JP2023120217A - 質量分析とインタフェースするマイクロ流体システムのためのソフトウェア - Google Patents
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Abstract
【課題】質量分析とインタフェースするマイクロ流体システムのためのソフトウェアの提供。【解決手段】エレクトロスプレーイオン化質量分析計(ESI-MS)データの品質を向上させるための方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアについて記載され、化学分離データと質量分析データとの間の相関の向上を達成するための方法、デバイス、及び、システムについても記載される。開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、プロテオミクス研究、創薬及び開発、並びに、臨床診断を含むがこれらに限定されない様々な分野において潜在的な用途を有する。【選択図】図1
Description
相互参照
この出願は、2018年5月31日に出願された米国仮出願第62/678,265号及び2018年6月12日に出願された米国仮出願第62/684,090号の利益を主張し、これらの出願はいずれも参照により本願に組み入れられる。
この出願は、2018年5月31日に出願された米国仮出願第62/678,265号及び2018年6月12日に出願された米国仮出願第62/684,090号の利益を主張し、これらの出願はいずれも参照により本願に組み入れられる。
本開示は、化学分析の分野、特に、混合物中の検体の分離及びそれらのその後の質量分析(MS)による分析に関する。検体の固有の品質に基づいて、より複雑な検体混合物から検体成分を分離するとともに、その品質の状態に関して濃縮される画分のセットを提供することは、分析化学の重要な部分である。このようにして複雑な混合物を単純化すると、ダウンストリーム分析の複雑さが軽減される。しかしながら、既知の濃縮方法及び/又は分析機器を伴うデバイス及び/又は技術をインタフェースしようとする際に問題が生じ得る。
例えば、タンパク質サンプル調製技術と質量分析計などのダウンストリーム検出システムとをインタフェースするために様々な方法が使用されてきた。一般的な方法は、液体クロマトグラフィを使用してサンプルを調製して、質量分析(LC-MS)のための画分を収集することである。これは、タンパク質サンプルをペプチド断片へと消化する必要があるという欠点を有し、それにより、分析されなければならない多数のサンプル画分と、実行後の複雑なデータ再構成とがもたらされる。特定の形態の液体クロマトグラフィ、例えばペプチドマップ逆相クロマトグラフィを質量分析計に結合できるが、これらの既知の技術は、無傷のタンパク質ではなく、ペプチド断片を使用することに限られ、そのため、それらの有用性が限られる。
サンプルを質量分析計に導入する他の方法は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)である。ESIでは、サンプル及び溶液の小さな液滴が、キャピラリーチップ又はエミッタチップと質量分析計のソースプレートとの間の電界の印加によって、エミッタチップ又はオリフィスなどのエレクトロスプレー機能を備えるキャピラリー又はマイクロ流体デバイスの先端から放出される。液滴は、この誘導電界内で伸長及び膨張し、蒸発して更なる分離及び検出のために質量分析計に導入される気相イオンを生成する益々小さい液滴を含む円錐形状の放出(すなわち、「テイラーコーン」)を形成する。一般に、エミッタチップは、ESIにとって都合の良い液滴量をもたらすキャピラリーから形成される。しかしながら、キャピラリーは、多段サンプル処理を許可しない直線状の流路に限られる。また、ESIは、分析の全体にわたって一定のままとなるべくESIチップにおける電圧にも依存し、これは、内部流体抵抗が経時的に変化する可能性があり、それにより、電気回路の様々な部分で電圧降下が変化し、その結果、ESIチップの電圧が変化する、多くの分析において課題となり得る。
マイクロ流体デバイスに関して他の研究が進められてきた。マイクロ流体デバイスは、様々な既知の技術によって製造可能であり、異なる流体操作を実行するように設計されるチャネルネットワークを構成できる所定の寸法の流体チャネルをもたらす。これらのデバイスは、キャピラリーよりも付加的な制御レベル及び複雑さをもたらし、そのため、サンプル調製にとってより良い選択となる。しかしながら、キャピラリーと同様に、これらのツールは、もしあれば、質量分析計への導入前に分離された検体画分の特性評価を制限することが多い。また、キャピラリーデバイス又はマイクロ流体デバイスを伴うシステムは、一般に、動作中にテイラーコーンを再確立するべくシステムを較正するためのツールをもたらさない。
エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)データの品質を向上させるための方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアについて記載し、化学分離データと質量分析データとの間の相関のより定量的な特性評価及び前記相関の向上を実現するための方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアについても記載する。
本明細書中には、分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化(ESI)チップをグランドに対して一定の電圧に維持するための方法であって、a)分離チャネルの基端部に第1の電圧を印加するステップであって、分離チャネルの先端部がESIチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、b)補助流体チャネルの基端部に第2の電圧を印加するステップであって、補助流体チャネルの先端部が分離チャネルの先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、c)分離反応を実行して検体の混合物を分離するステップであって、分離反応が分離チャネル内で行われる、ステップと、d)分離チャネルの抵抗の変化又はESIチップにおける電圧の変化をフィードバックループで監視するステップであって、フィードバックループが、分離チャネルの全体にわたる一定の電圧降下とESIチップにおける一定の電圧とを維持するように第1及び第2の電圧を調整する、ステップと、を含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、分離チャネルがキャピラリーのルーメンである。幾つかの実施形態では、キャピラリーがマイクロバイアルスプレーチップを備える。幾つかの実施形態では、分離チャネルがマイクロ流体デバイス内の流体チャネルである。幾つかの実施形態では、分離反応が等電点電気泳動反応を含む。幾つかの実施形態では、分離反応が電気泳動分離反応である。幾つかの実施形態では、第1の電圧がカソードに印加され、第2の電圧がアノードに印加される。幾つかの実施形態では、ESIチップにおける電圧がグランドに保持される。幾つかの実施形態では、ESIチップにおける電圧が第2の電圧に保持される。幾つかの実施形態において、第1及び第2の電圧を調整するステップは、第1の電圧及び第2の電圧からESIチップで測定される過渡電圧変化を差し引くステップを含む。幾つかの実施形態において、ESIチップにおける電圧は、第1の電圧又は第2の電圧を与える電源を使用して測定される。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも10Hzの周波数で動作する。幾つかの実施形態では、フィードバックループがESIチップにおける電圧を予め設定された値の±10%以内に維持する。幾つかの実施形態では、フィードバックループがESIチップにおける電圧を予め設定された値の±1%以内に維持する。幾つかの実施形態では、フィードバックループが分離チャネルの全体にわたる電圧降下を予め設定された値の±10%以内に維持する。幾つかの実施形態では、フィードバックループが分離チャネルの全体にわたる電圧降下を予め設定された値の±1%以内に維持する。
本明細書中には、a)2つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、b)2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するためにサンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、c)流体チャネル出口に向かう流体チャネルの内容物の動員時に検体ピークの速度を計算するステップと、d)検体ピークの速度を使用して、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間を決定するステップとを含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、流体チャネルがキャピラリーのルーメンである。幾つかの実施形態では、流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である。幾つかの実施形態において、分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく。幾つかの実施形態において、検体ピークの速度は、検体ピークが第1の位置から第2の位置に移動するのに必要な時間間隔から計算される。幾つかの実施形態において、第1の位置、第2の位置、及び、時間間隔は、流体チャネルの一連の2つ以上の画像から決定される。幾つかの実施形態において、一連の2つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む。幾つかの実施形態では、流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える。幾つかの実施形態において、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間は、質量分析計データを検体ピークと相関させるために使用される。幾つかの実施形態において、流体チャネルの内容物の動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む。幾つかの実施形態において、2つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される。幾つかの実施形態では、検体ピークの分離又は動員のための制御パラメータを調整するために検体ピークの速度がフィードバックループで使用される。幾つかの実施形態では、制御パラメータが電圧である。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する。
本明細書中には、a)2つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、b)2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するためにサンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、c)質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを介して流体チャネルから放出される2つ以上の個々の検体ピークに関して質量分析計データを収集するステップであって、質量分析計のためのデータ収集モードが高質量走査と低質量走査との間で交互に行われる、ステップとを含む方法が開示される。幾つかの実施形態において、質量分析計は、少なくとも0.5Hzの周波数において、高質量走査データ収集モードと低質量走査データ収集モードとの間で切り換えられる。幾つかの実施形態では、流体チャネルがキャピラリーのルーメンである。幾つかの実施形態では、流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である。幾つかの実施形態において、分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく。幾つかの実施形態では、高質量走査が生体高分子に関する質量スペクトルデータを捕捉する。幾つかの実施形態において、生体高分子は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、核酸分子、還元タンパク質、融合タンパク質、タンパク質複合体、又は、これらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、高質量走査に関するm/z比が1500~6000の範囲である。幾つかの実施形態において、低質量走査は、等電点電気泳動分離を実行する際に使用される液相両性電解質に関する質量スペクトルデータを捕捉する。幾つかの実施形態では、低質量走査に関するm/z比が150~1500の範囲である。幾つかの実施形態では、高質量走査で特定される生体高分子に関する等電点(pI)を較正するために1つ以上の液相両性電解質の質量スペクトルが使用される。
本明細書中には、a)サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップであって、サンプルが2つ以上の検体の混合物を含み、分離が2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解する、ステップと、b)流体チャネルの内容物を流体チャネル出口に向けて動員するステップであって、流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、ステップと、c)(i)(a)及び(b)の最中に検体ピークの位置を監視するために流体チャネルの少なくとも一部を同時に又は交互に撮像するとともに、(ii)エレクトロスプレー性能を監視するために流体チャネル出口と質量分析計への入口との間から流出するテイラーコーンを同時に又は交互に撮像するステップとを含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、検体ピークに関する速度を計算するために流体チャネルの少なくとも一部の2つ以上の画像における検体ピークの位置が使用される。幾つかの実施形態では、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間を決定するために検体ピークの速度が使用される。幾つかの実施形態において、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間は、質量分析計データを検体ピークと相関させるために使用される。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレー性能を調整するためにテイラーコーンの撮像から得られるデータがフィードバックループで使用される。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する。幾つかの実施形態では、流体チャネルがキャピラリーのルーメンである。幾つかの実施形態では、流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である。幾つかの実施形態において、分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく。幾つかの実施形態において、撮像は、紫外光吸収撮像、可視光吸収撮像、又は、蛍光撮像を含む。幾つかの実施形態において、流体チャネルの内容物の動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む。幾つかの実施形態において、2つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む。
本明細書中には、分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化(ESI)チップをグランドに対して一定の電圧に維持するためのコンピュータ実装方法であって、a)プロセッサを使用して、ESIチップにおける電圧の第1の測定値を受信するステップであって、分離チャネルの先端部がESIチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、b)プロセッサを使用して、ESIチップにおける電圧の第2の測定値を受信するステップと、c)プロセッサを使用して第2の測定値と第1の測定値とを比較するステップであって、第2の測定値が第1の測定値と異なる場合には、プロセッサにより、分離チャネルの基端部における電圧と、分離チャネルの先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある先端部を備える補助流体チャネルの基端部における電圧とが、ESIチップにおける電圧が第1の測定値に戻されるように調整される、ステップと、d)特定の周波数でステップ(a)~(c)を繰り返すステップとを含むコンピュータ実装方法が開示される。幾つかの実施形態では、分離チャネルがキャピラリーのルーメン又はマイクロ流体デバイス内の流体チャネルを備える。幾つかの実施形態では、分離反応が等電点電気泳動反応を含む。幾つかの実施形態では、分離反応が電気泳動分離反応である。幾つかの実施形態では、ESIチップにおける電圧がグランドに保持される。幾つかの実施形態では、特定の周波数が少なくとも1Hzである。幾つかの実施形態では、ESIチップにおける電圧が特定の値の±5%以内に維持される。
本明細書中には、a)プロセッサを使用して、キャピラリー内又はマイクロ流体デバイス内の分離チャネルの全部又は一部を撮像するように構成される検出器を使用して取得される2つ以上の画像を含む画像データを受信するステップと、b)同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して画像データを処理し、2つ以上の画像内における分離チャネル内の検体ピークの位置を決定するステップと、c)同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用し、2つ以上の画像内における検体ピークの位置と、2つ以上の画像の取得間の既知の時間間隔とに基づいて、検体ピークの速度を計算する、ステップと、d)同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して、検体ピークが分離チャネル出口に到達する時間を決定するステップとを含むコンピュータ実装方法が開示される。幾つかの実施形態では、分離チャネル内で実行される分離反応が、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)を含む。幾つかの実施形態において、2つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む。幾つかの実施形態において、分離チャネル出口は、質量分析計とのエレクトロスプ
レーインタフェースと流体連通している又は質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える。幾つかの実施形態において、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間は、質量分析計データを検体ピークと相関させるために使用される。幾つかの実施形態において、検体は、混合物から分離されるとともに、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝物分子、又は、小有機化合物を含む。幾つかの実施形態では、生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される。幾つかの実施形態では、分離チャネル内で実行される分離反応のための制御パラメータを調整するために検体ピークの速度がフィードバックループで使用される。幾つかの実施形態では、制御パラメータが電圧である。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する。
レーインタフェースと流体連通している又は質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える。幾つかの実施形態において、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間は、質量分析計データを検体ピークと相関させるために使用される。幾つかの実施形態において、検体は、混合物から分離されるとともに、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝物分子、又は、小有機化合物を含む。幾つかの実施形態では、生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される。幾つかの実施形態では、分離チャネル内で実行される分離反応のための制御パラメータを調整するために検体ピークの速度がフィードバックループで使用される。幾つかの実施形態では、制御パラメータが電圧である。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する。
参照による組み入れ
この明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び、特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、又は、特許出願が参照によりその全体が組み入れられるように具体的に且つ個別に示唆されるかのように同じ程度まで参照によりそれらの全体が本願に組み入れられる。本明細書中の用語と組み入れられた引用文献中の用語との間に矛盾がある場合には、本明細書中の用語が支配する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化(ESI)チップをグランドに対して一定の電圧に維持するための方法であって、
a)分離チャネルの基端部に第1の電圧を印加するステップであって、前記分離チャネルの先端部が前記ESIチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
b)補助流体チャネルの基端部に第2の電圧を印加するステップであって、前記補助流体チャネルの先端部が前記分離チャネルの前記先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
c)前記分離反応を実行して検体の混合物を分離するステップであって、前記分離反応が前記分離チャネル内で行われる、ステップと、
d)前記分離チャネルの抵抗の変化又は前記ESIチップにおける電圧の変化をフィードバックループで監視するステップであって、前記フィードバックループが、前記分離チャネルの全体にわたる一定の電圧降下と前記ESIチップにおける一定の電圧とを維持するように前記第1及び第2の電圧を調整する、ステップと、
を含む方法。
(項目2)
前記分離チャネルがキャピラリーのルーメンである、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記キャピラリーがマイクロバイアルスプレーチップを備える、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記分離チャネルがマイクロ流体デバイス内の流体チャネルである、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記分離反応が等電点電気泳動反応を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記分離反応が電気泳動分離反応を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記第1の電圧がカソードに印加され、前記第2の電圧がアノードに印加される、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記ESIチップにおける前記電圧がグランドに保持される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記ESIチップにおける前記電圧が前記第2の電圧に保持される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記第1及び第2の電圧を調整する前記ステップは、前記第1の電圧及び前記第2の電圧から前記ESIチップで測定される過渡電圧変化を差し引くステップを含む、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記ESIチップにおける前記電圧は、前記第1の電圧又は前記第2の電圧を与える電源を使用して測定される、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記フィードバックループが少なくとも10Hzの周波数で動作する、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記フィードバックループが前記ESIチップにおける前記電圧を予め設定された値の±10%以内に維持する、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記フィードバックループが前記ESIチップにおける前記電圧を予め設定された値の±1%以内に維持する、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記フィードバックループが前記分離チャネルの全体にわたる前記電圧降下を予め設定された値の±10%以内に維持する、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記フィードバックループが前記分離チャネルの全体にわたる前記電圧降下を予め設定された値の±1%以内に維持する、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
a)2つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、
b)前記2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するために前記サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、
c)流体チャネル出口に向かう前記流体チャネルの内容物の動員時に検体ピークの速度を計算するステップと、
d)前記検体ピークの前記速度を使用して、前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する時間を決定するステップと、
を含む方法。
(項目19)
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく、項目18から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記検体ピークの前記速度は、前記検体ピークが第1の位置から第2の位置に移動するのに必要な時間間隔から計算される、項目18から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記第1の位置、第2の位置、及び、時間間隔は、前記流体チャネルの一連の2つ以上の画像から決定される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記一連の2つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、項目18から24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、項目18から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記流体チャネルの内容物の前記動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む、項目18から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記2つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む、項目18から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される、項目26から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記検体ピークの前記分離又は前記動員のための制御パラメータを調整するために前記検体ピークの前記速度がフィードバックループで使用される、項目18から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記制御パラメータが電圧である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する、項目30又は項目31に記載の方法。
(項目33)
a)2つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、
b)前記2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するために前記サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、
c)質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを介して前記流体チャネルから放出される前記2つ以上の個々の検体ピークに関して質量分析計データを収集するステップであって、前記質量分析計のためのデータ収集モードが高質量走査と低質量走査との間で交互に行われる、ステップと、
を含む方法。
(項目34)
前記質量分析計は、少なくとも0.5Hzの周波数において、前記高質量走査データ収集モードと前記低質量走査データ収集モードとの間で切り換えられる、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、項目33又は34に記載の方法。
(項目36)
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、項目33又は34に記載の方法。
(項目37)
前記分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく、項目33から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記高質量走査が生体高分子に関する質量スペクトルデータを捕捉する、項目33から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記生体高分子は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、核酸分子、還元タンパク質、融合タンパク質、タンパク質複合体、又は、これらの任意の組み合わせを含む、項目39に記載の方法。
(項目40)
前記高質量走査に関するm/z比が1500~6000の範囲である、項目33から39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記低質量走査は、等電点電気泳動分離を実行する際に使用される液相両性電解質に関する質量スペクトルデータを捕捉する、項目33から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記低質量走査に関するm/z比が150~1500の範囲である、項目33から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記高質量走査で特定される生体高分子に関する等電点(pI)を較正するために1つ以上の液相両性電解質の前記質量スペクトルが使用される、項目41又は42に記載の方法。
(項目44)
a)サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップであって、前記サンプルが2つ以上の検体の混合物を含み、前記分離が前記2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解する、ステップと、
b)前記流体チャネルの内容物を流体チャネル出口に向けて動員するステップであって、前記流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、ステップと、
c)(i)(a)及び(b)の最中に検体ピークの位置を監視するために前記流体チャネルの少なくとも一部を同時に又は交互に撮像するとともに、(ii)エレクトロスプレー性能を監視するために前記流体チャネル出口と前記質量分析計への入口との間から流出するテイラーコーンを同時に又は交互に撮像するステップと、
を含む方法。
(項目45)
前記検体ピークに関する速度を計算するために前記流体チャネルの少なくとも一部の2つ以上の画像における前記検体ピークの前記位置が使用される、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する時間を決定するために前記検体ピークの前記速度が使用される、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、項目46に記載の方法。
(項目48)
エレクトロスプレー性能を調整するために前記テイラーコーンの撮像から得られるデータがフィードバックループで使用される、項目44から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、項目44から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、項目44から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく、項目44から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記撮像は、紫外光吸収撮像、可視光吸収撮像、又は、蛍光撮像を含む、項目44から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記流体チャネルの内容物の前記動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む、項目44から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記2つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む、項目44から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化(ESI)チップをグランドに対して一定の電圧に維持するためのコンピュータ実装方法であって、
a)プロセッサを使用して、前記ESIチップにおける電圧の第1の測定値を受信するステップであって、前記分離チャネルの先端部が前記ESIチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
b)前記プロセッサを使用して、前記ESIチップにおける前記電圧の第2の測定値を受信するステップと、
c)前記プロセッサを使用して前記第2の測定値と前記第1の測定値とを比較するステップであって、前記第2の測定値が前記第1の測定値と異なる場合には、前記プロセッサにより、前記分離チャネルの基端部における電圧と、前記分離チャネルの前記先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある先端部を備える補助流体チャネルの基端部における電圧とが、前記ESIチップにおける前記電圧が前記第1の測定値に戻されるように調整される、ステップと、
d)特定の周波数で前記ステップ(a)~(c)を繰り返すステップと、
を含むコンピュータ実装方法。
(項目57)
前記分離チャネルが、キャピラリーのルーメン又はマイクロ流体デバイス内の流体チャネルを備える、項目56に記載のコンピュータ実装方法。
(項目58)
前記分離反応が等電点電気泳動反応を含む、項目56又は57に記載のコンピュータ実装方法。
(項目59)
前記分離反応が電気泳動分離反応を含む、項目56又は57に記載のコンピュータ実装方法。
(項目60)
前記ESIチップにおける前記電圧がグランドに保持される、項目56から59のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目61)
前記特定の周波数が少なくとも1Hzである、項目56から60のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目62)
前記ESIチップにおける前記電圧が特定の値の±5%以内に維持される、項目56から61のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目63)
a)プロセッサを使用して、キャピラリー内又はマイクロ流体デバイス内の分離チャネルの全部又は一部を撮像するように構成される検出器を使用して取得される2つ以上の画像を含む画像データを受信するステップと、
b)前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して前記画像データを処理し、前記2つ以上の画像内における前記分離チャネル内の検体ピークの位置を決定するステップと、
c)前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用し、前記2つ以上の画像内における前記検体ピークの前記位置と、前記2つ以上の画像の取得間の既知の時間間隔とに基づいて、前記検体ピークの速度を計算する、ステップと、
d)前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して、前記検体ピークが分離チャネル出口に到達する時間を決定するステップと、
を含むコンピュータ実装方法。
(項目64)
前記分離チャネル内で実行される分離反応が、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)を含む、項目63に記載のコンピュータ実装方法。
(項目65)
前記2つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む、項目63又は64に記載のコンピュータ実装方法。
(項目66)
前記分離チャネル出口は、質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースと流体連通している又は質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、項目63から65のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目67)
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、項目63から66のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目68)
前記検体は、混合物から分離されるとともに、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝物分子、又は、小有機化合物を含む、項目63から67のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目69)
生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される、項目63から68のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目70)
前記分離チャネル内で実行される分離反応のための制御パラメータを調整するために前記検体ピークの前記速度がフィードバックループで使用される、項目63から69のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目71)
前記制御パラメータが電圧である、項目70に記載のコンピュータ実装方法。
(項目72)
前記フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する、項目70又は項目71に記載のコンピュータ実装方法。
この明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び、特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、又は、特許出願が参照によりその全体が組み入れられるように具体的に且つ個別に示唆されるかのように同じ程度まで参照によりそれらの全体が本願に組み入れられる。本明細書中の用語と組み入れられた引用文献中の用語との間に矛盾がある場合には、本明細書中の用語が支配する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化(ESI)チップをグランドに対して一定の電圧に維持するための方法であって、
a)分離チャネルの基端部に第1の電圧を印加するステップであって、前記分離チャネルの先端部が前記ESIチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
b)補助流体チャネルの基端部に第2の電圧を印加するステップであって、前記補助流体チャネルの先端部が前記分離チャネルの前記先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
c)前記分離反応を実行して検体の混合物を分離するステップであって、前記分離反応が前記分離チャネル内で行われる、ステップと、
d)前記分離チャネルの抵抗の変化又は前記ESIチップにおける電圧の変化をフィードバックループで監視するステップであって、前記フィードバックループが、前記分離チャネルの全体にわたる一定の電圧降下と前記ESIチップにおける一定の電圧とを維持するように前記第1及び第2の電圧を調整する、ステップと、
を含む方法。
(項目2)
前記分離チャネルがキャピラリーのルーメンである、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記キャピラリーがマイクロバイアルスプレーチップを備える、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記分離チャネルがマイクロ流体デバイス内の流体チャネルである、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記分離反応が等電点電気泳動反応を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記分離反応が電気泳動分離反応を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記第1の電圧がカソードに印加され、前記第2の電圧がアノードに印加される、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記ESIチップにおける前記電圧がグランドに保持される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記ESIチップにおける前記電圧が前記第2の電圧に保持される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記第1及び第2の電圧を調整する前記ステップは、前記第1の電圧及び前記第2の電圧から前記ESIチップで測定される過渡電圧変化を差し引くステップを含む、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記ESIチップにおける前記電圧は、前記第1の電圧又は前記第2の電圧を与える電源を使用して測定される、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記フィードバックループが少なくとも10Hzの周波数で動作する、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記フィードバックループが前記ESIチップにおける前記電圧を予め設定された値の±10%以内に維持する、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記フィードバックループが前記ESIチップにおける前記電圧を予め設定された値の±1%以内に維持する、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記フィードバックループが前記分離チャネルの全体にわたる前記電圧降下を予め設定された値の±10%以内に維持する、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記フィードバックループが前記分離チャネルの全体にわたる前記電圧降下を予め設定された値の±1%以内に維持する、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
a)2つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、
b)前記2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するために前記サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、
c)流体チャネル出口に向かう前記流体チャネルの内容物の動員時に検体ピークの速度を計算するステップと、
d)前記検体ピークの前記速度を使用して、前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する時間を決定するステップと、
を含む方法。
(項目19)
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく、項目18から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記検体ピークの前記速度は、前記検体ピークが第1の位置から第2の位置に移動するのに必要な時間間隔から計算される、項目18から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記第1の位置、第2の位置、及び、時間間隔は、前記流体チャネルの一連の2つ以上の画像から決定される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記一連の2つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、項目18から24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、項目18から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記流体チャネルの内容物の前記動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む、項目18から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記2つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む、項目18から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される、項目26から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記検体ピークの前記分離又は前記動員のための制御パラメータを調整するために前記検体ピークの前記速度がフィードバックループで使用される、項目18から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記制御パラメータが電圧である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する、項目30又は項目31に記載の方法。
(項目33)
a)2つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、
b)前記2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するために前記サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、
c)質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを介して前記流体チャネルから放出される前記2つ以上の個々の検体ピークに関して質量分析計データを収集するステップであって、前記質量分析計のためのデータ収集モードが高質量走査と低質量走査との間で交互に行われる、ステップと、
を含む方法。
(項目34)
前記質量分析計は、少なくとも0.5Hzの周波数において、前記高質量走査データ収集モードと前記低質量走査データ収集モードとの間で切り換えられる、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、項目33又は34に記載の方法。
(項目36)
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、項目33又は34に記載の方法。
(項目37)
前記分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく、項目33から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記高質量走査が生体高分子に関する質量スペクトルデータを捕捉する、項目33から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記生体高分子は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、核酸分子、還元タンパク質、融合タンパク質、タンパク質複合体、又は、これらの任意の組み合わせを含む、項目39に記載の方法。
(項目40)
前記高質量走査に関するm/z比が1500~6000の範囲である、項目33から39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記低質量走査は、等電点電気泳動分離を実行する際に使用される液相両性電解質に関する質量スペクトルデータを捕捉する、項目33から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記低質量走査に関するm/z比が150~1500の範囲である、項目33から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記高質量走査で特定される生体高分子に関する等電点(pI)を較正するために1つ以上の液相両性電解質の前記質量スペクトルが使用される、項目41又は42に記載の方法。
(項目44)
a)サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップであって、前記サンプルが2つ以上の検体の混合物を含み、前記分離が前記2つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解する、ステップと、
b)前記流体チャネルの内容物を流体チャネル出口に向けて動員するステップであって、前記流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、ステップと、
c)(i)(a)及び(b)の最中に検体ピークの位置を監視するために前記流体チャネルの少なくとも一部を同時に又は交互に撮像するとともに、(ii)エレクトロスプレー性能を監視するために前記流体チャネル出口と前記質量分析計への入口との間から流出するテイラーコーンを同時に又は交互に撮像するステップと、
を含む方法。
(項目45)
前記検体ピークに関する速度を計算するために前記流体チャネルの少なくとも一部の2つ以上の画像における前記検体ピークの前記位置が使用される、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する時間を決定するために前記検体ピークの前記速度が使用される、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、項目46に記載の方法。
(項目48)
エレクトロスプレー性能を調整するために前記テイラーコーンの撮像から得られるデータがフィードバックループで使用される、項目44から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、項目44から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、項目44から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記分離は、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)に基づく、項目44から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記撮像は、紫外光吸収撮像、可視光吸収撮像、又は、蛍光撮像を含む、項目44から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記流体チャネルの内容物の前記動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む、項目44から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記2つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む、項目44から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化(ESI)チップをグランドに対して一定の電圧に維持するためのコンピュータ実装方法であって、
a)プロセッサを使用して、前記ESIチップにおける電圧の第1の測定値を受信するステップであって、前記分離チャネルの先端部が前記ESIチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
b)前記プロセッサを使用して、前記ESIチップにおける前記電圧の第2の測定値を受信するステップと、
c)前記プロセッサを使用して前記第2の測定値と前記第1の測定値とを比較するステップであって、前記第2の測定値が前記第1の測定値と異なる場合には、前記プロセッサにより、前記分離チャネルの基端部における電圧と、前記分離チャネルの前記先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある先端部を備える補助流体チャネルの基端部における電圧とが、前記ESIチップにおける前記電圧が前記第1の測定値に戻されるように調整される、ステップと、
d)特定の周波数で前記ステップ(a)~(c)を繰り返すステップと、
を含むコンピュータ実装方法。
(項目57)
前記分離チャネルが、キャピラリーのルーメン又はマイクロ流体デバイス内の流体チャネルを備える、項目56に記載のコンピュータ実装方法。
(項目58)
前記分離反応が等電点電気泳動反応を含む、項目56又は57に記載のコンピュータ実装方法。
(項目59)
前記分離反応が電気泳動分離反応を含む、項目56又は57に記載のコンピュータ実装方法。
(項目60)
前記ESIチップにおける前記電圧がグランドに保持される、項目56から59のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目61)
前記特定の周波数が少なくとも1Hzである、項目56から60のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目62)
前記ESIチップにおける前記電圧が特定の値の±5%以内に維持される、項目56から61のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目63)
a)プロセッサを使用して、キャピラリー内又はマイクロ流体デバイス内の分離チャネルの全部又は一部を撮像するように構成される検出器を使用して取得される2つ以上の画像を含む画像データを受信するステップと、
b)前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して前記画像データを処理し、前記2つ以上の画像内における前記分離チャネル内の検体ピークの位置を決定するステップと、
c)前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用し、前記2つ以上の画像内における前記検体ピークの前記位置と、前記2つ以上の画像の取得間の既知の時間間隔とに基づいて、前記検体ピークの速度を計算する、ステップと、
d)前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して、前記検体ピークが分離チャネル出口に到達する時間を決定するステップと、
を含むコンピュータ実装方法。
(項目64)
前記分離チャネル内で実行される分離反応が、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、又は、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)を含む、項目63に記載のコンピュータ実装方法。
(項目65)
前記2つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む、項目63又は64に記載のコンピュータ実装方法。
(項目66)
前記分離チャネル出口は、質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースと流体連通している又は質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、項目63から65のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目67)
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、項目63から66のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目68)
前記検体は、混合物から分離されるとともに、タンパク質、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝物分子、又は、小有機化合物を含む、項目63から67のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目69)
生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される、項目63から68のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目70)
前記分離チャネル内で実行される分離反応のための制御パラメータを調整するために前記検体ピークの前記速度がフィードバックループで使用される、項目63から69のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
(項目71)
前記制御パラメータが電圧である、項目70に記載のコンピュータ実装方法。
(項目72)
前記フィードバックループが少なくとも0.1Hzの周波数で動作する、項目70又は項目71に記載のコンピュータ実装方法。
本発明の新規の特徴が添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明及び添付図面を参照することによって得られる。
本明細書中に記載される幾つかの実施形態は、質量分析検出と統合されるキャピラリーとマイクロ流体とに基づく分離システムからのデータを分析して分離システムの動作を指示するための革新的なソフトウェア及びシステムに関する。幾つかの実施形態では、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスにおける分離中に検体が撮像され、また、分子量又は質量-電荷比が分離後に質量分析計で測定される。開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、分離された検体ピークのより正確な特性評価をもたらすとともに、化学分離データと質量分析(MS)データとの間の改善された相関の達成をもたらす。エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)データの品質を改善するための方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアも開示される。開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、プロテオミクス研究、創薬及び開発、並びに、臨床診断を含むがこれらに限定されない様々な分野において潜在的な用途を有する。例えば、幾つかの実施形態において、開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、以下で更に詳しく論じられるように、開発及び/又は製造中の生物学的医薬及びバイオシミラー医薬の特性評価のために利用されてもよい。生物製剤及びバイオシミラーは、例えば、組み換えタンパク質、抗体、ウイルス生ワクチン、ヒト血漿由来タンパク質、細胞ベースの薬剤、天然由来タンパク質、抗体-薬物複合体、タンパク質-薬物複合体、及び、他のタンパク質薬物を含む薬物類である。
様々な化学的分離技術のいずれかを実行するように設計されるとともにダウンストリーム質量分析に基づく分析を実行するためのエレクトロスプレーイオン化インタフェースも備えるマイクロ流体デバイスについて説明する。好ましい実施形態において、開示されるデバイスは、タンパク質又は他の生体高分子の等電点電気泳動を実行するように設計される。他の好ましい実施形態において、開示されるデバイスは、撮像技術と共に使用されるように設計される。撮像されるマイクロ流体分離を質量分析と統合するためのデバイス及び方法は、例えば、公開されたPCT特許出願公報である国際公開第2017/095813号及び米国特許出願公開第2017/0176386号に既に記載されてしまっており、これらは、全ての目的のために参照により本願に組み入れられる。これらの出願は、とりわけ、MS分析と併せて撮像分離を実行するためのシステムについて記載する。そのようなマイクロ流体システムは、生物学的特性評価における重要な進歩を象徴する。しかしながら、そのようなシステムが最大の利益を与えるには、本明細書中に開示されるように、これらのシステムの動作及び撮像データとMSデータとのダウンストリーム統合を支援する革新的なソフトウェア及びシステムを有することが有益である。
したがって、好ましい実施形態では、例えば、分離チャネル内の検体の混合物から等電点分離されてしまった1つ以上の検体に関して等電点(pI)の正確な決定を行って実質的に純粋な個々の検体成分(本明細書中では「ピーク」又は「バンド」とも称される)を含む一連の濃縮画分を形成するために、開示されるマイクロ流体デバイスが撮像技術と組み合わせて使用されてもよい。分離チャネルの全部又は一部を撮像することにより、分離されるべきサンプルと共に注入されてしまった2つ以上のpI標準(又はpIマーカー)の位置を決定でき、したがって、それぞれの分離された検体のピークごとに外挿によってより正確なpIを計算して局所的なpHを決定できる。幾つかの実施形態において、分離チャネル内の検体混合物の撮像は、分離が実行されている間に行われ、また、分離されている検体のうちの1つ以上に関する等電点の決定は、分離が実行されている間に行われて繰り返し更新されていてもよい。幾つかの実施形態において、等電点電気泳動されてしまった1つ以上の検体に関する等電点の撮像に基づく決定は、分離が完了した後に行われる。幾つかの実施形態において、等電点電気泳動されてしまった1つ以上の検体に関する等電点の撮像に基づく決定は、分離が完了した後であって、分離された検体混合物がエレクトロスプレーチップに向かって動員される前に行われる。幾つかの実施形態において、本明細書中に開示される撮像に基づく方法は、マイクロ流体デバイスに基づくESI-MSシステムではなくキャピラリーに基づくESI-MSシステムと共に使用されてもよい。幾つかの実施形態において、1つ以上の検体ピークに関する等電点の決定は、コンピュータ実装方法によって行われてもよい。
他の好ましい実施形態では、分離された検体混合物の動員後に、すなわち、ピークが分離チャネルからエレクトロスプレーチップに向けて移動する際に、分離された検体ピークを撮像するために、開示されるマイクロ流体デバイスが撮像技術と組み合わせて使用されてもよい。幾つかの実施形態において、撮像動員ステップは、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリー界面動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フロー平衡キャピラリー電気泳動、又は、差速により検体混合物の成分を分離する任意の他の分離技術を含む分離ステップを実施するときなど、撮像分離ステップと同じステップである。幾つかの実施形態では、撮像分離における濃縮画分を質量スペクトルと相関させるために撮像動員ステップが分析されてもよい。動員された検体ピークの撮像は、例えば、一連の動員画像内のそれらの位置に基づいて1つ以上の検体ピークにおける速度を決定するために利用されてもよく、該速度は、その後、(1又は複数の)検体ピークが分離チャネルから流出する又はエレクトロスプレーチップにより放出される時点を決定するために使用されてもよく、したがって、質量分析計データを特定の検体ピークと相関させるために使用されてもよい。場合によっては、(1又は複数の)検体ピークの速度は、検体ピークが特定の変位値を移動する(例えば、第1の位置から第2の位置に移動する)のに必要な時間間隔から計算される。幾つかの実施形態において、動員される検体ピークの撮像は、それらの検体ピークが流体チャネルを通じて移動してエレクトロスプレーチップにより放出される際に(1又は複数の)ピークの直接的な監視を可能にし、したがって、質量分析計データを特定の検体ピークと直接に相関させるために使用されてもよい。幾つかの実施形態において、本明細書中に開示される撮像に基づく方法は、マイクロ流体デバイスに基づくESI-MSシステムではなくキャピラリーに基づくESI-MSシステムと共に使用されてもよい。幾つかの実施形態において、1つ以上の検体ピークに関する速度、検体ピークの実際の又は予測される分離チャネル流出時間、及び/又は、検体ピークのエレクトロスプレー放出時間の決定は、コンピュータ実装方法によって行われてもよい。
幾つかの実施形態において、分離された検体ピークの動員は、マイクロ流体デバイス内の電界又はフローパラメータの変化によって開始されてもよい。幾つかの実施形態では、コンピュータ実装方法により動員を開始するために、電源をマイクロ流体デバイスに接続する1つ以上の電極が接続され又は切断されてもよい。幾つかの実施形態において、エレクトロスプレーチップで形成されるテイラーコーンは、動員ステップ中に撮像されてもよい。幾つかの実施形態では、安定したエレクトロスプレー動作条件を特定するためにコンピュータにより実施される画像分析が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、画像分析がオペレータによって行われてもよい。幾つかの実施形態では、画像分析が自動画像処理ソフトウェアを使用して行われてもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレー性能に影響を与えることで知られている1つ以上の動作パラメータが、安定したエレクトロスプレー動作状態を取り戻すべく調整される。調整され得る動作パラメータの例としては、電気泳動電圧、流量、エレクトロスプレーチップからMS入口までの距離、MS電圧などが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーパラメータを調整するためにコンピュータ実装方法が使用されてもよい。
幾つかの実施形態では、電気泳動電界を生成するために複数の電源が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、プラスの極性を有する2つの電源が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、1つ以上の電源がマイナスの極性を有してもよい。幾つかの実施形態では、電気泳動分離のための分離チャネル内で同じ電圧勾配を維持するために電源における電圧設定は一斉に変更されてもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーチップで一定の電圧を維持するために電源における電圧設定が変更されてもよい。幾つかの実施形態では、複数の電源が単一のマルチチャネル電源内の異なるチャネルであってもよい。幾つかの実施形態では、等電点電気泳動が分離チャネル内で行われてもよく、また、チャネル内の抵抗が経時的に増大してもよい。幾つかの実施形態では、化学的動員が分離チャネル内で行われてもよく、また、チャネル内の抵抗が経時的に減少してもよい。幾つかの実施形態では、圧力駆動動員が行われてもよく、また、新しい試薬がチャネル内に押し込まれるにつれてチャネル内の抵抗が経時的に変化してもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーチップがグランドに保持されてもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーチップが質量分析計に対して特定の電圧に保たれてもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーチップがグランドに対して特定の電圧に保たれてもよい。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、分離チャネル内の一定の電界強度(又はアノードとカソードとの間の一定の電圧降下)、及び、エレクトロスプレーチップの一定の電圧を維持するために電圧を調整してもよい。幾つかの実施形態では、チップの電圧が電圧計を使用して測定されてもよい。幾つかの実施形態において、チップの電圧は、チップに位置付けられる又はチップの内部に位置付けられる電極を使用して測定されてもよい。幾つかの実施形態では、更なる電源が、電流制御を使用して0μAに設定されてもよく、また、チップ電圧を読み取るための電圧計として使用されてもよい。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、チップの電圧の値を読み取るとともに、電圧を調整して分離チャネル内で一定の電界強度(又はアノードとカソードとの間で一定の電圧降下)を維持し、且つ、チップで一定の電圧を維持する。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、分離電界回路を通じた電流の流量に基づいてESIチップの電圧を計算する。幾つかの実施形態において、分離チャネルの全体にわたる電圧降下は、一定の電力又は最大電力が分離チャネルに印加されるように調整され、この場合、分離チャネルにおいて印加される電力は、以下のように計算される。
[数1]
電力=分離チャネルの全体にわたる電圧×分離チャネル内の電流
[数1]
電力=分離チャネルの全体にわたる電圧×分離チャネル内の電流
ここで、電流を分離中に絶えず又は定期的に測定でき、また、電流測定を使用して分離チャネルの全体にわたる電圧を調整できる。分離チャネルにおける電力を制御するこの方法は、分離チャネル内の温度効果を管理するのに役立ち得る。
幾つかの実施形態において、分離経路は、酸性陽極液及びプラス電極又は塩基性陰極液及びマイナス電極を収容するバイアル内に挿入される入口を伴う所定長さの直線状のコーティングされた又はコーティングされないキャピラリー、チューブ、又は、ラインである。幾つかの実施形態では、分離経路の出口が接合噴霧器内に挿入される。幾つかの実施形態において、接合噴霧器は、液体を液体電気接点にもたらすキャピラリー出口に他の導電性補給溶液を導入できる二次チューブ、ライン、又は、キャピラリーのためのティーと、エレクトロスプレーをサポートするとともに分離チャネルから出現する検体をエレクトロスプレーイオン化によって質量分析計に導入するためにチップへ輸送するための液体流との両方を収容する。幾つかの実施形態において、システムは、分離経路入口に陽極液及びプラス電極を伴って構成されてもよく、また、分離経路の接合部又は先端部には集束直前に陰極液が充填されてもよい。集束が完了した後、競合する陰イオンを伴う動員物質が流体力学的な又は電気浸透的な力のいずれかによって接合部に導入されてもよい。幾つかの実施形態では、分離経路入口が陰極液及びマイナス電極を伴うバイアル内に浸漬されてもよく、また、キャピラリーの接合部又は先端部には集束直前に陽極液が充填されてもよい。集束が完了した後、競合する陽イオンを伴う動員物質が流体力学的な又は電気浸透的な力のいずれかによって接合部に導入されてもよい。幾つかの実施形態において、分離チャネルは、等電点電気泳動のために一端がキャピラリーをプラス電極に接続する陽極液リザーバ内に挿入されるとともに他端がキャピラリーをマイナス電極に接続する陰極液リザーバ内に挿入される所定長さの直線状のキャピラリーである。幾つかの実施形態では、集束後、キャピラリーの陰極液端部は、陰極液から除去されて、図14Aに示されるように、質量分析計付近の接合噴霧器(例えば、マイクロバイアル噴霧器)内に挿入される。幾つかの実施形態において、接合噴霧器は、ESI内の検体を帯電させて集束された検体を動員するため所定量の動員材を備えてもよい。幾つかの実施形態において、接合噴霧器は、完全動員回路に対する電気的接続をもたらしてもよい。幾つかの実施形態において、陽極液及び接合噴霧器の電圧は、陽極液と接合噴霧器との間の電圧又は電界の変化(ΔV)が一定のままであるとともにESIチップの電圧が一定のままであるように調整される。
幾つかの実施形態において、分離チャネル(例えば、キャピラリー)は、ESIへの動員された流出物の移送を容易にし得るマイクロバイアルを備える。マイクロバイアルは、キャピラリーの一部であってもよく、或いは、分離チャネルに追加され及び/又は融合されてもよい。マイクロバイアルは、ESIチップの一部であってもよい。場合によっては、マイクロバイアルは、接合噴霧器を備えてもよく又は接合噴霧器の一部であってもよい。マイクロバイアルは、チャネルの一部に又はESIチップに流体流路(例えば、シース流体用)を備えてもよい。
幾つかの実施形態では、電流シンクを形成するために1つの電源がレジスタに接続されてもよい。幾つかの実施形態において、レジスタは、電気泳動回路をグランドに接続することによって電流をシンクしてもよい。幾つかの実施形態において、レジスタは、電界効果トランジスタ(FET)調整可能レジスタである。幾つかの実施形態において、レジスタは、精密可変レジスタ、リレーレジスタネットワーク、レジスタラダー、又は、電流をシンクするための経路を与えることができる任意の他の抵抗素子であってもよい。幾つかの実施形態では、電流シンクがFETであってもよく、この場合、FETは、それがFETを通じて流れる定電流をもたらすように制御され、或いは、必要に応じて開回路又は短絡回路として機能するように制御され得る。幾つかの実施形態では、バイポーラ接合トランジスタ(BJT)を電流シンク機能のために使用できる。幾つかの実施形態において、レジスタは、電気泳動回路を電流シンク電源に接続することによって電流をシンクしてもよい。幾つかの実施形態において、電流シンク電源の電圧設定は、分離チャネルの抵抗が経時的に変化するにつれて調整される。幾つかの実施形態において、電流シンク電源の電圧は、レジスタの全体にわたって一定の電流を維持するように調整される。幾つかの実施形態では、レジスタ又はレジスタのセット、抵抗回路などが電流シンクとして使用されてもよい。
幾つかの実施形態において、走査されるべき質量-電荷(m/z)比範囲は、動員/ESIステップ中に変えられてもよい。幾つかの実施形態では、高いm/z範囲と低いm/z範囲との間を切り換えるためにコンピュータ実装方法が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、1m/z範囲の質量スペクトルが異なる質量範囲での検体の分離のための内部標準として使用されてもよい。このスペクトルは、等電点(pI)の標準として使用されてもよい遊離溶液等電位勾配両性電解質に関するデータを含んでもよく、或いは、このスペクトルは、電気泳動、例えばキャピラリーゾーン電気泳動における標準として使用されてもよい電気泳動移動度標準に関するデータを含んでもよい。場合によっては、このスペクトルは、対象の検体とは異なる質量範囲にある、分離ステップで例えばpI、電荷対質量比、ゲルによる評価、電気泳動移動度などによって分解され得る任意の分子に関するデータを含んでもよい。
本開示のシステムは、(i)検体分離、例えば、質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースをもたらす等電点電気泳動に基づく分離を行うように設計されるキャピラリー又はマイクロ流体デバイス、(ii)質量分析計、(iii)撮像デバイス又はシステム、(iv)プロセッサ又はコンピュータ、(v)キャピラリー又はマイクロ流体デバイスに基づく検体分離の動作を画像取得と協調させるためのソフトウェア、(vi)分離が行われている間、分離が完了した後、又は、エレクトロスプレーチップに向けたpI標準及び検体ピークの動員の後に、画像を処理して分離チャネル内の1つ以上のpI標準又は検体ピークの(1又は複数の)位置を決定するためのソフトウェア、(vii)画像を処理するとともに、1つ以上のpI標準又は検体ピークに関して速度、流出時間、及び/又は、エレクトロスプレー放出時間を決定するためのソフトウェア、(viii)分離チャネルの画像を同時に又は交互に取得して、エレクトロスプレーチップと質量分析計への入口との間に存在するテイラーコーン及び検体ピークの位置を監視し、エレクトロスプレー性能を監視するためのソフトウェア、(ix)テイラーコーンの画像を処理するとともに、質量分析計の入口に対するエレクトロスプレーチップの位置、エレクトロスプレーチップを通じた流体の流量、エレクトロスプレーチップと質量分析計との間の電圧又は、それらの任意の組み合わせのうちの1つ以上を調整して、質量分析計データの品質の変化に影響を与えるためのソフトウェア、(x)エレクトロスプレーインタフェースから放出される個々の検体ピークに関する質量分析計データの収集を制御するためのソフトウェアであって、質量分析計におけるデータ収集モードが高質量走査と低質量走査との間で交互に行われる、ソフトウェア、(xi)エレクトロスプレーチップの電圧を読み取るとともに、チップの電圧を一定に保ちつつ、分離チャネル電圧を調整して、チャネルの電界強度を一定に保つ(又はアノードとカソードとの間の電圧降下を一定に保つ)ためのソフトウェア、或いは、これらの任意の組み合わせのうちの1つ以上を備えてもよい。幾つかの実施形態において、システムは、これらの機能的構成要素の選択が所定の形態でパッケージ化される一体型システムを構成してもよい。幾つかの実施形態において、システムは、新たな用途のためのシステムを再構成するために機能的構成要素の選択が変えられてもよいモジュールシステムを備えてもよい。幾つかの実施形態において、これらの機能的システム構成要素の幾つか、例えば、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスは、交換可能又は使い捨て可能な構成要素である。
前述の一般的な概要及び以下の説明がいずれも、典型的且つ説明的なものにすぎず、本明細書中に記載される方法及びデバイスを限定するものではないことが理解されるべきである。
定義:別段に規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語は、この開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
この明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び、「その(the)」は、文脈が明らかにそうでないと示されない限り、複数の指示対象を含む。本明細書中における「又は」への言及は、別段述べられなければ、「及び/又は」を包含することが意図される。同様に、「備える(comprise)」、「備える(comprises)」、「備えている」、「含む(include)」、「含む(includes)」、及び、「含んでいる」という句は、限定しようとするものではない。
本明細書中で使用される用語「約」を伴う数は、その数のプラスマイナス10%の数を指す。「約」という用語は、範囲との関連で使用される場合、その範囲-その最小値の10%及びその範囲+その最大値の10%を指す。
検体:前述したように、開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、分離された検体ピークのより正確な特性評価を可能にするとともに、化学分離データと質量分析データとの間の改善された相関を可能にする。場合によっては、これらの検体は、例えば、解放されたグリカン、炭水化物、脂質又はそれらの誘導体(例えば、細胞外小胞、リポソームなど)、DNA、RNA、無傷のタンパク質、消化されたタンパク質、タンパク質複合体、抗体薬物複合体、タンパク質-薬物複合体、ペプチド、代謝物、有機化合物、又は、他の生物学的に関連する分子、或いは、これらの任意の組み合わせであってもよい。場合によっては、これらの検体が小分子薬物であってもよい。場合によっては、これらの検体は、タンパク質混合物中のタンパク質分子、例えば、生物学的タンパク質医薬及び/又は培養物から又は体内で単離される細胞から収集される溶解物であってもよい。
サンプル:開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、様々な生物学的サンプル又は非生物学的サンプルのいずれかから得られる検体の分離及び特性評価のために使用されてもよい。例としては、組織サンプル、細胞培養サンプル、全血サンプル(例えば、静脈血、動脈血、毛細管血サンプル)、血漿、血清、唾液、間質液、尿、汗、涙、工業用酵素又は生物学的薬物製造プロセスから得られるタンパク質サンプル、環境サンプル(例えば、空気サンプル、水サンプル、土壌サンプル、表面スワイプサンプル)などが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、サンプルは、統合された化学分離及び質量分析特性評価のための開示された方法及びデバイスを使用する分析の前に当業者に公知の様々な技術のいずれかを使用して処理されてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、サンプルは、タンパク質又は核酸を抽出するために処理されてもよい。サンプルは、細菌、ウイルス、植物、動物、又は、ヒトなど、様々なソース又は対象物のいずれかから収集されてもよい。
サンプル量:開示される方法及びデバイスの幾つかの実施形態において、微細加工技術の使用により達成され得る小型化は、非常に少ないサンプル量の処理を可能にする。幾つかの実施形態において、分析のために使用されるサンプル量は、約0.1μl~約1mlの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、分析のために使用されるサンプル量は、少なくとも0.1μl、少なくとも1μl、少なくとも2.5μl、少なくとも5μl、少なくとも7.5μl、少なくとも10μl、少なくとも25μl、少なくとも50μl、少なくとも75μl、少なくとも100μl、少なくとも250μl、少なくとも500μl、少なくとも750μl、又は、少なくとも1mlであってもよい。幾つかの実施形態において、分析のために使用されるサンプル量は、最大1ml、最大750μl、最大500μl、最大250μl、最大100μl、最大75μl、最大50μl、最大25μl、最大10μl、最大7.5μl、最大5μl、最大2.5μl、最大1μl、又は、最大0.1μlであってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、分析のために使用されるサンプル量が約5μl~約500μlの範囲であってもよい。当業者であれば認識できるように、分析のために使用されるサンプル量は、この範囲内の任意の値、例えば、約10μlを有してもよい。
分離技術:開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、当業者に知られている様々な検体分離技術のいずれかを利用してもよい。例えば、幾つかの実施形態において、撮像分離は、検体混合物から1つ以上の分離された検体画分を生成する、等電点電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリー界面動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フロー平衡キャピラリー電気泳動、電界勾配集束、動的電界勾配集束などの電気泳動分離であってもよい。
キャピラリー等電点電気泳動(CIEF):幾つかの実施形態において、分離技術は、等電点電気泳動(IEF)、例えば、キャピラリー等電点電気泳動(CIEF)を含んでもよい。等電点電気泳動(又は「焦点電気泳動」)は、分子の等電点(pI)の違い、つまり分子が正味ゼロ電荷を有するpHの違いによって分子を分離するための技術である。CIEFは、アノード又はカソードを含む試薬リザーバ間のサンプルチャネルに両性電解質(両性の電解質)溶液を加えて、全体にわたり分離電圧が印加される分離チャネル(つまり、電極を含むウェルを接続する流体チャネル)内にpH勾配を生成することを伴う。両性電解質は、液相であってもよく、或いは、チャネル壁の表面に固定され得る。マイナスに帯電された分子は、媒体中のpH勾配にわたってプラス電極に向けて移動し、一方、プラスに帯電された分子は、マイナス電極に向けて移動する。その等電点(pI)未満のpH領域にあるタンパク質(又は他の分子)は、プラスに帯電され、そのため、カソード(すなわち、マイナスに帯電された電極)に向けて移動する。タンパク質の全体的な正味電荷は、それがpIに対応するpH領域に到達するまで、それが増大するpHの勾配にわたって移動するにつれて減少し(例えば、カルボキシル基又は他のマイナスに帯電された官能基のプロトン化に起因する)、pIに対応するpH領域に到達した時点で、正味電荷を有さず、そのため、移動が止まる。結果として、タンパク質の混合物は、酸性及び塩基性の残留物の相対的含有量に基づいて分離し、各タンパク質がそのpIに対応するpH勾配のポイントに位置付けられたシャープな固定バンドに集束されるようになる。この技術は、単一の電荷が別個のバンドへと分画されることによって異なるタンパク質を用いて非常に高い分解能が得られる。幾つかの実施形態において、等電点電気泳動は、電気浸透流(EOF)を排除するために、例えば中性及び親水性ポリマーコーティングにより恒久的又は動的にコーティングされてしまった分離チャネルで行われてもよい。適切なコーティングの例としては、アミノ改質材、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)及びポリビニルアルコール(PVA)、Guarant(登録商標)(Alcor Bioseparations)、線状ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ポリビニルピロリジン(PVP)、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、トリエチルアミン、プロイルアミン、モルホリン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジアミノプロパン、エチレンジアミン、キトサン、ポリエチレンイミン、カダベリン、プトレッシン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、セルロース、デキストラン、ポリエチレンオキシド(PEO)、酢酸セルロース、アミロペクチン、エチルピロリジンメタクリレート、ジメチルメタクリレート、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド、Brij 35、スルホベタイン、1,2-ジラウリルロイルスン-ホスファチジルコリン、1,4-ジデシル-1,4-ジアゾニアビシクロ[2,2,2]オクタンジブロミド、アガロース、ポリ(Nヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポール-323、ハイパーブランチポリアミノエステル、プララン、グリセロール、吸着コーティング、共有コーティング、動的コーティングなどが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、等電点電気泳動は、電気浸透流を大幅に減らして、より良いタンパク質可溶化を可能にするとともに、電解質の粘度を上げることによって流体チャネルのキャピラリー内の拡散を制限するために、分離媒体中でメチルセルロース、グリセロール、尿素、ホルムアミド、界面活性剤(例えば、トリトン-X 100、CHAPS、ジギトニン)などの添加剤を使用して(例えば、コーティングされない分離チャネル内で)行われる。
前述したように、キャピラリー等電点電気泳動技術のために使用されるpH勾配は、両性電解質、つまり、酸性基及び塩基性基の両方を含むとともに特定の範囲のpH内で主に両性イオンとして存在する両性分子の使用によって生成される。分離チャネルのアノード側の電解質溶液の部分は、「陽極液」として知られている。分離チャネルのカソード側の電解質溶液のその部分は、「陰極液」として知られている。開示される方法及び装置では、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、グルタミン酸、リジン、ギ酸、ジメチルアミン、トリエチルアミン、酢酸、ピペリジン、ジエチルアミン、及び/又は、これらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な電解質が使用されてもよい。電解質は、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%などの任意の適した濃度で使用されてもよい。電解質の濃度は、少なくとも0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%であってもよい。電解質の濃度は、最大で90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%であってもよい。所定範囲の電解質の濃度、例えば、0.1%~2%が使用されてもよい。両性電解質は、任意の市販又は非市販のキャリア両性電解質混合物(例えば、Servalyt pH 4~9(Serva、ハイデルベルク、ドイツ)、Beckman pH 3~10(Beckman Instruments、フラートン、カリフォルニア州、アメリア)、Ampholine 3.5~9.5及びPharmalyte 3-10(いずれも、General Electric Healthcareが提供、オルセー、フランス)、AESlytes(AES)、FLUKA両性電解質(Thomas Scientific、スゥィーズボーロ、ニュージャージー州)、Biolyte(Bio-Rad、ヘラクレス、カリフォルニア州))などから選択され得る。キャリア両性電解質混合物は、間隔の狭いpI値と良好な緩衝能力とを有する複数の脂肪族アミノ基とカルボン酸基とを含む小分子(約300~1,000Da)の混合物を備えてもよい。印加電界の存在下で、キャリア両性電解質は、アノードからカソードに向けて徐々に増増大する滑らかな線形又は非線形のpH勾配に分かれる。
分離された検体ピークに関して等電点を計算するための開示された方法及びデバイスでは様々なpI標準のいずれかが使用されてもよい。例えば、CIEF用途で一般的に使用されるpIマーカー、例えば、タンパク質pIマーカー及び合成小分子pIマーカーが使用されてもよい。場合によっては、タンパク質pIマーカーは、一般に受け入れられるpI値を有する特定のタンパク質であってもよい。場合によっては、pIマーカーは、例えば、撮像によって検出できてもよい。市販されている様々なタンパク質pIマーカー又は合成小分子pIマーカー又はこれらの組み合わせ、例えば、Advanced Electrophoresis Solutions,Ltdから入手可能な小分子pIマーカー(ケンブリッジ、オンタリオ、カナダ)、ProteinSimple、Shimuraにより設計されたペプチドライブラリ、及び、Slais色素(Alcor Biosepartions)が使用されてもよい。
動員技術:幾つかの実施形態では、例えば、等電点電気泳動が使用される場合、分離された検体バンドが、ダウンストリーム分析デバイス、例えば、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インタフェースとインタフェースする分離チャネルの端部に向けて動員されてもよい。幾つかの実施形態では、例えば、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリー界面動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フロー平衡キャピラリー電気泳動、又は、差速により検体混合物の成分を分離する任意の他の分離技術が使用される場合、分離ステップが動員ステップと見なされてもよい。
幾つかの実施形態において、検体バンドの動員は、分離チャネルの一端部に流体力学的圧力を印加することによって実施されてもよい。幾つかの実施形態において、検体バンドの動員は、重力が使用され得るように分離チャネルを垂直位置に向けることによって実施されてもよい。幾つかの実施形態において、検体バンドの動員は、EOF支援動員を使用して実施されてもよい。幾つかの実施形態において、検体バンドの動員は、化学的動員を使用して実施されてもよい。幾つかの実施形態では、これらの動員技術の任意の組み合わせが使用されてもよい。
一実施形態では、等電点電気泳動された検体バンドのための動員ステップが化学的動員を含む。圧力に基づく動員と比べて、化学的動員は、圧力の使用によって引き起こされる流体力学的放物線状の流れプロファイルを克服することによって最小のバンドの広がりを示すという利点を有する。化学的動員は、完全に又は部分的に集束されるpH勾配を含む分離経路の入口又は出口のいずれかを、分離経路内への電気泳動に関してヒドロニウム又はヒドロキシルのいずれかと競合するイオンを伴う導電性溶液に導入することによって実施されてもよい。これは、ほぼゼロの正味電荷状態を破壊することによってpH勾配成分の段階的な界面動電変位をもたらす。陰極化学的動員の場合には、所定量のヒドロキシル陰極液溶液が、競合する陰イオンを含む動員溶液で置き換えられてもよい。競合する陰イオンは、pH勾配成分で正電荷を発現する分離経路のpHの低下を引き起こす可能性があり、それにより、pH勾配成分がカソードに向けて移動できる。それに対応して、陽極動員では、所定量のヒドロニウム陽極液溶液が、pH勾配成分の負電荷を発現する分離でpHを増大させる競合する陽イオンを含む動員溶液と置き換えられ、それにより、pH勾配成分がアノードに向けて移動できる。幾つかの実施形態において、陰極動員は、任意の適切な濃度で、ギ酸、酢酸、炭酸、リン酸などの酸性電解質を使用して開始されてもよい。幾つかの実施形態において、陽極動員は、水酸化アンモニウム、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピペリジン、水酸化ナトリウムなどの塩基性電解質を使用して開始されてもよい。幾つかの実施形態において、化学的動員は、塩化ナトリウムなどの塩又は任意の他の塩を陽極液溶液又は陰極液溶液に加えることによって開始されてもよい。
好ましい実施形態において、化学的動員ステップは、デバイス内の電界を変化させて動員電解質を分離チャネル内へ電気泳動させることによってCIEFをESI-MSと統合するように設計されるマイクロ流体デバイス内で開始されてもよい。幾つかの実施形態において、電界の変化は、1つ以上の電源に取り付けられる1つ以上の電極を接続又は切断することによって実施されてもよく、この場合、1つ以上の電極がデバイス上の試薬ウェル内に配置される又はデバイスの流体チャネルと一体化される。幾つかの実施形態において、1つ以上の電極の接続又は切断は、コンピュータ実装方法及びプログラム可能なスイッチを使用して制御されてもよく、それにより、動員ステップのタイミング及び持続時間を分離ステップ、エレクトロスプレーイオン化ステップ、及び/又は、質量分析データ収集と協調させることができる。幾つかの実施形態において、分離回路からの1つ以上の電極の切断は、電流制御を使用して電流を0μAに設定することによって実施されてもよい。
キャピラリーゾーン電気泳動(CZE):幾つかの実施形態において、分離技術は、キャピラリーゾーン電気泳動、印加電界内で溶液中の荷電検体を分離するための方法を含んでもよい。荷電検体分子の正味速度は、分離システムによって示される電気浸透流(EOF)移動度μEOFと、個々の検体に関する電気泳動移動度μEP(分子のサイズ、形状、及び、電荷に依存する)との両方により影響され、それにより、異なるサイズ、形状、又は、電荷を示す検体分子が異なる差分移動速度を示してバンドに分離する。
キャピラリーゲル電気泳動(CGE):幾つかの実施形態において、分離技術は、キャピラリーゲル電気泳動、高分子(例えば、DNA、RNA、及び、タンパク質)及びそれらの断片を高分子のサイズ及び電荷に基づいて分離して分析するための方法を含んでもよい。この方法は、ゲルが充填された分離チャネルの使用を含み、この場合、ゲルは、印加電界内での荷電検体分子の電気泳動移動中に対流防止媒体及び/又はふるい媒体として作用する。ゲルは、電界の印加によって引き起こされる熱対流を抑制するように機能するとともに、分子の通過を遅らせるふるい媒体としても作用し、それにより、異なるサイズ又は電荷の分子に関して差分移動速度をもたらす。
キャピラリー等速電気泳動(CITP):幾つかの実施形態において、分離技術は、キャピラリー等速電気泳動、適した寸法のキャピラリー内又は流体チャネル内の2つの電解質(先行電解質及び終端電解質として知られる)の不連続システムを使用する荷電検体の分離のための方法を含んでもよい。先行電解質は、最高の電気泳動移動度を伴うイオンを含んでもよく、一方、終端電解質は、最低の電気泳動移動度を伴うイオンを含んでもよい。分離されるべき検体混合物(すなわち、サンプル)をこれらの2つの電解質間に挟むことができ、また、電界の印加により、電気泳動移動度を減少させる順序で、キャピラリー内又は流体チャネル内の荷電検体分子が、密接に隣り合うゾーンに分かれる。ゾーンは、検出器、例えば、導電率検出器、光検出器、又は、撮像デバイスを利用して分離チャネルに沿ったゾーンの通過を記録できるように印加電界内において一定速度で移動する。キャピラリーゾーン電気泳動とは異なり、陰イオンアニオン性及び陽イオン性の検体の同時決定又は検出は、キャピラリー等速電気泳動を使用して実行される単一の分析では実現できない。
キャピラリー界面動電クロマトグラフィ(CEC):幾つかの実施形態において、分離技術は、キャピラリー界面動電クロマトグラフィ、液体クロマトグラフィと界面動電分離方法との組み合わせに基づく検体混合物の分離のための方法を含んでもよい。CECは、キャピラリー電気泳動(CE)の効率と、充填キャピラリー高速液体クロマトグラフィ(HPLC)の選択性及びサンプル容量の両方を与える。CECで使用されるキャピラリーはHPLC充填材料で充填されるため、HPLCで利用できる様々な検体選択性がCECでも利用できる。これらの充填材料の高い表面積により、CECキャピラリーは比較的大量のサンプルを受け入れることができ、それにより、その後に溶出される検体の検出は、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)における検出作業よりもやや簡単な作業になる。
ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC):幾つかの実施形態において、分離技術は、ミセル動電クロマトグラフィ、界面活性剤ミセル(疑似固定相)と周囲の水性緩衝液(可動相)との間の差動分配に基づく検体混合物の分離のための方法を含んでもよい。MEKCにおいて、緩衝液は、界面活性剤モノマーがミセルと平衡状態になるように、臨界ミセル濃度(CMC)よりも高い濃度で界面活性剤を含んでもよい。MEKCは、強い電気浸透流を生成するためにアルカリ性条件を使用して開放したキャピラリー内又は流体チャネル内で実行されてもよい。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの様々な界面活性剤がMEKC用途で使用されてもよい。例えば、SDSの陰イオン性硫酸基により、界面活性剤及びミセルは、強い電気浸透流の方向とは逆の電気泳動移動度を有する。結果として、界面活性剤モノマー及びミセルはゆっくりと移動するが、それらの正味の動きは依然として電気浸透流の方向、すなわち、カソードに向かう。MEKC分離中、検体は、ミセルの疎水性内部と親水性緩衝液との間に分布し得る。ミセル内部で不溶性の親水性検体は、電気浸透流速度uoで移動し、緩衝剤の保持時間tMで検出される。ミセル内で完全に可溶化する疎水性検体は、ミセル速度ucで移動し、最終溶出時間tcで溶出する。
フロー平衡キャピラリー電気泳動(FCCE):幾つかの実施形態において、分離技術は、フロー平衡キャピラリー電気泳動、圧力誘導逆流を利用してキャピラリーを介した検体の動電移動を能動的に遅延、停止、又は、逆行するキャピラリー電気泳動の効率及び分解能を高めるための方法を含んでもよい。検体を検出ウィンドウ全体にわたって遅延、停止、又は、前後に移動することにより、対象の検体が通常の分離条件下よりもはるかに長い時間にわたって分離チャネルに効果的に閉じ込められ、それにより、分離の効率及び分解能の両方が向上されてもよい。
分離時間及び分離分解能:一般に、完全な分離を達成するために必要な分離時間は、特定の分離技術と利用される動作パラメータ(分離チャネル長、マイクロ流体デバイス設計、緩衝剤組成、印加電圧など)とに応じて変化する。幾つかの実施形態において、ソフトウェアは、同時係属中の米国特許出願第16/261,382号に記載されるように、検体ピークの撮像に基づく分析に基づいて分離が完了する時期を決定する。幾つかの実施形態では、分離時間が約0.1分~約30分の範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、分離時間は、少なくとも0.1分、少なくとも0.5分、少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも15分、少なくとも20分、少なくとも25分、又は、少なくとも30分であってもよい。幾つかの実施形態において、分離時間は、最大で30分、最大で25分、最大で20分、最大で15分、最大で10分、最大で5分、最大で1分、最大で0.5分、又は、最大で0.1分であってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、分離時間が約1分~約20分の範囲であってもよい。分離時間は、この範囲内の任意の値、例えば、約7分を有してもよい。
同様に、開示される方法及びデバイスを使用して達成される分離効率及び分解能は、特定の分離技術と利用される動作パラメータ(例えば、分離チャネル長、マイクロ流体デバイス設計、緩衝剤組成、印加電圧など)とに応じて変化し得る。幾つかの実施形態では、達成される分離効率(例えば、理論段数)が約1,000~1,000,000の範囲であってもよい。場合によっては、分離効率は、少なくとも1,000、少なくとも5,000、少なくとも10,000、少なくとも20,000、少なくとも30,000、少なくとも40,000、少なくとも50,000、少なくとも60,000、少なくとも70,000、少なくとも80,000、少なくとも90,000、少なくとも100,000、少なくとも200,000、少なくとも300,000、少なくとも400,000、少なくとも500,000、少なくとも600,000、少なくとも700,000、少なくとも800,000、少なくとも900,000、又は、少なくとも1,000,000であってもよい。効率の分離分解能は、混合物中の検体の1つ以上の特性(例えば、分子量、拡散性、電気泳動又は等電移動度など)に応じて変化し得る。
マイクロ流体デバイスの設計及び製造:開示される方法、デバイス、及び、システムの幾つかの実施形態では、1つ以上のサンプル調製ステップ(例えば、濾過ステップ、事前濃縮ステップ、又は、抽出ステップなど)及び/又はエレクトロスプレーイオン化ステップを伴う分離ステップ(例えば、先に概説したようなステップ)を統合するように設計されるマイクロ流体デバイスを使用して、混合物からの検体の分離が行われてもよく、及び、ESI-MSを使用する検体のその後の分析が実行されていてもよい。
幾つかの実施形態において、開示されるマイクロ流体デバイスは、1つ以上のサンプル又は試薬ポート(入口ポート、サンプルウェル、又は、試薬ウェルとも称される)、1つ以上の廃棄物ポート(出口ポートとも称される)、前記入口ポート及び出口ポートを互いに又は中間流体チャネル(例えば、分離チャネル)と接続する1つ以上の流体チャネル、或いは、これらの任意の組み合わせを備えてもよい。幾つかの実施形態において、開示されるマイクロ流体デバイスは、1つ以上の反応チャンバ又は混合チャンバ、1つ以上の微細加工バルブ、1つ以上の微細加工ポンプ、1つ以上の通気構造、1つ以上の膜(例えば、濾過膜)、1つ以上のマイクロカラム構造(例えば、クロマトグラフィ分離媒体が充填された流体チャネル又は改変された流体チャネル)、又は、これらの任意の組み合わせを更に備えてもよい。
好ましい実施形態において、開示されるマイクロ流体デバイスは、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インタフェースを与えるべくエレクトロスプレーオリフィス又はエレクトロスプレーチップを組み込む。そのようなインタフェースの1つの非限定的な例は、同時係属中の米国特許出願公開第2017/0176386号及び第2018/0003674号に記載される。図1は、等電点電気泳動とそれに続くESI-MS特性評価とを実行するように設計されるマイクロ流体デバイスの1つの非限定的な例を示す。図1に示される流体チャネルネットワークは、標準的なフォトリソグラフィエッチング技術を使用して280nmの光の非常に低い透過率を有するソーダ石灰ガラスのプレートから製造される。分離(又は濃縮)チャネル418の深さは、ガラス層402の厚さと同じであり、すなわち、濃縮チャネル418は、ガラスプレート402の上端から下端までずっと延在する。デバイス400は、デバイス400の一方側に配置される光源によって照明されるとともに、デバイス400の反対側に配置される検出器によって撮像され得る。基板402は不透明であるが、濃縮チャネル418は光学スリットを画定するため、基板402は、濃縮チャネル418を通過しない光を遮断することができ、それにより、迷光を遮断して、撮像プロセスの分解能を向上させることができる。ガラス層402は、280nmの光を透過する(例えば、透明である)2つの石英ガラスプレート間に挟まれる。上端プレートは、機器及びユーザがチャネルネットワークとインタフェースするための貫通穴を含み、一方、下端プレートは中実である。3枚のプレートが30分間にわたって520℃で互いに結合される。入口及び出口のチューブは、チャネルネットワークに結合される劈開されたキャピラリー(100μmID、Polymicro)から製造される。タンパク質の等電点電気泳動及びその後の質量分析特性評価を実行する際のこのデバイスの動作は、以下の実施例1に記載される。
当業者に知られている様々な流体作動機構のいずれかを使用して、デバイスを通るサンプル及び試薬の流体の流量を制御してもよい。開示される方法、デバイス、及び、システムで用いるのに適した流体作動機構の例としては、1つ以上の入口ポート又は出口ポートに対する正又は負の圧力の印加、重力又は遠心力、界面動電力、エレクトロウェッティング力、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、正又は負の圧力は、例えば、流体チャネルを通じたサンプル又は試薬の流れを行わせるために入口ポート及び/又は出口ポートに結合される機械的アクチュエータ又はピストンの使用によって直接に印加されてもよい。幾つかの実施形態において、機械的アクチュエータ又はピストンは、入口ポート及び/又は出口ポートをシールするために使用される可撓性の膜又は隔壁に力を及ぼしてもよい。幾つかの実施形態において、正又は負の圧力は、例えば、1つ以上の入口ポート及び/又は出口ポートに接続される加圧ガスライン又は真空ラインの使用によって間接的に印加されてもよい。幾つかの実施形態では、1つ以上の入口ポート及び/又は出口ポートと接続されるポンプ、例えば、プログラム可能なシリンジポンプ、HPLCポンプ、又は、蠕動ポンプを使用して、流体の流れをもたらしてもよい。幾つかの実施形態において、界面動電力及び/又はエレクトロウェッティング力は、電界の使用及びデバイス内の表面特性の制御によって印加されてもよい。電界は、1つ以上の入口ポート及び/又は出口ポートに挿入される電極によって、又は、デバイス内の1つ以上の流体チャネルに組み込まれる電極によって印加されてもよい。電極は、デバイス内の電圧及び/又は電流を制御するために1つ以上のDC又はAC電源と接続されてもよい。
一般に、デバイスの本体を含む、開示されるマイクロ流体デバイスの入口ポート、出口ポート、流体チャネル、又は、他の構成要素は、ガラス、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマー(COC)又は環状オレフィンポリマー(COP)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、又は、他のエラストマー材料を含むがこれらに限定されない様々な材料のいずれかを使用して製造されてもよい。適切な製造技術は一般に材料の選択に依存し、逆もまた同様である。例としては、CNC機械加工、フォトリソグラフィ及び化学エッチング、レーザ光アブレーション、射出成形、ホットエンボス加工、ダイカット、3D印刷などが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、例えば、流体チャネルを備える流体工学層がチャネルをシールするために上層及び/又は下層の間に挟まれる層状構造を備えてもよい。上層及び/又は下層は、流体工学層の流体チャネルと位置合わせして入口ポート及び/又は出口ポートなどを形成する開口を備えてもよい。2つ以上のデバイス層が、分解されてもよいデバイスを形成するために互いにクランプされてもよく、或いは、恒久的に結合されてもよい。適切な結合技術は、一般に、層を製造するために使用される材料の選択に依存する。例としては、陽極接合、熱接合、レーザ溶接、又は、硬化性接着剤(例えば、熱硬化性又は光硬化性の接着剤)の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイス内の入口ポート、出口ポート、又は、流体チャネルの全て又は一部は、電気浸透流特性を変えるために使用される表面コーディング(例えば、HPC又はPVAコーティング)及び/又は入口ポート、出口ポート、又は、流体チャネル壁の疎水性/親水性特性を変えるために使用される表面コーティング(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)コーティング)を備えてもよい。
開示されるデバイスの入口ポート及び/又は出口ポートは、様々な形状及びサイズで製造され得る。適切な入口ポート及び/又は出口ポートの幾何学的形態としては、球形、円筒形、楕円形、立方体、円錐形、半球形、長方形、又は、多面体(幾つかの平面から構成される3次元の幾何学的形態、例えば、直方体、六角柱、八角柱、逆三角錐、逆四角錐、逆五角錐、逆六角錐、又は、逆角錐台)、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
入口ポート及び/又は出口ポートの寸法は、平均の直径及び深さに関して特徴付けられてもよい。本明細書中で使用される入口ポート又は出口ポートの平均直径は、入口ポート及び/又は出口ポートの幾何学的形態の平断面内で内接され得る最大の円を指す。本開示の幾つかの実施形態において、入口ポート及び/又は出口ポートの平均直径は、約0.1mm~約10mmの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、入口ポート及び/又は出口ポートの平均直径は、少なくとも0.5mm、少なくとも1mm、少なくとも2mm、少なくとも4mm、少なくとも8mm、又は、少なくとも10mmであってよい。幾つかの実施形態において、平均直径は、最大10mm、最大8mm、最大6mm、最大4mm、最大2mm、最大1mm、又は、最大0.5mmであってよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、平均直径が約2mm~約8mmの範囲であってもよい。当業者であれば認識できるように、入口ポート及び/又は出口ポートの平均直径がこの範囲内の任意の値、例えば、約5.5mmを有する。
幾つかの実施形態では、入口ポート及び/又は出口ポート(例えば、サンプル又は試薬ウェル)の深さが約5μm~約500μmの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、深さは、少なくとも5μm、少なくとも10μm、少なくとも25μm、少なくとも50μm、少なくとも75μm、少なくとも100μm、少なくとも200μm、少なくとも300μm、少なくとも400μm、又は、少なくとも500μmであってもよい。幾つかの実施形態において、深さは、最大500μm、最大400μm、最大300μm、最大200μm、最大100μm、最大50μm、最大25μm、最大10μm、又は、最大5μmであってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、入口及び/又は出口ポートの深さが約50μm~約200μmの範囲であってもよい。当業者であれば認識できるように、深さがこの範囲内の任意の値、例えば、約130μmを有してもよい。幾つかの実施形態では、入口ポート及び/又は出口ポート(例えば、サンプル又は試薬ウェル)の深さが約500μm~約50mmの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、深さは、少なくとも1mm、少なくとも5mm、少なくとも10mm、少なくとも15mm、少なくとも20mm、又は、少なくとも50mmであってもよい。幾つかの実施形態において、深さは、最大で50mm、最大で20mm、最大で15mm、最大で10mm、最大で5mm、又は、最大で1mmであってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、入口ポート及び/又は出口ポートの深さが約50μm~約5mmの範囲であってもよい。
幾つかの実施形態において、開示されるデバイスの流体チャネルは、正方形、長方形、円形などの様々な断面形状のいずれかを有してもよい。一般に、流体チャネルの断面形状は、それらを形成するために使用される製造技術に依存し、逆もまた同様である。幾つかの実施形態では、流体チャネルの断面寸法(例えば、非長方形断面の流体チャネルに関する高さ、幅、又は、平均直径であり、ここで、平均直径は、流体チャネルの断面形状内で内接され得る最大円の直径として定義される)が約5μm~約500μmの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、流体チャネルの寸法は、少なくとも5μm、少なくとも10μm、少なくとも25μm、少なくとも50μm、少なくとも75μm、少なくとも100μm、少なくとも200μm、少なくとも300μm、少なくとも400μm、少なくとも500μm、又は、少なくとも1000μmであってもよい。幾つかの実施形態において、流体チャネルの寸法は、最大で1000μm、最大で500μm、最大で400μm、最大で300μm、最大で200μm、最大で100μm、最大で50μm、最大で25μm、最大で10μm、又は、最大で5μmであってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、流体チャネルの寸法が約75μm~約300μmの範囲であってもよい。当業者であれば認識できるように、寸法がこの範囲内の任意の値、例えば、約95μmを有してもよい。幾つかの実施形態では、流体チャネルの深さがデバイスの入口ポート及び/又は出口ポートの深さに等しくてもよい。
撮像技術:開示される方法及びデバイスの幾つかの実施形態において、検体分離ステップ及び/又は動員ステップの撮像は、紫外(UV)光吸収、可視光吸収、蛍光、フーリエ変換赤外分光法、フーリエ変換近赤外分光法、ラマン分光法、光学分光法などの光学検出技術を使用して実行されてもよい。幾つかの実施形態では、分離(又は濃縮)チャネルの全部又は一部、分離チャネルの端部とダウンストリーム分析機器又はエレクトロスプレーオリフィス又はチップ、エレクトロスプレーオリフィス又はチップ自体を接続する接合部又は接続チャネル、或いは、これらの任意の組み合わせが撮像されてもよい。幾つかの実施形態では、分離(又は濃縮)チャネルがキャピラリーのルーメンであってもよい。幾つかの実施形態では、分離(又は濃縮)チャネルがマイクロ流体デバイス内の流体チャネルであってもよい。
分離された検体バンドの検出のために使用される(1又は複数の)波長範囲は、一般に、撮像技術の選択と、デバイス又はその一部を製造するための材料とに依存する。例えば、UV光吸光度が分離チャネルの全部又は一部或いはマイクロ流体デバイスの他の部分を撮像するために使用される場合には、約220nm(ペプチド結合の本来の吸収度に起因する)及び/又は約280nm(芳香族アミノ酸残留物の本来の吸光度に起因する)での検出により、デバイスの少なくとも一部、例えば分離チャネルがこれらの波長の光を透過するならば、分離中及び/又は動員中にタンパク質バンドを視覚化できる。幾つかの実施形態において、ESI-MSを介して分離及び特徴付けられるべき検体は、分離前に、例えば、蛍光プローブ、化学発光タグ、又は、他の適切な標識で標識化されてもよく、それにより、蛍光撮像又は他の適した撮像技術を使用して検体を撮像できる。幾つかの実施形態では、例えば、検体が商業的製造プロセスによって生成されるタンパク質を含む実施形態では、タンパク質が緑色蛍光タンパク質(GFP)ドメイン又はその変異体を組み込むように遺伝子操作されてもよく、それにより、蛍光を使用してタンパク質を撮像できる。幾つかの実施形態では、タンパク質がタグ付け又は標識化されてもよい。標識化されたタンパク質は、選択された分離技術が基づいている検体特性を標識が妨げない又は混乱させないように構成されてもよい。
開示される方法、デバイス、及び、システムを実装する目的で、様々な撮像システム構成要素のいずれかが利用されてもよい。例としては、1つ以上の光源(例えば、発光ダイオード(LED)、ダイオードレーザ、ファイバレーザ、ガスレーザ、ハロゲンランプ、アークランプなど)、集光レンズ、対物レンズ、ミラー、フィルタ、ビームスプリッタ、プリズム、画像センサ(例えば、CCD画像センサ又はカメラ、CMOS画像センサ又はカメラ、ダイオードアレイ、熱画像センサ、FTIRなど)、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。利用される撮像モードに応じて、光源及び画像センサは、例えば、吸光度に基づく画像を取得できるように、マイクロ流体デバイスの両側に位置付けられてもよい。幾つかの実施形態において、光源及び画像センサは、例えば、落射蛍光画像を取得できるように、マイクロ流体デバイスの同じ側に位置付けられてもよい。
画像は、分離中、動員中、及び/又は、エレクトロスプレーのステップ中に連続的に取得されてもよく、又は、ランダムに又は特定の時間間隔で取得されてもよい。幾つかの実施形態では、一連の1つ以上の画像が、連続的に、ランダムな時間間隔で、又は、特定の時間間隔で取得される。幾つかの実施形態では、一連の1つ以上の画像がビデオ画像を含んでもよい。
エレクトロスプレー前のタンパク質等電点の決定のためのpIマーカーの撮像:幾つかの実施形態では、前述したように、CIEFに晒されてしまった分離された検体混合物を含む分離チャネルの画像中の2つ以上のpIマーカーの位置を使用して、1つ以上の個々の検体ピーク(タンパク質検体ピークなど)の等電点を決定してもよい。幾つかの実施形態において、1つ以上の検体ピークに関する等電点は、局所的なpHと分離チャネルに沿う位置との間の想定された線形関係に基づいて2つ以上のpIマーカーの位置から計算される。幾つかの実施形態において、1つ以上の検体ピークに関する等電点は、局所的なpHと分離チャネルに沿う位置との間の関係を表す非線形フィッティング関数(例えば、非線形多項式)に基づいて3つ以上のpIマーカーの位置から計算される。幾つかの実施形態において、1つ以上の検体に関する等電点は、分離チャネルの画像から決定される2、3、4、5、6、7、8、9、又は、10以上のpI標準の位置に基づいて計算される。
幾つかの実施形態において、2つ以上のpIマーカーの位置を決定するために使用される画像は、検体混合物が分離されているときに取得され、また、各検体バンドのpIの計算は、分離が続くにつれて繰り返し更新される。幾つかの実施形態において、2つ以上のpIマーカーの位置を決定するために使用される画像は、分離が完了した後、動員ステップの開始前に取得される。幾つかの実施形態において、2つ以上のpIマーカーの位置を決定するために使用される画像は、分離された混合物が動員されてエレクトロスプレーチップ又はオリフィスを通じて排出されるときに取得される。幾つかの実施形態において、2つ以上のpIマーカーの位置を決定するために使用される画像は、分離された混合物が動員されて分離チャネルをダウンストリーム分析機器に接続する流体チャネルを通じて排出されるときに取得される。
幾つかの実施形態において、2つ以上のpIマーカーの位置及び分離された混合物中の(1又は複数の)検体バンドの位置を決定するために使用される画像は、コンピュータ実装方法(例えば、ソフトウェアパッケージ)を使用して取得される。幾つかの実施形態において、2つ以上のpIマーカー並びに(1又は複数の)検体バンドの位置は、自動化された画像処理を含むコンピュータ実装方法を使用して決定される。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、自動化された画像処理から得られる位置データに基づいて1つ以上の検体バンドの等電点の計算を実行することを更に含む。
図2は、分離チャネル(又はマイクロ流体デバイスの他の部分)の(1又は複数の)画像を取得し、(1又は複数の)画像中のpIマーカー及び検体バンドの位置を決定する(すなわち、分離ステップがCIEFを含む場合)とともに、検体の分離された混合物中の1つ以上の検体バンドに関するpIを計算するコンピュータ実装方法のためのプロセスフローチャートの一例を与える。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、一連の1つ以上の画像の取得を制御することを含んでもよく、これらの画像は、その後、pIマーカー及び分離された検体バンドの位置を特定するために処理される。適切な自動画像処理アルゴリズムの例については以下でより詳しく説明する。幾つかの実施形態において、pIマーカーの予測位置、例えば、pIマーカーのみを含む「対照」サンプルの画像から決定されるpIマーカーの位置に関する所定の知識を使用して、pIマーカーに対応するバンドと分離された検体に対応するバンドとの間を区別してもよい。幾つかの実施形態において、pIマーカーの画像は、分離された検体バンドの画像を取得するために使用されるものとは異なる波長で又は異なる撮像モードを使用して取得されてもよい。図2に示されるように、画像処理ステップが既知の数のpIマーカーに関する及び/又は分離された検体バンドに関する位置を決定できない場合、システムは、画像処理ステップを繰り返すことができるように(1又は複数の)新たな画像を取得するように指示されてもよい。pIマーカー及び分離された検体バンドの位置が決定された時点で、pIマーカーの位置に関するデータが、pH勾配に関してユーザが選択したモデル(例えば、線形又は非線形のモデル)に対して適合され、その後、局所的なpHと分離チャネルに沿う位置との間の結果として得られる適合関係を使用して、1つ以上の検体バンドに関する等電点が計算される。
幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、pIマーカー及び検体バンドの位置を検出するステップ、pH勾配モデルに対して位置データを適合させるステップ、及び、1つ以上の検体バンドに関して等電点を計算するステップが繰り返されることにより等電点が連続的に更新されて精緻化される(例えば、幾つかの決定の平均化によって)反復プロセスであってもよい。幾つかの実施形態では、画像を取得して処理するステップ、pIマーカー及び検体バンドの位置を検出するステップ、pH勾配モデルに対してpIマーカー位置データを適合させるステップ、及び、1つ以上の検体バンドに関する等電点を計算するステップを含むサイクルが、等電点の計算を少なくとも0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz、又は、1,000Hzの速度又は任意の他の関連する速度で、例えば、少なくともナイキストレートの速度で更新して精緻化できる十分短い時間で完了されてもよい。
速度を決定するための検体バンドの撮像:幾つかの実施形態において、前述したように、1つ以上の検体バンドの位置は、1つ以上の検体バンドに関する速度を2つ以上の画像中の検体バンドの相対位置の差と2つ以上の画像に関する取得時間同士の間の既知の時間間隔とから計算できるように、分離チャネル(又はマイクロ流体デバイスの他の部分)の一連の2つ以上の画像から決定されてもよい。幾つかの実施形態では、分離ステップが実行されている間に、分離チャネルの少なくとも一部の2つ以上の画像を取得されてもよい。幾つかの実施形態では、2つ以上の画像が動員ステップ中に取得されてもよい。幾つかの実施形態において、2つ以上の画像は、分離チャネルの端部をダウンストリーム分析機器に接続する流体チャネルを通じて分離されたサンプルが排出されている間に取得されてもよい。幾つかの実施形態において、2つ以上の画像は、テイラーコーンを形成するべく分離されたサンプルがエレクトロスプレーチップ又はオリフィスを通じて排出されている間に取得されてもよい。幾つかの実施形態では、所定の検体バンドが分離チャネルから流出する時間を計算するために、1つ以上の検体バンドに関して決定される速度が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、例えば、分離チャネルの端部を出口ポート、例えば、エレクトロスプレーオリフィス又はチップと接続する1つ以上の相互接続する流体接合部又は流体チャネルが存在するときに、1つ以上の検体バンドに関して決定される速度を使用して、所定の検体バンドが出口ポートに到達してデバイスから流出する時間を計算してもよい。幾つかの実施形態では、1つ以上の検体バンドに関して決定される速度を使用して、所定の検体バンドがエレクトロスプレーチップ又はエレクトロスプレーオリフィスから流出してエレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計の入口との間に形成されるテイラーコーンに入る時間を計算してもよい。
幾つかの実施形態において、1つ以上の検体バンドに関する速度を決定するために使用される画像のシーケンスは、コンピュータ実装方法(例えば、ソフトウェアパッケージ)を使用して取得されてもよい。幾つかの実施形態において、1つ以上の検体バンドの速度は、自動画像処理を含むコンピュータ実装方法を使用して決定される。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、所定の検体バンドが分離チャネルから流出する時間の計算を実行することを更に含む。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、所定の検体バンドが出口ポートに到達してデバイスから流出する時間の計算を実行することを更に含む。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、所定の検体バンドがエレクトロスプレーチップ又はエレクトロスプレーオリフィスから流出してエレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計の入口との間に形成されるテイラーコーンに入る時間の計算を実行することを更に含む。幾つかの実施形態において、1つ以上の検体バンドに関して決定される(1又は複数の)流出時間は、特定の検体バンドを質量分析データ又は他の分析機器を使用して収集されるデータと相関させるために使用される。
図3は、分離チャネル(又はマイクロ流体デバイスの他の部分)の(1又は複数の)画像を取得し、1つ以上の検体バンドの速度を決定するとともに、所定の検体バンドがデバイス内の特定のポイント、例えば、分離チャネルの端部、分離チャネルと二次流体チャネルとの間の接合点、デバイスの出口ポート、又は、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスの出口に達する時間を計算するためのコンピュータ実装方法に関するプロセスフローチャートの他の例を与える。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、一連の1つ以上の画像の取得を制御することを含んでもよく、これらの画像は、その後、分離された検体バンドの位置を特定するために処理される。適切な自動画像処理アルゴリズムの例については以下でより詳しく説明する。図3に示されるように、画像処理ステップが分離された検体バンドに関する位置を決定できない場合、システムは、画像処理ステップを繰り返すことができるように(1又は複数の)新たな画像を取得するように指示されてもよい。分離された検体バンドの位置が一連の2つ以上の画像に関して決定された時点で、2つ以上の画像中の検体バンドの相対位置と2つ以上の画像の取得時間同士の間の既知の(1又は複数の)時間間隔とに基づいて検体ピークのうちの1つ以上に関して速度が計算される。幾つかの実施形態では、一連の画像における1つの画像から次の画像までの1つ以上の検体バンドの追跡を使用して、幾つかの分離された検体バンド間を区別するとともに、速度計算を精緻化してもよい(例えば、一連の画像における画像の幾つかの対から計算される速度値を平均化することによって)。幾つかの実施形態では、選択された撮像モードを使用して検出され得るpIマーカー又は他の内部標準が「速度標準」として使用されてもよい。このようにして決定される検体バンド速度を使用して、所定のバンドがデバイス内のユーザ指定ポイント、例えば、分離チャネルの出口端部、デバイス内の特定の流体接合部、デバイスの出口ポート、検体がテイラーコーンに入るエレクトロスプレーイオン化チップ又はオリフィスなどに到達する時間を計算してもよい。
幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、検体バンド位置を検出するステップ、検体バンド速度を決定するステップ、及び、流出時間を計算するステップが繰り返されることにより流出時間予測が連続的に更新されて化学分離データと質量分析データ(又は他のタイプのダウンストリーム分析データ)との相関が更に改善される反復プロセスであってもよい。幾つかの実施形態において、画像取得及び処理ステップ、速度計算ステップ、及び、(1又は複数の)流出時間予測ステップを含むサイクルは、(1又は複数の)流出時間予測が少なくとも0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz、又は、1,000Hzの速度で、又は任意の他の関連する速度で、例えば少なくともナイキストレートの速度で更新され得る十分短い時間で完了されてもよい。
分離データと質量分析データとの相関:幾つかの実施形態では、等電点電気泳動される検体バンドに関する正確な等電点の撮像に基づく決定を実行するための前述のコンピュータ実装方法により、等電点データを質量分析データ(又は他の分析データ)における特定のm/zピークと相関させることができ、それにより、データセットの情報内容が改善される(実験の単一実行の場合でも)とともに、検体サンプルのより定量的な特性評価が可能になる。
幾つかの実施形態では、画像から得られるデータを使用して分離された検体バンドに関して速度を計算して流出時間を予測するための前述したコンピュータ実装方法(様々な異なる分離技術のいずれかを使用する)により、化学分離データ(例えば、保持時間、電気泳動移動度、等電点など)と質量分析データ(又は他の分析データ)における特定のm/zピークとの間の時間相関を改善することができ、それにより、データセットの情報内容が改善される(実験の単一実行の場合でも)とともに、分離時間の実験ごと又は機器ごとの変動を補正できるため、異なるサンプル実行、異なるサンプルに関して収集されたデバイスと異なる機器で収集されたデータとのより定量的な比較が可能となる。したがって、開示される方法、デバイス、及び、システムは、様々なメタボロミクス、プロテオミクス、及び、薬物開発又は製造用途にとって特に有利となり得る。
幾つかの実施形態(例えば、CIEFステップを含む実施形態)において、本開示のコンピュータ実装方法は、正確な等電点の撮像に基づく決定、及び、分離された検体バンドの速度の撮像に基づく決定の両方を実行してもよい。
質量分析及びエレクトロスプレーイオン化:幾つかの実施形態において、本開示の方法、デバイス、及び、システムは、分離された検体混合物のエレクトロスプレーイオン化及びその質量分析計への注入を実行するように構成されてもよい。質量分析(MS)は、サンプル中の検体分子をイオン化してそれらの質量-電荷(m/z)比に基づいて得られたイオンを選別することによって検体分子の「質量」を測定する分析技術である。先行の液相又は気相サンプル分離システムと組み合わせて、質量分析は、例えば生物学的サンプルにおいて、一般的であるように、複数の少量の検体を含む複合サンプルを分析するために利用できる最も効果的な手段のうちの1つを与える。
全ての質量分析計は、質量分析器への導入前にイオンが気相にあるという要件を共有する。マトリックス支援レーザ脱離イオン化(MALDI)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI)を含むがこれらに限定されない様々なサンプルイオン化モードが開発されてきた。MALDI技術において、サンプル(例えば、タンパク質の混合物を含む生物学的サンプル)は、シナピン酸又はα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸などのエネルギー吸収マトリックス(EAM)と混合されて、金属プレート上で結晶化される。表面増強レーザ脱離イオン化(SELDI)は、特定のクラスのタンパク質の特異的結合を促進するために金属プレート上に更なる界面化学を組み込む技術の一般的な変形である。プレートが真空チャンバ内へ挿入され、また、マトリックス結晶には窒素レーザから光パルスが当て付けられる。マトリックス分子によって吸収されるエネルギーがタンパク質に伝達され、それにより、タンパク質が、脱離、イオン化し、気相でイオンのプルームを生成し、これらのイオンは、電界の存在下で加速されて、フライトチューブに引き込まれ、該フライトチューブで、これらのイオンは、飛行時間を記録する検出器にイオンが衝突するまで漂流する。引き続き、飛行時間を使用して、イオン化された種のm/z比を計算してもよい。開示されるデバイスの幾つかの実施形態において、デバイスの出口ポートは、例えば、特定の検体バンドのための等電点をMALDI質量分析計データと相関させるために、質量分光分析に備えて分離された検体バンド(又はその一部)をMALDIプレート上に堆積するために使用されるキャピラリー又は他の機能部を備えてもよい。
エレクトロスプレーイオン化(ESI;本明細書中では単に「エレクトロスプレー」とも称される)は、液体クロマトグラフィ又は動電クロマトグラフィ分離技術を質量分析計とインタフェースするためのその固有の互換性に起因して幅広く使用される他の技術である。前述したように、エレクトロスプレーイオン化では、サンプル及び溶液の小さな液滴が、チップ又はオリフィスと質量分析計のソースプレートとの間の電界の印加により、エレクトロスプレー機能(例えば、エミッタチップ又はオリフィス)を備えるキャピラリー又はマイクロ流体デバイスの先端部から放出される。その後、液滴は、この誘導電界内で伸長及び膨張し、蒸発して更なる分離及び検出のために質量分析計に導入される気相イオンを生成する益々小さい液滴を含む円錐形状の放出(すなわち、「テイラーコーン」)を形成する。ESIにとって都合の良い液滴量を与えるマイクロ流体チップ形態に組み込まれたキャピラリー又はコーナー又はESIチップからエミッタチップが形成されてもよい。ラッピングホイール、ヤスリ、機械加工工具、CNC機械加工工具、ウォータージェット切断、或いは、小さい表面量等を与えるようにESIチップを形成するための他の工具又はプロセスなどを使用して、エミッタチップが小さい表面及び滴量をもたらすべく鋭利にされてもよい。幾つかの実施形態において、チップは、チップのチップ部を加熱して伸長することによって引き出されてもよい。幾つかの実施形態では、その後、チップが所望の長さ又は直径まで切断されてもよい。幾つかの実施形態において、エレクトロスプレーチップは、チップ上に形成される液滴のサイズを最小にし得る疎水性コーティングでコーティングされてもよい。幾つかの実施形態において、システムは、検体がデバイスから溶出されていないときに、分離ステップ中に動員材、陰極液、又は、任意の他の液体をエレクトロスプレーしてもよい。
開示される方法、デバイス、及び、システムの幾つかの実施形態では、誘導結合レーザイオン化、高速原子衝撃、ソフトレーザ脱離、大気圧化学イオン化、二次イオン質量分析、スパークイオン化、熱イオン化、及び、同様のものなどの他のイオン化方法が使用される。
エレクトロスプレーイオン化に関して、幾つかの実施形態では、開示されるマイクロ流体デバイスは、図1に示されるように、効率的なエレクトロスプレーイオン化及びダウンストリーム質量分析との都合の良いインタフェースを促進させるようになっている機能を備える。マイクロ流体デバイスから排出されて(例えば生物学的又はバイオシミラー)質量分析計に導入される検体に関する質量-電荷比(又は「質量」)は、様々な異なる質量分析計形態のいずれかを使用して測定され得る。例としては、飛行時間~質量分析、四重極質量分析、イオントラップ又はオービトラップ質量分析、飛行距離型質量分析、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、共鳴質量測定、及び、ナノメカニカル質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイスのエレクトロスプレー機能部は、分離チャネルと一直線になっていてもよい。幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイスのエレクトロスプレー機能部は、分離チャネルに対して直角又は中間角度に向けられてもよい。開示される方法の幾つかの実施形態では、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスで実行される最終分離又は濃縮ステップからの分離及び/又は濃縮された検体画分の実質的に全てが、連続した流れでエレクトロスプレーチップ又はエレクトロスプレー機能部から排出される。幾つかの実施形態において、検体混合物の一部(例えば、対象の画分)は、質量分析計又はサンプルの少なくとも一部を分画する及び/又は濃縮するように構成される別のデバイスなどの分析機器とインタフェースするように構成される出口を介してマイクロ流体デバイスから排出されてもよい。検体混合物の他の部分(例えば、対象の画分以外の画分を含む)を廃棄物チャネルにより排出できる。
幾つかの実施形態において、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスからの排出は、圧力、電気力、イオン化、又は、これらの任意の組み合わせを使用して実行される。幾つかの実施形態では、排出が前述のような動員ステップと一致する。幾つかの実施形態において、エレクトロスプレーイオン化のために使用されるシース液は、電気泳動分離のための電解質として使用される。幾つかの実施形態において、噴霧ガスは、検体画分を微細なスプレーにまで減らすように供給される。
エレクトロスプレーイオン化性能の撮像に基づくフィードバック:キャピラリー又はマイクロ流体デバイスを使用する従来のESI-MSシステムは、一般に、動作中にテイラーコーンを再確立するべくシステムを較正するためのツールを備えない。安定したテイラーコーンの維持は、マイクロ流体デバイス内又はキャピラリー内の分離チャネルの全体にわたって印加される電気泳動電界によって複雑化され得る。実行間又は実行中の試薬の導電率の変化は、質量分析計とのインタフェースにおける電位を変化させる可能性がある。インタフェースでの電位の変化は、テイラーコーンに悪影響を及ぼす場合があり、エレクトロスプレーイオン化効率の損失をもたらし得る。本明細書中に開示されるのは、エレクトロスプレーイオン化性能を向上させるための方法及びシステムであり、したがって、キャピラリーに基づく又はマイクロ流体デバイスに基づくESI-MSシステムに関して収集される質量分析データの品質である。幾つかの実施形態では、例えば、テイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性が特定の範囲内に維持されるように1つ以上の動作パラメータのフィードバック制御を行うべく、エレクトロスプレーイオン化セットアップにおけるテイラーコーンの撮像がコンピュータ実装方法で使用されてもよい。幾つかの実施形態において、そのようなフィードバックプロセスによって制御され得る動作パラメータとしては、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計の入口との位置合わせ、エレクトロスプレーチップと質量分析計の入口との間の距離(例えば、プログラム可能な精密X-Y-Z変換ステージ上に一体型エレクトロスプレー機能部を備えるキャピラリーチップ又はマイクロ流体デバイス装着することによって)、エレクトロスプレーチップを通じた検体サンプルの流量(例えば、検体サンプルの排出をもたらすために使用される圧力、電界強度、又は、これらの組み合わせを調整することによって)、例えばチャネルの基端部、例えば、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計の入口との間で印加される電圧、排出される検体サンプルの周囲のシース液体又はシースガスの体積流量、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
図4は、(i)テイラーコーンの画像を取得する(様々な画像センサ、例えば、CCD画像センサ又はCMOS画像センサのいずれかを使用する)、(ii)画像を処理してテイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性を決定する、(iii)テイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性を指定値又は目標値のセットと比較する、及び、(iv)前記比較に基づき、テイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性を1つ以上の動作パラメータに関連付ける数学アルゴリズムを使用して、1つ以上の動作パラメータに適した調整を決定し、テイラーコーンを指定値又は目標値に回復させるために使用されるコンピュータ実装方法のためのプロセスフローチャートの一例を与える。幾つかの実施形態では、テイラーコーンの画像から得られるデータに加えて、質量分析計から取得されるデータ(例えば、総イオン電流データ)を使用して、システム性能を監視するとともに、1つ以上の動作パラメータに対して調整を行ってもよい。
幾つかの実施形態において、画像を取得して処理するステップ、テイラーコーン特性を特定するステップ、前記テイラーコーン特性と目標値のセットとを比較するステップ、及び、1つ以上のESI-MSシステムの動作パラメータに必要な調整を計算するステップを含む図4に示される周期的プロセスは、1つ以上の動作パラメータを少なくとも0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz、又は、1,000Hzの速度で、又は、任意の他の関連する速度で、例えば少なくともナイキストレートの速度で更新できるのに十分短い時間で完了されてもよい。
交互に行う高質量/低質量走査:開示される方法、デバイス、及び、システムの幾つかの実施形態において、質量分析計は、高質量走査範囲(例えば、約1500~6000のm/z範囲)又は「高質量走査」と低質量走査範囲(例えば、約150~1500のm/z範囲)又は「低質量走査」の間で交互に行うように設定されてもよく、これにより、低質量走査を使用して低質量マーカー、例えば、等電点電気泳動分離ステップが実行された場合には遊離溶液両性電解質を特定することができ、低質量マーカーは、質量分析データで特定され得るとともに、低質量マーカーによって示される特性(例えば、遊離溶液両性電解質が検出される場合の等電点の特定の範囲、ペプチド、小分子マーカー)に関してそれを較正するために使用され得る。高質量走査と低質量走査との間の切り換え及び走査速度は、エレクトロスプレーインタフェースからの検体サンプルの流出に比べて高速でなければならない。場合によっては、高質量走査と低質量走査との間の切り換え速度が約0.5Hz~約50Hzの範囲であってもよい。場合によっては、切り換え速度は、少なくとも0.5Hz、少なくとも1Hz、少なくとも5Hz、少なくとも10Hz、少なくとも20Hz、少なくとも30Hz、少なくとも40Hz、又は、少なくとも50Hzであってもよい。
ESIチップ電圧を一定に保つための高分離/動員動電圧及び低分離/動員動電圧の変更:幾つかの実施形態において、質量分析計のESIイオン源は、質量分析計に関して負電圧を設定できる調整可能な電源を有する。幾つかの実施形態において、質量分析計のESIイオン源は、質量分析計に関して正電圧を設定できる調整可能な電源を有する。幾つかの実施形態では、質量分析計のESIイオン源がグランドに保持される。幾つかの実施形態において、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスにおけるESIチップは、ESIチップと質量分析計の帯電したESIイオン源との間に電界を生成するためにグランド又はその付近に保持される。幾つかの実施形態において、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスにおけるESIチップは、正又は負の電圧に保持されて、ESIチップと質量分析計の接地されたESIイオン源との間に電界を生成する。
図15は、動員中にESIチップ電圧を0Vに維持しつつアノードとカソードとの間で3000Vの一定の電圧降下を維持するためのコンピュータ制御フィードバックループの典型的なフローチャートを与える。幾つかの実施形態において、このフィードバックループは、質量分析計のESIイオン源がグランドに対して正電圧又は負の電圧(例えば、-3500V)に設定されるときに実施されてもよい。この例では、図7Aにおいて最初に陽極液ポート110を+3000Vに設定するとともに動員材ポート104を0Vに設定することによって陽極液ポート110と動員材ポート104との間のΔVが3000Vに維持される。幾つかの実施形態において、異なるΔVは、陽極液ポート110を異なる値に設定することによって設定されてもよい。幾つかの実施形態では、陽極動員が使用されてもよく、また、ポート110が例えば-3000Vに設定される陰極液ポートである。図15に概説された例では、動員中に、分離チャネル112内の抵抗が、電荷を回復する分離において検体及び両性電解質に起因して低下している。これにより、チャネル112の全体にわたる電圧降下が低下し、その結果、式1にしたがって、ESIチップ116の電圧の増大がもたらされる。
V116=(ΔV110-104)*(R105)/(R109+R112+R105)
しかしながら、ESIチップ電圧116を測定又は計算することにより、陽極液ポート110及び動員材ポート104の電圧設定を調整できる。陽極液ポート110及び動員材ポート104の両方の設定からESIチップ電圧116を差し引くことにより、ΔV110-104が3000Vのままであり、それにより、動員は影響されないが、式2にしたがってESIチップ116の電圧が0に設定される。
しかしながら、ESIチップ電圧116を測定又は計算することにより、陽極液ポート110及び動員材ポート104の電圧設定を調整できる。陽極液ポート110及び動員材ポート104の両方の設定からESIチップ電圧116を差し引くことにより、ΔV110-104が3000Vのままであり、それにより、動員は影響されないが、式2にしたがってESIチップ116の電圧が0に設定される。
V116=(ΔV110-104)*(R105)/(R109+R112+R105)+V104
このフィードバックループは、動員が完了するまで動作し続け、それにより、ESIチップ116の電圧が通常の周波数で、例えばナイキストレート又は約0.2Hzで0に調整される。場合によっては、ESIチップ116の電圧は、少なくとも0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz、又は、1,000Hzの速度で0に調整されてもよい。ESIチップ116で一定の安定した電圧を維持することは、動員プロセス中に安定したエレクトロスプレーを維持するために重要となり得る。
このフィードバックループは、動員が完了するまで動作し続け、それにより、ESIチップ116の電圧が通常の周波数で、例えばナイキストレート又は約0.2Hzで0に調整される。場合によっては、ESIチップ116の電圧は、少なくとも0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz、又は、1,000Hzの速度で0に調整されてもよい。ESIチップ116で一定の安定した電圧を維持することは、動員プロセス中に安定したエレクトロスプレーを維持するために重要となり得る。
場合によっては、フィードバックループは、ESIチップの電圧を予め設定された値の特定のパーセンテージ内に維持するように動作する。例えば、場合によっては、フィードバックループは、ESIチップの電圧を予め設定された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、又は、0.1%内に維持するように動作する。場合によっては、フィードバックループは、ESIチップ電圧を1000V、500V、100V、75V、50V、25V、10V、5V、又は、1Vの予め設定された値の範囲に維持するように動作する。
幾つかの実施形態では、質量分析計のESIイオン源がグランドに保持され、また、ESIチップ116と質量分析計との間に電界を生成するためにESIチップ116が一定の正電圧又は負電圧に保たれる必要がある。幾つかの実施形態において、ESIチップ電圧(例えば、予め設定された値)は、約+5000V、約+4000V、約+3500V、約+3000V、約+2500V、約+2000V、約+1500V、約+1000V、約+500V、又は、約-5000V、約-4000V、約-3500V、約-3000V、約-2500V、約-2000V、約-1500V、約-1000V、又は、約-500Vであってもよい。図12は、動員中にESIチップ電圧を3000Vに維持しつつアノードとカソードとの間で3000Vの一定の電圧降下を維持するためのコンピュータ制御フィードバックループのフローチャートの一例を与える。コンピュータ制御フィードバックループの動作は、陽極液ポート110及び動員材ポート104の電圧が+3000Vだけオフセットされ、それにより、ESIチップ116の電圧が+3000Vにオフセットされ、依然として式2にしたがうことを除き、図15と同じである。幾つかの実施形態では、電界強度の制御をアナログ回路を使用して達成できる。幾つかの実施形態において、キャピラリーに基づく又はマイクロ流体デバイスに基づく分離システムと接触する1つ以上の電極における電圧の制御は、1つ、2つ、3つ、又は、4つ以上の独立した高電圧電源を使用することによって行われてもよい。場合によっては、キャピラリーに基づく又はマイクロ流体デバイスに基づく分離システムと接触する1つ以上の電極における電圧の制御は、例えば、単一の多重化された高電圧電源を使用することによって行われてもよい。
場合によっては、フィードバックループは、分離チャネル内の電界強度又はアノードとカソードとの間の電圧降下を予め設定された値の特定のパーセンテージ内に維持するように動作する。例えば、場合によっては、フィードバックループは、分離チャネル内の電界強度又はアノードとカソードとの間の電圧降下を予め設定された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、又は、0.01%内に維持するように動作する。場合によっては、フィードバックループは、分離チャネル内の電界強度又はアノードとカソードとの間の電圧降下を1000V、500V、100V、75V、50V、25V、10V、5V、又は、1Vの予め設定された値の範囲内に維持するように動作する。
システムハードウェア:図5は、開示される方法、デバイス、及び、システムの1つの実施形態におけるシステムハードウェアブロック図の概略図を与える。図示のように、本開示のシステムは、以下のハードウェア構成要素、すなわち、(i)化学分離システム(例えば、検体分離、例えば、等電点電気泳動に基づく分離を実行するように設計されるキャピラリー又はマイクロ流体デバイス、及び、1つ以上の高電圧電源)、(ii)場合によっては(破線により示されるように)分離システムと直接に一体化されてもよい質量分析計用のエレクトロスプレーインタフェース、(iii)質量分析計、(iv)撮像デバイス又はシステム、(v)プロセッサ又はコンピュータ、及び、(vi)コンピュータメモリデバイス、又は、これらの任意の組み合わせのうちの1つ以上を備えてもよい。幾つかの実施形態において、システムは、1つ以上のキャピラリー又はマイクロ流体デバイスフローコントローラ(例えば、プログラム可能なシリンジポンプ、蠕動ポンプ、HPLCポンプなど)、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスの全部又は一部に関して特定の温度を維持するように構成される温度コントローラ、更なるフォトセンサ又は画像センサ(例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、CMOS画像センサ及びカメラ、CCD画像センサ及びカメラなど)、光源(例えば、発光ダイオード(LED)、ダイオードレーザ、ファイバレーザ、ガスレーザ、ハロゲンランプ、アークランプなど)、他のタイプのセンサ(例えば、温度センサ、流量センサ、pHセンサ、導電率センサなど)、コンピュータメモリデバイス、コンピュータディスプレイデバイス(例えば、グラフィカルユーザインタフェースを備える)、デジタル通信デバイス(例えば、イントラネット、インターネット、WiFi、ブルートゥース(登録商標)、又は、他の有線又は無線通信ハードウェア)などを更に備えてもよい。
幾つかの実施形態において、システムは、機能的なハードウェアコンポーネントの選択が所定の形態でパッケージ化される一体型システムを備えてもよい。幾つかの実施形態において、システムは、新たな用途のためにシステムを再構成するべく機能的なハードウェアコンポーネントの選択が変更されてもよいモジュールシステムを備えてもよい。幾つかの実施形態において、これらの機能的システム構成要素の幾つか、例えば、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスは、交換可能又は使い捨て可能な構成要素である。
前述したように、様々な異なる質量分析計のいずれかが、飛行時間型質量分析計、四重極質量分析計、イオントラップ又はオービトラップ質量分析計、飛行距離型分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴分光計、共鳴質量測定分光計、及び、ナノメカニカル質量分析計を含むがこれらに限定されない開示されるシステムの異なる実施形態で利用されてもよい。
システム及びアプリケーションソフトウェア:図6に示されるように、本開示のシステムは、複数のソフトウェアモジュールを備えてもよい。例えば、システムは、システム制御ソフトウェアモジュール、データ取得ソフトウェアモジュール、データ処理ソフトウェアモジュール、又は、これらの任意の組み合わせを備えてもよい。一般に、これらのソフトウェアモジュールは、コンピュータプロセッサによってホストされるオペレーティングシステム内又は環境内で動作するように構成されるとともに、互いに及び/又はオペレーティングシステムと通信してデータを共有してもよい。
幾つかの実施形態において、システム制御ソフトウェアモジュールは、(i)キャピラリー又はマイクロ流体デバイスに基づく検体分離システムの動作を撮像システムによる画像取得と協調させる、(ii)キャピラリー又は又はマイクロ流体デバイスに基づく検体分離システムの動作を質量分析計システムによるデータ取得と協調させる、(iii)撮像システムによる画像取得をキャピラリー又はマイクロ流体デバイスに基づく検体分離システム及び/又は質量分析計システムの動作と協調させる、(iv)分離チャネル及び/又はテイラーコーンの撮像から得られるデータに基づいてエレクトロスプレーイオン化セットアップ及び/又は質量分析計の1つ以上の動作パラメータのフィードバック制御を行う、(v)高質量走査範囲と低質量走査範囲の間を交互態様に切り換えつつ質量分析計によるデータ取得を制御する、(vi)ESIチップの電圧を監視して分離回路の電圧を調整し、一定の分離電界強度(又はアノードとカソードとの間の電圧降下)とESIチップでの一定の電圧を維持する、又は、これらの任意の組み合わせのためのソフトウェアを備えてもよい。
幾つかの実施形態において、データ取得モジュールは、(i)1つ以上の画像センサ又は撮像システムによる画像取得を制御し、前記画像データを記憶するとともに、システム制御及び/又はデータ処理ソフトウェアモジュールとのソフトウェアインタフェースを与える、(ii)1つ以上の質量分析計システムによるデータ取得を制御し、前記質量分析計データ(又は他のダウンストリーム分析機器)を記憶するとともに、システム制御及び/又はデータ処理ソフトウェアとのソフトウェアインタフェースを与える、又は、これらの任意の組み合わせのためのソフトウェアを備えてもよい。
幾つかの実施形態において、データ処理モジュールは、(i)分離が実行されている間、分離が完了した後、又は、分離チャネル出口又はエレクトロスプレーチップに向かうpI標準及び検体ピークの動員後に、画像を処理して、分離チャネル内の1つ以上のpI標準又は検体ピークの(1又は複数の)位置を決定する、(ii)画像を処理して、1つ以上のpI標準又は検体ピークに関して速度、流出時間、及び/又は、エレクトロスプレー放出時間を決定する、(iii)分離チャネルの画像を処理して、検体ピークの位置及びテイラーコーンの画像を監視し、エレクトロスプレー性能を監視する、この場合、分離チャネル及びテイラーコーンの画像が同時に又は交互に取得される、(iv)テイラーコーンの画像を処理し、テイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性を決定するとともに、質量分析計の入口に対するエレクトロスプレーチップ又はオリフィスの位置(すなわち、位置合わせ及び/又は分離距離)、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスを通じた流体の流量、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計との間の電圧など、又は、これらの任意の組み合わせを含む1つ以上の動作パラメータに対して行われるべき調整を計算して、質量分析計データの品質の変化に影響を与える、又は、これらの任意の組み合わせのためのソフトウェアを備えてもよい。
開示されるシステム及びアプリケーションソフトウェアは、当業者に知られている様々な又はプログラミング言語及び環境のいずれかを使用して実装されてもよい。例としては、C、C++、C#、PL/I、PL/S、PL/8、PL-6、SYMPL、Python、Java、LabView、Visual Basic、.NETなどが挙げられるが、これらに限定されない。
画像処理ソフトウェア:幾つかの実施形態では、前述したように、データ処理モジュールは、テイラーコーン機能などの形状、密度、又は、他の視覚的指標を特徴付けるために、pIマーカー又は分離された検体バンドの位置を決定するための画像処理ソフトウェアを備えてもよい。開示される方法及びシステムを実施する際に画像前処理又は画像処理のために当業者に知られている様々な画像処理アルゴリズムのいずれかが利用されてもよい。例としては、Cannyエッジ検出方法、Canny-Dericheエッジ検出方法、1次勾配エッジ検出法(例えば、Sobel演算子など)、2次微分エッジ検出方法、位相一致(位相コヒーレンス)エッジ検出法、他の画像セグメンテーションアルゴリズム(例えば、強度閾値化、強度クラスタリング法、強度ヒストグラムベース法など)、特徴及びパターン認識アルゴリズム(例えば、任意の形状を検出するための一般化されたハフ変換、円形ハフ変換など)、及び、数学的分析アルゴリズム(例えば、フーリエ変換、高速フーリエ変換、ウェーブレット分析、自動相関、Savitzky-Golay平滑化、Eigen分析など)、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
プロセッサ及びコンピュータシステム:1つ以上のプロセッサ又はコンピュータを使用して、本明細書中で開示される方法を実施してもよい。1つ以上のプロセッサは、中央処理ユニット(CPU)、グラフィック処理装置(GPU)、汎用処理ユニット、又は、コンピューティングプラットフォームなどのハードウェアプロセッサを備えてもよい。1つ以上のプロセッサは、様々な適切な集積回路(深層学習ネットワークアーキテクチャを実装するために特別に設計された(特定用途向け集積回路(ASIC)、又は、計算時間を加速するため等及び/又は配備を容易にするためのフィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA))、マイクロプロセッサ、新興の次世代マイクロプロセッサ形態(例えば、メモリスタベースのプロセッサ)、論理デバイスなどのいずれかから構成されてもよい。本開示はプロセッサに関連して説明されているが、他のタイプの集積回路及び論理デバイスも適用可能となり得る。プロセッサは、任意の適切なデータ操作能力を有することができる。例えば、プロセッサは、512ビット、256ビット、128ビット、64ビット、32ビット、又は、16ビットのデータ操作を実行できる。1つ以上のプロセッサは、シングルコア又はマルチコアプロセッサ、或いは、並列処理用に構成された複数のプロセッサであってもよい。
開示される方法を実施するために使用される1つ以上のプロセッサ又はコンピュータは、より大きなコンピュータシステムの一部であってもよく、及び/又は、データの送信及びデータの共有を容易にするために通信インタフェースを用いてコンピュータネットワーク(「ネットワーク」)に動作可能に結合されてもよい。ネットワークは、ローカルエリアネットワーク、イントラネット及び/又はエクストラネット、インターネットと通信しているイントラネット及び/又はエクストラネット、或いは、インターネットであってもよい。場合によっては、ネットワークは電気通信及び/又はデータネットワークである。ネットワークは、場合によってはクラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にする1つ以上のコンピュータサーバを含んでもよい。ネットワークは、場合によってはコンピュータシステムを用いて、ピアツーピアネットワークを実装してもよく、これにより、コンピュータシステムに結合されるデバイスがクライアント又はサーバとして振る舞うことができてもよい。
また、コンピュータシステムは、メモリ又は記憶場所(例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ、Intel(登録商標)Optane(商標)テクノロジー)、電子記憶ユニット(例えば、ハードディスク)、1つ以上の他のシステムと通信するための通信インタフェース(例えば、ネットワークアダプタ)、及び、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、及び/又は、電子ディスプレイアダプタなどの周辺機器を含んでもよい。メモリ、記憶ユニット、インタフェース、及び、周辺機器は、例えばマザーボード上に見られるように、通信バスを介して、1つ以上のプロセッサ、例えば、CPUと通信してもよい。(1又は複数の)記憶ユニットは、データを記憶するための(1又は複数の)データ記憶ユニット(又はデータリポジトリ)であってもよい。
1つ以上のプロセッサ、例えば、CPUは、プログラム(又はソフトウェア)に具現化される一連の機械可読命令を実行する。命令は記憶場所に記憶される。命令は、CPUに向けられ、その後、CPUは、本開示の方法を実施するようにCPUをプログラムする或いはさもなければ構成する。CPUによって実行される動作の例としては、フェッチ、デコード、実行、及び、ライトバックが挙げられる。CPUは、集積回路などの回路の一部であってもよい。システムの他の1つ以上の他の構成要素が回路に含まれてもよい。場合によっては、回路が特定用途向け集積回路(ASIC)である。
記憶ユニットは、ドライバ、ライブラリ、保存されたプログラムなどのファイルを記憶する。記憶ユニットは、ユーザデータ、例えば、ユーザ指定の好み及びユーザ指定のプログラムを記憶する。コンピュータシステムは、場合によっては、イントラネット又はインターネットを介してコンピュータシステムと通信しているリモートサーバ上に位置付けられるなど、コンピュータシステムの外部にある1つ以上の付加的なデータ記憶ユニットを含んでもよい。
本明細書中で提供される方法及びシステムの幾つかの態様は、例えば、メモリ内又は電子記憶ユニット内など、コンピュータシステムの電子記憶場所に記憶される機械(例えば、プロセッサ)実行可能コードによって実装される。機械実行可能コード又は機械読み取り可能コードは、ソフトウェアの形式で設けられる。使用中、コードは1つ以上のプロセッサによって実行される。場合によっては、コードは記憶ユニットから取り出され、1つ以上のプロセッサがいつでもアクセスできるようにメモリに記憶される。場合によっては、電子記憶ユニットが排除され、また、機械実行可能な命令がメモリに記憶される。コードは、コードを実行するようになっている1つ以上のプロセッサを有する機械と共に使用するように予めコンパイルされて構成されてもよく、或いは、実行時にコンパイルされてもよい。コードは、コードが予めコンパイルされた又はコンパイルされる態様で実行できるようにするべく選択されるプログラミング言語で供給されてもよい。
開示される方法及びデバイスの様々な態様は、「製品」又は「製造品」、例えば、一般にある種の機械可読媒体に記憶される機械(又はプロセッサ)実行可能コード及び/又は関連データの形態の「コンピュータプログラム又はソフトウェアプロダクト」と考えられてもよく、この場合、実行可能コードは、本明細書中に開示される1つ以上の方法を実行する際にコンピュータ又はコンピュータシステムを制御するための複数の命令を含む。機械実行可能コードは、光ディスク、CD-ROM、DVD、又は、ブルーレイディスクなどの光学的に読み取り可能な媒体を含む光学記憶ユニットに記憶されてもよい。機械実行可能コードは、メモリ(例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ)などの電子記憶ユニットに又はハードディスクに記憶されてもよい。「記憶」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリのいずれか又は全て、或いは、それらの関連モジュール、例えば、様々な半導体メモリチップ、光学ドライブ、テープドライブ、ディスクドライブなどを含み、これらは、本明細書中に開示される方法及びアルゴリズムをエンコードするソフトウェアのためにいつでも一時的な記憶を行うことができる。
ソフトウェアコードの全部又は一部は、インターネット又は他の様々な電気通信ネットワークを介して通信される場合がある。そのような通信は、例えば、あるコンピュータ又はプロセッサから他のコンピュータへの、例えば管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にする。したがって、ソフトウェアエンコードされた命令を伝えるために使用される他のタイプの媒体としては、ローカルデバイス間の物理インタフェースの全体にわたって、有線及び光学固定電話ネットワークを介して、及び、様々な大気リンクにわたって使用されるものなど、光学、電気、及び、電磁波が挙げられる。有線又は無線リンク、光リンクなどのそのような波を伝える物理的要素もまた、本明細書中に開示される方法を実行するためのソフトウェアエンコードされた命令を伝える媒体と見なされる。本明細書中で使用されるコンピュータ又は機械「読み取り可能媒体」などの用語は、持続性の有形な「記憶」媒体に限定されなければ、実行のためにプロセッサに命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。
コンピュータシステムは、一般に、例えば、マシンビジョンシステムによって捕捉される画像を与えるための電子ディスプレイを含む又は電子ディスプレイと通信してもよい。ディスプレイは、一般に、ユーザインタフェース(UI)を与えることもできる。UIの例としては、グラフィカルユーザインタフェース(GUI)、ウェブベースのユーザインタフェースなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用途:開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、プロテオミクス研究、創薬及び開発、並びに、臨床診断を含むがこれらに限定されない様々な分野において潜在的な用途を有する。例えば、開示される方法を使用する検体サンプルの分離に基づくESI-MS分析のために達成され得る改善された情報内容及びデータ品質は、開発中及び/又は製造中の生物学的及びバイオシミラー医薬の特性評価にとって非常に有益となり得る。他の用途としては、環境汚染物質、農薬、小分子、代謝物、ペプチド、変換後改質、グリコフォーム、抗体-薬物複合体、融合タンパク質、ウイルス、アレルガン、単細胞生物、及び、他の用途の分析を挙げることができるが、これらに限定されない。
生物製剤及びバイオシミラーは、例えば、組み換えタンパク質、抗体、ウイルス生ワクチン、ヒト血漿由来タンパク質、細胞ベースの薬剤、天然由来タンパク質、抗体-薬物複合体、タンパク質-薬物複合体、及び、他のタンパク質薬物を含む薬物類である。FDA及びその他の規制当局は、構造、機能、動物毒性、ヒト薬物動態(PK)、及び、薬力学(PD)に関する提案製品と基準製品との比較、臨床免疫原性、及び、臨床安全性と有効性(「基準製品との生物学的類似性を実証する際の科学的考慮事項:産業向けガイダンス」、米国食品医薬品局、2015年4月を参照)を含んでもよい、生物学的類似性を実証するための段階的アプローチの使用を要求する。タンパク質製品に関して求められ得る構造特性データの例としては、一次構造(つまり、アミノ酸配列)、二次構造(つまり、アルファヘリックス又はベータシート構造を形成するためのフォールディングの程度)、三次構造(つまり、ポリペプチド骨格と二次構造ドメインの折りたたみによって生成されるタンパク質の3次元形状)、及び、四次構造(例えば、活性タンパク質複合体を形成するために必要なサブユニットの数、又はタンパク質の凝集状態))が挙げられる。多くの場合、この情報は、X線結晶学などの面倒で時間のかかる高価な技術を使用しないと利用できない場合がある。したがって、候補生物学的薬物と基準薬物との間の生物学的類似性を確立する目的で、タンパク質構造の都合の良いリアルタイムな比較的ハイスループットの特性評価を可能にする実験技術が必要である。
幾つかの実施形態において、開示される方法、デバイス、及び、システムは、生物学的類似性を確立する目的で生物学的薬物候補(例えば、モノクローナル抗体(mAb))及び基準生物学的薬物に関する構造比較データを与えるために使用されてもよい。例えば、幾つかの例において、薬物候補及び基準薬物に関する等電点データ及び/又は質量分析データは、生物学的類似性の実証を支持する重要な証拠を与え得る。幾つかの実施形態において、同一の反応条件下においていずれも部位特異的プロテアーゼで処理された薬物候補及び基準薬物に関する等電点データ及び/又は質量分析データは、生物学的類似性の実証を支持する重要な証拠を与え得る。幾つかの実施形態では、開示される方法、デバイス、及び、システムを使用して、生物学的薬物製造プロセスを監視し、製造プロセスの異なる時点で採取されたサンプル又は異なる製造実行から採取されたサンプルを分析することによって製品の品質及び一貫性を確保してもよい。幾つかの実施形態では、開示される方法、デバイス、及び、システムを使用して、製剤緩衝液の安定性を評価してもよい。幾つかの実施形態において、開示される方法、デバイス、及びシステムは、生物学的薬物候補の産生及び品質に関してクローン化された細胞株を評価するために使用されてもよい。
[実施例]
これらの例は、単なる例示目的で与えられているにすぎず、本明細書中で与えられる特許請求の範囲を限定するものではない。
これらの例は、単なる例示目的で与えられているにすぎず、本明細書中で与えられる特許請求の範囲を限定するものではない。
実施例1-質量分析を実行する前のチップ上のタンパク質電荷の特性評価
図1に示されるマイクロ流体デバイスの製造については前述した。動作させるために、デバイスは、窒素ガス源、ヒータ、陽圧ポンプ(例えば、Parker、T5-1IC-03-1EEP)、2つのプラチナ-イリジウム電極(例えば、Sigma-Aldrich、357383)で終端する電気泳動電源(Gamm High Voltage、MC30)、UV光源(例えば、LED、qphotonics、UVTOP280)、CCDカメラ(例えば、ThorLabs、340UV-GE)、及び、サンプルをデバイスへ取り込むためのオートサンプラを含む機器上に装着される。電源は、質量分析計と共通のアースグランドを共有する。機器はソフトウェア(例えば、Lab View)によって制御される。
図1に示されるマイクロ流体デバイスの製造については前述した。動作させるために、デバイスは、窒素ガス源、ヒータ、陽圧ポンプ(例えば、Parker、T5-1IC-03-1EEP)、2つのプラチナ-イリジウム電極(例えば、Sigma-Aldrich、357383)で終端する電気泳動電源(Gamm High Voltage、MC30)、UV光源(例えば、LED、qphotonics、UVTOP280)、CCDカメラ(例えば、ThorLabs、340UV-GE)、及び、サンプルをデバイスへ取り込むためのオートサンプラを含む機器上に装着される。電源は、質量分析計と共通のアースグランドを共有する。機器はソフトウェア(例えば、Lab View)によって制御される。
タンパク質サンプルは、バイアル内に配置してオートサンプラに取り込む前に、両性電解質pH勾配及びpIマーカーと予め混合される。タンパク質サンプルは、オートサンプラから入口412により濃縮チャネル418を通じてマイクロ流体デバイス400に連続的に取り込まれるとともに、デバイスから出口434を介して廃棄物430に送られる。
シース/陰極液(50% MeOH,N40H/H20)が2つの陰極液ウェル404,436に取り込まれ、陽極液(10mM H3P04)が陽極液ウェル426に取り込まれるとともに、加熱された窒素ガスの供給源が2つのガスウェル408,440に取り付けられる。
全ての試薬が取り込まれた後、電極を陽極液ウェル426及び陰極液ウェル404,436に接続することによって+600V/cmの電界が陽極液ウェル426から陰極液ウェル404,436に印加され、等電点電気泳動が開始される。UV光源が濃縮チャネル418下に位置合わせされ、濃縮チャネル418を通過する光を測定するためにカメラが濃縮チャネル418の上方に配置され、それにより、集束タンパク質をそれらの吸光度によって検出する。ソーダ石灰ガラスから構成されるガラス板402がカメラからの任意の迷光を遮断するように作用し、そのため、濃縮チャネル418を通過しない光がカメラに到達するのが妨げられ、それにより、測定の感度が高まる。
集束タンパク質の画像は、IEF中に連続的及び/又は定期的に捕捉され得る。集束が完了すると、低圧が入口412から印加され、それにより、pH勾配がオリフィス424に向けて動員される。この時点で電界を維持して、高分解能のIEF分離を維持することができる。ESIプロセス中に濃縮チャネル418を撮像し続けることにより、各タンパク質のpIをタンパク質がオリフィス424から排出される際に決定することができる。
濃縮されたタンパク質画分が濃縮チャネル418から合流部420へ移動する際、濃縮されたタンパク質画分はシース流体と混合し、該シース流体は、陰極液ウェル404,436からシース/陰極液チャネル406,438を介して合流部420に流れることができる。濃縮されたタンパク質画分をシース流体と混合することにより、タンパク質画分を質量分析互換性溶液中に入れることができるとともに、集束タンパク質への電荷を回復させることができ(IEFがタンパク質を非荷電状態へともたらす)、それにより、イオン化が改善される。
その後、濃縮されたタンパク質画分がオリフィス424へと進み続け、オリフィス424はガラス板402の皿表面422によって画定され得る。濃縮されたタンパク質画分は、シース流体ウェルグランドと質量分析計の負極との間の電界内に補足された時点でテイラーコーンを形成できる。
溶液が濃縮チャネル418からテイラーコーンを押し続ける際、流体の小さい液滴が、テイラーコーンから排出され、質量分析計の入口に向かって飛ぶ。窒素ガス(例えば、150℃)は、ガスウェル408,440からガスチャネル410,432を下って流れて、マイクロ流体デバイスを離れる前にテイラーコーンから生じる液滴を微細な霧に変換することができるテイラーコーンの両側に位置する窒素ガスジェットを形成することができ、これは質量分析計での検出に役立ち得る。入口412からの圧力を調整することにより、必要に応じてテイラーコーンのサイズを調整でき、質量分析計での検出を改善できる。
実施例2-検体ピークがマイクロ流体チップを出て質量分析計に入るときの速度の追跡
この例の場合、図7Aのマイクロ流体チャネルネットワーク100が不透明な環状オレフィンポリマーの250ミクロン厚の層中に形成される。チャネル112の深さは250ミクロンであり、そのため、チャネルは250ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが50ミクロンの深さである。チャネル層は、図7Bの場合のように環状オレフィンポリマーの2つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート102,104,106,108,110が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート102は真空源に接続され、それにより、チャネル103が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸(1%ギ酸)が、ポート108を介してチャネル109,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。サンプル(4%Pharmalyte 3-10、12.5mM pI標準3.38(精製ペプチド、配列:Trp-Asp-Asp-Asp)、12.5mM pI標準10.17(精製ペプチド、配列:Trp-Tyr-Lys-Arg)、NISTモノクローナル抗体標準(部品番号8671、NIST))が、ポート106を介してチャネル107,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。これにより、サンプル検体を含むチャネル112が残る。塩基(1%ジメチルアミン)が、ポート104を介してチャネル105,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。動員材(1%ギ酸、49%メタノール)が、ポート110を介してチャネル111,114,103にプライミングされ、チャネル103からポート102に排出される。
この例の場合、図7Aのマイクロ流体チャネルネットワーク100が不透明な環状オレフィンポリマーの250ミクロン厚の層中に形成される。チャネル112の深さは250ミクロンであり、そのため、チャネルは250ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが50ミクロンの深さである。チャネル層は、図7Bの場合のように環状オレフィンポリマーの2つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート102,104,106,108,110が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート102は真空源に接続され、それにより、チャネル103が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸(1%ギ酸)が、ポート108を介してチャネル109,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。サンプル(4%Pharmalyte 3-10、12.5mM pI標準3.38(精製ペプチド、配列:Trp-Asp-Asp-Asp)、12.5mM pI標準10.17(精製ペプチド、配列:Trp-Tyr-Lys-Arg)、NISTモノクローナル抗体標準(部品番号8671、NIST))が、ポート106を介してチャネル107,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。これにより、サンプル検体を含むチャネル112が残る。塩基(1%ジメチルアミン)が、ポート104を介してチャネル105,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。動員材(1%ギ酸、49%メタノール)が、ポート110を介してチャネル111,114,103にプライミングされ、チャネル103からポート102に排出される。
チャネル112内の検体サンプルの電気泳動は、ポート108に4000Vを印加してポート110をグランドに接続することによって実行される。検体サンプル中の両性電解質は、チャネル112に及ぶpH勾配を確立する。分離の吸光度撮像は、チャネル112に位置合わせされる280nm光源を使用し、CCDカメラによりチャネル112を通過する280光の透過率を測定することで実行される。ソフトウェアが、分離中又は動員中の光透過率を、検体が実行される前に集束された検体がない場合に行われる「ブランク」基準測定と比較することによって吸光度を計算し、その後、チャネル112の長さにわたってピクセルごとに吸光度を表示する。図9A~図9Fに示されるように、標準又は検体が集束された場所がピークとして表示される。
検体が集束を完了した時点で、最終的な集束吸光度画像が捕捉される。ソフトウェアは、pIマーカーの空間位置を特定して、マーカー間で補間し、集束検体画分ピークのpIを計算する。この時点で、制御ソフトウェアがリレーをトリガし、リレーは、ポート110でグランドを切断して、ポート104をグランドに接続するとともに、ポート104に接続される動員材リザーバに作用する圧力を設定して、ポート104を通じてチャネル105,114に入ってオリフィス116でチップから出る100nL/分の動員材溶液の流れを確立する。オリフィス116は、入口電圧が-3500V~-4500Vである質量分析計のESl入口から2mm離れて位置付けられる。
圧力駆動流が動員材をポート104からオリフィス116へ方向付ける一方で、動員材試薬中のギ酸の一部がチャネル105からチャネル112を通ってポート108のアノードにギ酸塩の形態で電気泳動する。ギ酸塩がチャネル112を通って移動するにつれて、ギ酸塩は、等電pH勾配を乱し、それにより、両性電解質、標準、及び、検体サンプルは、電荷を増大させるとともに、電気泳動的にチャネル112からチャネル114へ移動し、ここで、ポート110からの圧力駆動流がそれらをオリフィス116からESIスプレーに運ぶ。
動員が発生している間、ソフトウェアは、吸光度画像を捕捉し続けてピークを特定し、それにより、撮像チャネル112からチャネル114へのピークの移動を追跡する。各ピークが撮像チャネル112から離れる時間、その速度、及び、チャネル114内の流量を追跡することにより、ソフトウェアは、ピークがチャネル114を横切ってオリフィス116を介して質量分析計に導入される時間を計算し、それにより、当初の集束ピークと結果として生じる質量スペクトルとの間の直接的な相関が可能となる。
図9A~図9Fは、1分間隔で取得された一連の吸光度トレースの例を与え、分離チャネルの画像から決定された等電点(pI)標準の動員を示している。図9Aは、動員前の5つのpI標準(ピーク915,920,925,930,935)の等電点電気泳動が完了した後におけるチャネル距離905に応じた吸光度910のプロットを示す。図9Bに示されるように、1分の動員後、pI=9.99標準に対応するピーク915が、撮像システムの視野の縁にある。図9Cに示されるように、2分の動員後、ピーク915(pI=9.99標準)は撮像されているチャネルの部分から出た。図9Dに示されるように、3分の動員後、ピーク920(pI=8.40標準)が撮像されているチャネルの部分から出た。図9Eに示されるように、4分の動員後、ピーク925(pI=7.00標準)が撮像されているチャネルの部分から出た。図9Fに示されるように、5分の動員後、ピーク930(pI=4.05標準)が撮像されているチャネルの部分から離れた。
実施例3-フィードバックを使用してMSパラメータ及びESIパラメータを調整する
実施例3では、チップ、機器、及び、ソフトウェアが実施例2の場合と同じ手順を全て実行する。更に、図8に示されるように、ESI中にテイラーコーンを撮像するために第2のCCDカメラが使用される。これらの画像は、テイラーコーンの品質及び一貫性を評価するために使用される。質量分析計で画像及び/又は合計数を評価することにより、ESIテイラーコーンの不具合の特定及び原因の診断が可能となる。
実施例3では、チップ、機器、及び、ソフトウェアが実施例2の場合と同じ手順を全て実行する。更に、図8に示されるように、ESI中にテイラーコーンを撮像するために第2のCCDカメラが使用される。これらの画像は、テイラーコーンの品質及び一貫性を評価するために使用される。質量分析計で画像及び/又は合計数を評価することにより、ESIテイラーコーンの不具合の特定及び原因の診断が可能となる。
ESIでのテイラーコーンの形成は、蒸発及びESIに失われている流体の速度と一致するコーンへの入力流を維持することに依存する。テイラーコーンのサイズは、流量、マイクロ流体デバイスとMSとの間の電圧勾配、マイクロ流体デバイスとMSとの間の距離、並びに、マイクロ流体デバイスのESIチップ及び局所環境の微妙な変化に依存する。
テイラーコーンの撮像により、ESIの不具合の原因を診断できる。例えば、テイラーコーンの損失は十分な流れがないことを示しており、また、ソフトウェアはマイクロ流体デバイスへの動員材の流れを増大させることができる。同様に、コロナ放電は電圧が高すぎることを示し、また、ソフトウェアは電圧を下げることができる。ESIクラウドの拡大は電圧が高すぎることを示し、一方、テイラーコーンではなく液滴を形成することは電圧が低すぎることを示す。これらの違い及び他の視覚的違いを画像中で特定でき、また、ソフトウェアは、テイラーコーンを再確立するように自動的に補償できる。
実施例4-分離のマーカーとしての低質量走査
実施例4では、チップ、機器、及び、ソフトウェアが実施例2の場合と同じ手順を全て実行する。更に、動員が発生して検体ピークがMSへ移動し始めた時点で、MSは、1500~6000及び150~1500のm/z範囲間を交互に切り換えるように設定される。1500~6000の範囲は、NIST抗体検体画分ピークをそれらがMSに導入される際に特定するために使用される。150~1500m/z範囲走査は、遊離溶液の両性電解質(Pharmalytes)をそれらがMSに導入される際に特定するために使用される。特定の両性電解質の存在は任意の時点でMSで分析されている等電点pH勾配の一部を規定するため、両性電解質は、質量走査で特定され、MSからの全イオンクロマトグラフを較正するために使用され得る。
実施例4では、チップ、機器、及び、ソフトウェアが実施例2の場合と同じ手順を全て実行する。更に、動員が発生して検体ピークがMSへ移動し始めた時点で、MSは、1500~6000及び150~1500のm/z範囲間を交互に切り換えるように設定される。1500~6000の範囲は、NIST抗体検体画分ピークをそれらがMSに導入される際に特定するために使用される。150~1500m/z範囲走査は、遊離溶液の両性電解質(Pharmalytes)をそれらがMSに導入される際に特定するために使用される。特定の両性電解質の存在は任意の時点でMSで分析されている等電点pH勾配の一部を規定するため、両性電解質は、質量走査で特定され、MSからの全イオンクロマトグラフを較正するために使用され得る。
実施例5-チップにおける電界強度及び一定の電圧を維持するために高電圧及び低電圧を変更する。
この例の場合、図7Aのマイクロ流体チャネルネットワーク100が不透明な環状オレフィンポリマーの250ミクロン厚の層中に形成される。チャネル112の深さは250ミクロンであり、そのため、チャネルは250ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが50ミクロンの深さである。チャネル層は、図7Bの場合のように環状オレフィンポリマーの2つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート102,104,106,108,110が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート102は真空源に接続され、それにより、チャネル103が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸(1%ギ酸)が、ポート108を介してチャネル109,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。サンプル(4%Pharmalyte 3-10、12.5mM pI標準3.38(精製ペプチド、配列:Trp-Asp-Asp-Asp)、12.5mM pI標準10.17(精製ペプチド、配列:Trp-Tyr-Lys-Arg)、NISTモノクローナル抗体標準(部品番号8671、NIST))が、ポート106を介してチャネル107,112,114にプライミングされ、ポート102に排出される。これにより、サンプル検体を含むチャネル112が残る。塩基(1%ジメチルアミン)が、ポート104を介してチャネル105,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。動員材(1%ギ酸、49%メタノール)が、ポート110を介してチャネル110,114,103にプライミングされ、チャネル102からポート102に排出される。圧力がベースリザーバに印加されて、ポート104を通じてチャネル105,114に入ってオリフィス116から出る100nL/分の流れが生成される。
チャネル112における検体サンプルの等電点電気泳動は、電源1005を使用してポート108に2000Vを印加するとともにポート110を高電圧電源1010に接続して-2000Vを印加することによって開始される。これは、高電圧電源1005及び高電圧電源1010(場合によっては、電源1005及び電源1010が単一の多重化された高電圧電源の2つのチャネルを備えてもよい)を含んでアノードとカソードとの間に4000Vの電圧降下を生み出す図10Aに表される回路を確立する。チャネルの電気抵抗は、チャネルの寸法と試薬の導電率とに依存する。この例では、チャネル109(図7A参照)に対応する酸チャネルの電気抵抗R109が10メガオームであり、チャネル112(図7A参照)に対応するサンプルチャネルの電気抵抗R112が40メガオームで始まり、また、チャネル111(図7A参照)に対応するチャネルにおけるベースの抵抗R111が50メガオームである。オリフィス116(図7A参照)と質量分析計1015との間のエレクトロスプレーイオン化(ESI)インタフェースの抵抗R113は2ギガオームである。チャネル109,112,111(図7A参照)間の全電圧降下は4000Vであり、また、これらのチャネルは直列の3つの抵抗に相当するため、チップ(V116)の電圧は式1にしたがって計算される。
V116=ΔV108-110*(R111)/(R109+R112+R111)+(高電圧-電源1010電圧設定)。
等電点電気泳動の開始時には、V116=0ボルトである。オリフィス116(図7A参照)は、質量分析計のESI入口から2mm離れて位置付けられ、この場合、テイラーコーンを形成するために入口電圧は-3500V~-4500Vである。図10Bは、チャネル105の抵抗R105を含む、図10Aに表される回路の他の実施形態を示す。
検体サンプル中の両性電解質は、チャネル112に及ぶpH勾配を確立する。分離の吸光度撮像は、チャネル112に位置合わせされる280nm光源を使用し、CCDカメラによりチャネル112を通過する280nm光の透過率を測定することで実行される。ソフトウェアが、分離中又は動員中の光透過率を、検体が実行される前に集束された検体がない場合に行われる「ブランク」基準測定と比較することによって吸光度を計算し、その後、チャネル112の長さにわたってピクセルごとに吸光度を表示する。図9A~図9Fに示されるように、標準又は検体が集束された場所がピークとして表示される。
サンプルが集束するにつれて、両性電解質、抗体アイソフォーム、及び、標準がそれらの等電点に到達してそれらの電荷を失うため、サンプルチャネル112の抵抗が増大し、一方、チャネル109,111及びESIインタフェースにおける抵抗は不変のままである。コンピュータ実装方法は、電源1005における電流を監視し、チャネル112内の任意の時点での抵抗を計算できる。コンピュータ実装方法は、この情報を使用して電源1005,1010を調整する。例えば、チャネル112の抵抗が140メガオームまで上昇した場合、電源が調整されていなければ、オリフィス116の電圧が-1000Vになり、テイラーコーンが乱れる。しかしながら、電源1005を+3000Vに調整するとともに電源1010を-1000Vに調整することにより、チップが0Vのままになり、チャネル109,112,111にわたる全電圧降下は4000Vのままである。これらの調整は、チャネル112の抵抗が変化する際にオンザフライで行われる。
検体が集束を完了した時点で、最終的な集束吸光度画像が捕捉される。ソフトウェアは、pIマーカーの空間位置を特定して、マーカー間で補間し、集束検体画分ピークのpIを計算する。この時点で、制御ソフトウェアがリレーをトリガし、リレーは、ポート110で電源1010を切断して、ポート104を電源1010に接続するとともに、ポート104に接続される動員材リザーバに作用する圧力を設定して、ポート104を通じてチャネル105,114に入ってオリフィス116でチップから出る100nL/分の動員材溶液の流れを確立する(図7Aのチップ概略図及び図10Bに示される電気回路を参照)。オリフィス116は、入口電圧が-3500V~-4500Vである質量分析計のESl入口から2mm離れて位置付けられる。
圧力駆動流が動員材をポート104からオリフィス116へ方向付ける一方で、動員材試薬中のギ酸の一部がチャネル105からチャネル112を通ってポート108のアノードにギ酸塩の形態で電気泳動する。ギ酸塩がチャネル112を通って移動するにつれて、ギ酸塩は、等電pH勾配を乱し、それにより、両性電解質、標準、及び、検体サンプルは、電荷を増大させるとともに、電気泳動的にチャネル112からチャネル114へ移動し、ここで、ポート110からの圧力駆動流がそれらをオリフィス116からESIスプレーに運ぶ。
動員が発生している間、チャネル112の抵抗が低下する。図11A~図11Bは、チャネルの抵抗を導出するために使用されてもよい、チャネル112に関する電圧及び電流データの例を示す。図11Aは、時間の関数としての電圧のプロットを示す。図11Bは、時間の関数としての電流のプロットを示す。ソフトウェアは、図15に示されるように、電流の変化を監視して、電源を調整し、アノードとカソードとの間の電圧降下を3000Vに維持するとともに、チップ116で0Vを維持する。電圧変化は一時的であってもよく又は安定していてもよい。
動員が発生している間、ソフトウェアは、吸光度画像を捕捉し続けてピークを特定し、それにより、撮像チャネル112からチャネル114へのピークの移動を追跡する。各ピークが撮像チャネル112から離れる時間、その速度、及び、チャネル114内の流量を追跡することにより、ソフトウェアは、ピークがチャネル114を横切ってオリフィス116を介して質量分析計に導入される時間を計算し、それにより、当初の集束ピークと結果として生じる質量スペクトルとの間の直接的な相関が可能となる。
図13Aは、電流をグランドにシンクするために更なるレジスタR120を使用してESIチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図7Aに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与える。回路は、アノードとカソードとの間に特定の電圧降下(例えば、4000V)を生み出すために、1005と実質的に同様であってもよい高電圧電源1305と、1010と実質的に同様であってもよい高電圧電源1310とを備えてもよい。回路は、第3の高電圧電源1307を更に備えてもよい。チャネルの電気抵抗は、チャネルの寸法と試薬の導電率とに依存する。回路には、チャネル109(図7A参照)に対応する酸チャネルの電気抵抗R109、チャネル112(図7A参照)に対応するサンプルチャネルの電気抵抗R112、及び、チャネル111(図7A参照)に対応するチャネルにおけるベースの抵抗R111、並びに、実質的に1015と同様であってもよい、オリフィス116(図7A参照)と質量分析計1315の電圧源との間のエレクトロスプレーイオン化(ESI)のインタフェースの抵抗R113も組み込まれる。また、回路は、チャネル105の電気抵抗R105を含んでもよい。電源1307は、チャネル111に接続されて(図7A参照)、動員中に0μAに設定された電流制御を使用できる。この電源は、チップの電圧を読み取って、コンピュータ制御のフィードバックループを実施してチップの電圧を一定に維持するために使用されてもよい。
図13Bは、電流を電源1320にシンクするためにレジスタR120を使用してESIチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図7Aに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。図13Cは、電流をシンクするために電界効果トランジスタ(FET)1325を使用してESIチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図7Aに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。電気回路は、増幅器1330、電圧基準1335、及び、更なるレジスタR200を更に備えてもよい。図13Dは、電流をシンクするためにバイポーラ接合トランジスタ(BJT)1340を使用してESIチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図7Aに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。電源1307は、チャネル111に接続されて(図7A参照)、0μAに設定された電流制御を使用できる。この電源は、チップの電圧を読み取って、コンピュータ制御のフィードバックループを実施してチップの電圧を一定に維持するために使用されてもよい。図13Eは、ESIチップがグランド又はグランド付近に保持される、分離された検体混合物の化学的動員中の図7Aに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与える。電源1307は、チャネル111に接続されて(図7A参照)、0μAに設定された電流制御を使用できる。この電源は、チップの電圧を読み取って、コンピュータ制御のフィードバックループを実施してチップの電圧を一定に維持するために使用されてもよい。
実施例6-チップ電圧の測定に基づいてチップにおける電界強度及び一定の電圧を維持するために高電圧及び低電圧を変更する
この例の場合、図7Aのマイクロ流体チャネルネットワーク100が不透明な環状オレフィンポリマーの250ミクロン厚の層中に形成される。チャネル112の深さは250ミクロンであり、そのため、チャネルは250ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが50ミクロンの深さである。チャネル層は、図7Bの場合のように環状オレフィンポリマーの2つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート102,104,106,108,110が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート102は真空源に接続され、それにより、チャネル103が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸(1%ギ酸)が、ポート108を介してチャネル109,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。サンプル(4%Pharmalyte 3-10、12.5mM pI標準3.38(精製ペプチド、配列:Trp-Asp-Asp-Asp)、12.5mM pI標準10.17(精製ペプチド、配列:Trp-Tyr-Lys-Arg)、NISTモノクローナル抗体標準(部品番号8671、NIST))が、ポート106を介してチャネル107,112,114にプライミングされ、ポート102に排出される。これにより、サンプル検体を含むチャネル112が残る。塩基(1%ジメチルアミン)が、ポート104を介してチャネル105,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。動員材(1%ギ酸、49%メタノール)が、ポート110を介してチャネル110,114,103にプライミングされ、チャネル102からポート102に排出される(図7Aのチップ概略図及び図13Eに示される電気回路を参照)。
この例の場合、図7Aのマイクロ流体チャネルネットワーク100が不透明な環状オレフィンポリマーの250ミクロン厚の層中に形成される。チャネル112の深さは250ミクロンであり、そのため、チャネルは250ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが50ミクロンの深さである。チャネル層は、図7Bの場合のように環状オレフィンポリマーの2つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート102,104,106,108,110が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート102は真空源に接続され、それにより、チャネル103が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸(1%ギ酸)が、ポート108を介してチャネル109,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。サンプル(4%Pharmalyte 3-10、12.5mM pI標準3.38(精製ペプチド、配列:Trp-Asp-Asp-Asp)、12.5mM pI標準10.17(精製ペプチド、配列:Trp-Tyr-Lys-Arg)、NISTモノクローナル抗体標準(部品番号8671、NIST))が、ポート106を介してチャネル107,112,114にプライミングされ、ポート102に排出される。これにより、サンプル検体を含むチャネル112が残る。塩基(1%ジメチルアミン)が、ポート104を介してチャネル105,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。動員材(1%ギ酸、49%メタノール)が、ポート110を介してチャネル110,114,103にプライミングされ、チャネル102からポート102に排出される(図7Aのチップ概略図及び図13Eに示される電気回路を参照)。
チャネル112における検体サンプルの電気泳動は、電源1305を使用してポート108に1500Vを印加するとともにポート110を0Vに設定される電源1307に接続することによって開始される。5分後、集束を完了するために電源1305が3分間にわたって3000Vまで増大される。
検体サンプル中の両性電解質は、チャネル112に及ぶpH勾配を確立する。分離の吸光度撮像は、チャネル112に位置合わせされる280nm光源を使用し、CCDカメラによりチャネル112を通過する280光の透過率を測定することで実行される。ソフトウェアが、分離中又は動員中の光透過率を、検体が実行される前に集束された検体がない場合に行われる「ブランク」基準測定と比較することによって吸光度を計算し、その後、チャネル112の長さにわたってピクセルごとに吸光度を表示する。図9A~図9Fに示されるように、標準又は検体が集束された場所がピークとして表示される。
検体が集束を完了した時点で、最終的な集束吸光度画像が捕捉される。ソフトウェアは、pIマーカーの空間位置を特定して、マーカー間で補間し、集束検体画分ピークのpIを計算する。この時点で、制御ソフトウェアがリレーをトリガし、リレーは、ポート104を電源1310に接続するとともに、ポート104に接続される動員材リザーバに作用する圧力を設定して、ポート104を通じてチャネル105,114に入ってオリフィス116でチップから出る100nL/分の動員材溶液の流れを確立する。オリフィス116は、入口電圧が-3500V~-4500Vである質量分析計のESI入口1315から2mm離れて位置付けられる。電源1307が電流制御を使用して0μAに設定され、電源1305が3000Vに設定され、電源1310が0Vに設定され、また、MS ESIイオン源が-3500V~-4500Vに設定される。
圧力駆動流が動員材をポート104からオリフィス116へ方向付ける一方で、動員材試薬中のギ酸の一部がチャネル105からチャネル112を通ってポート108のアノードにギ酸塩の形態で電気泳動する。ギ酸塩がチャネル112を通って移動するにつれて、ギ酸塩は、等電pH勾配を乱し、それにより、両性電解質、標準、及び、検体サンプルは、電荷を増大させるとともに、電気泳動的にチャネル112からチャネル114へ移動し、ここで、ポート110からの圧力駆動流がそれらをオリフィス116からESIスプレーに運ぶ。
動員が発生している間、チャネル112の抵抗が低下する。チャネル111の全体にわたる電圧降下がこの時点で0であるため(ΔV=IR=0*R111=0V)、0μAに設定される電源1307は図13EにおけるV116の電圧に等しい。図11A~図11Bのデータに示されるように、集束が完了してから8分(480秒)で、ソフトウェアは、図15に記載されるように、電流の変化を監視し、電源を調整して、アノードとカソードとの間で3000Vの一定の電圧降下を維持するとともにチップ116で0ボルトを維持する。チップの電圧(V116)は式2によって表される。
V116=ΔV108-110*(R111)/(R109+R112+R105)+(電源1310電圧設定)。
動員が発生している間、ソフトウェアは、吸光度画像を捕捉し続けてピークを特定し、それにより、撮像チャネル112からチャネル114へのピークの移動を追跡する。各ピークが撮像チャネル112から離れる時間、その速度、及び、チャネル114内の流量を追跡することにより、ソフトウェアは、ピークがチャネル114を横切ってオリフィス116を介して質量分析計に導入される時間を計算し、それにより、当初の集束ピークと結果として生じる質量スペクトルとの間の直接的な相関が可能となる。
実施例7-チップ電圧及びレジスタの測定に基づいてチップにおける電界強度及び一定の電圧を維持するために高電圧及び低電圧を変更する
この例の場合、図7Aのマイクロ流体チャネルネットワーク100が不透明な環状オレフィンポリマーの250ミクロン厚の層中に形成される。チャネル112の深さは250ミクロンであり、そのため、チャネルは250ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが50ミクロンの深さである。チャネル層は、図7Bの場合のように環状オレフィンポリマーの2つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート102,104,106,108,110が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート102は真空源に接続され、それにより、チャネル103が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸(1%ギ酸)が、ポート108を介してチャネル109,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。サンプル(4%Pharmalyte 3-10、12.5mM pI標準5.52(精製ペプチド、配列:Trp-Glu-His)、12.5mM pI標準8.4(精製ペプチド、配列:Trp-Tyr-Lys)、インフリキシマブバイオシミラーモノクローナル抗体標準(部品番号MCA6090、Bio-rad))が、ポート106を介してチャネル107,112,114にプライミングされ、ポート102に出力される。これにより、サンプル検体を含むチャネル112が残る。塩基(1%ジメチルアミン)が、ポート104を介してチャネル105,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。動員材(1%ギ酸、49%メタノール)が、ポート110を介してチャネル110,114,103にプライミングされ、チャネル102からポート102に排出される(図7Aのチップ概略図及び図13Bに示される電気回路を参照)。
この例の場合、図7Aのマイクロ流体チャネルネットワーク100が不透明な環状オレフィンポリマーの250ミクロン厚の層中に形成される。チャネル112の深さは250ミクロンであり、そのため、チャネルは250ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが50ミクロンの深さである。チャネル層は、図7Bの場合のように環状オレフィンポリマーの2つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート102,104,106,108,110が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート102は真空源に接続され、それにより、チャネル103が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸(1%ギ酸)が、ポート108を介してチャネル109,112,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。サンプル(4%Pharmalyte 3-10、12.5mM pI標準5.52(精製ペプチド、配列:Trp-Glu-His)、12.5mM pI標準8.4(精製ペプチド、配列:Trp-Tyr-Lys)、インフリキシマブバイオシミラーモノクローナル抗体標準(部品番号MCA6090、Bio-rad))が、ポート106を介してチャネル107,112,114にプライミングされ、ポート102に出力される。これにより、サンプル検体を含むチャネル112が残る。塩基(1%ジメチルアミン)が、ポート104を介してチャネル105,114,103にプライミングされ、ポート102に排出される。動員材(1%ギ酸、49%メタノール)が、ポート110を介してチャネル110,114,103にプライミングされ、チャネル102からポート102に排出される(図7Aのチップ概略図及び図13Bに示される電気回路を参照)。
チャネル112における検体サンプルの電気泳動は、電源1305を使用してポート108に1500Vを印加するとともにポート110を0Vに設定される電源1307に接続することによって開始される。5分後、電源1305が3000Vまで増大される。
検体サンプル中の両性電解質は、チャネル112に及ぶpH勾配を確立する。分離の吸光度撮像は、チャネル112に位置合わせされる280nm光源を使用し、CCDカメラによりチャネル112を通過する280nm光の透過率を測定することで実行される。ソフトウェアが、分離中又は動員中の光透過率を、検体が実行される前に集束された検体がない場合に行われる「ブランク」基準測定と比較することによって吸光度を計算し、その後、チャネル112の長さにわたってピクセルごとに吸光度を表示する。図9A~図9Fに示されるように、標準又は検体が集束された場所がピークとして表示される。
検体が集束を完了した時点で、インフリキシマブの電荷変異体が図16Aに示されるように分離され、最終的な集束吸光度画像が捕捉される。ソフトウェアは、pIマーカーの空間位置を特定して、マーカー間で補間し、集束検体画分ピークのpIを計算する。この時点で、制御ソフトウェアがリレーをトリガし、リレーは、ポート104を電源1310に接続するとともに、ポート104に接続される動員材リザーバに作用する圧力を設定して、ポート104を通じてチャネル105,114に入ってオリフィス116でチップから出る100nL/分の動員材溶液の流れを確立する。オリフィス116は、質量分析計のESI注入口1315から2mm離れて位置付けられる。電源1307が電流制御を使用して0μAに設定され、電源1305が7000Vに設定され、電源1310が4000Vに設定され、また、MS ESIイオン源1315がグランドに保持される。図13Bに示されるように、更なるレジスタR120が電源1310とチャネル105(R電流シンク)との間の系に接続され、また、レジスタR120の反対側が電源1320に接続される。電源1320は、電流シンクとして作用するために電源1310よりも最低4000V低く設定される。レジスタR120は、代わりに、図13Aの場合のように電気回路をグランドに接続することができ、図13Cに示されるように電界効果トランジスタ(FET)となることができ、図13Dに示されるようにバイポーラ接合トランジスタ(BJT)となることができ、又は、機能する電気泳動回路を形成するべく電源1310から電流をシンクすることができる任意の他の抵抗素子となり得る。
圧力駆動流が動員材をポート104からオリフィス116へ方向付ける一方で、動員材試薬中のギ酸の一部がチャネル105からチャネル112を通ってポート108のアノードにギ酸塩の形態で電気泳動する。ギ酸塩がチャネル112を通って移動するにつれて、ギ酸塩は、等電pH勾配を乱し、それにより、両性電解質、標準、及び、検体サンプルは、電荷を増大させるとともに、電気泳動的にチャネル112からチャネル114へ移動し、ここで、ポート110からの圧力駆動流がそれらをオリフィス116からESIスプレーに運ぶ。
動員が発生している間、チャネル112の抵抗が低下する。チャネル111の全体にわたる電圧降下がこの時点で0であるため(ΔV=IR=0*R111=0V)、0μAに設定される電源1307はV116の電圧に等しい。図11A~図11Bのデータに示されるように、ソフトウェアは、図12に記載されるように、電流の変化を監視し、電源を調整して、アノードとカソードとの間で3000Vの一定の電圧降下を維持するとともにチップ116で3000ボルトを維持する。チップの電圧(V116)は式2によって表される。
V116=ΔV108-110*(R111)/(R109+R112+R105)+(電源1310電圧設定)。
動員が発生している間、ソフトウェアは、吸光度画像を捕捉し続けてピークを特定し、それにより、撮像チャネル112からチャネル114へのピークの移動を追跡する。各ピークが撮像チャネル112から離れる時間、その速度、及び、チャネル114内の流量を追跡することにより、ソフトウェアは、ピークがチャネル114を横切ってオリフィス116を介して質量分析計に導入される時間を計算でき、それにより、当初の集束ピークと結果として生じる質量スペクトルとの間の直接的な相関が可能となる。例えば、図16Bは、図16Aに示されるエレクトロフェログラムの酸性ピークに含まれた、質量分析計にエレクトロスプレーされるグリコフォームの質量を示す。図16Cは、図16Aからの主要なインフリキシマブピークにおけるグリコフォームの質量を示す。図16D及び図16Eは、図16Aに示されるエレクトロフェログラムからの基本ピークの質量を示す。
実施例8-2ステップキャピラリーIEFで電界強度及び一定電圧を維持するために高電圧及び低電圧を変更する
実施例8では、図14Aに概説されるように、2ステップIEF(等電点電気泳動とそれに続く動員)が、60cmキャピラリーで実行され、接合噴霧器を介してESI-MSへ動員される。分離キャピラリー1808が陽極液バイアル1806中に浸漬される。高電圧電源1802が電極1804を介して陽極液バイアル1806に接続される。キャピラリー1808の他端部は、ティーユニオン1812を介して接合噴霧器1814に接続される。キャピラリー1808は、キャピラリー出口がESIチップ1824に近接するように接合噴霧器1814に挿入される。ティーユニオン1812の第3のアームは、加圧された動員材バイアル1818中に浸漬される動員材キャピラリー1816に接続される。また、加圧された動員材バイアル1818は、それが電流シンクとして作用するように電極1817を介して接地される。更に、接合噴霧器1814は、噴霧器1814の外側に接続する配線1820を介して電源1810に接続される。この例では、質量分析計のイオン源がグランドに保持される。
実施例8では、図14Aに概説されるように、2ステップIEF(等電点電気泳動とそれに続く動員)が、60cmキャピラリーで実行され、接合噴霧器を介してESI-MSへ動員される。分離キャピラリー1808が陽極液バイアル1806中に浸漬される。高電圧電源1802が電極1804を介して陽極液バイアル1806に接続される。キャピラリー1808の他端部は、ティーユニオン1812を介して接合噴霧器1814に接続される。キャピラリー1808は、キャピラリー出口がESIチップ1824に近接するように接合噴霧器1814に挿入される。ティーユニオン1812の第3のアームは、加圧された動員材バイアル1818中に浸漬される動員材キャピラリー1816に接続される。また、加圧された動員材バイアル1818は、それが電流シンクとして作用するように電極1817を介して接地される。更に、接合噴霧器1814は、噴霧器1814の外側に接続する配線1820を介して電源1810に接続される。この例では、質量分析計のイオン源がグランドに保持される。
試薬は以下のように調製される。陽極液バイアル1806には水中に1%ギ酸が充填され、分離キャピラリー1808には水性サンプル(250μg/mL NIST mAb、1.5%Pharmalyte 5-8両性電解質、1.5%Pharmalyte 8-10.5、5 mg/mL pI標準7.00及び10.17)が充填され、接合噴霧器チャンバ1826及び動員材キャピラリー1816には水中に1%ジエチルアミンが充填され、加圧動員材バイアル1818には1%ギ酸、50%アセトニトリル、及び、49%水が充填される。
この例では、質量分析計のイオン源がグランドに保持される。集束を開始するために、電源1802が+30kVに設定され、電源1810が4kVに設定される。そして、動員材バイアル1818からの圧力駆動流が100nL/分で開始される。このようにして、ESIが接合噴霧器キャビティ1826でジエチルアミンを使用して開始され、ジエチルアミンは等電点電気泳動ステップのための陰極液としても作用する。
キャピラリー1808で集束が進行するにつれて、サンプルは電荷運搬能力を失い、キャピラリー1808で抵抗が増大する。ESIチップがキャピラリー1808とチャンバ1826内のジエチルアミンとの間に電気的に位置付けられると(図14B参照)、ESIチップ電圧(V1824)は式3にしたがって低下する。
V1824=ΔV1806-1814*R1826/(R1808+R1826)+V1814
更に、キャピラリー1808の抵抗が増大するにつれて、電源1802で測定され得るキャピラリーを通過する電流が減少する。増大した電流は、式4によってキャピラリー1808の抵抗変化に直接に関連付けられる。
更に、キャピラリー1808の抵抗が増大するにつれて、電源1802で測定され得るキャピラリーを通過する電流が減少する。増大した電流は、式4によってキャピラリー1808の抵抗変化に直接に関連付けられる。
I1806=ΔV1806-1814/(R1808+R1826)
図12に記載されるようなコンピュータ制御フィードバックループを使用して、システムは、キャピラリー1808の抵抗の変化(したがって、ESIチップ1824における電圧を規定するキャピラリー1808の全体にわたる電圧降下の変化)を計算することができ、システムは、26kVのΔVを保持するとともに4000kVのESIチップ電圧を維持するべく電源1802,1810を調整できる。
図12に記載されるようなコンピュータ制御フィードバックループを使用して、システムは、キャピラリー1808の抵抗の変化(したがって、ESIチップ1824における電圧を規定するキャピラリー1808の全体にわたる電圧降下の変化)を計算することができ、システムは、26kVのΔVを保持するとともに4000kVのESIチップ電圧を維持するべく電源1802,1810を調整できる。
集束が完了した後(約30分)、加圧動員材バイアル1818内の動員材溶液は接合噴霧器チャンバ1826内のジエチルアミンに取って代わってしまっており、それにより、キャピラリー1808内のNIST mAbタンパク質アイソフォームの動員が開始される。同様の態様であるが等電点電気泳動とは反対に、動員が進むにつれて、キャピラリー1808の抵抗が低下し、それにより、ESIチップ1824の電圧に影響が及ぶ。この場合も、コンピュータ制御のフィードバックループは、式3及び式4を使用して、ESIチップ1824の電圧を4kVに維持しつつ26kVの電界を維持するために電源1802,1810に必要な変化を計算する。
本発明の好ましい実施形態について図示して本明細書中で説明してきたが、当業者に明らかなように、そのような実施形態は単なる一例として提供されている。本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び、置換が当業者に想起され得る。本明細書中に記載される本発明の実施形態の様々な代替物を本発明を実施する際に任意に組み合わせて使用できることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、それによって、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物が網羅されることが意図される。
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- 本明細書に記載の発明。
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