CN117363681A - 一种鲣鱼弹性蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲣鱼弹性蛋白肽及其制备方法，一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法，包括以下步骤：S1、清洗，去杂质，控水后剪碎，加无水乙醇，搅拌，2h后用清水冲洗；S2、控水后加入纯净水超声匀浆，调pH至12，摇动反应2h；S3、离心，向沉淀中加入纯净水，用HCl调pH至1，摇动反应后离心；S4、将沉淀加入NaCl溶液中，摇动反应后离心；S5、向沉淀中加入纯净水，调pH至7.8，加入弹性蛋白酶，离心，将沉淀冷冻干燥后粉碎，即得鲣鱼弹性蛋白肽。本发明提供的一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法条件温和，得率高，获得的鲣鱼弹性蛋白肽不存在安全隐患，可放心食用/使用，分子量低能更好地穿越表皮屏障到达目的部位，进而更好地发挥其生物学作用。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白肽技术领域，尤其是涉及一种鲣鱼弹性蛋白肽及其制备方法。
背景技术
不少人认为，留住肌肤青春的保养重点就是如何补充胶原蛋白，其实弹性蛋白在维持肌肤弹性方面也担当着重要的角色。在机体中弹性蛋白与胶原蛋白共同存在，赋予皮肤组织以弹性和抗张能力。弹性蛋白与胶原蛋白的关系如同伞骨和伞面，其中，弹性蛋白是伞骨，负责支撑，而胶原蛋白是伞面，负责填充，二者捆扎共生，缺一不可。
特别是对于肺、心脏、大动脉、弹性软骨、皮肤、韧带和膀胱等经常受力而变形的组织和器官，弹性蛋白显得尤为重要。弹性蛋白的主要功能是为所在组织和器官提供抵抗反复压缩和形变的能力，如同橡皮带一样，它的长度能够伸展到正常长度的几倍，当收缩时又能恢复到原始长度，从而赋予这些组织以弹性和抗张能力。
弹性蛋白独有的氨基酸类是锁链素和异锁链氨基酸类，它们与赖氨酸残基共价交联形成网状结构，通过这种网状结构构型的变化使弹性蛋白具有很强的弹性，有研究显示，弹性蛋白的伸展性比同样横截面积的橡皮条至少大5倍。
弹性蛋白在人体内的合成从出生开始，并逐渐升高，到青春期达到峰值，但是机体在25岁后，弹性蛋白的生产即停止，各种内外因素造成的损伤逐渐积累且难以修复，降解增强，致使体内的弹性蛋白不断被降解、片段化、含量不断减少直至消失，皮肤开始出现弹性减退、松弛/垂、有细纹等老化现象，具有弹性的器官弹性减弱直至消失、功能减退。
鲣鱼弹性蛋白肽”是我国卫健委目前唯一批准使用的可食用弹性蛋白原料，鲣鱼心脏动脉球是优质的弹性蛋白肽来源，其中含有弹性蛋白的标志性氨基酸——锁链素和异锁链素，可以补充体内流逝的弹性蛋白，对维持皮肤、血管的弹性、外观、新陈代谢产生很好的效果。
目前，常用的鲣鱼弹性蛋白肽的提取、纯化方法有热碱法、热酸法、盐抽提、酶消化等方法，热碱法和热酸法反应强烈，弹性蛋白降解厉害，得率低，盐抽提法中使用的盐多对人体有害，例如盐酸胍苯酚。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲣鱼弹性蛋白肽及其制备方法，以解决目前鲣鱼弹性蛋白肽提取过程中弹性蛋白降解严重、得率低、所用提取试剂对人体健康存在安全隐患等问题。
为实现上述目的，本发明提供一种鲣鱼弹性蛋白肽及其制备方法。一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法，包括以下步骤：
S1、将购买的鲣鱼心脏动脉球用清水清洗，去除可见的杂质，控水后将鲣鱼心脏动脉球剪碎，加入无水乙醇中，并不断搅拌，2h后从无水乙醇中捞出并用清水冲洗，直至无明显乙醇气味；
S2、控水后加入动脉球3～4倍质量的纯净水，超声匀浆后调pH至12，摇动反应2h；
S3、离心，向沉淀中加入纯净水并用HCl调pH至1，摇动反应后离心；
S4、将沉淀加入1mol/L的NaCl溶液中，摇动反应，然后离心；
S5、向沉淀中加入纯净水，调pH至7.8，加入弹性蛋白酶，离心，将沉淀冷冻干燥后，粉碎过80目筛即得鲣鱼弹性蛋白肽。
优选的，所述步骤S1中鲣鱼心脏动脉球被剪碎后的面积不大于5×5mm2；鲣鱼心脏动脉球：无水乙醇的质量体积比为1:1.5～1:2；搅拌速度为200r/min。
优选的，所述步骤S2中超声时间为10～15min；调pH所用试剂选用NaOH或KOH溶液；所述步骤S2～S5中的摇动反应在摇床上进行，摇动频率为60～70次/min。
优选的，所述步骤S3～S5中离心条件为7000～8000r/min，4℃，离心10～15min；所述步骤S3中，移除上清液获得沉淀，然后用pH为12的NaOH或KOH溶液吸打清洗沉淀后再离心，再用HCl调pH前重复2～3次上述步骤，之后用纯净水重复上述步骤1～2次。
优选的，所述步骤S4中在将沉淀加入NaCl溶液之前，需将沉淀用1mol/L的HCl重悬然后离心，并重复上述步骤2～3次，然后用纯净水重悬后离心1次；摇动反应2～3h。
优选的，所述步骤S5中在调pH前重复用纯净水重悬沉淀、离心去上清步骤2次；加入的弹性蛋白酶与沉淀的质量比为1:200～250，酶解15～20min。
一种如上所述的鲣鱼弹性蛋白肽制备方法获得的鲣鱼弹性蛋白肽。
鲣鱼心脏动脉球中除弹性蛋白主要包括脂肪、酸性蛋白、碱性蛋白、胶原蛋白、球蛋白等。本发明提供的制备方法，通过在无水乙醇中浸提，除去鲣鱼心脏动脉球中的脂肪，同时，因为无水乙醇为无毒、溶解能力较强的有机溶剂，还可以同时去掉大部分动脉球中的腥臭味；通过调节提取液pH至碱性和酸性，分别使动脉球中的酸性蛋白和碱性蛋白先后溶于提取液中，通过固液分离被分别去除，同时，在碱性条件下还可以去掉其中大部分的胶原蛋白；最后，通过盐溶液来去除其中的球蛋白。
因此，本发明提供的一种鲣鱼弹性蛋白肽及其制备方法，具有以下技术效果：
(1)本发明提供的制备方法没有使用任何对人体健康存在安全隐患的试剂，制备的弹性蛋白肽对使用者安全无害，可以放心食用/使用；
(2)本发明提供的制备方法条件温和，没有加热过程，大大降低了热降解的比率，为提高弹性蛋白肽的得率奠定了基础；
(3)本发明提供的制备方法通过减少降解、超声破碎更细腻、利用弹性蛋白耐酸耐碱耐有机试剂的特点大大提高了鲣鱼蛋白肽的得率；
(4)本发明提供的制备方法通过利用弹性蛋白酶酶解，使弹性蛋白的分子量大大降低，从而使其能更好地穿越表皮屏障到达目的部位，更好地发挥其生物学作用。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过具体的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员的通常理解的含义相同。
鲣鱼心脏动脉球购自宁波今日食品有限公司；电动摇床购自武汉汇诚科技生物有限公司，型号为PY45；离心机为Thermo ST16R冷冻离心机；弹性蛋白酶购自合肥诺尔达生物科技有限公司，酶活10万；冷冻干燥机为北京四环科学仪器厂生产的LGJ-10D冷冻干燥机。
实施例一
制备鲣鱼弹性蛋白肽，包括以下步骤：
S1、将购买的鲣鱼心脏动脉球用清水清洗，去除可见的杂质，控水后将鲣鱼心脏动脉球剪碎，使动脉球碎片的面积不大于5×5mm2，称取1kg动脉球碎片，加入1.5L无水乙醇中，以200r/min的转速不断搅拌，2h后从无水乙醇中捞出，稍沥无水乙醇后加入2L清水中搅拌清洗，冲洗3次后无明显乙醇气味和腥臭味；
S2、将清洗干净的动脉球碎片控水，然后加入3kg的纯净水中，超声匀浆10min，边搅拌边加入1mol/L的NaOH，并不断检测匀浆液的pH，待匀浆液各部分的pH均为12时停止加入NaOH。将电动摇床的摇动频率调为60次/min，将匀浆液置于摇床上摇动反应2h；
S3、将匀浆液等量分装入6个1L的离心瓶中，以7000r/min的转速，4℃条件下离心10min，移除上清液，再加入200mLpH为12的NaOH溶液吸打混匀，重复离心、移除上清液、加NaOH溶液的操作3次。向获得的沉淀中加入200mL纯净水吸打混匀后采用上述离心条件离心，去除上清液，再加入300mL的纯净水，用1mol/L的HCl溶液调pH至1，在摇动频率为70次/min的电动摇床上摇动反应2h后，以7000r/min的转速，4℃条件下离心10min；
S4、移除上清液，向沉淀中加入200mL 1mol/L的HCl重悬，然后以7000r/min的转速，4℃条件下离心10min，重复加HCl重悬、离心的操作3次，然后加入纯净水重悬、离心，向获得的沉淀中加入300mL 1mol/L的NaCl溶液，以70次/min的频率摇动反应3h，然后以7000r/min的转速，4℃条件下离心15min；
S5、向沉淀中加入200mL纯净水，重悬沉淀，吸打混匀，然后以7000r/min的转速，4℃条件下离心15min，重复上述加纯净水、混匀、离心、留沉淀的步骤2次，将获得的沉淀中加入300mL纯净水，用NaOH和HCl调沉淀液的pH至7.8，每个离心瓶加入1mg弹性蛋白酶，酶解15min后，于8000r/min，4℃条件下离心10min，移除上清液，将沉淀置于冷冻干燥机中冷冻干燥，将干燥的沉淀粉碎过80目筛即得鲣鱼弹性蛋白肽。
实施例二
制备鲣鱼弹性蛋白肽，包括以下步骤与实施例一完全相同，只是存在如下区别：
步骤S1中加入无水乙醇的量为1.8L；
步骤S2中的超声时间为12min，摇床摇动频率为65次/min；
步骤S3中的离心条件为7500r/min的转速，4℃条件下离心15min，沉淀用纯净水清洗2次，摇动频率为65次/min；
步骤S4中的离心条件为7500r/min的转速，4℃条件下离心15min，摇动频率为65次/min，摇动反应3h，HCl重悬、离心的操作重复2次，然后加入纯净水重悬、离心2次；
步骤S5中的离心条件为7500r/min的转速，4℃条件下离心15min，加入弹性蛋白酶0.8mg，酶解20min。
实施例三
制备鲣鱼弹性蛋白肽，包括以下步骤与实施例一完全相同，只是存在如下区别：
步骤S1中加入无水乙醇的量为2L；
步骤S2中的超声时间为15min，调pH选用1mol/L的KOH溶液，摇床摇动频率为70次/min；
步骤S3中的离心条件为8000r/min的转速，4℃条件下离心12min，加入的碱液为pH12的KOH溶液，重复离心、移除上清液、加KOH溶液的操作2次，用纯净水清洗2次，摇动频率为60次/min；
步骤S4中的离心条件为8000r/min的转速，4℃条件下离心12min，摇动频率为60次/min，摇动反应2h；
步骤S5中的离心条件为8000r/min的转速，4℃条件下离心12min，加入弹性蛋白酶1.1mg，酶解20min。
结果分析
经过称量，1kg鲜重鲣鱼心脏动脉球用实施例一中的制备方法可以获得30g冷冻干燥的弹性蛋白肽，实施例二中的方法共得到29.5g冷冻干燥的弹性蛋白肽，实施例三中的方法共得到30.2g冷冻干燥的弹性蛋白肽。
分别取实施例一、二和三制备的鲣鱼弹性蛋白肽3g，送谱尼测试基团股份有限公司检测多肽的分子量，结果显示实施例一至三中获得的鲣鱼弹性蛋白肽的分子量分别为不大于120Da、100Da和110Da。
因此，本发明提供的一种鲣鱼弹性蛋白肽及其制备方法没有使用任何对人体健康存在安全隐患的试剂，制备的弹性蛋白肽对使用者安全无害，可以放心食用/使用；条件温和，没有加热过程，大大降低了热降解的比率，为提高弹性蛋白肽的得率奠定了基础；通过减少降解、超声破碎更细腻、利用弹性蛋白耐酸耐碱耐有机试剂的特点大大提高了鲣鱼蛋白肽的得率；通过利用弹性蛋白酶酶解，使弹性蛋白的分子量大大降低，从而使其能更好地穿越表皮屏障到达目的部位，更好地发挥其生物学作用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将购买的鲣鱼心脏动脉球用清水清洗，去除可见的杂质，控水后将鲣鱼心脏动脉球剪碎，加入无水乙醇中，并不断搅拌，2h后从无水乙醇中捞出并用清水冲洗，直至无明显乙醇气味；
S2、控水后加入动脉球3～4倍质量的纯净水，超声匀浆后调pH至12，摇动反应2h；
S3、离心，向沉淀中加入纯净水并用HCl调pH至1，摇动反应后离心；
S4、将沉淀加入1mol/L的NaCl溶液中，摇动反应，然后离心；
S5、向沉淀中加入纯净水，调pH至7.8，加入弹性蛋白酶，离心，将沉淀冷冻干燥后，粉碎过80目筛即得鲣鱼弹性蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法，其特征在于：所述步骤S1中鲣鱼心脏动脉球被剪碎后的面积不大于5×5mm2；鲣鱼心脏动脉球：无水乙醇的质量体积比为1:1.5～1:2；搅拌速度为200r/min。
3.根据权利要求1所述的一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法，其特征在于：所述步骤S2中超声时间为10～15min；调pH所用试剂选用NaOH或KOH溶液；所述步骤S2～S5中的摇动反应在摇床上进行，摇动频率为60～70次/min。
4.根据权利要求1所述的一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法，其特征在于：所述步骤S3～S5中离心条件为7000～8000r/min，4℃，离心10～15min；所述步骤S3中，移除上清液获得沉淀，然后用pH为12的NaOH或KOH溶液吸打清洗沉淀后再离心，再用HCl调pH前重复2～3次上述步骤，之后用纯净水重复上述步骤1～2次。
5.根据权利要求1所述的一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法，其特征在于：所述步骤S4中在将沉淀加入NaCl溶液之前，需将沉淀用1mol/L的HCl重悬然后离心，并重复上述步骤2～3次，然后用纯净水重悬后离心1次；摇动反应2～3h。
6.根据权利要求1所述的一种鲣鱼弹性蛋白肽制备方法，其特征在于：所述步骤S5中在调pH前重复用纯净水重悬沉淀、离心去上清步骤2次；加入的弹性蛋白酶与沉淀的质量比为1:200～250，酶解15～20min。
7.一种如权利要求1～6任一项所述的鲣鱼弹性蛋白肽制备方法获得的鲣鱼弹性蛋白肽。
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- 2023-11-13 CN CN202311503003.2A patent/CN117363681A/zh active Pending
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