CN101280334B - 一种交流电辅助蛋白高效酶解方法 - Google Patents

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本发明属蛋白质组学技术领域，具体涉及一种交流电辅助蛋白高效酶解方法。本发明将蛋白质与蛋白水解酶如胰蛋白酶按一定比例溶解于缓冲溶液中，使溶液与一对施加有交流电压的电极接触。在电极间交变电场的作用下，带电荷的蛋白、酶以及无机离子等迅速改变在电场中的运动方向，引起蛋白和酶等分子的振动、碰撞、旋转和摩擦等运动。同时，蛋白分子中肽链中荷电基团也会在交变电场的作用下发生震动，使更多的酶切位点暴露出来，这些运动提高了蛋白和酶分子的能量水平及相互作用频率，从而大幅提高蛋白酶解效率。采用交流电辅助蛋白酶解，酶解时间从传统溶液酶解的12小时大幅缩短到5到10分钟，而酶解效率得到显著提高。

Description

一种交流电辅助蛋白高效酶解方法
技术领域
本发明属蛋白质组学技术领域，具体涉及一种交流电辅助蛋白高效酶解方法。
背景技术
蛋白组质组学是目前国际生命科学界的研究热点，其在整体的蛋白质水平上，在一个更加深入、更加贴近生命本质的层次上去探讨和发现生命活动的规律以及重要生理、病理现象的本质等，其中蛋白的鉴定是其最为重要的工作之一。肽质量指纹图谱法(Peptide mass fringprint，PMF)是研究蛋白质结构信息和鉴定蛋白质的常用方法，而酶解是蛋白质组学研究中蛋白质分析的关键的一个步骤，目的是将蛋白分解成肽段，然后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)或液相色谱电喷雾质谱(LC-ESI-MS)分析多肽混合物，获得肽质量指纹图谱。由于传统的溶液酶解方法耗时(12小时以上)，直接制约了蛋白质分析速度的提高，故建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义[1]。
目前提高酶解效率的方法主要有固定化酶技术以及微波和超声波辅助酶解技术等。固定化酶技术中研究较多的有酶微反应器和磁固定化酶技术。酶微反应器主要是将蛋白水解酶(如胰蛋白酶)通过溶胶-凝胶包埋[2，3]和共价键合[4]等技术固定在毛细管或微流芯片的微通道内表面，由于可将高浓度的蛋白水解酶固定在微小的通道内，可使酶解时间大幅缩短。而磁固定化酶技术是将蛋白水解酶通过共价键合等手段固定在磁性微球表面，使固定有酶的磁球与蛋白溶液反应生成多肽后，通过磁铁将磁性微球分离。该酶解技术需要外加热源，以促进酶解[5]。最近采用微波辅助溶液蛋白酶解已有报道，利用该技术酶解蛋白只需要十几分钟[6]。此外，超声波也被用于促进蛋白溶液酶解，酶解时间可缩短到数分钟[7]。
本发明提出了交流电辅助蛋白酶解方法，将蛋白质的酶解时间从传统溶液酶解的12小时以上大幅度降低到5分钟，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。由于本发明使用的低压交流电可通过变压器直接由市电转换而来，设备简单，操作简便。低压交流电对人体无害，操作安全，可用于批量蛋白样品的高通量酶解和鉴定。本发明提出的交流电辅助蛋白高效酶解方法及其装置在蛋白质研究、生物医学研究以及药品和食品分析等领域有良好的应用前景。
参考文献
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发明内容
本发明的目的在于提出一种交流电辅助蛋白快速酶解方法。
本发明提出的交流电辅助蛋白高效酶解方法，具体步骤如下：将蛋白质与蛋白水解酶按质量比为1∶20-1∶100的量溶解于pH为7-9的缓冲溶液中，得到样品溶液；使样品溶液与一对施加有交流电压的电极接触，交流电压为1-20V，进行交流电辅助酶解。酶解时间为5到10分钟。
本发明中，电极对上加的电压为正弦波、三角波或方波交流电压。
本发明中，所述的蛋白质与蛋白水解酶的混合溶液可以置于容器中，或者直接点在不锈钢质谱靶板上。
用于上述方法的装置图如图1所示。由一个聚丙烯离心管4和两个电极1和2组成。具体操作过程如下：
将蛋白质溶解在缓冲溶液如10-100毫摩尔/升的碳酸氢铵溶液中，浓度一般在1-500纳克/微升，于90-100℃的水浴中加热变性5-15分钟，使蛋白的酶切位点充分暴露。然后与一定浓度的蛋白水解酶(如胰蛋白酶溶液)混合，得样品缓冲溶液，其中蛋白质与蛋白水解酶的质量比为1∶20-1∶100；将样品溶液置于一聚丙烯离心管4中，将两个电极插入混合溶液中，然后在电极上施加1-20V的交流电压，进行交流电辅助酶解，酶解时间控制在5到10分钟，使溶液中蛋白酶解完全。也可以将样品溶液直接点在不锈钢质谱靶板上，然后将1-20V的交流电压施加在不锈钢质谱靶板7和与蛋白水解酶混合溶液液滴5接触的铂圆盘电极间，当交流电将通过含蛋白水解酶和蛋白的样品溶液5-10分钟后，即完成交流电辅助蛋白酶解，如图2所示。
交流电辅助蛋白快速酶解的原理如下：由于在与样品溶液接触的电极间加有交流电压，在溶液中就会产生交变电场，于是在电极间带电荷的蛋白、酶以及无机离子等在库仑力的作用下迅速改变在电场中的运动方向，引起蛋白和酶等分子的振动、碰撞、旋转和摩擦等运动，提高了分子本身的能量水平以及蛋白和酶的作用频率，从而提高蛋白酶解效率。此外蛋白分子中肽链中荷电基团也会在交变电场的作用下发生震动，使更多的酶切位点暴露出来，提高了蛋白水解酶与蛋白的酶切位点的作用频率，从而提高酶解效率。
本发明利用交流电代替传统蛋白溶液酶解中使用的水浴，将蛋白质的酶解时间从传统溶液酶解的12小时以上大幅度降低到5分钟，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。由于本发明使用的低压交流电可通过变压器直接由市电转换而来，设备简单，操作简便。低压交流电对人体无害，操作安全，可用于批量蛋白样品的高通量酶解和鉴定。本发明提出的交流电辅助蛋白高效酶解方法及其装置在蛋白质研究、生物医学研究以及药品和食品分析等领域有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中交流电辅助酶解装置图。
图2为本发明中质谱靶板上交流电辅助蛋白高效酶解装置示意图。
图3(A)和图3(B)分别为使用电压为5V的交流电辅助酶解于管中的牛血清白蛋白(A)和马心细胞色素C(B)溶液获得产物的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图(MALDI-TOF MS)；图3(C)和图3(D)分别为使用电压为5V的直流电辅助酶解于管中的牛血清白蛋白(C)和马心细胞色素C(D)溶液获得酶解产物的MALDI-TOF质谱图。酶解时间，5分钟；酶解温度，25℃；蛋白质溶液浓度200ng/μL(溶于10mmol/L NH4HCO3水溶液中，pH 8.1)；蛋白和胰蛋白酶的质量比为1∶40；所有被鉴定的肽段均用“*”标出。
图4(A)为使用电压为5V的交流电辅助酶解于管中的马心细胞色素C溶液获得酶解产物的大范围MALDI-TOF质谱图；图4(B)为使用常规溶液酶解方法酶解马心细胞色素C(B)溶液获得酶解产物的大范围MALDI-TOF质谱图。酶解时间，5分钟；酶解温度，(A)25℃，(B)37℃；蛋白质溶液浓度200ng/μL(溶于10mmol/L NH4HCO3水溶液，pH 8.1中)；蛋白和胰蛋白酶的质量比为1∶40。
图中标号：1为直形铂丝电极，2为螺旋形铂丝电极，3为盖子，4为聚丙烯离心管，5为蛋白质和蛋白水解酶混合溶液(样品溶液)，6为铂圆盘电极，7为质谱点样靶板
具体实施方式
下面通过实施例和附图进一步描述本发明：
1、管内交流电辅助蛋白快速酶解
本发明提出的管内交流电辅助蛋白质酶解装置结构如图1所示，由一个0.5mL的聚丙烯离心管4、直形铂丝电极1、螺旋形铂丝电极2和盖子3组成，施加在电极上的交流电通过小型变压器将民用220V交流电(50Hz)直接降压获的，变压器的次级线圈有中间抽头，可提供2-10V的低压交流电(50Hz)。
将蛋白质溶解在50毫摩尔/升的碳酸氢铵溶液(pH 8.0)中，于95℃的水浴中加热变性10分钟，使蛋白的酶切位点充分暴露。然后与一定浓度的胰蛋白酶溶液混合，其中蛋白质的浓度为200纳克/微升，蛋白质与蛋白水解酶的质量比为1∶40，该溶液置于聚丙烯离心管4中，在电极1和2间施加5V的交流电压，管内交流电辅助酶解，酶解时间控制在5分钟，酶解在室温(约25℃)进行。
图3为使用交流电辅助酶解方法酶解于聚丙烯离心管3中牛血清白蛋白和马心细胞色素C溶液获得产物的MALDI-TOF质谱图。可见在谱图中出现了酶解肽段的质谱峰，已用“*”标出。通过检索网上数据库，发现分别有36和14条肽段与牛血清白蛋白和马心细胞色素C匹配，得到鉴定的氨基酸分别有321和88个，蛋白序列覆盖度分别为52％和84％；而传统溶液酶解牛血清白蛋白和马心细胞色素C产物的蛋白序列覆盖度分别为38％和69％(酶解时间为12小时，酶解温度为37℃)，表明交流电辅助管内蛋白酶解在5分钟内的酶解结果优于溶液酶解12小时的结果，结果证明本发明提出的交流电辅助蛋白酶解方法具有较高的酶解效率。
此外，我们还测定了交流电辅助质谱靶上酶解马心细胞色素C和常规溶液酶解方法酶解马心细胞色素C的大范围MALDI-TOF质谱图(见图4(A))。细胞色素C的峰未在质谱图谱中出现，说明采用交流电辅助酶解方法，蛋白可在5分钟之内可以酶解完全。而采用常规溶液酶解方法在5分钟内酶解马心细胞色素C不彻底，在对应的大范围MALDI-TOF质谱图中仍可见未酶解的马心细胞色素C的峰(见图4(B))。
2、质谱靶板上交流电辅助蛋白快速酶解
对于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，蛋白水解溶液在分析前需要将溶液点在质谱靶板上，而蛋白质质谱靶板上直接酶解可以简化操作步骤。作为本发明实施例2，进行了质谱靶上交流电辅助快速酶解马心肌红蛋白工作。
将马心肌红蛋白的变性溶液(热变性方法见实施例1)与胰蛋白酶溶液的混合，其中马心肌红蛋白的浓度为200纳克/微升，马心肌红蛋白与胰蛋白酶的质量比为1∶40，取0.5微升该溶液直接点在质谱靶板上，将一直径为0.5微米的铂园盘电极16通过三维定位仪的调节与质谱靶板7上的液滴接触，在不锈钢质谱靶板7与铂园盘电极16间施加5V的交流电压，进行质谱靶板上交流电辅助靶上酶解，酶解时间控制在5分钟。酶解完毕，带有酶解产物的不锈钢质谱靶板7直接进入质谱仪器系统进行质谱分析。根据获得马心肌红蛋白溶液酶解产物的MALDI-TOF质谱图(图略)，通过检索网上数据库，发现对于马心肌红蛋白分别有16条肽段匹配，得到鉴定的氨基酸分别有138个，蛋白序列覆盖度90％；而传统溶液酶解马心肌红蛋白产物的蛋白序列覆盖度为69％(酶解时间为12小时，酶解温度为37℃)，表明交流电辅助质谱靶板上蛋白酶解在5分钟内的酶解结果优于溶液酶解12小时的结果，说明本发明提出的交流电辅助蛋白质靶上酶解方法具有良好的酶解能力。

Claims (3)

1.一种交流电辅助蛋白酶解方法，其特征在于具体步骤如下：将蛋白质与蛋白水解酶按质量比为1∶20-1∶100的量溶解于pH为7-9的缓冲溶液中，得到样品溶液；使样品溶液与一对施加有交流电压的电极接触，交流电压为1-20V，进行交流电辅助酶解，酶解时间为5到10分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于电极对上加的电压为正弦波、三角波或方波交流电压。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白质与蛋白水解酶的混合溶液置于容器中，或者直接点在不锈钢质谱靶板上。
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