CN108308196A - 一种壳聚糖复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种壳聚糖复合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物保护制剂领域，提供了一种壳聚糖复合菌剂，包括壳聚糖、芽孢杆菌溶液和霍格兰氏营养液，所述壳聚糖与霍格兰氏营养液的质量体积比为10～25g:90～120mL，所述霍格兰氏营养液与枯草芽孢杆菌的体积比为8～10:1。本发明所述壳聚糖复合制剂中以壳聚糖和芽孢杆菌溶液为主要活性物质，通过壳聚糖与芽孢杆菌溶液复配能够提高壳聚糖在较高浓度下对黑曲霉的抑菌效果。本发明所述的壳聚糖复合菌剂还能够用于植物保护中，将所述壳聚糖复合菌剂在发挥抑菌作用的同时还具有调节植物根系土壤中的微生物结构、促进有机质分解、产生丰富的代谢物的作用，从而对植物起到促进生长和保护作用。

Description

一种壳聚糖复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物保护制剂领域，具体涉及一种壳聚糖复合菌剂及其制备方法，以及所述壳聚糖复合菌剂在植物保护中的应用。
背景技术
壳聚糖(chitosan)，又称脱乙酰甲壳素，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，是甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，是甲壳素最基本、最重要的衍溶生物。壳聚糖由于具有无毒副作用、可经微生物降解、良好的生物可容性和成膜性而被广泛运用。壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解，特别值得指出的是溶解后的溶液中含有氨基(-NH2)，这些氨基通过结合负电子来抑制细菌。壳聚糖的抑制细菌活性，使其在医药、纺织和食品等领域有着广泛的应用。
黑曲霉菌菌属于曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。在高温、高湿环境下，黑曲霉容易大量生长繁殖产酶生热，侵染棉花时引起落花或烂铃，或生于多汁的果实上，引起腐烂或软腐，侵染洋葱鳞片表面生大量黑粉；梅雨季节亦容易引起衣物发霉等。现有研究表明，壳聚糖对真菌黑曲霉具有抑制作用，但是其抑制作用与壳聚糖的分子量和浓度有关，随着壳聚糖分子量的逐渐增大，对黑曲霉的抑制效果逐渐减弱；高分子量和高浓度的壳聚糖对黑曲霉不仅没有抑制作用，反而会促进其生长；只有在适当低浓度下的一定分子量壳聚糖对黑曲霉才有抑制作用(李小芳.壳聚糖抑菌活性及机理研究[D].兰州大学,2009)。
发明内容
有鉴于此，为了解决壳聚糖较高浓度下对细菌和真菌抑制效果差的问题，本发明提供了一种壳聚糖复合菌剂。
为了实现上述发明目，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种壳聚糖复合菌剂，包括壳聚糖、芽孢杆菌溶液和霍格兰氏营养液，所述壳聚糖与霍格兰氏营养液的质量体积比为10～25g:90～120mL，所述霍格兰氏营养液与枯草芽孢杆菌的体积比为8～10:1；
所述芽孢杆菌液含有1.0×108～1.0×109CFU/mL的芽孢杆菌。
优选的，所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或短小芽孢杆菌中的一种或多种。
优选的，所述芽孢杆菌溶液的溶剂为水、芽孢杆菌液体培养基或霍格兰氏营养液。
优选的，所述壳聚糖是以南美白对虾虾壳为原料提取得到的。
优选的，从南美对虾虾壳中提取壳聚糖的方法包括以下步骤：
(1)将干燥的南美白对虾虾壳与无水乙醇按照料液比1:1.5～5混合进行粗提，反应2～6h后过滤取滤渣，得到初级物料；
(2)将所述初级物料与中性蛋白酶溶液按照料液比1:1.5～4混合进行酶解，酶解3～6h，过滤后取滤渣，得到虾壳酶解余料；
(3)将所述虾壳酶解余料与质量分数4～8％的盐酸溶液混合进行酸解，反应后得到的固体物料为粗甲壳质；
(4)将所述粗甲壳质与质量分数0.2～1.0％的高锰酸钾溶液混合进行漂白，得到漂白物料；
(5)将所述漂白物料与质量分数0.5～2％的苯甲酸混合进行脱乙酰基反应，60～70℃下反应20～50min，得到脱乙酰基甲壳质；
(6)将所述脱乙酰基甲壳质与质量分数40～60％的氢氧化钠溶液混合进行脱蛋白，在90～150℃下反应0.5～2h，得到壳聚糖。
优选的，所述步骤(2)中，中性蛋白酶溶液的酶含量为800～1500U/g，酶解温度为42～50℃，酶解反应pH值为6.8～7.2。
本发明还提供了上述技术方案所述的壳聚糖复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将壳聚糖与霍格兰氏营养液按照质量体积比混合，得到壳聚糖溶液；
S2、将所述壳聚糖溶液与芽孢杆菌溶液按照所用霍格兰氏营养液与芽孢杆菌溶液的体积比混合，得到壳聚糖复合菌剂。
本发明的目的还在于提供前述技术方案壳聚糖复合菌剂或上述技术方案所述制备方法得到的壳聚糖复合菌剂在植物保护中的应用。
优选的，所述应用为：壳聚糖复合菌剂在促进植物生长和防治植物微生物病害中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种壳聚糖复合菌剂，包括壳聚糖、芽孢杆菌溶液和霍格兰氏营养液，所述壳聚糖与霍格兰氏营养液的质量体积比为10～25g:90～120mL，所述霍格兰氏营养液与枯草芽孢杆菌的体积比为8～10:1；所述芽孢杆菌液含有1.0×108～1.0×109CFU/mL的芽孢杆菌。本发明所述壳聚糖复合制剂中以壳聚糖和芽孢杆菌溶液为主要活性物质，通过壳聚糖与芽孢杆菌溶液复配能够提高壳聚糖在较高浓度下对各细菌和真菌的抑菌效果。
在本发明所述壳聚糖复合菌剂中，所述芽孢杆菌溶液主要起到抑菌作用。现有技术中壳聚糖在一定浓度下会对芽孢杆菌的活性产生抑制，但在本发明所述的壳聚糖浓度下不会抑制芽孢杆菌活性，反而壳聚糖与芽孢杆菌复配后存在协同增效作用，提高了抑菌效果。
在本发明中，所述霍格兰氏营养液主要起到溶剂作用，其pH值为弱酸性，有助于壳聚糖的溶解，同时溶解于酸性溶液的壳聚糖含有氨基，氨基可通过结合负电子抑制细菌；霍格兰氏营养液中的营养成分能够为芽孢杆菌提供适宜的生存环境，有利于保持壳聚糖复合菌剂的抑菌性能稳定。
在一些具体实施方式中，本发明以南美白对虾虾壳为原料，通过无水乙醇脱色脱脂、酶解、盐酸脱钙、苯甲酸脱乙酰基、氢氧化钠脱蛋白的工艺制备壳聚糖，壳聚糖的得率可达到9.8％，所制备得到的壳聚糖最佳抑菌浓度为3～4mg/mL。采用上述方法得到的壳聚糖分子量在150～300kDa范围内，壳聚糖得率高，抑菌效果好。
本发明所述的壳聚糖复合菌剂还能够用于植物保护中，所述壳聚糖复合菌剂的抑菌效果较好，施用于土壤中能够有效抑制土壤中的多种病原微生物生长，能够降低植物病害的发病率；同时壳聚糖复合菌剂中含有的芽孢杆菌具有促进有机质分解、产生丰富的代谢物的能力，所含的霍格兰氏营养液中营养成分能够使芽孢杆菌迅速繁殖，而较高浓度的壳聚糖也可以为微生物和植物生长提供营养，从而在发挥抑菌作用的同时还能够有效调节植物根系土壤中的微生物结构，对植物起到促进生长和保护作用。
具体实施方式
本发明提供了一种壳聚糖复合菌剂，包括壳聚糖、芽孢杆菌溶液和霍格兰氏营养液，所述壳聚糖与霍格兰氏营养液的质量体积比为10～25g:90～120mL，所述霍格兰氏营养液与枯草芽孢杆菌的体积比为8～10:1；
所述芽孢杆菌液含有1.0×108～1.0×109CFU/mL的芽孢杆菌。
在本发明中，所述芽孢杆菌优选的包括枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种或多种；本发明所述的芽孢杆菌溶液更优选为枯草芽孢杆菌溶液。当所述芽孢杆菌溶液中含有多种芽孢杆菌时，本发明对各种芽孢杆菌之间的用量无特殊限定。本发明对所述芽孢杆菌溶液的来源无特殊限定，采用市售菌剂即可。在本发明中，当存在多种芽孢杆菌时，活菌数为多种芽孢杆菌数量的总和。
具体的，本发明所述芽孢杆菌液中除了芽孢杆菌外，还含有能够溶解芽孢杆菌菌液的溶剂，所述溶剂为任何能够溶解芽孢杆菌且不降低芽孢杆菌活性的液体，包括但不限于水、霍格兰氏营养液、芽孢杆菌液体培养基等，其中优选为霍格兰氏营养液。
在本发明所述的壳聚糖复合菌剂中，所述芽孢杆菌溶液主要起抑菌作用，芽孢杆菌生长过程中产生的次级代谢产物能够有效地抑制病原微生物的生长。在本发明所述的壳聚糖复合菌剂中，与芽孢杆菌溶液复配的壳聚糖不但不会抑制芽孢杆菌的活性反而对其活性有促进作用，与壳聚糖复配后有效地提高了其在较高浓度下对各细菌和真菌的抑菌功效，从而获得优良的抑菌效果。
在本发明中，所述霍格兰氏营养液的组成优选包括：硝酸钙945mg/L、硝酸钾607mg/L、磷酸铵115mg/L、硫酸镁493mg/L、铁盐溶液2.5mL/L、微量元素溶液5mL/L，pH＝6.0。所述微量元素溶液的组成为：碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L和氯化钴0.025mg/L。在本发明中，所述铁盐溶液为由七水硫酸亚铁2.78g、乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na)3.73g和蒸馏水500mL组成，pH＝5.5。本发明对所述霍格兰氏营养液的来源无特殊限定，自行配制或购买市售商品均可。
在本发明所述的壳聚糖复合菌剂中，所述壳聚糖溶解于弱酸性(pH＝6)的霍格兰氏营养液后，溶液中含有的氨基具有正电性，可以通过结合负电子的方式破坏细菌膜结构，发挥抑菌作用，从而进一步提高壳聚糖复合菌剂的抑菌效果。另一方面，霍格兰氏营养液作为溶剂还能够为芽孢杆菌提供适宜的生存环境以及增殖的初始营养物质，从而提高了壳聚糖复合菌剂抑菌效果的稳定性，还能够确保施用后芽孢杆菌抑菌作用的有效性。
本发明所述的壳聚糖复合菌剂中，所述壳聚糖与霍格兰氏营养液的质量体积比优选为12～17g:95～115mL，更优选为15g:100mL。在本发明中，所述霍格兰氏营养液与枯草芽孢杆菌的体积比优选为9:1。
在本发明中，所述壳聚糖复合菌剂的壳聚糖含量为74.07～252.53mg/mL，所含芽孢杆菌的总活菌数为0.91×107～1.11×108CFU/mL。本发明所述的壳聚糖复合菌剂中，壳聚糖起到主要的抑菌作用，与芽孢杆菌溶液复配后提高了其在较高浓度下对各种细菌和真菌的抑菌效果。
在本发明中，所述壳聚糖优选为以南美白对虾虾壳为原料提取得到的；更优选的，所述以南美白对虾虾壳为原料提取壳聚糖的方法包括如下步骤：
(1)将干燥的南美白对虾虾壳与无水乙醇按照料液比1:1.5～5混合进行粗提，反应2～6h后过滤取滤渣，得到初级物料；
(2)将所述初级物料与中性蛋白酶溶液按照料液比1:1.5～4混合进行酶解，酶解3～6h，过滤后取滤渣，得到虾壳酶解余料；
(3)将所述虾壳酶解余料与质量分数4～8％的盐酸溶液混合进行酸解，反应后得到的固体物料为粗甲壳质；
(4)将所述粗甲壳质与质量分数0.2～1.0％的高锰酸钾溶液混合进行漂白，得到漂白物料；
(5)将所述漂白物料与质量分数0.5～2％的苯甲酸混合进行脱乙酰基反应，60～70℃下反应20～50min，得到脱乙酰基甲壳质；
(6)将所述脱乙酰基甲壳质与质量分数40～60％的氢氧化钠溶液混合进行脱蛋白，在90～150℃下反应0.5～2h，得到壳聚糖。
本发明在提取壳聚糖前，优选的对南美白对虾虾壳进行干燥。虾壳属于海产品加工废料，本发明以南美白对虾虾壳为壳聚糖的提取原料不但能够降低成本，还能够获得蛋白酶解液，增加经济效益。本发明优选的在65～75℃下对南美白对虾虾壳进行干燥，更优选为70℃。干燥至南美白对虾的含水量为0.1～0.5％时即可。
在本发明中，所述料液比的单位均为g:L。
本发明将干燥的南美白对虾虾壳与无水乙醇按照料液比1:1.5～5进行混合，反应2～6h后过滤，得到的滤渣为初级物料。所述料液比优选为1:1.8～3，更优选为1:2；所述反应时间优选为3h。在本发明中，所述干燥的南美白对虾虾壳与无水乙醇的反应温度优选为45～60℃，更优选为50℃。
在本发明中，所述无水乙醇的主要作用是对南美白对虾虾壳进行粗提取，在前期脱脂和脱色。
得到初级物料后，本发明将初级物料与中性蛋白酶溶液按照料液比1:1.5～4混合，酶解3～6h后过滤，得到虾壳酶解余料。所述料液比优选为1:2，所述酶解时间优选为4h。
在本发明中，所述中性蛋白酶溶液的酶含量优选为800～1500U/g，更优选为1000U/g。在本发明中，所述中性蛋白酶酶解主要是为了将南美白对虾虾壳中的蛋白质分离，除去蛋白质。本发明对所述中性蛋白酶的来源无特殊限定，采用市售商品即可。
在本发明中，所述酶解温度优选为42～50℃，更优选为45℃；所述酶解反应的pH值为6.8～7.2，更优选为7.0。
得到虾壳酶解余料后，本发明将虾壳酶解余料与质量分数4～8％的盐酸溶液混合，得到粗甲壳质。优选的，所述盐酸溶液的质量分数为6％。在本发明中，所述盐酸溶液的主要作用是脱除虾壳酶解余料中的钙。本发明对所述盐酸溶液的用量无特殊限定，只要能够浸没虾壳酶解余料即可。
在本发明中，所述盐酸溶液与虾壳酶解余料的反应时间优选为3～6h，更优选为4h；反应结束后优选的对混合物进行过滤，从而得到粗甲壳质。所述反应温度优选为28～35℃，更优选为30℃。
得到粗甲壳质后，本发明将粗甲壳质与质量分数0.2～1.0％的高锰酸钾溶液混合进行漂白，得到漂白物料。所述高锰酸钾的质量分数优选为1％。在本发明中，所述高锰酸钾溶液的主要作用是对粗甲壳质进行漂白，去除其中的色素。本发明对高锰酸钾溶液的用量无特殊限定，能够浸没粗甲壳质即可。
在本发明中，所述漂白的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h。所述漂白后，以水对漂白后的粗甲壳质洗涤至无色，过滤，得到漂白物料。
得到漂白物料后，本发明将漂白物料与质量分数0.5～2％的苯甲酸混合，60～70℃下反应20～50min，得到脱乙酰基甲壳质。所述苯甲酸的质量分数优选为1％；所述反应温度优选为65℃。在本发明中，苯甲酸溶液的主要作用是脱乙酰基。本发明对所述苯甲酸溶液的用量无特殊限定，能够浸没漂白物料即可。
在本发明中，所述漂白物料与苯甲酸的反应时间优选为30min；反应结束后优选的以水对混合物进行洗涤1～4次，80～110℃下干燥1～3h，得到脱乙酰基甲壳质。
得到脱乙酰基甲壳质后，本发明将脱乙酰基甲壳质与质量分数4～8％的氢氧化钠溶液混合，在90～150℃下反应0.5～2h，得到壳聚糖。所述氢氧化钠溶液的质量分数优选为6％；所述反应温度优选为90℃。在本发明中，所述氢氧化钠溶液的主要作用是进一步脱除蛋白。本发明对所述氢氧化钠溶液的用量无特殊限定，能够浸没脱乙酰基甲壳质即可。
在本发明中，所述氢氧化钠脱蛋白的反应时间优选为2h；所述反应完成后，过滤，再以水进行洗涤1～3次，再次过滤后低温真空干燥，即得壳聚糖。优选的，所述低温真空干燥条件为：真空度50～60Pa；干燥温度-30～-40℃；干燥时间12～18h。
采用上述方法从南美白对虾虾壳中提取壳聚糖的得率在9.8％以上，纯度为96～98％。制备得到的壳聚糖分子量大小为150～300kDa，壳聚糖的脱乙酰度为96.2～97.8％。在本发明的一些具体实施方式中，上述方法制备得到的壳聚糖对黑曲霉的最佳抑菌浓度为3～4mg/mL。
本发明还提供了上述技术方案所述壳聚糖复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将壳聚糖与霍格兰氏营养液按照质量体积比混合，得到壳聚糖溶液；
S2、将所述壳聚糖溶液与芽孢杆菌溶液按照所用霍格兰氏营养液与芽孢杆菌溶液的体积比混合，得到壳聚糖复合菌剂。
本发明对所述混合时的条件无特殊限定，采用常规混合方式即可。
本发明所述的壳聚糖复合菌剂还能够用于植物保护中，具体来说，本发明所述壳聚糖复合菌剂能够在促进植物生长和防治植物微生物病害方面应用，将所述壳聚糖复合菌剂稀释1.5～3倍后喷施于植物根系土壤或植物地上部位即可。在植物根部出现溃烂时，喷洒用于治疗。
本发明提供的壳聚糖复合菌剂的抑菌活性高，当其施用于植物根系土壤时，能够抑制土壤中的众多病原微生物活性，使有益微生物处于优势地位，结合本发明所述壳聚糖复合菌剂中含有的一定量枯草芽孢杆菌能够有效地调理植物根系土壤的微生态环境，使植物根系土壤中的微生物菌群结构改善，进而能够促进土壤中的有机质分解速度、产生更为丰富的代谢产物，达到改善植物根系土壤环境，促进植物生长的作用。本发明所述的壳聚糖复合菌剂施用于植物根系土壤后，对土壤中存在的多种病原菌具有抑制作用，包括但不限于黑星菌、疫霉菌、黑粉菌、白锈菌和线虫等。
当本发明所述的壳聚糖复合菌剂施用于细菌或真菌感染的植物花、果实上能够有效的抑制病原菌生长，对感染黑曲霉的棉花治愈率高达70％以上，应用范围广。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将南美白对虾虾壳清洗成净壳，在70℃下对洗净的南美白对虾虾壳干燥水分为0.1％，得到干燥的南美白对虾虾壳。取100g南美白对虾虾壳与2L无水乙醇混合，在50℃下反应3h进行粗提取，反应结束后过滤，固体部分即为初级物料。
将得到的初级物料和中性蛋白酶溶液按照料液比1:2的比例混合，在45℃、pH7.0的条件下酶解4h，过滤，得到酶解蛋白液和虾壳酶解余料，酶解蛋白液可以作为蛋白加工原料。其中，中性蛋白酶溶液中的酶含量为1000U/g。
将得到的虾壳酶解余料在质量分数6％的盐酸溶液中浸泡4h，浸泡温度30℃，过滤，得到粗甲壳质。将粗甲壳质在质量分数0.5％的高锰酸钾溶液中浸泡1h进行漂白，反应结束后用水冲洗至无色，过滤，得到漂白物料。将漂白物料在质量分数1％的苯甲酸中浸泡30min以脱除乙酰基，反应温度为65℃，反应结束后以水洗涤2次，110～130℃下干燥1～3h，得到脱乙酰基甲壳质。将脱乙酰基甲壳质在质量分数为5％的氢氧化钠溶液中浸泡1h，反应温度90℃，过滤，以水对固形物洗涤3次，再次过滤后在-30℃、50Pa的条件下低温真空干燥18h，得到9.8g白色的壳聚糖。
经检测本次试验得到的壳聚糖分子量为150～300kDa，脱乙酰度为97.8％。本次制备得到的壳聚糖得率为9.8％。
实施例2
将南美白对虾虾壳清洗成净壳，在65℃下对洗净的南美白对虾虾壳干燥水分为0.5％，得到干燥的南美白对虾虾壳。取100g南美白对虾虾壳与1.5L无水乙醇混合，在50℃下反应6h进行粗提取，反应结束后过滤，固体部分即为初级物料。
将得到的初级物料和中性蛋白酶溶液按照料液比1:1.5的比例混合，在42℃、pH6.8的条件下酶解6h，过滤，得到酶解蛋白液和虾壳酶解余料，酶解蛋白液可以作为蛋白加工原料。其中，中性蛋白酶溶液中的酶含量为800U/g。
将得到的虾壳酶解余料在质量分数4％的盐酸溶液中浸泡6h，浸泡温度28℃，过滤，得到粗甲壳质。将粗甲壳质在质量分数0.2％的高锰酸钾溶液中浸泡1.5h进行漂白，反应结束后用水冲洗至无色，过滤，得到漂白物料。将漂白物料在质量分数0.5％的苯甲酸中浸泡50min以脱除乙酰基，反应温度为60℃，反应结束后以水洗涤3次，110～130℃下干燥1～3h，得到脱乙酰基甲壳质。将脱乙酰基甲壳质在质量分数为4％的氢氧化钠溶液中浸泡21h，反应温度123℃，过滤，以水对固形物洗涤2次，再次过滤后在-40℃、60Pa的条件下低温真空干燥12h，得到9.0g白色的壳聚糖。
经检测本次试验得到的壳聚糖分子量为150～300kDa，脱乙酰度为96.2％。本次制备得到的壳聚糖得率为9.0％。
实施例3
将南美白对虾虾壳清洗成净壳，在75℃下对洗净的南美白对虾虾壳干燥0.1％，得到干燥的南美白对虾虾壳。取100g南美白对虾虾壳与5L无水乙醇混合，在60℃下反应2h进行粗提取，反应结束后过滤，固体部分即为初级物料。
将得到的初级物料和中性蛋白酶溶液按照料液比1:4的比例混合，在60℃、pH7.2的条件下酶解6h，过滤，得到酶解蛋白液和虾壳酶解余料，酶解蛋白液可以作为蛋白加工原料。其中，中性蛋白酶溶液中的酶含量为1200U/g。
将得到的虾壳酶解余料在质量分数8％的盐酸溶液中浸泡3h，浸泡温度35℃，过滤，得到粗甲壳质。将粗甲壳质在质量分数1.0％的高锰酸钾溶液中浸泡0.5h进行漂白，反应结束后用水冲洗至无色，过滤，得到漂白物料。将漂白物料在质量分数2％的苯甲酸中浸泡20min以脱除乙酰基，反应温度为70℃，反应结束后以水洗涤4次，110～130℃下干燥1～3h，得到脱乙酰基甲壳质。将脱乙酰基甲壳质在质量分数为8％的氢氧化钠溶液中浸泡0.5h，反应温度150℃，过滤，以水对固形物洗涤2次，再次过滤后在-35℃、55Pa的条件下低温真空干燥15h，得到9.3g白色的壳聚糖。
经检测本次试验得到的壳聚糖分子量为150～300kDa，脱乙酰度为97.0％。本次制备得到的壳聚糖得率为9.3％。
实施例4
本次试验对实施例1～3得到的壳聚糖抑菌浓度进行检测。
1、菌液的制备：取保存的黑曲霉菌转接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，37℃下恒温培养24h，对黑曲霉菌进行活化。用接种环挑取少量菌体置于装有无菌生理盐水的试管中，振荡均匀，得到菌悬液，使菌悬液中的活菌数为103CFU/mL。取100μL菌悬液稀释到5mL，依次进行10倍逐级稀释，分别取10-8、10-9、10-10、10-11稀释倍数的菌液进行涂布实验。
2、样品的制备：分别取0.1g实施例1～3制备得到的壳聚糖，溶于10mL生理盐水中，得到样品溶液，并配置成1～5mg/mL不同梯度梯度样品溶液。
3、抑菌试验：分别将0.1mL不同稀释倍数的菌液和0.1mL样品溶液均匀涂布于加药平板上，每个浓度设置三个平行试验；其中加药平板是加入100μL/平板的二甲基亚砜的LB固体培养基。以LB培养基作为完全空白对照组，以0.1mL不同稀释倍数的菌液和0.1mL清水涂布的加药平板作为空白对照组。
各组涂布30min后在37℃下倒置培养24h，统计菌落个数，计算抑菌浓度。
4、结果：根据统计结果，计算显示，实施例1～3制备得到的壳聚糖对黑曲霉最佳抑菌浓度为3～4mg/mL。
实施例5
取按照实施例1所述方法制备得到的壳聚糖30g，溶于200mL霍格兰氏营养液中，得到200mL质量体积分数15％的壳聚糖溶液。
取25g活菌数为1.0×108CFU/g枯草芽孢杆菌25mL霍格兰氏营养液中，得到枯草芽孢杆菌制剂。
将200mL壳聚糖溶液与25mL枯草芽孢杆菌制剂混合，得到225mL壳聚糖复合菌剂。
本次试验制备得到的壳聚糖复合菌剂中，壳聚糖含量为133.3mg/mL，枯草芽孢杆菌的活菌数为1.11×107CFU/mL。
实施例6
取按照实施例2所述方法制备得到的壳聚糖20g，溶于180mL霍格兰氏营养液中，得到180mL质量体积分数11.1％的壳聚糖溶液。
取活菌数为3.0×108CFU/g的短小芽孢杆菌5g、活菌数为3.0×108CFU/g的枯草芽孢杆菌5g溶于20mL霍格兰氏营养液中，得到芽孢杆菌溶液。
将180mL壳聚糖溶液与20mL芽孢杆菌溶液混合，得到200mL壳聚糖复合菌剂。
本次试验制备得到的壳聚糖复合菌剂中，壳聚糖含量为100mg/mL，芽孢杆菌的活菌数为1.5×107CFU/mL。
实施例7
取按照实施例3所述方法制备得到的壳聚糖50g，溶于250mL霍格兰氏营养液中，得到150mL质量体积分数20％的壳聚糖溶液。
取活菌数为1.0×109CFU/g的苏云金芽孢杆菌20g溶于25mL霍格兰氏营养液中，得到苏云金芽孢杆菌溶液。
将250mL壳聚糖溶液与25mL苏云金芽孢杆菌混合，得到275mL壳聚糖复合菌剂。
本次试验制备得到的壳聚糖复合菌剂中，壳聚糖含量为181.82mg/mL，苏云金芽孢杆菌的活菌数为7.27×107CFU/mL。
实施例8
本次试验对壳聚糖复合菌剂的抑菌效果进行验证。
取按照实施例5所述方法制备的壳聚糖复合菌剂400mL，以水稀释至1L，对感染黑曲霉的10株果实泛黄略黑的棉花植株果实部位进行喷洒，每日1次，每次使用1L，施用7d后，统计棉花植株的感染情况。
结果显示，施用本发明所述的壳聚糖复合菌剂5d后，感染黑曲霉的10株棉花植株中有7株痊愈即治愈率为70％，果实由泛黄色转为白色。
实施例2的壳聚糖单独抑菌试验表明，壳聚糖溶液对黑曲霉的最佳抑菌浓度为3～4mg/mL，当壳聚糖溶液浓度提高时其对黑曲霉的抑菌效果降低。而在本次试验中，所述壳聚糖复合菌剂稀释后的溶液含有53.32mg/mL的壳聚糖，是壳聚糖单用最佳抑菌浓度的10倍以上，但是本发明所述的壳聚糖复合菌剂依旧能够取得良好的黑曲霉抑制效果，能够快速有效地治愈感染黑曲霉的棉花植株，表明本发明提供的壳聚糖复合菌剂通过壳聚糖与枯草芽孢杆菌复配后抑菌性能得到的了显著提高，能够在较高的壳聚糖浓度下表现出优异的抑菌效果。
实施例9
本次试验对壳聚糖复合菌剂作为植物保护制剂的抑菌效果进行验证。
选取历年发病较重的同一棉田中生长的20株棉花，分为对照组和试验组，试验前取各组棉花植株根系土壤1g进行微生物分离培养，分析土壤中的微生物种类和数量。
取实施例5所述方法制备得到的壳聚糖复合菌剂400mL，以水稀释至1L，喷施于试验组棉花根系土壤，连续喷施30d；对照组喷施相同量的清水。30d后分别取试验组和对照组棉花植株根系土壤1g进行微生物分离培养，分析土壤中的微生物种类和数量，并与试验前的结果进行对比。
结果显示，与试验前的土壤样品相比，对照组中的真菌、放线菌数量有显著提高，细菌数量无显著差异；试验组中的真菌数量有显著降低，放线菌数量与试验前土壤相差不大，细菌数量有显著升高。具体的，试验组土壤样品中的病原菌黑星菌、疫霉菌、黑粉菌、白锈菌和线虫等数量有显著降低。
一般的棉花病株根系土壤的真菌数量多于健康植株，施用本发明所述的壳聚糖复合菌剂后能够有效降低植物根系土壤的真菌数量，抑制病原菌活性，并能够调理植物根系土壤的微生物菌群结构，进而实现对植物的保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种壳聚糖复合菌剂，包括壳聚糖、芽孢杆菌溶液和霍格兰氏营养液，所述壳聚糖与霍格兰氏营养液的质量体积比为10～25g:90～120mL，所述霍格兰氏营养液与枯草芽孢杆菌的体积比为8～10:1；
所述芽孢杆菌液含有1.0×108～1.0×109CFU/mL的芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖复合菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖复合菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌溶液的溶剂为水、芽孢杆菌液体培养基或霍格兰氏营养液。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖复合菌剂，其特征在于，所述壳聚糖是以南美白对虾虾壳为原料提取得到的。
5.根据权利要求4所述的壳聚糖复合菌剂，其特征在于，从南美对虾虾壳中提取壳聚糖的方法包括以下步骤：
(1)将干燥的南美白对虾虾壳与无水乙醇按照料液比1:1.5～5混合进行粗提，反应2～6h后过滤取滤渣，得到初级物料；
(2)将所述初级物料与中性蛋白酶溶液按照料液比1:1.5～4混合进行酶解，酶解3～6h，过滤后取滤渣，得到虾壳酶解余料；
(3)将所述虾壳酶解余料与质量分数4～8％的盐酸溶液混合进行酸解，反应后得到的固体物料为粗甲壳质；
(4)将所述粗甲壳质与质量分数0.2～1.0％的高锰酸钾溶液混合进行漂白，得到漂白物料；
(5)将所述漂白物料与质量分数0.5～2％的苯甲酸混合进行脱乙酰基反应，60～70℃下反应20～50min，得到脱乙酰基甲壳质；
(6)将所述脱乙酰基甲壳质与质量分数40～60％的氢氧化钠溶液混合进行脱蛋白，在90～150℃下反应0.5～2h，得到壳聚糖。
6.根据权利要求5所述的壳聚糖复合菌剂，其特征在于，所述步骤(2)中，中性蛋白酶溶液的酶含量为800～1500U/g，酶解温度为42～50℃，酶解反应pH值为6.8～7.2。
7.权利要求1～6任意一项所述的壳聚糖复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将壳聚糖与霍格兰氏营养液按照质量体积比混合，得到壳聚糖溶液；
S2、将所述壳聚糖溶液与芽孢杆菌溶液按照所用霍格兰氏营养液与芽孢杆菌溶液的体积比混合，得到壳聚糖复合菌剂。
8.权利要求1～6任意一项所述的壳聚糖复合菌剂或权利要求7所述制备方法得到的壳聚糖复合菌剂在植物保护中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为：壳聚糖复合菌剂在促进植物生长和防治植物微生物病害中的应用。
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