CN112933221A

CN112933221A - 免疫复合物疫苗

Info

Publication number: CN112933221A
Application number: CN202110196710.6A
Authority: CN
Inventors: 陈继明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2021-06-11

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及免疫复合物疫苗。所述疫苗可以但不限于在常规的疫苗制造过程中，添加同源特异性单克隆抗体而制成。所述疫苗的特征是不需要添加任何活病毒，且疫苗中含有蛋白质抗原与其特异性同源单克隆抗体相互结合形成的免疫复合物。所述免疫复合物能够提升疫苗诱导的特异性抗体水平，提升疫苗诱导的特异性细胞免疫。所述疫苗具有安全性好、免疫保护效果优异、适合于多种病毒病的预防等优点。

Description

免疫复合物疫苗

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及预防人与动物病毒病等用途的疫苗研制、生产和应用，能够用于人与动物多种病毒病的预防、其他疾病的预防和治疗、动物生理调节。

背景技术

疫苗是预防病毒病的重要物质。有些疫苗还用于乙肝、癌症的治疗。有些疫苗，如去势疫苗和促生长疫苗，还能调节动物的生理。现今已经批准使用或正在研究的疫苗有多种类别，包括减毒活疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗等。

上述疫苗都有一些优点，也有一些缺点。其中，灭活疫苗和蛋白质疫苗安全性好，但是免疫效果较差。它们免疫效果较差主要表现在两个方面：一是它们诱导的抗体水平较低；二是它们难以诱导特异性细胞免疫保护作用。为了提高灭活疫苗和蛋白质疫苗的免疫效果，人们在疫苗中添加氢氧化铝等佐剂。在佐剂作用下，灭活疫苗和蛋白质疫苗的免疫效果有所提高，但是往往还达不到令人满意的程度。

为了提高灭活疫苗和蛋白质疫苗的免疫效果，人们有时在这些疫苗中添加同源的特异性多克隆抗体(来自相应的病毒病康复者的血清，或者来自相应的疫苗接种者的血清；对于禽，同源多克隆抗体常来自于卵黄抗体)。添加后，疫苗中的蛋白质抗原与多克隆抗体形成的免疫复合物，这些免疫复合物能够诱导免疫调理作用(opsonization)，而免疫调理作用能够显著提高疫苗诱导的抗体水平，也能够诱导灭活疫苗和蛋白质疫苗难以诱导的特异性细胞免疫保护作用。但是多克隆抗体难以大量制备，而且多克隆抗体的质量难以控制，有些多克隆抗体还含有一些病原微生物。因此，这类用同源的特异性多克隆抗体来提升免疫效果的灭活疫苗或蛋白质疫苗，在生产实践中，还未大量应用。

发明内容

本发明公开一类用于预防病毒病等用途的疫苗。所述疫苗不需要添加任何活病毒；所述疫苗是在灭活疫苗或蛋白质疫苗的生产过程中，添加单克隆抗体(不是多克隆抗体)，使疫苗中含有蛋白质抗原与单克隆抗体特异性结合而形成的免疫复合物；所述蛋白质可以是病毒增殖过程中产生的蛋白质，也可以是通过基因工程产生的重组蛋白质，也可以是通过化学合成的多肽；所述疫苗如果是人用疫苗，则所述单克隆抗体为人源单克隆抗体；所述疫苗如果是某种动物用的疫苗，则所述单克隆抗体为该种动物源的单克隆抗体。所述单克隆抗体包括嵌合单克隆抗体(chimeric monoclonal antibody)、抗体互补决定区植入单克隆抗体(CDR grafting monoclonal antibody)。

其有益效果是：与不含蛋白质抗原与抗体形成的免疫复合物的疫苗相比，所述疫苗，在蛋白质抗原与单克隆抗体形成的免疫复合物所诱导的免疫调理作用的作用下，疫苗免疫效果得到显著提升；与既往的用多克隆抗体形成的免疫复合物疫苗相比，这种用单克隆抗体制备的免疫复合物疫苗，制造的成本更低(原因是随着科学技术的进步，单克隆抗体制造成本显著下降)，质量更为稳定(原因是单克隆抗体在抗体分子类型、抗体亲和力、抗体纯度、抗体浓度等方面，都易于保持稳定，而多克隆抗体在这些方面都不容易保持稳定)，也不含有其他病原微生物。与其他疫苗一样，所述的免疫复合物疫苗可以含有佐剂或细胞因子，达到进一步提升疫苗免疫效果的效果。

进一步的，所述疫苗含有两种或两种以上的蛋白质抗原与单克隆抗体特异性结合而形成的免疫复合物。其有益效果可以是但不限于用于两种或两种以上病毒病的预防。

进一步的，所述疫苗含有两种或两种以上的蛋白质抗原与单克隆抗体特异性结合而形成的免疫复合物，并且所述的两种或两种以上的蛋白质抗原中，部分或全部的蛋白质抗原都含有相同的B细胞表位，且这些具有相同的B细胞表位的蛋白质抗原与同一种单克隆抗体结合或相同的数种单克隆抗体结合而形成免疫复合物。其有益效果是：用一种单克隆抗体或相同的数种单克隆抗体，即可与两个或两个以上的蛋白质抗原结合形成免疫复合物(因为这些蛋白质抗原含有相同的B细胞表位)，这样的免疫复合物即可用来制备同时预防两种或两种以上病毒病的疫苗。

进一步的，所述疫苗中的蛋白质的B细胞表位是用有机化学方法，人为地在动物体外或细胞外面添加的某些化学基团参与构成的。其有益效果是：简便地使多种蛋白质具有相同的B细胞表位。

进一步的，所述疫苗用于疱疹病毒科(Herpesviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、呼肠病毒科(Reoviridae)、布尼病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、丝状病毒库(Filoviridae)的病毒引起的人的病毒病的预防，或者用于猪、马、牛、羊、禽、狗、猫等动物各种病毒病的预防，包括古典猪瘟、口蹄疫、猪蓝耳病、非洲猪瘟、猪冠状病毒感染、小反刍兽疫、禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病。其有益效果是：与预防病毒病的活疫苗相比，所述疫苗的安全性更好(因为它可以不含有活病毒)；与预防病毒病的其他疫苗相比，所述疫苗的免疫效果优异，并且适合于多种病毒病的预防。

具体实施方式

为便于本领域的技术人员理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

实施例1阐述了预防H9亚型禽流感和小鼠冠状病毒3型的一种免疫复合物疫苗的制备方法。实施例1是说明本发明的具体应用方式。该实施例不是用于限定本发明的应用范围和本发明专利的保护范围。

实施例1所述疫苗是接种小鼠的免疫复合物疫苗。它含有通过基因工程制备的两种重组蛋白质(H9亚型禽流感病毒的HA1蛋白质和小鼠冠状病毒3型的S1蛋白质)。这两种蛋白质都含有His-Tag(6个组氨酸组成的小肽)这个B细胞表位，并且都借助这个B细胞表位，与小鼠抗His-Tag的单克隆抗体，形成免疫复合物。

实施例1所述疫苗的制备包括以下五个步骤。第一，委托相关的生物技术公司，将H9亚型禽流感病毒的HA1基因与His-Tag进行融合，在真核细胞中表达这个融合蛋白(记为H9HA1-His)，然后进行H9HA1-His纯化和定量，溶解在0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.4)中；第二，委托相关的生物技术公司，将小鼠冠状病毒3型的S1蛋白与His-Tag进行融合，在真核细胞中表达这个融合蛋白(记为MHV3-His)，然后进行MHV3-His纯化和定量，溶解在0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.4)中；第三，委托相关的生物技术公司，在真核细胞中分别表达与Flag标签(亲水性多肽，序列是DYKDDDDK)H9亚型禽流感病毒的HA1基因和小鼠冠状病毒3型的S1蛋白(分别记为H9HA1-Flag和MHV3-Flag)，然后进行纯化和定量，溶解在0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.4)中；第四，委托相关的生物技术公司，制备小鼠抗His-Tag的单克隆抗体(记为HisMb)，溶解在0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.4)中；第五，按照质量比为1:1:30的比例，将纯化的H9HA1-His、MHV3-His、HisMb进行混合，制成待测的A疫苗(每份疫苗含1微克H9HA1-His、1微克MHV3-His、30微克HisMb，每份疫苗为0.1毫升)，将纯化的H9HA1-His和MHV3-His，等质量混合分装成待测的B疫苗(每份疫苗含1微克H9HA1-His和1微克MHV3-His，每份疫苗为0.1毫升)。

将上述A疫苗(实施例1制备的免疫复合物疫苗)、B疫苗(常规的蛋白质疫苗)、生理盐水(用作阴性对照)，分别接种三组10日龄的SPF小鼠，每组8只，每只小鼠肌肉注射接种1份疫苗或0.1毫升生理盐水。在接种后第28日，采集小鼠血清，用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法(酶标板包被H9HA1或MHV3，然后用脱脂奶封闭，然后加入梯度稀释的待测小鼠血清，然后加入酶标兔抗小鼠IgG，然后进行显色，从脱脂奶封闭之后，每步操作之前需要洗涤酶标板，去除未结合的大分子)，检测每只小鼠针对H9HA1-Flag和MHV3-Flag的抗体。

表1是三组小鼠抗H9HA1-Flag抗体和抗MHV3-Flag抗体的效价对比，通过表1中的检测结果可知，A疫苗诱导的抗H9HA1-Flag抗体效价约是B疫苗的诱导的抗H9HA1-Flag抗体效价126倍(2.1Log)，A疫苗诱导的抗MHV3-Flag抗体效价约是B疫苗的诱导的抗MHV3-Flag抗体效价316倍(2.5Log)，说明A疫苗免疫效果显著高于B疫苗。

表1.三组小鼠抗H9HA1-Flag抗体和抗MHV3-Flag抗体的效价(用Log表示)

接种的疫苗	抗H9HA1-Flag抗体效价	抗MHV3-Flag抗体效价
			A疫苗(免疫复合物疫苗)	6.6±0.2	7.6±0.3
B疫苗(常规的蛋白质疫苗)	4.5±0.4	5.1±0.5
			对照组(接种等体积生理盐水)	0	0

实施例2

实施例2阐述了预防鸡新城疫的一种免疫复合物疫苗的制备方法。实施例2是说明本发明的具体应用方式。该实施例不是用于限定本发明的应用范围和本发明专利的保护范围。

实施例2所述疫苗是接种小鼠的免疫复合物疫苗。它含有病毒增殖过程中产生的多种病毒蛋白质。这些蛋白质都通过有机化学方法，添加了同一种B细胞表位(克伦特罗)。这些蛋白质都借助这个B细胞表位，与小鼠抗克伦特罗的单克隆抗体，形成免疫复合物。

实施例2所述疫苗是用新城疫疫苗毒株Lasota病毒，按照常规方法(在鸡胚中培养病毒，收获尿囊液，用-丙内脂灭活病毒)，制备灭活疫苗(记为ND-IV，每份疫苗含有1微克灭活的新城疫病毒)。对ND-IV中的蛋白质，用重氮法，偶联克伦特罗，然后将偶联后的ND-IV与克伦特罗鼠源单抗(从生物试剂公司购置)进行混合(单抗过量)，制备新城疫单抗免疫复合物疫苗(记为ND-ASIV，即为实施例2所述疫苗)，每份ND-ASIV含有的新城疫病毒抗原摩尔数与ND-IV相同。SPF小鼠分成三组，每组10只，分别免疫ND-IV、ND-ASIV、生理盐水。接种后第28天，采集小鼠尾静脉血，检测新城疫抗体。结果显示，B组小鼠血清抗体的新城疫病毒的血凝抑制效价，是A组小鼠的796.4倍，B组小鼠血清抗体针对新城疫病毒NP蛋白的ELISA检测效价，是A组小鼠的27835.2倍，C组小鼠未产生新城疫抗体。这些数据说明实施例2疫苗显著提升相应的灭活疫苗的免疫效果。实施例2还提供了用单一单克隆抗体，制备多种蛋白质-抗体免疫复合物途径。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims

1.免疫复合物疫苗，其特征在于同时满足以下条件：所述疫苗含有蛋白质抗原与其特异性单克隆抗体相互结合形成的免疫复合物；所述蛋白质可以是病毒增殖过程中产生的蛋白质，也可以是通过基因工程产生的重组蛋白质，也可以是通过化学合成的多肽；所述疫苗如果是人用疫苗，则所述单克隆抗体为人源的单克隆抗体；所述疫苗如果是某种动物用的疫苗，则所述单克隆抗体为该种动物源的单克隆抗体；所述单克隆抗体包括嵌合单克隆抗体(chimeric monoclonal antibody)、抗体互补决定区植入单克隆抗体(CDR graftingmonoclonal antibody)。

2.根据权利要求1所述的免疫复合物疫苗，其特征在于：所述疫苗含有两种或两种以上的蛋白质抗原与单克隆抗体特异性结合而形成的免疫复合物。

3.根据权利要求2所述的免疫复合物疫苗，其特征在于：所述的两种或两种以上的蛋白质抗原中，部分或全部的蛋白质抗原都含有相同的B细胞表位(B cell epitope)，且这些具有相同的B细胞表位的蛋白质抗原与同一种单克隆抗体或相同的数种单克隆抗体结合而形成免疫复合物。

4.根据权利要求3所述的免疫复合物疫苗，其特征在于：所述B细胞表位是用化学方法添加的化学基团参与构成的。

5.根据权利要求1所述的免疫复合物疫苗，其特征在于：所述疫苗用于病毒病的预防，所述病毒病是指疱疹病毒科(Herpesviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、呼肠病毒科(Reoviridae)、布尼病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、丝状病毒库(Filoviridae)的病毒引起的人的病毒病；以及猪、马、牛、羊、禽、狗、猫等动物的各种病毒病，包括古典猪瘟、口蹄疫、猪蓝耳病、非洲猪瘟、猪冠状病毒感染、小反刍兽疫、禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病。