CN113252891A

CN113252891A - 检测塞尼卡病毒a抗体的试剂盒

Info

Publication number: CN113252891A
Application number: CN202110021181.6A
Authority: CN
Inventors: 冯霞; 马军武; 郭慧琛; 孙世琪; 张韵; 白满元; 郭丽莹
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本发明公开一种用于检测猪塞尼卡病毒A抗体的试剂盒。本发明的检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒至少有包被有塞尼卡病毒A兔抗血清的酶标板和塞尼卡病毒A豚鼠抗血清。本发明具有敏感性高、特异性好、且操作简单、结果稳定、适合于批量检测，可评估未免疫猪群中塞尼卡病毒A的感染情况，及疫苗免疫后猪群的特异性抗体水平的优点。

Description

检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种病毒抗体检测试剂，特别是一种用于检测猪塞尼卡病毒A抗体的试剂盒及非疾病检测猪塞尼卡病毒A抗体的方法。

背景技术

塞尼卡病毒A(Senecavirus A，SVA)是微RNA病毒科(Picornaviridae)塞尼卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员。SVA基因组为单股正链RNA、不分节段、有感染性，无囊膜，全长约为7.3kb，含有5'和3'非翻译区(UTR)，以及一个长的开放阅读框(ORF)。5'UTR包含内部核糖体进入位点(IRES)(其结构和功能与猪瘟病毒的相似，IV型)，3'带有poly(a)尾巴，ORF编码的多聚蛋白由前导区(L)和3个主要蛋白区(P1、P2和P3)组成，裂解产生12个成熟蛋白(5‘-L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’)。它与心病毒较为相近。纯化SVA病毒粒子的透射电子显微镜图等参见附图1。

成熟的SVA病毒粒子直径大约27nm，无囊膜，呈二十面体的球状颗粒(透射电子显微镜图1(a))。病毒衣壳由60个VP1、VP2、VP3和VP4分子四种结构蛋白组成，其中VP1、VP2和VP3“拼接”在一起形成外壳(图1(b)),VP4位于衣壳内侧下方(图1(c))。病毒RNA基因组(与Vpg蛋白共价连接)包裹在病毒颗粒内(图1(c))。图1中，结构蛋白由P1区编码，包括VP1(红色)、VP2(黄色)、VP3(绿色)和VP4(蓝色)形成病毒衣壳(图1(b～d))。P2区编码的非结构蛋白包括2A、2B和2C，P3区编码的NSP包括3A、3B、3C和3D，非结构蛋白是SVA病毒在感染和复制过程中表达，它们干扰宿主细胞正常的复制周期，会劫持宿主的细胞机制来制造病毒增殖所需的蛋白质，对病毒复制增殖发挥作用(比如2A执行核糖体跳跃的功能，2C蛋白具有解旋酶活性，3B在RNA合成中起蛋白质引物的作用，3C是一种蛋白酶，负责切割SVA多聚蛋白前体和某些宿主蛋白，2C和3C还可以诱导细胞凋亡，3D是RNA依赖性RNA聚合酶，在病毒复制和VPg尿苷酰化中起作用)，但最终不作为病毒结构一部分，所以纯化的病毒颗粒中不含非结构蛋白成分，只含有结构蛋白和病毒RNA基因组(或可含有极其微量的3D聚合酶，参与将病毒RNA引入细胞核)。

SVA较早出现在与美国(1988，2012)、加拿大(2007)等国，与猪原发性水泡病有关。随后扩散到巴西(2015)、中国(2015)、泰国(2017)、哥伦比亚(2017)，该病毒引起的疾病虽不及口蹄疫那样剧烈，但也颇有星火燎原之势。2015年，我国广东省的两个万头猪场首次发现该病，之后疫情蔓延至湖北(2016)、黑龙江(2017)、河南(2017)、福建(2018)、广东(2018)等地。目前，全国超过一半的省份都发现该病毒的存在，并且有些是无症状感染(Liu etal.,2020)。

已经建立了多种方法来诊断SVA感染。一类是检测病毒RNA(核酸)的，其特点是特异性和灵敏度高，包括普通反转录聚合酶链式反应RT-PCR、定量RT-PCR(qRT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR、逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP)等。这属于病原学检测，但比经典的病毒分离(使用敏感细胞系或敏感动物)要快速、方便。一般动物感染病毒后2～10天左右(2～5天最佳)可用该方法检测。另一类血清学方法，主要是检测血清中的特异性抗体，国外已经开发了出竞争性ELISA和免疫荧光抗体试验进行检测，但前者需要使用专门的单克隆抗体(Gooliaet al.,2017；别的国家还没有)，后者操作繁琐需要进行细胞培养(需要的样品量大，且不适合大量样品)。细胞中和试验也可以检测血清中的SVA特异性抗体，但需要培养细胞和动用病毒，操作非常繁琐，需要的时间长，并且不适合大量样品的检测。一般动物感染病毒或注射疫苗7天至数月，可以检测到特异性抗体。

SVA病毒致病的临床特征与口蹄疫、猪水泡病(此二者均为国家一类传染病)等劣性传染病的极为相似，也是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性病变，因此必须进行实验室检测予以甄别。目前，国内尚无商品化的塞尼卡病毒A抗体检测试剂盒。

发明内容

本发明提供一种可检测猪塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，以及一种用于非疾病检测为目的的检测猪塞尼卡病毒A抗体的方法。

本发明的检测塞尼卡病毒A的试剂盒至少有包被有塞尼卡病毒A兔抗血清的酶标板和塞尼卡病毒A豚鼠抗血清。

优选地，本发明的检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒还有终止液与显色液，或者还可以有猪塞尼卡病毒A阳性血清和阴性血清。

本发明的非疾病检测为目的的检测塞尼卡病毒A抗体的方法为：将稀释的待检血清分别加入权利要求1至3所述的任一试剂盒的酶标板，洗板后加入用阻断稀释液稀释塞尼卡病毒A豚鼠抗血清稀释至工作浓度，封板，37℃温育1小时经再洗板拍干处理后用1×PBST稀释的兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度，封板，37℃温育1小时后再经洗板、拍干处理，再加入底物溶液，37℃温育15分钟，再加入终止液终止反应，根据490nm波长下读取光吸收值确定被检血清是否有塞尼卡病毒A抗体。

本发明是一种的阻断ELISA方法，具体是用塞尼卡病毒A兔血清包被ELISA板，作为捕获抗体。对检测血清进行2倍系列稀释(1：4，1：8，1：16，1：32等)，之后加入定量的塞尼卡病毒A灭活的抗原。混合均匀，若检测血清中有塞尼卡病毒A特异性抗体，就会与特异性的抗原反应，从而阻断抗原与之后依次加入的塞尼卡病毒A豚鼠血清、辣根过氧物酶标记的抗豚鼠Ig G结合物(即酶标抗体)，不会形成捕获抗体-抗原-第二抗体-酶标抗体复合物的链条，再加底物溶液显色、加酸终止。颜色的深浅和检测血清中的塞尼卡病毒A特异性抗体浓度呈负相关(即抗体水平越高，颜色越浅)。用酶标仪在490nm波长下测定吸光度(OD值)。以抗原OD值的一半作为临界值进行判定。

本发明敏感性高、特异性好、且操作简单、结果稳定、适合于批量检测，可评估未免疫猪群中塞尼卡病毒A的感染情况，及疫苗免疫后猪群的特异性抗体水平。

附图说明

图1SVA病毒粒子结构示意图，其中：(a)，SVA病毒粒子扫描电镜照片，(b)整体前视图，(c)剖面视图，(d)SVA基因组编码产物示意图。(引自Liu et al.,2020.doi:10.3389/fvets.2020.567792)

具体实施方式

本发明以下结合实施例进行解说。

一、试剂盒的制备

①塞尼卡病毒A繁殖和灭活：使用IBRS-2细胞(猪肾细胞系)进行塞尼卡病毒A的繁殖，在DMEM培养基中添加10％FBS和1％双抗(青霉素、链霉素)，置5％CO₂培养箱37℃培养，当IBRS-2细胞密度达80％时，接种塞尼卡病毒A(100μL/瓶)(分离自发病猪的水平皮，本研究团队保存，登录号KY747510)，约12h后CPE达90％，收获病毒(-30℃保存)。等收获的病毒量较多时(约4000mL)，加入二乙烯亚胺(BEI)灭活(终浓度1.5％，30℃150rpm振荡28h)，之后加阻断剂50％硫代硫酸钠(已灭菌，终浓度2％)阻断。4℃离心，6500rpm离心30min，弃沉淀。上清液分装：部分5mL/瓶，-70℃保存；部分500mL/瓶，-70℃保存，备用。

②塞尼卡病毒A抗原的纯化、定量：利用蔗糖密度梯度(45％、35％、25％、15％)法纯化(Barteling andMeloen；1974)，应用Qubit蛋白质浓度测定试剂盒(LifeTechnologies目录号1814929)测得塞尼卡病毒A抗原含量为0.68μg/mL，纯化1000mL，共计获得680μg抗原。-70℃保存，备用。

③塞尼卡病毒A兔血清和豚鼠血清的制备：将上述②所获抗原与金纳米颗粒溶液等体积混合，超声乳化25min，免疫兔子和豚鼠(200μL/兔子，50μL/豚鼠，肌肉注射)，采集血液、分离血清，琼脂扩散检测其血清抗体达到1：4。分装1mL/支，-70℃保存，备用。

④塞尼卡病毒A猪阳性血清和阴性血清的制备：将上述①所获灭活抗原与金纳米颗粒混合，超声乳化25min(滴入水中不散开)，免疫SPF猪(2mL/猪)，不同时间采集血液、分离血清(0d、7d、14d、28d)，待琼脂扩散检测其血清抗体达到1：2时，大量采血，分离血清。分装1mL/支，-70℃保存，备用。直接采集SPF猪的血液、分离血清，作为阴性血清。分装1mL/支，-70℃保存，备用。

⑤包被ELISA板：用包被缓冲液稀释塞尼卡病毒A兔抗血清至工作浓度(1:500)，混匀，每孔加50μl于底部，尽量不触及孔壁，封板，轻轻震荡2-3min，使液体铺满孔底。4℃过夜。

二、检测

①待检血清与抗原的孵育(此步骤在样品稀释板上进行操作)：首先进行待检血清稀释(如表1所示)，用1×PBST将待检血清从1:4(A行加25μl待检血清和75μl PBST，B～H各行分别加50μl PBST)开始做2倍连续稀释至1:512；注意要留2列分别加塞尼卡病毒A猪阳性血清和阴性血清。其次进行抗原稀释，用1×PBST将塞尼卡病毒A灭活抗原稀释至工作浓度，所有血清稀释孔均加抗原(50μl/孔)，此时待检血清的稀释度就变为1:8、1:16、1:32、至1：1024；在样品稀释板另留6个孔只加抗原(100μl/孔)。封板，轻轻震荡3min，使血清与抗原充分混匀，4℃过夜。

表1样品布局及血清稀释图

②洗涤ELISA板：弃去液体，加洗涤液(0.2×PBST)，280μl/孔，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干。将②中血清与抗原的混合物或抗原移入对应位置，50μl/孔。封板，37℃温育1小时。

③加二抗：用阻断稀释液(含5％马血清、0.05％吐温20)将塞尼卡病毒A豚鼠抗血清稀释至工作浓度(1:500)，50μl/孔，封板，37℃温育1小时。用PBST洗涤ELISA板4次，拍干。

④加酶：用1×PBST稀释兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度(1:500)，50μl/孔。封板，37℃温育1小时。用PBST洗涤ELISA板4次，拍干。

⑤显色：每孔加50μl底物溶液(20mmol/L OPD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015％H₂O₂)，37℃温育15分钟。

⑥终止：每孔再加50μl终止液(1.25％H₂SO₄，体积_98％硫酸/(体积_水+体积_98％硫酸)终止反应。

⑦测定：在490nm波长下读取光吸收值(OD₄₉₀nm)。

三、结果判定

按上述方法对9份有代表性的血清样品及塞尼卡病毒A猪阳性血清和猪阴性血清进行检测，结果如表2所示(以抗原OD值的一半作为临界值进行判定，OD₄₉₀大于临界值的孔为阴性孔，小于临界值的孔为阳性孔)。这9份代表性的血清样品分别是：S1—抗O型口蹄疫病毒强阳性血清、S2—抗A型口蹄疫病毒强阳性血清、S3—抗亚洲1型口蹄疫病毒强阳性血清、S4—抗猪水泡病病毒强阳性血清、S5—塞尼卡病毒A灭活疫苗免疫前猪血清、S6—塞尼卡病毒A灭活疫苗免疫猪第15天血清、S7—塞尼卡病毒攻毒第3天猪血清、S8—塞尼卡病毒攻毒第7天猪血清和S9—塞尼卡病毒攻毒第15天猪血清。

如表2所示，抗体滴度≧1：45表示存在针对塞尼卡病毒A的特异性抗体(以红色显示)，抗体滴度≤1：8表示无特异性抗体(以绿色显示)，抗体滴度界于二者之间为可疑(以灰色显示)，对可疑动物可过7天左右再采集血液进行检测。

从检测结果来看(表2)，本发明的特异性强，对具有相似临床症状的口蹄疫(O型S1、A型S2和亚洲1型S3)和猪水泡病(S4)没有交叉反应(抗体水平均＜1：8)，对免疫前动物(S5)也检测不到针对塞尼卡病毒A的特异性抗体。其次，本发明的敏感性高，对疫苗免疫动物(S6)和感染动物(S8和S9)均检测到特异性抗体，感染第3天猪血清(S7)就处于可疑范围之内(1：8＜抗体＞1：45)。这种动物可过7天左右再采集血液进行检测。第三，本发明操作简单、可以进行批量检测，一次检测数百份样品也是常有的事。目前常用的塞尼卡病毒A的特异性抗体检测方法有血清中和试验(SNT)，但SNT测试周期长、操作复杂、对照设立繁琐、对培养的细胞依赖性强，即使检测数十份样品就很费时、费力了。当然，与细胞中和试验相比，本发明更易在基层兽医检测部门中推广应用。第四，本发明检测的塞尼卡病毒A的特异性抗体是针对其完整的衣壳结构的(包括VP1、VP2、VP3和VP4)，因此不仅灭活疫苗和病毒样颗粒免疫的动物中存在此类抗体，塞尼卡病毒A感染的动物中也存在此类抗体。所以可以用本发明评估未免疫猪群中塞尼卡病毒A的感染情况，及疫苗免疫后猪群的特异性抗体水平。第五，本发明不能检测的针对塞尼卡病毒A非结构蛋白(比如2A、2B、2C、3A、3B、3C、或3ABC等等)的特异性抗体，因为只有病毒感染动物(或细胞)时，病毒基因组复制，会产生一定量的非结构蛋白；成熟的病毒粒子仅由结构蛋白包裹病毒RNA组成，并不含其它非结构蛋白。

表2九份代表性的血清样品阻断ELISA检测结果(OD₄₉₀)

Claims

1.检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，其特征在于试剂盒内至少有包被有塞尼卡病毒A兔抗血清的酶标板和塞尼卡病毒A豚抗鼠血清。

2.根据权利要求1所述的检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有终止液与显色液。

3.根据权利要求1或2所述的检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有猪塞尼卡病毒A抗体阳性血清和阴性血清。

4.一种非疾病检测为目的的检测猪塞尼卡病毒A抗体方法，其特征在于：将稀释的待检血清分别加入权利要求1至3所述的任一试剂盒的酶标板，洗板后加入用阻断稀释液稀释塞尼卡病毒A豚鼠抗血清稀释至工作浓度，封板，37℃温育1小时经再洗板拍干处理后用1×PBST稀释的兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度，封板，37℃温育1小时后再经洗板、拍干处理，再加入底物溶液，37℃温育15分钟，再加入终止液终止反应，根据490nm波长下读取光吸收值确定被检血清是否有塞尼卡病毒A抗体。