上比对其它还原糖如葡萄糖和果糖的灵敏度小。然而，对于许多种含糖的水溶液，例如主要含葡萄糖和果糖的青贮饲料液，本方法能给出准确的结果，并首次提供了易于使用的CFD，它可在室温下，于短时间内测定出还原糖的总含量，使其适合于在现场使用，例如在农场就地使用。而且相信，增强传感器灵敏度的深入开发研究，将会产生一种方法和装置，完全能够测定许多其它领域产生的水溶液中还原糖的总含量。
例如，进一步设想的用途是测定蔬菜和水果的成熟度。这会涉及到测定从水果和蔬菜样品榨出的液体中还原糖类的含量。实施方案的说明
通过实施例给出的实用方法和装置的如下说明，本发明的其他特点将是显而易见的。在附图中：
图1是为电量测量法设计的毛吸填充装置(CFD)的说明图；
图2是电量测量法CFD的测量电路；
图3是为电位测量法设计的CFD的说明图；
图4是电位测量法CFD的测量电路；
图5是在CFD中电荷对使用屏蔽电极时间的说明图；
图6是果糖在电压扫描试验CFD中，电流对电位的伏安响应曲线；
图7是在试验CFD中得到的果糖浓度对总电荷的曲线(没有氧化还原对)；
图8是在载有氧化还原介体的试验CFD中，改变果糖浓度得到的总电荷对时间的曲线图；
图9-11是表示对于不同的糖类，采用实用CFD所得测量结果的电荷对浓度图；果糖(图9)，葡萄糖(图10)和半乳糖(图11)；
图12是表示在实用CFD中对青贮饲料液所得结果的电荷对糖浓度曲线图；
图13是强制对流池的示意图；
图14-16表示采用强制对流池所得到的各种试验结果的曲线。
附图详述
毛细填充装置(CFD)包括两块板，它们由约0.2mm的小间隙隔开。因而液体样品可通过毛细作用被吸入两块板之间的空隙。如图1所示，一块板10为10mm×20mm，由陶瓷材料制成，在其上面沉积一个电极，电极配置适合于测量的方法，在这种情况下为电量测量法。第一，外边的电极12是银/氯化银参比电极，第二，里边的电极14是金的工作电极(尽管可用碳替换)，第三，中间的电极16是屏蔽电极，优选与工作电极相同的材料。这些电极全是8μm厚，是采用常规的丝网印刷技术沉积的。电极14和16由约150μm的间隙隔开。通过绝缘层20延伸的导线18分别把这些电极连接到相应的接点或终端垫片22上。图2所示的部分测量电路形成的传感器，能够检测在工作电极14上通过的电荷或电流。
图2所示的电量测量法电路是一目了然的，因而不再详述。简要地说，它在参比电极上建立并保持稳定的参比电位；收集流过工作电极的电流并将其转化成模拟测量信号；保持屏蔽电极与工作电极处于相同的电位，防止有任何电流从屏蔽电极泄漏进入测量信号。最终的测量信号由A/D转换器接收，并将数字信息输给由软件控制的信息处理器，计算在给定期间内在工作电极上流动的总电流，结果可显示在液晶显示器上。
为了完整起见，图3示出了一个为简易的电位测量法而设计的CFD。氯化银参比电极编号为24，碳或金氧化还原工作电极编号为26。绝缘层20桥接这两个电极。未表示出屏蔽电极。然而，为了实施本发明，可优选一个屏蔽电极，在这种情况下，可用陶瓷板附带一个与图1中相似的电极结构层。电位测量电路示于图4，它起着电压跟随器的作用，测量在给定期间在工作电极上发生的总电压变化。
除了配备屏蔽电极以外，图1-4的配置都是常规的，屏蔽电极构成了本发明的第二个重要方面，下文还会提到。特别是在图1所示的电极配置方式下，可以采用圆形同心电极层代替矩形电极层。
对丝网印刷的试剂层28，还没有参考文献介绍，在图1和图3配置的情况下，被配置在CFD的另一块板30(玻璃或聚碳酸酯)上。在本发明中，该试剂层是一种加入了能产生碱性物质例如加入碱金属氢氧化物、特别是氢氧化锂的氧化还原介体，然而也可采用其它的碱金属氢氧化物或更普通的金属氢氧化物代替。对于实际应用，为了制成丝网印刷的油墨，借助聚合物溶剂例如PVC、醋酸酯或纤维素来携带氧化还原介体。有时氧化还原介体可沉积在电极板上而不是所示对面的板上，或者是局部地附着在两块板上。
氧化还原介体是根据在CFD中待检测的氧化/还原反应选择的，也考虑到其氧化还原对在工作电极上的可逆性，在这种情况下，工作电极是金电极。因此，在本发明中，优选的氧化还原介体是一种能很快地溶解于含糖水溶液中，又能很快地被溶液中的还原糖还原且能在金电极上迅速逆转的物质。因此，所选择的氧化还原介体是铁氰化钾形式的铁氰根离子。
试剂层按一定的面积和厚度沉积，这样，当样品液体通过毛细作用被吸入两板之间的空隙时，它能使尽可能大量的铁氰根和氢氧离子很快地进入该系统。过量的氢氧化锂可能对铁氰化物的溶解度有不利影响，因此优选的试剂层包含2.5M LiOH和1M K3Fe(CN)6。大量减少氢氧离子的数量对该体系的反应活性有不利影响，所以氢氧化物和铁氰根离子的数量平衡必须综合考虑。
现在来解释在CFD中屏蔽电极的重要性。
首先必须理解，当电量测量法CFD在工作时，例如对含有还原糖的样品，采用铁氰根离子作氧化还原介体，总电流是根据亚铁氰根离子(已被糖还原)重新氧化时，在工作电极上释放的电子测量的。
待测的总电流是由样品液与工作电极共同扩展的体积产生的。根据薄层电化学测定装置如CFD的特性，发现铁氰根离子还原成亚铁氰根离子及其随之发生的重新氧化作用进行得相当快，所以在经过短暂的时间之后，电流对时间描绘的曲线应逐渐形成一个电流平稳的区段。然而，如果采用没有屏蔽电极的电量测量法进行测量，由于被还原的离子通过侧向扩散从外部进入与工作电极共同扩展的体积，就不能出现这个稳定的区段。因而所要求的测定可能是错误的。
但是当采用屏蔽电极时，从外部扩散进入该体积的被还原离子在到达工作电极之前便被重新氧化，因而在电流-时间曲线上出现了所预期的总电流稳定的区段。图5示出了在电量测量法的CFD中采用屏蔽电极的影响，图中虚线是没有屏蔽电极时传感器的响应曲线，实线则是有屏蔽电极时传感器的响应曲线。这些曲线是在采用15mM葡萄糖溶液，用葡萄糖氧化酶试剂、铁氰化钾和pH7的磷酸盐缓冲剂时使用葡萄糖传感器得到的。采用电位测量法的CFD测定，会出现类似的结果。
采用没有试剂层的CFDs做重复性的试验检验比采用装备完全的CFDs更容易，以这种方式进行了许多次试验，在试验时必须向CFD中加入铁氰根离子，氢氧离子和含糖的样品，可用移液管等加入。这些试验考查了改变该体系的有关参数所产生的影响，如不同的铁氰根和氢氧离子浓度、不同的氢氧离子来源，不同的糖类和不同的糖浓度，以及在工作电极上不同的工作电压。随后，考查了一些备好的实用CFDs，并将所得的结果与在空的CFD试验期间所得的最佳结果进行了比较。现在简要地叙述一下这些有意义的试验结果。
在理论上，利用氧化还原电位变化测定的响应电位应由Nernst方程决定。
E＝E°+RT/nF ln[Mox]/[Mred]
在该方程中，E是响应电位，E°是标准电极电位(V)，R是气体常数8.13(Kjmol-1K-2)，T是Kelvin温度，n是转化每摩尔氧化态物质的摩尔数，F是Faraday因数(-96500 Cmol-1)，有效常数，及[Mox][Mred]分别为物质M氧化态和还原态的浓度。
因此，根据这一原理工作的任何装置的响应电位都应当是对数性的。例如，基于电量测量法检测的传感器应当给出线性的响应特性曲线。
在实践中，一些采用在CFD中装有400mM果糖和1M氢氧化钠的循环伏安法的试验结果作表明，随着全工作电极上工作电压的变化，在200～300毫伏处出现氧化作用的高峰。实际上，由于金电极可能的结晶取向，在此范围内有双峰活化作用，但这是不明显的。在100mM～5 M内，改变氢氧化钠浓度进行同样的试验，对氢氧化钾和氢氧化锂也做类似的试验。这些试验结果似乎表明，工作电极优选的工作电压为100～400mv，优选约300mV。当使用屏蔽电极时，同样的电压似乎也适合于该电极。图6表示出在这些试验中对果糖得到的伏安法响应曲线。条件是：1M NaNO3，V＝100mVS-1，饱和氮的400mN果糖(反应时间30秒钟)。扫描电位为-700mv～700mv。反电极是一个金片，直径1.6mm，参比电极为Ag/AgCl。给出了对1M LiOH，1M NaOH和1M KOH的曲线。对其它糖类也得到了类似的结果。
线性的伏安法试验表明，工作电极上电压峰值的位置和幅度，可能在一定程度上随果糖的浓度不同而变化，可能是由于对参比电极电位的影响，但从后来的试验看，这些变化是不明显的。
第三，还进行了试验，试图在氢氧化钠的存在下，在工作电极上直接氧化果糖，但没有得到任何有效的结果。
然后，把一些测试扩大为试验，在这些试验中，也把氧化还原介体、铁氰根离子与糖和氢氧离子合并起来加入空的CFD中。
结果表明，正如根据理论所推断的，对果糖的浓度为0～50mM，得到了总电荷(在电量测量法的CFD中)随果糖浓度变化的线性响应曲线。图7示出了相应的电量测量法的响应曲线。条件是10μl果糖溶液+40μl(1K3Fe(CN)6，2.5M Lion)，反应时间60秒，电位300mV。
第二系列试验补充了以前的结果，优选的工作电极电压为100～400mv。
第三系列试验考查了在CFD中也加入铁氰根和氢氧离子时，果糖的浓度变化对测得的总电荷的影响。图8的曲线表示在空的CFDs中，果糖的电量测量法响应曲线对反应时间的影响。条件是10μl果糖溶液+40μl(2.5M LiOH 1MK3Fe(CN)6)。工作电位是300mV。在理想情况下，这些曲线应当基本上是平的，但结果表明，在果糖浓度大约50mM以上产生许多影响，影响了测得的总电荷。浓度在100mM以上，测定的总电荷会出现降低。深入研究所发生的这些影响的原因是不必要的，但果糖在银参比电极上的吸附作用以及随之发生的参比
电极电位的变化是值得注意的。
更重要的是，图8的曲线证明了本发明的方法利用CFD传感器的潜在用途。总电荷的水平非常高，易于测定，比在烧杯里进行的化学反应的总电荷大得多，但在室温下反应时间很短，不超过2分钟。本发明的方法是非常实用的，特别是对测定0～25mM糖浓度，但也可能高达50mM，而这一浓度范围常见于许多包括青贮饲料液的生物液体。
一些实用的CFD一般与图1一致，带有含铁氰根和氢氧离子的试剂层，通过对一系列的标准糖溶液和试验糖溶液做电化学测量，对它们做了进一步地考查。现在对这些考查结果进行简要的讨论。
利用稀释法制备了葡萄糖、果糖和半乳糖等糖类的原料液，在100ml水中加9g糖。取等分的原料液样品，加水稀释到适当的体积，配制浓度为1.5、3.12、6.25、12.5、25和50mmol/l的标准溶液。
取20微升的糖溶液加入一个新的CFD中，CFD的内表面带有一个试剂层，在其PVC基质中含33％氢氧化锂和67％铁氰化物，该试剂层(在以所应用的水溶液样品稀释之后)使溶液相对于铁氰化物达到饱和(即浓度约1摩尔)，而氢氧化锂浓度约为3～5摩尔。
使溶液在CFD中平衡大约1分钟。然后使用一台M270 EG&G稳压器，采用控制电位电量测量法测定亚铁氰化物的浓度。试验结果如表1所示，并用图解法表示在图9-11中。
对于图9，电荷＝1.30，浓度+3.83，修正＝99.8
对于图10，电荷＝1.63，浓度+3.13，修正＝99.9
对于图11，电荷＝1.67，浓度+3.07，修正＝99.9
表1
糖溶液浓度 测得的电荷，mC
(mmol/L) 果糖 葡萄糖 半乳糖
50 68 71 57
25 38 44 45
12.5 21 24 24
6.25 12 13 13
3.12 7 8 8
1.5 5 5 5
0 3 3 3
标定之后，在与进行标定试验所用的同样的CFD中，按照与上述方法相同的试验方案分析已知还原糖总浓度(由常规方法测定的)的青贮饲料液等分样品。这些结果列于表2，并用图解法表示在图12中。
对于图12，电荷＝1.78，浓度+17.65，修正＝95％。
表2
还原糖的总浓度 测得的电荷
(mmol/L) (mc)
1 19
5 23.5
7 36
12 38
24 55
28 72
表2和图12的结果特别表明，本发明的方法采用CFD能够定量地测定含有糖类混合物水溶液中还原糖的含量，并具有满意的准确度。
进一步的实验工作是用强制对流池(FCC)进行的，如图13所示，强制对流池是CFD的一个合格的试验室等效装置。
该池包括容器50，用于容纳检测溶液52，其中插入银/氯化银双接点参比电极54和板56，板上带有印刷的金电极58。强制混合溶液并测定两个电极间的△E。
用电位测量电路代替电量测量电路进行了进一步的研究。在实践中，通过GPIB卡把一台keithley静电计与Lotus measure接口而获取数据。
图14、15和16表示，在采用图13所示的FCC时，向含有铁氰化物和氢氧化锂(在工作体积下分别为0.25M和2M)的混合物中加入含果糖的溶液时的电位测量响应曲线。对下列不同的果糖浓度绘出了图14和15中的曲线：
□ 0.016M
+ 0.031M
◇ 0.062M
△ 0.125M
× 0.25M
0.5M
图15所示为图14的曲线放大的一部分。在向含有氢氧化锂的溶液中加入铁氰化物时，该体系的电极化作用迅速逆转，在图14中表现为负值。正如这些图中所表示，加入含果糖的溶液，电位开始逆转(变得更正)。在果糖浓度大于0.12M时，达到原来的电极化作用；对所有大于0.125M的果糖浓度，电位变成正值。在正负电位之间的转变点上，溶液的颜色发生了变化，从黄色，即含有铁氰化物(氧化型)溶液的颜色，变为透明，即亚铁氰化物(还原型)溶液的颜色，这一行为就是果糖被铁氰化物按(近似)化学计量氧化的证据。描述铁氰化物还原作用的方程式是众所周知的，其方程为：
氧化1摩尔果糖需要2摩尔铁氰化物的认识，得到了如下事实的支持：葡萄糖和另一种已糖被铁氰化物氧化，也有同样的化学计量关系存在。
为了完全氧化以最高浓度0.5M存在的果糖，必须采用浓度为1M的铁氰化物。这是铁氰化物溶解度的极限。不过，尽管在检测中使用1M铁氰化物是不实际的，因为需要保持溶液组分的分离，但在CFD中支持使用1M铁氰化物。
利用干的盐类印刷层，盐中含有铁氰化物，在葡萄糖CFD中，照惯例，铁氰化物浓度可达到1M，这起初是为监测血液中的葡萄糖开发的，由依赖胰岛素的糖尿病患者使用。
尽管有上述的限制，要说明电位响应与果糖浓度之间的关系符合Nernst方程是可能的。对图14和15所列举的每一次检测，图16都给出了电位响应V·log[果糖]关系。在每一种情况下都是在加入果糖后50秒钟，在电极的极化作用反向之前测取电位值的。图16的斜率约为0.067E/log[M]。
最后一个问题是当采用KOH，NaOH和LiOH时，特别是采用后两者时在检测中出现的。虽然氢氧化锂不如氢氧化钠活泼，但吸湿性小，在总糖传感器的实际应用中，例如在现场测定青贮饲料的糖含量时，氢氧化锂的储存问题较少，不过在密封的条件下带干燥剂储存仍然是必要的。在装置内就地产生碱性环境，例如采用在WO94/15207中所公开的技术，具有克服储存问题的优点，该问题是由于碱性盐类具有不稳定性引起的。
Claims (23)
1.一种测定水溶液中还原糖含量的方法，该方法包括在碱性环境中和在可溶性氧化还原介体的存在下，使待检测溶液形成一个薄层；并应用电化学方法测定氧化还原介体还原产物的量。
2.根据权利要求1的方法，其中氧化还原介体包含铁氰化物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中该介体的含量足以形成饱和溶液。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中该薄层的厚度小于约1mm。
5.根据权利要求4的方法，其中该薄层的厚度小于约0.5mm。
6.根据权利要求5的方法，其中该薄层的厚度小于约0.2mm。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中碱性环境由产生碱性的可溶性物质形成。
8.根据权利要求7的方法，其中可产生碱性的可溶性物质包含一种碱金属氢氧化物。优选氢氧化钠或氢氧化锂。
9.根据权利要求8的方法，其中氢氧化物的浓度至少约为1摩尔。
10.根据权利要求9的方法，其中氢氧化物的浓度不大于约5摩尔。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该水溶液包含青贮饲料液样品。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，该溶液中还原糖的含量不大于约50毫摩尔，优选0-25毫摩尔。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，该方法在薄层电化学测量装置中进行，其内表面上至少有一种可溶性的氧化还原介体的涂层，该装置包括可产生碱性环境的手段。
14.根据权利要求13的方法，其中可溶性的氧化还原介体包含一种可产生碱性的可溶性物质。
15.根据权利要求14的方法，其中可产生碱性的可溶性物质包含一种碱金属氢氧化物，优选氢氧化钠或氢氧化锂。
16.根据权利要求13-15中任一项的方法，其中薄层电化学测量装置至少有一个工作电极和一个参比电极，该装置适合于保持一薄层水溶液样品来桥接正在使用的电极。
17.根据权利要求13-16中任一项的方法，其中薄层电化学测量装置包括毛细填充装置。
18.一种电化学测量装置，在该装置接受流体的内表面上有一个工作电极和一个参比电极，其中在工作电极和参比电极之间有一个屏蔽电极，该屏蔽电极的电位基本上保持与工作电极的电位相同。
19.根据权利要求18的电化学测量装置，其中接受流体的装置包含一对基本上平行的板。
20.根据权利要求19的电化学测量装置，其中基本上平行的两块板间相隔的间距约为1mm或更小。
21.根据权利要求20的电化学测量装置，其中基本上平行的两块板间相隔的间距约为0.2mm或更小。
22.根据权利要求18-21中任一项的电化学测量装置，其中三个电极是同心排列的。
23.根据权利要求1-17中任一项的方法，该方法在如权利要求18-22中任一项的电化学测量装置中进行。
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