CN112301042A - A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用，属于病毒技术领域。本发明在对SVA/HN/11/2017兰兽研进行全基因组测定的基础上，在其基因组cDNA序列的5’端引入了T7启动子序列，在3’端引入Not I酶切位点序列，同时在2B基因处引入了Xho I酶切位点，消除了Xma I酶切位点，构建含SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA的重组质粒。基于感染性cDNA克隆拯救得到的病毒在制备A型塞内卡病毒标记疫苗中的应用。本发明提供的感染性cDNA克隆及制备方法为深入开展SVA的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。

Description

A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用

技术领域

本发明属于病毒技术领域，具体涉及A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用。

背景技术

A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，是引起猪出现水泡性病变的病原。SVA感染导致的临床症状包括在猪鼻镜、口腔上皮及蹄冠处出现水疱、溃烂从而导致跛行，在小日龄仔猪中会引起嗜睡、腹泻、神经系统症状和急性死亡，0～3日龄的仔猪死亡率高达(40％～80％)，4～7日龄的仔猪死亡率达(0～30％)。SVA感染引起的临床症状与口蹄疫、猪水泡病、水疱性口炎和猪水疱疹引起的病变相似，在临床上难以区分。

SVA是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员，其基因组为单股正链RNA，全长约7.28Kb，依次由5′-非翻译区(Untranslated region，UTR)(0.66Kb)、开放阅读框(Open reading frame，ORF)(6.54Kb)和3′-UTR(0.07Kb)组成。SVA的ORF编码一个大的多聚蛋白前体，然后经蛋白酶剪切后形成4种结构蛋白(VP4，VP2，VP3和VP1)和8种非结构蛋白(L，2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D)。

SVA最早于2002年从胚胎视网膜细胞(PRR.C6)培养物中首次分离得到，该分离株被命名为SVV-001。尽管调查发现SAV自1988年就在美国的猪群中流行，但并未确诊；直到2007年，才从加拿大运往美国的患有水疱样症状的猪中检测到SVA RNA阳性，而能引起猪水疱症状的口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒和水疱性疹病毒的病原学检测均为阴性，而从认为SVA是导致被检猪只发生水疱性疾病的病原。目前，国内外研究人员对SVA在生物学特性、诊断试剂和疫苗研究等方面做了一些工作，然而SVA的感染与复制机理仍不清楚。

反向遗传学(Reverse Genetics)是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是由表及里，即从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律；而反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象，即在获得生物基因信息的基础上，有目的地对生物体基因组进行加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，来研究这些修饰对生物体的表型、性状的影响等，从而揭示该基因与表型的关系。

反向遗传操作技术的兴起使得人们可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰和改造，然后通过拯救病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果，从而对病毒基因组的表达调控机制、病毒的致病机理等进行研究。然而与DNA病毒和反转录病毒不同，大多数RNA病毒由于其基因组本身的结构特点和不稳定性，同时在其复制期间不经历DNA中间阶段，增加了研究的难度。但随着RT-PCR和体外转录RNA技术的发展，一种名为反向遗传学的操作技术，克服了对RNA病毒基因组难以操作的难题，可以通过操作其相对稳定的cDNA而在分子水平上进一步研究RNA病毒。

RNA病毒反向遗传学技术主要是指通过构建RNA病毒的感染性cDNA分子克隆，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行体外操作，然后通过体外转录RNA技术获得具有感染性，并可稳定遗传的子代病毒，从而研究该病毒基因结构和功能关系的方法。该技术的核心是构建RNA病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA聚合酶启动子，通过体外转录过程得到病毒RNA，然后将该转录物RNA转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒。这种技术的建立克服了对RNA病毒基因组难以操作的难题，使得在病毒cDNA分子水平上对其进行体外操作成为可能，如进行基因的点突变、缺失、插入、转位和互补等改造，依此来研究RNA病毒的基因组结构与功能、表达与调控机理、致病机制、病毒与宿主的相互作用关系，以及构建新型病毒载体，甚至还可以得到减毒毒株，开发新型的疫苗，特别是在分子标记疫苗研究中将具有不可取代的作用。

在获得病毒基因组cDNA序列之后，成功构建感染性克隆需要满足高效成功拯救病毒的要求，常见方法包括体外转录和体内转录两种方式。体外转录(in vitrotranscription)是利用RNA聚合酶在体外将病毒基因组cDNA转录成病毒基因组RNA，再用病毒基因组RNA去转染宿主细胞，从而产生子代病毒粒子的过程。体外转录要求将病毒基因组cDNA序列置于外源启动子核心序列的下游，以便RNA聚合酶在体外起始病毒基因组RNA的合成，同时还要避免在转录产物的5’端引入多余的核苷酸，以免影响病毒的拯救效率。另外，还要保证病毒基因组cDNA的3’端正确终止。利用体外转录获得感染性病毒RNA的方法目前已广泛应用于各类RNA病毒中，常用的启动子有T7启动子，T3启动子和SP6启动子。体内转录就是将含有病毒cDNA的重组质粒导入真核生物体内，利用宿主的RNA聚合酶系统，在体内进行转录，生成具有感染性的病毒RNA，进而装配成病毒粒子的过程。体内转录具有以下优点：(1)能够获得比较稳定的RNA；(2)避免了体外转录过程，对于体外转录感染性不高的病毒是一种较为理想的方法；(3)能降低由于体外转录所需的试剂的成本。虽然体内转录具有诸多优点，但其成功的关键依赖于病毒全长感染性cDNA的重组质粒的构建。经检索目前还未有关于A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用，具有快速、简便、高效的特点，为深入开展SVA的基础和应用研究提供了有效的平台。

本发明提供了一种A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，在载体的多克隆位点处插入含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列；

所述含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述载体包括M-pSK载体。

优选的，所述多克隆位点包括KpnI/NotI。

本发明提供了所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，包括以下步骤：

1)以A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研的RNA为模板，分别用引物对S1F/S1R、S2F/SmR、SmF/S2R和S3F/S3R进行RT-PCR扩增，获得扩增产物分别为S1、Sm1、Sm2和S3片段；

所述S1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述S1R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述S2F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述SmR的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述SmF的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述S2R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述S3F的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述S3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

2)利用融合PCR将所述Sm1和Sm2片段进行融合，获得S2片段；

3)将所述S1、S2和S3片段克隆到载体中，获得包含SVA基因组全长cDNA的克隆。

优选的，所述RT-PCR扩增的反应程序：50℃，30min；94℃，2min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸130s，共30个循环；最后再72℃延伸10min。

优选的，所述融合PCR是以所述Sm1和Sm2片段为模板，以所述S2F和S2R为引物对进行融合PCR扩增；

所述融合PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；然后98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸200s，共35个循环；最后再延伸10min。

优选的，S1片段克隆到载体的多克隆位点为Kpn I/Nde I；

S2片段克隆到载体的多克隆位点为Nde I/BglII；

S3片段克隆到载体的多克隆位点为Bgl II/Not I。

本发明提供了所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆在拯救A型塞内卡病毒中的应用。

本发明提供了基于所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆拯救得到的病毒rSVA-HN，在2B基因中引入了一个Xho I酶切位点，同时消除了一个Xma I酶切位点；

所述病毒rSVA-HN和亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研的形态结构、大小、感染性及生长速度及病毒效价一致。

本发明提供了所述病毒rSVA-HN在制备A型塞内卡病毒标记疫苗中的应用。

本发明提供了一种A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，在载体的多克隆位点处插入含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列；所述含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明在对SVA分离株SVA/HN/11/2017兰兽研进行全基因组测定的基础上，在其基因组cDNA序列之前引入了T7启动子的核苷酸序列，在其基因组cDNA序列之后引入Not I酶切位点序列，构建了含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA的重组质粒。该克隆经Not I线性化以便于更好的、更精确的终止转录，将所述NotI线化的克隆转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞，成功拯救到重组病毒。本发明提供的克隆为深入开展SVA的基础和应用研究提供了有效的平台(为进一步研究SVA的生物学特性、复制机制、致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础)，具有重要的科学应用价值。

同时本发明提供的克隆中涉及到的酶切位点，便于对其cDNA进行操作，也便于以SVA/HN/11/2017兰兽研的感染性cDNA克隆为框架进行各种基础和应用研究。

本发明提供了基于所述SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆拯救得到的病毒rSVA-HN，通过拯救病毒的RT-PCR鉴定和遗传稳定性分析表明，拯救的病毒rSVA-HN在PK-15细胞上连续传代，细胞病变时间逐渐缩短，病变更加典型，传至第5代，病变时间逐渐稳定，95％以上细胞病变时间为15h；分别提取第5代和第10代病毒的RNA，用S2F/S2R引物对进行RT-PCR扩增，扩增产物测序结果表明拯救到的病毒来自构建的感染性克隆，且引入的分子标记能够稳定遗传。免疫荧光检测结果表明，拯救的病毒及亲本病毒在BHK-21细胞中均能产生明亮的绿色荧光，而对照细胞(正常BHK-21细胞)无特异荧光产生。表明重组病毒感染的BHK-21细胞中有SVA蛋白的表达，同时也表明拯救出了具有感染性的塞内卡病毒。此外，蚀斑试验和一步生长曲线试验结果表明，亲本病毒和重组病毒均可在PK-15细胞上形成蚀斑，且蚀斑形态大小相似(图7)，表明二者具有相似的复制能力，一步生长曲线分析结果表明重组病毒和亲本病毒具有相似的生长特性。SVA/HN/11/2017兰兽研感染性cDNA克隆的成功构建为进一步研究SVA的生物学特性、复制机制、致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础，具有重要的科学应用价值。

附图说明

图1为SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA克隆的构建示意图；

图2为RT-PCR扩增S1、Sm1、Sm2、S3片段及S2片段的融合PCR产物的电泳图，M1：DL2000 DNAmarker；1：S1片段；2：Sm1片段；3：Sm2片段；4：S3片段；5：S2片段；M2：1Kb DNALadder；

图3为重组病毒在PK-15细胞上的致细胞病变效应，图3A为正常PK-15细胞；图3B为重组病毒rSVA-HN感染的PK-15细胞；

图4为重组病毒的遗传稳定性分析结果；

图5为重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果；

图6为重组病毒的电镜观察结果，图6A为亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研；图6B为重组病毒rSVA-HN；

图7为重组病毒的蚀斑表型及一步生长曲线分析；图7A为亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研及重组病毒rSVA-HN的蚀斑表型；图7B为亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研重组病毒rSVA-HN的一步生长曲线。

生物材料保藏信息

A型塞内卡病毒(SenecavirusA)SVA/HN/11/2017兰兽研，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年07月13。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC NO.19966。

具体实施方式

本发明提供了一种A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，在载体的多克隆位点处插入含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列；所述含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。在SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA(SEQ ID NO:10)的5’端插入Kpn I酶切位点和T7启动子序列(TAATACGACTCACTATA，SEQ ID NO:11)，为了提高T7启动子的转录效率，在T7启动子之后加入了3个G，同时在2B基因区域引入了2个沉默突变作为分子标签，其中引入了一个Xho I酶切位点(TCTCGAG)，同时消除了一个Xma I酶切位点，且该分子标签能稳定遗传，可后续用于区分拯救病毒与亲本病毒，同时在3’端增加Not I酶切位点(GCGGCCGC)。

本发明对所述载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的载体即可，为了举例说明构建感染性克隆的方法，本发明以M-pSK载体作为载体骨架进行构建。当所述载体为M-pSK载体时，所述多克隆位点优选包括KpnI/NotI。所述M-pSK载体在现有技术中报道，参见如下文献：Li P,Lu Z,Bao H,Li D,King DP,Sun P,Bai X,Cao W,Gubbins S,Chen Y,Xie B,Guo J,Yin H,Liu Z.In-vitro and in-vivo phenotype of type Asia 1foot-and-mouth disease viruses utilizing two non-RGD receptor recognitionsites.BMC Microbiol.2011Jun 29；11:154.doi:10.1186/1471-2180-11-154.PMID:21711567；PMCID:PMC3224205.

本发明提供了所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，包括以下步骤：

1)以A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研的RNA为模板，分别用引物对S1F/S1R、S2F/SmR、SmF/S2R和S3F/S3R进行RT-PCR扩增，获得扩增产物分别为S1、Sm1、Sm2和S3片段；

所述S1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述S1R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述S2F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述SmR的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述SmF的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述S2R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述S3F的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述S3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

2)利用融合PCR将得到的Sm1和Sm2片段进行融合，获得S2片段；

3)将所述S1、S2和S3片段克隆到载体中，获得包含SVA基因组全长cDNA的克隆。

所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法见图1。本发明以A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研的RNA为模板，分别用引物对S1F/S1R、S2F/SmR、SmF/S2R和S3F/S3R进行RT-PCR扩增，获得扩增产物依次分别为S1、Sm1、Sm2和S3片段。

在本发明中，A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研的第五代细胞病毒作为提取RNA的材料，提取RNA的方法参照RNeasy Mini Kit(Qiagen)说明书提取病毒样品SVA/HN/11/2017兰兽研的RNA。

在本发明中，所述RT-PCR扩增的反应体系优选如下：

组分	体积(μL)
		PrimeScript1StepEnzymeMix	2
2×1StepBuffer	25
		上游引物(20μM)	1
上游引物(20μM)	1
		RNA模板	8
无RNA酶水	13
		总计	50

在本发明中，所述RT-PCR扩增的反应程序优选如下：50℃，30min；94℃，2min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸130s，共30个循环；最后再72℃延伸10min。

得到Sm1和Sm2片段后，本发明利用融合PCR将所述Sm1和Sm2片段进行融合，获得S2片段。

在本发明中，所述融合PCR优选是以所述Sm1和Sm2片段为模板，以所述S2F和S2R为引物对进行融合PCR扩增。所述融合PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；然后98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸200s，共35个循环；最后72℃延伸10min。所述融合PCR扩增的反应体系为：

组分	体积(μL)
		PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)	0.5
5×PrimeSTAR缓冲液(含Mg<sup>2+</sup>)	10
		dNTP混合物(2.5mM/每种)	4
S2F引物(10μL)	1
		S2R引物(10μL)	1
Sm1片段	0.5
		Sm2片段	0.5
无RNA酶水	32.5
		总计	50

得到S1、S2和S3片段后，本发明将所述S1、S2和S3片段克隆到载体中，获得包含SVA基因组全长cDNA的克隆。

在本发明中，S1片段克隆到载体的多克隆位点优选为Kpn I/Nde I；S2片段克隆到载体的多克隆位点优选为Nde I/Bgl II；S3片段克隆到载体的多克隆位点优选为Bgl II/Not I。本发明对所述克隆的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的克隆方法即可，例如酶切、连接等操作。

在本发明中，获得包含SVA基因组全长cDNA的克隆后，还优选包括酶切鉴定和全长测序。所述酶切鉴定优选采用Xba I进行酶切鉴定，当产生约4100bp和6000bp的两个条带时，说明获得的克隆为阳性，当产生1条长片段时，为未插入SVA基因组全长cDNA的质粒。

本发明提供了所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆在拯救A型塞内卡病毒中的应用。

在本发明中，所述应用中，拯救A型塞内卡病毒的方法，优选包括将阳性重组质粒pSVA-HN经Not I酶切线化后，用Lipofectamine^TM2000介导转染生长至80％～90％满的BSR/T7细胞，转染5h后补加2mL含10％胎牛血清的GMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养环境中继续培养72h后收获细胞。经反复冻融3次后，在PK-15细胞上连续传代至出现典型的致细胞病变效应，收集的每代病毒样品置-70℃保存备用。拯救的重组病毒命名为rSVA-HN。

本发明提供了基于所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆拯救得到的病毒rSVA-HN，在2B基因中引入了一个Xho I酶切位点，同时消除对应位置的Xma I酶切位点；所述病毒rSVA-HN和亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研的形态结构、大小、感染性及生长速度及病毒效价一致。所述病毒rSVA-HN的制备方法同上，在此不做赘述。

本发明提供了所述病毒rSVA-HN在制备A型塞内卡病毒标记疫苗中的应用。本发明以病毒rSVA-HN作为候选疫苗株制备标记疫苗。所述标记疫苗可用于A型塞内卡病毒感染的防治。

下面结合实施例对本发明提供的A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

材料与试剂来源的说明

1)病毒、质粒、细胞

A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研株由中国农业科学院兰州兽医研究所宿主抗病毒感染与免疫生物学团队保存，并已经提交保藏，第五代细胞毒用于提取RNA，作为构建SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性克隆的材料；质粒M-pSK来源于pBluescript SK(+)质粒，经过去除原有的T7启动子序列并对限制性酶切位点进行改造而得，由本实验室保存(可参见现有技术，如Li et al.2012)；表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞(BSR/T7)由德国Conzelmann教授惠赠，同时在现有技术(Li et al.2012)中报道；BHK-21细胞和PK-15细胞通过常规购买即可。

2)试剂

RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit)购自QIAGEN公司；大肠杆菌感受态细胞(trans109)和质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；DNAMaker、DNA GelExtractionKit、dNTP(10mM)、PrimeScript^TM One Step RT-PCR试剂盒、PrimeSTARTM HSDNAPolymerase和限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司；Lipofectamine^TM 2000购自Invitrogen公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰酶、opti-MEM购自Gibico公司；SVA猪阳性血清由中国农业科学院兰州兽医研究所宿主抗病毒感染与免疫生物学团队制备保存；羊抗猪IgG-FITC购自北京索莱宝科技有限公司。

实施例1

1.引物设计

根据已测得的SVA/HN/11/2017兰兽研株的全基因组序列，并参考载体M-pSK中的单一的限制性酶切位点，设计了覆盖SVA基因组全长的8条引物(表1)，由金唯智生物科技有限公司合成。为了区分拯救病毒与亲本病毒，在引物SmF和SmR中引入了2个沉默突变作为分子标签(引入了一个XhoI酶切位点，同时消除了一个Xma I酶切位点)。

表1构建HN/11/2017全长感染性cDNA克隆的引物

注：引物中的限制性内切酶位点用下划线标出；T7启动子序列用斜体标出。

2.SVA全长cDNA重组质粒的构建

参照RNeasy Mini Kit(Qiagen)说明书提取病毒样品SVA/HN/11/2017兰兽研病毒株的RNA，然后利用RT-PCR的方法，分别用引物对S1F/S1R、S2F/SmR、SmF/S2R和S3F/S3R进行RT-PCR扩增，获得的各个DNA片段分别命名为S1、Sm1、Sm2和S3。利用融合PCR将Sm1和Sm22个片段融合获得S2片段；融合PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；然后98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸200s，共35个循环；最后72℃延伸10min。所述融合PCR扩增的反应体系如下：

组分	体积(μL)
		PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)	0.5
5×PrimeSTAR缓冲液(含Mg<sup>2+</sup>)	10
		dNTP混合物(2.5mM/每种)	4
S2F引物(10μL)	1
		S2R引物(10μL)	1
Sm1片段	0.5
		Sm2片段	0.5
无RNA酶水	32.5
		总计	50

依次将S1、S2和S3片段克隆到M-pSK载体中，获得包含SVA基因组全长cDNA的克隆pSVA-HN，经Xba I酶切鉴定后对其进行全长测序。SVA/HN/11/2017兰兽研株全长cDNA克隆的构建见图1。

SVA全长cDNA克隆的构建及鉴定结果

将SVA/HN/11/2017兰兽研株的基因组全长分为4个相互重叠的片段进行RT-PCR扩增，获得S1、Sm1、Sm2和S3片段，Sm1和Sm2片段经融合PCR获得S2片段(图2)，然后将S1、S2和S3片段依次连接到M-pSK上，得到含SVA/HN/11/2017兰兽研株基因组全长cDNA的克隆pSVA-HN。用Xba I进行酶切鉴定，在重组质粒pSVA-HN中，存在2个Xba I酶切位点，且这2个Xba I酶切位点来源于SVA/HN/11/2017兰兽研株的cDNA。因此重组质粒pSVA-HN经XbaI酶切后产生约4100bp和6000bp的2条带，而亲本质粒仅包含一个Xba I酶切位点，经Xba I酶切后，得到一条线性质粒。对酶切鉴定正确的全长质粒pSVA-HN进行测序鉴定，结果表明获得了包含目的基因的重组质粒。

实施例2

1.病毒的拯救

鉴定正确的重组质粒pSVA-HN经Not I酶切线化后，用Lipofectamine^TM2000介导转染生长至80％～90％满的BSR/T7细胞，同时设正常细胞对照。转染5h后补加2mL含10％胎牛血清的GMEM培养基，置37℃，5％CO₂培养箱中继续培养72h后收获细胞。经反复冻融3次后，在PK-15细胞上连续传代至出现典型的致细胞病变效应，收集的每代病毒样品置-70℃保存备用。拯救的重组病毒命名为rSVA-HN。

病毒的拯救结果

经Not I线化的重组质粒pSVA-HN转染BSR/T7细胞，72h后收集转染的上清，并在PK-15细胞上连续传代至出现明显的致细胞病变。转染细胞上清传至第2代，28h后细胞出现典型CPE，而对照组细胞生长良好。将出现CPE的细胞培养物在PK-15细胞上连续传代，细胞病变出现的时间缩短，病变更加典型，而对照组细胞生长良好，仍无CPE产生(图3)。拯救的重组病毒命名为rSVA-HN。

2.拯救病毒的鉴定

1)RT-PCR测序鉴定

将拯救的重组病毒rSVA-HN在PK-15细胞上连续传代，观察出现CPE的时间。提取第5代和第10代病毒的总RNA，然后用S2F/S2R引物对进行RT-PCR扩增，扩增方法同实施例1。扩增产物经琼脂糖凝胶纯化回收后送上海生工生物有限公司测序，以验证拯救病毒的正确性及遗传稳定性。

拯救病毒的RT-PCR鉴定和遗传稳定性分析结果

将拯救的病毒rSVA-HN在PK-15细胞上连续传代，细胞病变时间逐渐缩短，病变更加典型，传至第5代，病变时间逐渐稳定，95％以上细胞病变时间为15h。分别提取第5代和第10代病毒的RNA，用S2F/S2R引物对进行RT-PCR扩增，扩增产物测序结果表明拯救到的病毒来自构建的感染性克隆，且引入的分子标记能够稳定遗传(图4)。

2)间接免疫荧光检测

生长至80％满的BHK-21细胞分别接种拯救的重组病毒rSVA-HN(第5代)和亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研，同时设正常BHK-21细胞为阴性对照。37℃孵育8h后弃上清，经PBS漂洗3次后用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次后用0.2％的TritonX-100通透15min，PBS洗涤3次后用5％的BSA封闭1h，PBS洗涤3次后加SVA猪阳性血清37℃孵育1h，PBS漂洗3次后加FITC标记的羊抗猪二抗37℃孵育1h，PBS洗涤3次后置于荧光显微镜下观察并拍照。

免疫荧光检测结果

将第5代重组病毒rSVA-HN和亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研接种BHK-21细胞，以正常BHK-21细胞作为空白对照，用SVA猪阳性血清分别对其进行间接免疫荧光染色，以检测病毒蛋白的表达。结果显示，拯救的病毒及亲本病毒在BHK-21细胞中均能产生明亮的绿色荧光(图5)，而对照细胞(正常BHK-21细胞)无特异荧光产生(图5)。表明重组病毒感染的BHK-21细胞中有SVA蛋白的表达，同时也表明拯救出了具有感染性的A型塞内卡病毒。

3)电镜检测

将收获的重组病毒rSVA-HN(第8代)和亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研反复冻融3次，经BEI灭活后加入0.1％的Triton X-100室温振荡10min，离心去除细胞碎片；上清中加入8％的PEG-6000和4％的NaCl充分搅拌，4℃过夜，离心弃上清；用TNE缓冲液重悬沉淀，加入2倍体积的三氯乙烯充分振荡5min使其乳化，离心取上清；经蔗糖梯度(150g/L～450g/L)离心后收集目的条带，制成病毒悬液，磷钨酸常规负染后电镜观察。

病毒粒子的电镜观察结果

纯化的重组病毒rSVA-HN和亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研经负染后置电镜下观察，结果表明重组病毒rSVA-HN和亲本病毒均能够观察到形态完整的球形粒子，且其形态结构和大小一致(图6)，说明转染拯救到的病毒为SVA。

实施例3

1.蚀斑表型试验

将第6代拯救病毒rSVA-HN及亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研分别做10倍倍比稀释，将不同稀释度的病毒接种于长满单层的PK-15细胞上(200μL/孔，6孔板)，置37℃、5％CO₂恒温培养箱中孵育1h，期间每隔10min轻轻摇动1次，使液体浸润细胞表面。然后每孔加入2mL黄芪胶混合液(1份1.2％黄芪胶，1份2×MEM，1％血清)置37℃、5％CO₂恒温培养箱中静止培养，48h后弃培养液，加入预冷的固定液(50％甲醛+50％丙酮)于-20℃固定30min，用结晶紫(2g/L))室温染色1h，用清水冲洗后观察其蚀斑表型。

2.拯救病毒的一步生长曲线

将第6代拯救病毒rSVA-HN及亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研以1个MOI的病毒感染量接种长满的单层PK-15细胞于37℃5％CO₂的培养箱中吸附1h，用PBS洗涤细胞2次后补加新鲜的MEM培养基并置37℃、CO₂培养箱继续培养。在接种后第4、8、12、16和20小时分别收取样品，经3次反复冻融后在PK-15单层细胞上测定各时段病毒的半数组织培养感染量(50％Tissue culture infective dose，TCID₅₀)，绘制病毒的一步生长曲线。

蚀斑试验和一步生长曲线结果

为了检测重组病毒的复制能力和生长特性，分别对重组病毒和亲本病毒进行了蚀斑表型分析。结果表明，亲本病毒和重组病毒均可在PK-15细胞上形成蚀斑，且蚀斑形态大小相似(图7)，表明二者具有相似的复制能力。为进一步了解重组病毒的生长特性，用相同计量的重组病毒和亲本病毒(MOI＝1)分别感染单层PK-15细胞进行病毒的一步生长曲线分析，结果表明重组病毒和亲本病毒具有相似的生长特性(图7)。

由上述实施例可知，本发明成功构建了A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆，在对SVA/HN/11/2017兰兽研株进行全基因组序列测定的基础上，成功构建了其感染性cDNA克隆，为进一步研究SVA的生物学特性、复制机制、致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础，具有重要的科学应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtacctaat acgactcact atagggtttg aaatgggggg ctgggccctc atgcccagtc 60

cttcctttcc ccttccgggg ggtaaaccgg ctgtgtttgc tagaggcaca gaggagcaac 120

atccaacctg cttttgtggg gaacggtgcg gctccaattc ctgcgtcgcc aaaggtgtta 180

gcgcacccaa acggcgcatc taccaatgcc attggtgtgg tctgcgagtt ctagcctact 240

cgtttctccc ctactcactc attcacgcac aaaaactgtg ttgtaactac aagatttggc 300

cctcgcacgg gatgtgcgat aaccgcaaga ttgactcaag cgcggaaagc gctgtaacca 360

catgctgtta gtccctttat ggctgcgaga tggctatcca cctcggatca ctgaactgga 420

gctcgaccct ccttagtaag ggaaccgaga ggccttcttg caacaagctc cgacacagag 480

tccacgtgat tgctaccacc atgagtacat ggttctcccc tctcgaccca ggacttcttt 540

ttgaatatcc acggctcgat ccagagggtg gggcatgatc cccctagcat agcgagctac 600

agcgggaact gtagctaggc cttagcgtgc cttggatact gcctgatagg gcgacggcct 660

agtcgtgtcg gttctatagg tagcacatac aaatatgcag aactctcatt tttctttcga 720

tacagcctct ggcgcctttg aagacgtaac cggaacaaaa gtcaagatcg ttgaataccc 780

cagatcggtg aacaatggtg tttacgattc gtccactcat ttagagatac tgaacctaca 840

gggtgaaatt gaaattttaa agtctttcaa cgaataccaa attcgcgccg ccaaacaaca 900

acttggactg gacatcgtat acgaactaca gggtaatgtt cagacaacct caaagaatga 960

ttttgattcc cgcggcaata atggtaacat gaccttcaat tactatgcaa acacttacca 1020

gaattcagta gacttctcga cctcctcgtc ggcgtcaggc gccggacccg ggaactcccg 1080

gggcggatta gcgggtctcc tcacaaattt cagtggaatc ttgaaccctc ttggctacct 1140

caaagatcac aataccgaag aaatggaaaa ctctgctgat cgagtcataa cgcaaacggc 1200

gggcaacact gccataaaca cgcaatcatc actgggtgtg ttgtgtgcct acgttgaaga 1260

cccgaccaaa tctgaccctc cgtccagcag tacagatcaa cccaccacca cttttactgc 1320

catcgacagg tggtacactg gacgcctcaa ttcttggaca aaagctgtaa aaaccttctc 1380

ttttcaggcc gtcccgctcc ctggagcctt cctgtctaga cagggaggcc tcaacggagg 1440

ggccttcacg gccaccttac acagacattt cttaatgaag tgcgggtggc aggtgcaggt 1500

ccaatgtaat ttgacgcagt tccaccaagg tgctcttctt gttgccatgg tccccgaaac 1560

cacccttgat gtcaaacctg acggcaaggc aaagagctta caggagctga atgaagagca 1620

gtgggtggaa atgtctgacg actacctgac cgggaaaaac atgccttttc agtctcttgg 1680

tacatactat cggcccccta actggacttg gggccctaat ttcatcaacc cctatcaagt 1740

gacagtcttc ccacatcaaa ttctgaacgc gagaacctct acctcggtag acataagtgt 1800

cccatacatc ggggaaactc ctacacaatc ctcagagaca cagaactcct ggaccctcct 1860

tgttatggtg cttgtccccc tggactacaa ggagggagcc acaactgacc cagaaattac 1920

attttctgta aggcctacaa gtccctactt caatgggctt cgtaaccgct tcacgaccgg 1980

gacggacgag gaacaggggc ccattcccac agcacccaga gaaaattcgc ttatgtttct 2040

ctcaaccatc cctgacgaca ctgtccctgc ttacgggaat gtgcgtaccc ctcccgtcaa 2100

ttacctcccc ggtgaaataa ccgacctctt acaattggcc cgtataccca ctctcatggc 2160

gtttgggcgg gtgtctgaac ccgagcctgc ctcagacgca tatgtgccct acgttgccgt 2220

tcctgcccag ttcgacgaca agcctctcat ctccttcccg atcacccttt cagatcctgt 2280

ctaccagaac accctggtag gcgccatcag ttcgaacttc gccaactacc gggggtgtat 2340

ccaaatcact ctgacatttt gtggacccat gatggcaaga gggaaattcc tgctctcgta 2400

ttctccccca aatggagcac aaccacagac cctttctaaa gctatgcagt gcacatactc 2460

tatttgggat ataggcttga actctagttg gacctttgtc atcccctaca tctcgcccag 2520

tgattaccgt gaaactcggg ctattaccaa ctcagtttat tctgctgatg gttggtttag 2580

cttgcacaag ctgaccaaaa ttactctacc acctgactgc ccacagagtc cctgtattct 2640

ctttttcgcc tctgctggtg aggattacac cctccgtctc cctgttgatt gtaatccttc 2700

ctacgtgttc cactccaccg acaacgccga gactggggtt attgaggcag gtaacactga 2760

caccgatttc tctggtgaac tggcggctcc tggctctaac catactaatg ttaaattcct 2820

gtttgaccga tctcgactac tgaatgtaat taaggtactg gagaaggacg ccgtcttccc 2880

ccgtcctttc cccacagcaa cgggtgcaca gcaggacgat ggttactttt gtcttctaac 2940

accccgccca acagtcgctt cccgacccgc tactcgcttc ggcctgtacg tcaacccgtc 3000

tggcagtggc gttctcgcta atacttcact ggatttcaat tttttcagtt tggcctgttt 3060

cacttacttt agatcagacc ttgaagtcac ggtggtctca ctggagccag atttggaatt 3120

cgccgtgggg tggttcccct ctggcagtga gtaccaggct tctagctttg tctatgacca 3180

actgcatgta ccctaccact ttactgggcg cactccccgc gctttcacca gcaagggtgg 3240

aaaggtatct ttcgtgctcc cttggaactc tgtctcttcc gtgcttcccg tgcgctgggg 3300

gggcgcttcc aagctttctt ctgccacgcg gggtctgccg gctcatgctg actgggggac 3360

catttacgcc tttatccccc gtcctaacga gaagaaaagc accgctgtaa agcacgtggc 3420

ggtgtacgtt cggtacaaga acgcgcgtgc ttggtgcccc agcatgcttc cctttcgcag 3480

ctataagcag aagatgctga tgcaatcagg cgacatcgaa accaaccctg gccctgcttc 3540

tgacaaccca atcttggagt ttcttgaggc ggaaaacgac ctagtcactc tggcctctct 3600

ctggaagatg gtgcactctg ttcaacagac ctggagaaag tatgtgaaga acgacaattt 3660

ttggcccaac ttgctcagcg agctagtggg ggaaggctcc atcgccttgg ccgccacgct 3720

atctaaccaa gcttcagtga aagctctctt gggcctgcat tttctctctc gaggactcaa 3780

ttacacagat ttttactctt tactgataga gaaatgctct agtttcttta ctgtagaacc 3840

gcctcctcca ccagctgaaa atctgatgac caagccttcc gtgaagtcga aattccgaaa 3900

gctgtttaag atgcaaggac ccatggatac agtcaaagac tggaaccaaa tagccgccgg 3960

cttgaagaat ttccaatttg ttcgtgactt agtcaaggag gtggtcgact ggctccaggc 4020

ttggatcaat aaagagaaag ccagtcctgt cctccagtac cagctggaga tgaaaaagct 4080

cgggcccgtg gctttggctc atgatgcctt catggccggt tctgggcccc ctcttagtga 4140

cgaccagatt gaatatctcc agaacctcaa gtctcttgcc ctaacactgg ggaagaccaa 4200

tttggcccaa agtctcacca ctatgatcaa tgccaagcag agctccgccc aacgagtcga 4260

acccgttgtg gtggtcctca gaggcaagcc gggatgcggc aaaagcttgg cctccacgtt 4320

gattgcccag gctgtgtcca agcgtctcta tggctcacaa agtgtgtatt ctcttcctcc 4380

ggacccagac ttcttcgacg gatacaaagg acagtttgta accttgatgg acgatctggg 4440

acaaaacccg gatgggcaag atttctccac cttttgtcag atggtgtcga ccgcccaatt 4500

tcttcccaac atggcggacc ttgcagagaa ggggcgtccc ttcacctcca atcttatcat 4560

tgcaactaca aacctccctc actttagccc tgtcaccatt gctgatcctt ctgcagtctc 4620

tcggcgtatc aactacgacc tgactctgga agtatctgag gcctacaaga agcacacacg 4680

gctgaatttt gacttggctt tcagacgcac tgacgccccc cccatttatc cttttgctgc 4740

ccatgtgccc ttcgtggacg tggctgtgcg cttcaaaaat ggtcatcaaa gcttcaatct 4800

cctagagttg gtcgactcta tttgtgcaga cattcgggcc aagcaacaag gcgcccgaaa 4860

tatgcagact ctggttctac agagccctaa cgagaacgac gacacctccg tcgacgaggc 4920

gttgggtaga gttctcaccc ccgctgcggt cgacgaggcg cttgtcgacc tcgctccaga 4980

tgccgacccg gttggccgct tggctattct cgccaagcta ggtcttgccc tagctgcggt 5040

cacccctggt ttgataatct tggcagtggg actctacaag tacctctctg gttctgatac 5100

agaccaagaa gaaacagaaa gtgaggaacc tactaaagcg cctaggagcg agaatgctta 5160

tgacggcccg aagaaaaact ctaagccccc tggagcgctc tcccttatgg aaatgcaaca 5220

gcccaacgtg gacatgggct ttgaggctgc ggtcgctaag aaagtggtcg tccccattac 5280

cttcatggtt cccaacagac cttctggact tacacagtcc gctcttcttg tggccggccg 5340

gaccttccta atcaatgagc atacatggtc caacccctcc tggaccagct tcacaatccg 5400

tggtgaggtg catactcgtg atgagccttt ccaaacggtt cattttaccc accatggtct 5460

tcccacagat ctgatgatgg tacgtctcgg accgggcaac tctttcccta acaatctaga 5520

caagtttgga cttgaccaga tgccggcacg taactcccgt gtggttggcg tttcggctag 5580

ttacggtaac ttctttttct ctgggaactt cctcgggttt gttgactcca tcacctctga 5640

tcaaggaacc tatgcgagac ttttcaggta cagggtgacg acttacaagg gatggtgcgg 5700

ttcggccctg gtctgtgagg ccggtggtgt ccgacgcatc attggcatgc attctgctgg 5760

tgccgctggt atcggcgccg ggacttacat ctcaaaatta ggactgatca aagcccttaa 5820

acacctcggt gagcctctgg ctacaatgca aggactaatg actgagctag agcctggagt 5880

caccgtacat gtaccccgaa aatctaaatt gagaaagacg accgcacacg cggtgtacaa 5940

accggagttt gaacctgctg tgttgtcaaa atttgatccc agactgaaca gggatgttga 6000

cctagacgag gtaatttggt ctaaacacac cgccaacgtc ccttatcaac ctcctttgtt 6060

ctacacatac atgtcagagt acgctcatcg ggttttctcc tttttgggaa aagacaatga 6120

cattctgacc gtcaaagaag caatcctggg catccctgga ctagacccta tggatcccca 6180

cacagctccg ggtttgccct acgccattag cggccttcga cgtactgatc tcgtcgattt 6240

tgcgaacggc acggtagacc cggcactggc catgcagatc cagaaattct tagacggtga 6300

ctactctgat catgtcttcc aaacttttct gaaagatgaa atcagaccct cagagaaggt 6360

ccgggcggga aaaacccgca ttgtcgatgt gccctccctg gcgcactgca ttgtgggcag 6420

aatgctgctt gggcgctttg ctgccaagtt tcaatcccat cctggctttc tccttggctc 6480

cgctatcggg tctgaccccg atgtcttctg gaccgtcata ggggctcagc tcgagggaag 6540

aaagaacacg tatgacgtgg actacagtgc ctttgactct tcacacggca ctggctcctt 6600

cgaggctctc atctctcact ttttcaccgt ggacaatggt ttcagccctg cgctgggacc 6660

gtatctcaga tccctggctg tctcggtgca cgcttacggc gagcgtcgca tcaagattac 6720

cggaggcctc ccctctggtt gtgccgcgac cagcctgctg aacacagtgc tcaacaatgt 6780

gatcatcagg actgctctgg cattgaccta caaggaattt gaatatgaca tggttgatat 6840

catcgcctac ggtgacgacc ttctggttgg tacggactac gatctggact tcaatgaggt 6900

ggcgcggcgc gctgccaaac tggggtataa gatgactcct gccaacaagg gttctgtctt 6960

ccctccgact tcctctctct ctgacgctgt ttttctaaaa cgcaaattcg tccaaaacaa 7020

tgacggctta tatagaccag ttatggatgt aaagaatttg gaagccatgc tctcctactt 7080

caaaccagga acactactcg agaagctgca atctgtttct atgttggctc aacattctgg 7140

aaaagaagaa tatgatagat tgatgcaccc cttcgctgac tacggtgccg taccgagtca 7200

cgagtacctg caggcaagat ggagggcctt gttcgactga cctggatagc ccaacgcgct 7260

tcggtgctgc cagcgattct gggagaaccc agtcggaaca aaaaagggaa aaaaaaaaaa 7320

aaaaaaaaaa aaagcggccg c 7341

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcggggtacc taatacgact cactataggg tttgaaatgg ggggctgggc cctcatgc 58

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaacggcaac gtagggcaca tatgcgtctg aggcaggctc 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcctgcct cagacgcata tgtgccctac gttgccgttc 40

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtaaaaatct gtgtaattga gtcctcgaga gagaaaatgc aggcccaaga g 51

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcttgggcc tgcattttct ctctcgagga ctcaattaca cagattttta c 51

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagacgtacc atcatcagat ctgtgggaag accatggtgg 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaccatggt cttcccacag atctgatgat ggtacgtctc 40

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggcgcgcc gcggccgctt tttttttttt ttttttttt 39

<210> 10

<211> 7302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttgaaatgg ggggctgggc cctcatgccc agtccttcct ttccccttcc ggggggtaaa 60

ccggctgtgt ttgctagagg cacagaggag caacatccaa cctgcttttg tggggaacgg 120

tgcggctcca attcctgcgt cgccaaaggt gttagcgcac ccaaacggcg catctaccaa 180

tgccattggt gtggtctgcg agttctagcc tactcgtttc tcccctactc actcattcac 240

gcacaaaaac tgtgttgtaa ctacaagatt tggccctcgc acgggatgtg cgataaccgc 300

aagattgact caagcgcgga aagcgctgta accacatgct gttagtccct ttatggctgc 360

gagatggcta tccacctcgg atcactgaac tggagctcga ccctccttag taagggaacc 420

gagaggcctt cttgcaacaa gctccgacac agagtccacg tgattgctac caccatgagt 480

acatggttct cccctctcga cccaggactt ctttttgaat atccacggct cgatccagag 540

ggtggggcat gatcccccta gcatagcgag ctacagcggg aactgtagct aggccttagc 600

gtgccttgga tactgcctga tagggcgacg gcctagtcgt gtcggttcta taggtagcac 660

atacaaatat gcagaactct catttttctt tcgatacagc ctctggcgcc tttgaagacg 720

taaccggaac aaaagtcaag atcgttgaat accccagatc ggtgaacaat ggtgtttacg 780

attcgtccac tcatttagag atactgaacc tacagggtga aattgaaatt ttaaagtctt 840

tcaacgaata ccaaattcgc gccgccaaac aacaacttgg actggacatc gtatacgaac 900

tacagggtaa tgttcagaca acctcaaaga atgattttga ttcccgcggc aataatggta 960

acatgacctt caattactat gcaaacactt accagaattc agtagacttc tcgacctcct 1020

cgtcggcgtc aggcgccgga cccgggaact cccggggcgg attagcgggt ctcctcacaa 1080

atttcagtgg aatcttgaac cctcttggct acctcaaaga tcacaatacc gaagaaatgg 1140

aaaactctgc tgatcgagtc ataacgcaaa cggcgggcaa cactgccata aacacgcaat 1200

catcactggg tgtgttgtgt gcctacgttg aagacccgac caaatctgac cctccgtcca 1260

gcagtacaga tcaacccacc accactttta ctgccatcga caggtggtac actggacgcc 1320

tcaattcttg gacaaaagct gtaaaaacct tctcttttca ggccgtcccg ctccctggag 1380

ccttcctgtc tagacaggga ggcctcaacg gaggggcctt cacggccacc ttacacagac 1440

atttcttaat gaagtgcggg tggcaggtgc aggtccaatg taatttgacg cagttccacc 1500

aaggtgctct tcttgttgcc atggtccccg aaaccaccct tgatgtcaaa cctgacggca 1560

aggcaaagag cttacaggag ctgaatgaag agcagtgggt ggaaatgtct gacgactacc 1620

tgaccgggaa aaacatgcct tttcagtctc ttggtacata ctatcggccc cctaactgga 1680

cttggggccc taatttcatc aacccctatc aagtgacagt cttcccacat caaattctga 1740

acgcgagaac ctctacctcg gtagacataa gtgtcccata catcggggaa actcctacac 1800

aatcctcaga gacacagaac tcctggaccc tccttgttat ggtgcttgtc cccctggact 1860

acaaggaggg agccacaact gacccagaaa ttacattttc tgtaaggcct acaagtccct 1920

acttcaatgg gcttcgtaac cgcttcacga ccgggacgga cgaggaacag gggcccattc 1980

ccacagcacc cagagaaaat tcgcttatgt ttctctcaac catccctgac gacactgtcc 2040

ctgcttacgg gaatgtgcgt acccctcccg tcaattacct ccccggtgaa ataaccgacc 2100

tcttacaatt ggcccgtata cccactctca tggcgtttgg gcgggtgtct gaacccgagc 2160

ctgcctcaga cgcatatgtg ccctacgttg ccgttcctgc ccagttcgac gacaagcctc 2220

tcatctcctt cccgatcacc ctttcagatc ctgtctacca gaacaccctg gtaggcgcca 2280

tcagttcgaa cttcgccaac taccgggggt gtatccaaat cactctgaca ttttgtggac 2340

ccatgatggc aagagggaaa ttcctgctct cgtattctcc cccaaatgga gcacaaccac 2400

agaccctttc taaagctatg cagtgcacat actctatttg ggatataggc ttgaactcta 2460

gttggacctt tgtcatcccc tacatctcgc ccagtgatta ccgtgaaact cgggctatta 2520

ccaactcagt ttattctgct gatggttggt ttagcttgca caagctgacc aaaattactc 2580

taccacctga ctgcccacag agtccctgta ttctcttttt cgcctctgct ggtgaggatt 2640

acaccctccg tctccctgtt gattgtaatc cttcctacgt gttccactcc accgacaacg 2700

ccgagactgg ggttattgag gcaggtaaca ctgacaccga tttctctggt gaactggcgg 2760

ctcctggctc taaccatact aatgttaaat tcctgtttga ccgatctcga ctactgaatg 2820

taattaaggt actggagaag gacgccgtct tcccccgtcc tttccccaca gcaacgggtg 2880

cacagcagga cgatggttac ttttgtcttc taacaccccg cccaacagtc gcttcccgac 2940

ccgctactcg cttcggcctg tacgtcaacc cgtctggcag tggcgttctc gctaatactt 3000

cactggattt caattttttc agtttggcct gtttcactta ctttagatca gaccttgaag 3060

tcacggtggt ctcactggag ccagatttgg aattcgccgt ggggtggttc ccctctggca 3120

gtgagtacca ggcttctagc tttgtctatg accaactgca tgtaccctac cactttactg 3180

ggcgcactcc ccgcgctttc accagcaagg gtggaaaggt atctttcgtg ctcccttgga 3240

actctgtctc ttccgtgctt cccgtgcgct gggggggcgc ttccaagctt tcttctgcca 3300

cgcggggtct gccggctcat gctgactggg ggaccattta cgcctttatc ccccgtccta 3360

acgagaagaa aagcaccgct gtaaagcacg tggcggtgta cgttcggtac aagaacgcgc 3420

gtgcttggtg ccccagcatg cttccctttc gcagctataa gcagaagatg ctgatgcaat 3480

caggcgacat cgaaaccaac cctggccctg cttctgacaa cccaatcttg gagtttcttg 3540

aggcggaaaa cgacctagtc actctggcct ctctctggaa gatggtgcac tctgttcaac 3600

agacctggag aaagtatgtg aagaacgaca atttttggcc caacttgctc agcgagctag 3660

tgggggaagg ctccatcgcc ttggccgcca cgctatctaa ccaagcttca gtgaaagctc 3720

tcttgggcct gcattttctc tcccggggac tcaattacac agatttttac tctttactga 3780

tagagaaatg ctctagtttc tttactgtag aaccgcctcc tccaccagct gaaaatctga 3840

tgaccaagcc ttccgtgaag tcgaaattcc gaaagctgtt taagatgcaa ggacccatgg 3900

atacagtcaa agactggaac caaatagccg ccggcttgaa gaatttccaa tttgttcgtg 3960

acttagtcaa ggaggtggtc gactggctcc aggcttggat caataaagag aaagccagtc 4020

ctgtcctcca gtaccagctg gagatgaaaa agctcgggcc cgtggctttg gctcatgatg 4080

ccttcatggc cggttctggg ccccctctta gtgacgacca gattgaatat ctccagaacc 4140

tcaagtctct tgccctaaca ctggggaaga ccaatttggc ccaaagtctc accactatga 4200

tcaatgccaa gcagagctcc gcccaacgag tcgaacccgt tgtggtggtc ctcagaggca 4260

agccgggatg cggcaaaagc ttggcctcca cgttgattgc ccaggctgtg tccaagcgtc 4320

tctatggctc acaaagtgtg tattctcttc ctccggaccc agacttcttc gacggataca 4380

aaggacagtt tgtaaccttg atggacgatc tgggacaaaa cccggatggg caagatttct 4440

ccaccttttg tcagatggtg tcgaccgccc aatttcttcc caacatggcg gaccttgcag 4500

agaaggggcg tcccttcacc tccaatctta tcattgcaac tacaaacctc cctcacttta 4560

gccctgtcac cattgctgat ccttctgcag tctctcggcg tatcaactac gacctgactc 4620

tggaagtatc tgaggcctac aagaagcaca cacggctgaa ttttgacttg gctttcagac 4680

gcactgacgc cccccccatt tatccttttg ctgcccatgt gcccttcgtg gacgtggctg 4740

tgcgcttcaa aaatggtcat caaagcttca atctcctaga gttggtcgac tctatttgtg 4800

cagacattcg ggccaagcaa caaggcgccc gaaatatgca gactctggtt ctacagagcc 4860

ctaacgagaa cgacgacacc tccgtcgacg aggcgttggg tagagttctc acccccgctg 4920

cggtcgacga ggcgcttgtc gacctcgctc cagatgccga cccggttggc cgcttggcta 4980

ttctcgccaa gctaggtctt gccctagctg cggtcacccc tggtttgata atcttggcag 5040

tgggactcta caagtacctc tctggttctg atacagacca agaagaaaca gaaagtgagg 5100

aacctactaa agcgcctagg agcgagaatg cttatgacgg cccgaagaaa aactctaagc 5160

cccctggagc gctctccctt atggaaatgc aacagcccaa cgtggacatg ggctttgagg 5220

ctgcggtcgc taagaaagtg gtcgtcccca ttaccttcat ggttcccaac agaccttctg 5280

gacttacaca gtccgctctt cttgtggccg gccggacctt cctaatcaat gagcatacat 5340

ggtccaaccc ctcctggacc agcttcacaa tccgtggtga ggtgcatact cgtgatgagc 5400

ctttccaaac ggttcatttt acccaccatg gtcttcccac agatctgatg atggtacgtc 5460

tcggaccggg caactctttc cctaacaatc tagacaagtt tggacttgac cagatgccgg 5520

cacgtaactc ccgtgtggtt ggcgtttcgg ctagttacgg taacttcttt ttctctggga 5580

acttcctcgg gtttgttgac tccatcacct ctgatcaagg aacctatgcg agacttttca 5640

ggtacagggt gacgacttac aagggatggt gcggttcggc cctggtctgt gaggccggtg 5700

gtgtccgacg catcattggc atgcattctg ctggtgccgc tggtatcggc gccgggactt 5760

acatctcaaa attaggactg atcaaagccc ttaaacacct cggtgagcct ctggctacaa 5820

tgcaaggact aatgactgag ctagagcctg gagtcaccgt acatgtaccc cgaaaatcta 5880

aattgagaaa gacgaccgca cacgcggtgt acaaaccgga gtttgaacct gctgtgttgt 5940

caaaatttga tcccagactg aacagggatg ttgacctaga cgaggtaatt tggtctaaac 6000

acaccgccaa cgtcccttat caacctcctt tgttctacac atacatgtca gagtacgctc 6060

atcgggtttt ctcctttttg ggaaaagaca atgacattct gaccgtcaaa gaagcaatcc 6120

tgggcatccc tggactagac cctatggatc cccacacagc tccgggtttg ccctacgcca 6180

ttagcggcct tcgacgtact gatctcgtcg attttgcgaa cggcacggta gacccggcac 6240

tggccatgca gatccagaaa ttcttagacg gtgactactc tgatcatgtc ttccaaactt 6300

ttctgaaaga tgaaatcaga ccctcagaga aggtccgggc gggaaaaacc cgcattgtcg 6360

atgtgccctc cctggcgcac tgcattgtgg gcagaatgct gcttgggcgc tttgctgcca 6420

agtttcaatc ccatcctggc tttctccttg gctccgctat cgggtctgac cccgatgtct 6480

tctggaccgt cataggggct cagctcgagg gaagaaagaa cacgtatgac gtggactaca 6540

gtgcctttga ctcttcacac ggcactggct ccttcgaggc tctcatctct cactttttca 6600

ccgtggacaa tggtttcagc cctgcgctgg gaccgtatct cagatccctg gctgtctcgg 6660

tgcacgctta cggcgagcgt cgcatcaaga ttaccggagg cctcccctct ggttgtgccg 6720

cgaccagcct gctgaacaca gtgctcaaca atgtgatcat caggactgct ctggcattga 6780

cctacaagga atttgaatat gacatggttg atatcatcgc ctacggtgac gaccttctgg 6840

ttggtacgga ctacgatctg gacttcaatg aggtggcgcg gcgcgctgcc aaactggggt 6900

ataagatgac tcctgccaac aagggttctg tcttccctcc gacttcctct ctctctgacg 6960

ctgtttttct aaaacgcaaa ttcgtccaaa acaatgacgg cttatataga ccagttatgg 7020

atgtaaagaa tttggaagcc atgctctcct acttcaaacc aggaacacta ctcgagaagc 7080

tgcaatctgt ttctatgttg gctcaacatt ctggaaaaga agaatatgat agattgatgc 7140

accccttcgc tgactacggt gccgtaccga gtcacgagta cctgcaggca agatggaggg 7200

ccttgttcga ctgacctgga tagcccaacg cgcttcggtg ctgccagcga ttctgggaga 7260

acccagtcgg aacaaaaaag ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 7302

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taatacgact cactata 17

Claims (10)

1.A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，其特征在于，在载体的多克隆位点处插入含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列；

所述含T7启动子的SVA/HN/11/2017兰兽研全长cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，其特征在于，所述载体包括M-pSK载体。

3.根据权利要求1或2所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆，其特征在于，所述多克隆位点包括KpnI/NotI。

4.权利要求1～3任意一项所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研的RNA为模板，分别用引物对S1F/S1R、S2F/SmR、SmF/S2R和S3F/S3R进行RT-PCR扩增，获得扩增产物分别为S1、Sm1、Sm2和S3片段；

所述S1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述S1R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述S2F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述SmR的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述SmF的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述S2R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述S3F的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述S3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

2)利用融合PCR将得到的Sm1和Sm2片段进行融合，获得S2片段；

3)将所述S1、S2和S3片段克隆到载体中，获得包含SVA基因组全长cDNA的克隆。

5.根据权利要求4所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增的反应程序：50℃，30min；94℃，2min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸130s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

6.根据权利要求4所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，所述融合PCR是以所述Sm1和Sm2片段为模板，以所述S2F和S2R为引物对进行融合PCR扩增；

所述融合PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；然后98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸200s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，S1片段克隆到载体的多克隆位点为Kpn I/Nde I；

S2片段克隆到载体的多克隆位点为Nde I/BglII；

S3片段克隆到载体的多克隆位点为Bgl II/Not I。

8.权利要求1～3任意一项所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆在拯救A型塞内卡病毒中的应用。

9.基于权利要求1～3任意一项所述A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆拯救得到的病毒rSVA-HN，其特征在于，通过沉默突变在2B基因处引入了一个XhoI酶切位点，同时消除了一个Xma I酶切位点；

所述病毒rSVA-HN和亲本病毒SVA/HN/11/2017兰兽研株的形态结构、大小、感染性、生长速度及病毒效价一致。

10.权利要求9所述病毒rSVA-HN在制备A型塞内卡病毒标记疫苗中的应用。

Images