HU218010B - Vektorként alkalmazható módosított növényi vírusok - Google Patents

Vektorként alkalmazható módosított növényi vírusok Download PDF

Info

Publication number
HU218010B
HU218010B HU9302954A HU9302954A HU218010B HU 218010 B HU218010 B HU 218010B HU 9302954 A HU9302954 A HU 9302954A HU 9302954 A HU9302954 A HU 9302954A HU 218010 B HU218010 B HU 218010B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
virus
plant
rna
fragment
particles according
Prior art date
Application number
HU9302954A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT65554A (en
HU9302954D0 (en
Inventor
John Emil Johnson
George Peter Lomonossoff
Original Assignee
Axis Genetics Plc
Purdue Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10693567&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU218010(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Axis Genetics Plc, Purdue Research Foundation filed Critical Axis Genetics Plc
Publication of HU9302954D0 publication Critical patent/HU9302954D0/hu
Publication of HUT65554A publication Critical patent/HUT65554A/hu
Publication of HU218010B publication Critical patent/HU218010B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/18011—Comoviridae
    • C12N2770/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány egy növényi vírus összeillesztett részeire vonatkozik,amely a vírus fehérjeköpenyének részeként meghatározott idegenpeptidet tartalmaz. A találmány kiterjed a vírusrészecskékettartalmazó vakcinára, a módosított cDNS-fragmensre, az ezt tartalmazóvektorra és ezek RNS-átiratára, valamint ezek előállítására. Az idegenpeptid előnyösen egy biológiailag funkcióképes peptid, amelynekbiológiai alkalmazása kiváltható vagy fokozható, ha a peptid nagyobbmolekulával vagy részecskével társult formában fordul elő. ŕ

Description

A találmány idegen peptidek előállítása során hordozóként (vektorként) alkalmazható vírusokra vonatkozik. A találmány tárgya közelebbről egy olyan megoldás, amelynek során a vírus nukleinsavat olyan génmanipulációnak vetjük alá, amelyben idegen nukleinsavszekvenciát építünk be, amely a vírusrészecskékben (virion) pepiidként fejeződik ki. A leírásban az „idegen” kifejezés a peptid vagy az ezt kódoló nukleinsavvonatkozásában olyan peptidet vagy nukleinsavszekvenciát jelöl, amely a vektorként alkalmazott növényi vírusban természetes módon nem fordul elő. Az ilyen szekvencia alternatív kifejezésként exogén vagy heterológ szekvenciának is jelölhető. A peptid kifejezés alatt kis peptideket és polipeptideket értünk.
Vírusvakcinák előállítása során széles körben elterjedt megoldás, hogy idegen peptidek hordozójaként vírust alkalmaznak. Az ilyen vakcinák olyan kimér vírusokon alapulnak, amelyek különböző állati víruskomponensekből összeállított hibridek. Az ilyen hibrid főkomponense általában olyan vírusból származik, amely önmagában vagy megfelelő átalakítás következtében ártalmatlan, míg a kisebb komponens valamely patogén vírus antigénkomponense. így például a himlővírus, ami lehet vakcina vagy legyengített poliovírus, vektorként alkalmazható más, humán és állati vírusok immunogén komponense vonatkozásában.
A fenti technikák azonban számos hátránnyal járnak. Az ilyen vakcinákat sejttenyészetben növesztett vírusokból állítják elő, ami csak költségesen valósítható meg. Az összetett vírus előállításához az élő, állatokat fertőző vírusokon génmanipulációkat végeznek, amelynek során fennáll annak a veszélye, hogy mutációval a vírus olyan új formái alakulnak ki, amelyek megváltozott fertőzőképességgel, antigén- és/vagy patogéntulajdonságokkal rendelkeznek. A vektorként alkalmazott állati vírus gyakran olyan vírus, amellyel az állatot már fertőzték, és így az állat már képes a vektor antitestének előállítására. így a vektort elroncsolja az immunrendszer, mielőtt a második vírus beépített antigénhelye kiváltaná az immunválaszt.
A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi a fent említett hátrányok kiküszöbölését oly módon, hogy idegen szekvenciákat kifejező kimér vírusok előállításához lényegesen eltérő típusú víruskomponenst alkalmazunk. Annak ellenére, hogy a találmány fő feladata a vírusvakcinák előállítása során jelentkező problémák megoldása, a találmány koncepciója és alkalmazási területe jóval szélesebb körű, mint ez a leírásból kiderül.
A találmány értelmében vektorrendszerként növényi vírust alkalmazunk idegen nukleotidszekvencia, vagyis a természetes eredetű növényi vírusban elő nem forduló nukleotidszekvencia (RNS vagy DNS) kifejezésére, amely szekvencia a természetes eredetű növényi vírusban általában elő nem forduló peptidet kódol.
A találmány ezért egy növényi vírus összeillesztett részeire vonatkozik, amely idegen peptidet tartalmaz. A találmány szerinti növényi vírus a természetes vírus módosított formája, és az egyszerűség kedvéért a továbbiakban módosított vírusnak nevezzük.
A találmány értelmében a növényi vírusba beépített idegen peptid bármely tetszőleges típusú lehet, amely vonatkozásban csak az a korlátozás érvényes, hogy az idegen peptid tulajdonságai és mérete, valamint az a hely, amelyre a vírusrészecskében vagy -részecskén beépül, ne befolyásolja a módosított vírusnak az in vitro vagy in vivő tenyésztés során jelentkező összeilleszkedő képességét. Széles értelemben a módosított vírus bármely olyan biológiailag hatékony peptidből (általában polipeptidből) kialakítható, amelynek működése egy adott konformációt igényel. Ez megvalósítható például úgy, hogy a peptid egy nagyméretű molekulával társul, például a stabilitás javítása vagy egy adott biológiai rendszerben jelentkező előfordulási mód javítása érdekében. Az ilyen peptidekre példaként említhetők a peptidhormonok, enzimek, növekedési faktorok, véglényekből, vírusokból, baktériumokból vagy gombákból származó antigének, antitestek, így antiidiotipikus antitestek, immunregulátorok és citokinok, így interferon és interleukin, receptorok, adhezinek, valamint az említett peptidtípusok részei és prekurzorai. A peptid előnyösen legalább öt aminosavat tartalmaz.
A találmány értelmében növényi vírusvektorhoz kötött bioaktív peptidszekvenciák széles körén belül különleges fontossággal rendelkeznek az antigénpeptidek, amelyek vakcinák, elsősorban humán és állati vírusvakcinák alapját képezik. Vakcinaként történő alkalmazás szempontjából a találmány szerinti megoldás egy különösen hatékony epitóp hordozórendszert javasol. Ilyen esetben az antigénpeptid-komponens megfelelő pozícióban található a vírusrészecskén, és így az immunrendszer által könnyen felismerhető, például a vírusfehérje-köpeny szabadon álló részén történő lokalizálással. Ebből a megközelítésből a találmány egy módosított növényi vírus összeillesztett részeire vonatkozik, amelyek patogént, például állati vírusból származó antigént tartalmaznak a növényi vírus fehérjeköpenyének szabadon álló felületébe beépülve. A találmány kiterjed a fenti, összeillesztett, módosított növényi vírusrészek valamely vakcina immunogén komponenseként történő alkalmazására.
A 4 407 956 számú USA-beli szabadalmi leírásból, a 067 553, 194 809 és 221 044 számú európai közrebocsátást iratból, valamint a WO 87/06261 és WO 90/00611 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésekből ismert, hogy bizonyos növényi vírusok DNS-e és RNS-e vektorként alkalmazható exogén anyagnak a növénybe történő bevitelére, és így a növényen új tulajdonságok kialakítására vagy értékes vegyületek, például növényi metabolitok előállítására. Az ismert megoldásoknál az érdeklődés csupán a növényi vírus módosított DNS-ére vagy RNS-ére, valamint ennek a növény fenotípusos transzformációjában történő alkalmazására terjed ki. Az ismert megoldások legtöbbje elméleti és spekulatív jellegű, és nem ismerteti a növényi vírus teljes részeinek (virionok) izolálását, amelyek tartalmazzák a módosított burokfehérjét, és nem ismertetik az ilyen részecskék állati vírusvakcinák előállítása céljából vagy más célból történő alkalmazását. Takamatsu és munkatársai beszámolnak egy kísérletről, amelyben a dohány-mozaikví2
HU 218 010 Β rus fehérjeköpenyének karboxiterminálisához kapcsolt és öt aminosavból álló idegen pepiidet fejeznek ki [Febs Letters, 269., 73-76. (1990)].
Az ismertetett kísérletben azonban módosított növényi vírusrészecskéket nem állítanak elő.
A módosított növényi vírusrészecskék találmány szerinti előállítása során a növényi vírus nukleinsavát az idegen peptidet, például állati vírusantigént kódoló nukleotidszekvenciának a növényi vírusgenom azon részébe történő bevitelével módosítjuk, amely rész a fehérjeköpeny szabadon álló részét kódolja. A módosított vírus nukleinsavval növényt vagy növényi sejtet fertőzünk, és a módosított vírus összeillesztett részeit összegyűjtjük. Az eljárás a legjobb eredménnyel DNS-vírusok esetében a vírus DNS-ének, míg RNS-vírusok esetében az RNS-nek megfelelő cDNS közvetlen manipulásával valósítható meg. RNS-vírus esetében általában a módosított DNS RNS-átiratát alkalmazzuk a növényi sejt vagy előnyösen a teljes növény inokulálására, és a módosított vírus összeillesztett részeinek összegyűjtése előtt egy szaporodási ciklust építünk be. DNS-vírus esetében magát a DNS-t visszük be a növénybe. Ebben az esetben az idegen fehérje a burokfehérje részeként kifejeződik, és ezáltal a teljes vírusrészecske részeként termelődik. A peptid ily módon előállítható közvetlen felhasználásra alkalmas konjugált molekula formájában. Alternatív módon a vírus genetikai módosítása megvalósítható úgy is, hogy a kívánt peptid a vírusrészecskétől történő lehasadást kiváltó megfelelő szer alkalmazása után felszabaduljon.
Kereskedelmi mennyiségű módosított vírus előállításához nincs szükség arra, hogy minden tételhez fertőző oltóanyagot (DNS- vagy RNS-átiratot) állítsunk elő. Ehelyett, a növényt egy kezdeti oltóanyaggal fertőzzük, és a kapott módosított vírust a növényre átvive előállítjuk az egész vírust vagy vírus-RNS-t, amely oltóanyagként alkalmazható az ezt követő tételek előállításához.
A találmány értelmében a vektorként alkalmazható vírusok különösen előnyös csoportját képezik azok, amelyekben a fehérjeköpenyt kódoló nukleinsav más funkcionális molekulákat kódoló nukleinsavaktól elkülönült egységet képez, és amelyekben a fehérjeköpeny β-hengerszerkezetet mutat. Az ilyen szerkezettel rendelkező vírusok alkalmazásának előnye, hogy a β-burok egyedi szálai között található hurkok megfelelő helyet biztosítanak az idegen peptidek beépülésére. Az idegen peptidek kifejezése a találmány értelmében előnyösen megvalósítható egy vagy több hurok módosításával. A vírusok fenti csoportjába tartoznak például a komovírusok, így a tehénborsó-mozaikvírus, és a babhüvelyfoltvírus, valamint a nepovírusok, így a paradicsom gyűrűs foltvírus, és az eper latens gyűrűs foltvírus. A komovírusok előnye, hogy fehérjeköpenyük hat másolatban három különböző β-hengert tartalmaz, amelyek egyenként manipulálhatók. Hasonló háromdimenziós szerkezetű, de egyetlen típusú β-hengert tartalmazó vírusokra példaként említhetők a tombuszvírusok és szobemovírusok. A találmány értelmében módosíthatók más olyan növényi és állati vírusok is, amelyek hasonló szerkezettel rendelkeznek, de amelyeknél a fehérjeköpeny nem mutat β-hengerszerkezetet. Ilyenre példaként említhetők a növényi és állati rabdovírusok.
Az idegen RNS vagy DNS a növényi vírus genomjába tetszőleges konfigurációban bevihető. így például az inszertálás megvalósítható úgy, hogy az idegen RNS vagy DNS a meglévő nukleinsavhoz kapcsolódik vagy a meglévő szekvencia egy részét helyettesíti. A választást elsősorban a burokfehérje szerkezete határozza meg, valamint figyelembe kell venni azt is, hogy az addíció vagy a helyettesítés befolyásolja-e kevésbé a genetikailag módosított vírus azon képességét, hogy a növényben a megfelelő részek illeszkedjenek. A találmány szerinti addíció vagy helyettesítés lehetőségét és legkedvezőbb méretét a később ismertetésre kerülő kísérlettel esetenként határozzuk meg. Az addíciós inszert alkalmazása egyes esetekben nagyobb rugalmasságot biztosít, mint a helyettesítő inszert.
A találmány szerinti eljárás egyik fontos részét képezi a módosított vírusnak a növényi gazdában történő elszaporítása és nagy mennyiségű termelése, amely lehetővé teszi vakcinaként alkalmazható antigének és más peptidek előnyös előállítását. Mint fent említettük, a bevitt heterológ nukleotidszekvencia előnyösen olyan aminosavakat kódol, amelyek könnyen lehasithatók, és így az elszaporítás után a kívánt anyag elválasztható a vírusrészecskétől. A peptid teljes hasítása mellett lehetőség van arra is, hogy a peptidet olyan formában szabadítjuk fel, amelyben a peptid sértetlenül megmarad a burokfehérje főtömegében, de elválik a vírusnukleinsavtól.
A CPMV fehérjeköpeny felületén kifejezhető epitópokra példaként említhetők a pikomavímsok, így szájés körömfáj ás vírus (FMDV), polivírus, humán rinovírus (HRV) és hepatitisz A vírus (HAV), a humánimmunhiány-vírus (HÍV) gp41 vagy gpl20 változatához kapcsolódó epitópok, valamint a humán papillomavírus (HPV) fő burokfehérjéjéből származó epitóp.
Vakcina előállításának szempontjából nézve a találmány szerinti megoldás egy sor előnnyel rendelkezik a szokásos vakcinákhoz, így állati vírusokon alapuló rekombináns vakcinákhoz és peptidvakcinákhoz hasonlítva. Példaként az alábbiakat említjük :
1. Alacsony költséggel és magas kitermeléssel tiszta vírus állítható elő a fertőzött növényből, amelynek során szövettenyésztési lépésre nincs szükség.
2. Fokozott biztonságot jelent az a tény, hogy a növényi vírus képtelen állatok fertőzésére és állatokban történő szaporodásra, és ezért képtelen mutációval virulens forma kialakítására, ami a szokásos és rekombináns állati vírusvakcináknál előfordulhat.
3. Egyes növényi vírusok, így komovírusok kivételesen stabilak, amelynek következtében a tisztított készítmény szárítható, és szobahőmérsékleten éveken keresztül a hatékonyság csökkenése nélkül tárolható. Ez a tulajdonság lehetővé teszi lassan felszabaduló vakcina kialakítását, és így az immunitás fenntartásához szükséges injekciók számának csökkentését.
4. Az állatok általában nem kerülnek kapcsolatba növényi vírusokkal, és ezért nem rendelkeznek antitesttel a vektor ellen, ami fokozza az összetett vakcina hatékonyságát.
5. A növényi vírusok kisebbek, mint a korábban vektorként, így vakcinaként alkalmazott állati vírusok legtöbbje, és így a kimér gén bevitele homológ in vivő rekombináció (transzfekció) helyett in vitro manipulációval megvalósítható.
A rendszer bemutatására példaként a növényi vírusok közé tartozó tehénborsó-mozaikkomovírust (CPMV) választottuk. A CPMV háromdimenziós szerkezetét atomfelbontással határozzuk meg, ami lehetővé teszi a részecskék szerkezetének elroncsolása nélküli módosításra alkalmas helyek azonosítását.
A találmány széles körű alkalmazhatóságának igazolására három különböző állati vírusantigén helyeit alkalmazzuk. Két vírus az állati vírusok pikomavírus-csoportjába tartozik, ez a száj- és körömfájásvírus (FMDV) és a humán rinovírus (HRV). Ebbe a csoportba több fontos patogén tartozik, így az FMDV, a poliomielitisz (polio) és a hepatitisz A.
A harmadik kiválasztott vírus a humánimmunhiányvírus (HÍV), amely semmi hasonlóságot nem mutat az ismert növényi vírusokkal, és amelyre hatékony vakcinát eddig nem állítottak elő.
A találmány szerinti megoldás részletes ismertetését a következő ábrák segítik elő:
Az 1. ábra az egyszerű T=3 vírus, pikomavírus és komovírus fehérjeköpenye szerkezetének összehasonlítását mutatja. Mindhárom esetben egy trapezoid egy β-hengert jelöl. Ennek megfelelően a homovírus nagy burokfehérjéje (L vagy VP37) két kovalens kötésű βhengerből áll, amelyek ekvivalensek a T = 3 vírus C és B típusú alegységével, vagy a pikomavírus VP2 és VP3 részével. A kis burokfehérje (S vagy VP23) egyetlen β-hengerből áll, amely megfelel a T=3 vírus A típusú alegységének vagy a pikomavírus VP1 részének.
A 2. ábra egy hiteles β-henger szekunder szerkezetét és kapcsolódásait mutatja. A β burok egyedi szálait B-G betűkkel jelöljük, és megjelöljük továbbá a fehérje aminoterminális és karboxiterminális részét.
A 3. ábra a pPMM2902 plazmidot (A) és a pBT7-123 plazmidot (B) mutatja. A vonalkázott részek a plazmid CPMV-specifikus szakaszait jelölik, ahol a kódolószakaszokat a szélesebb részekkel azonosítjuk, ahol megjelöljük a vírus által kódolt különböző fehérjéket. Jelöljük továbbá a releváns restrikciósenzim-helyeket is. A plazmid szerkezetének részletes leírását Holness és munkatársai (1989), valamint Dessents és Lomonossoff (1991) idézett művei tartalmazzák.
A 4. ábra a CPMV M RNS azon szakaszát mutatja, amely a VP23 aminoterminális 40 aminosavát kódolja. A nukleotidszekvencia alatt megadott számok az M RNS-szekvenciára vonatkoznak, és jelöljük az egyedi Nhel hasítóhely elhelyezkedését. A VP23 βΒ és βί’ szálainak kialakításában részt vevő aminosavakat a fehérje aminosavszekvenciája felett a szokásos egybetűs kódokkal jelöljük.
Az 5. ábra a pFMDV kialakításához alkalmazott oligonukleotid nukleotidszekvenciáját (A) és a felső (pozitív) szál által kódolt aminosavszekvenciát, valamint a VP23 szerkezetét (B) mutatja az FMDV-specifikus oligonukleotídok inszertálása után. A nyíllal megjelölt szakasz a beépített FMDV-epitóp kiterjedését mutatja. A klónozás során sértetlenül megmaradt Nhel helyet xNhel jellel jelöljük. Jelöljük továbbá a bevitt szekvenciában található diagnosztikai Bgll 1 helyet.
A 6. ábra a pFMDV-plazmid szerkezetét mutatja. A különböző CPMV-specifikus szakaszokat a 3. ábrához hasonló módon jelöljük. A VP23-ba beépített FMDV-specifikus szakaszt a CPMV-specifikus kódolószakaszban található fekete szegmens mutatja.
A 7. ábra a pMT7-601 plazmidot mutatja. A különböző CPMV-specifikus szakaszokat a 3. ábrához hasonló módon jelöljük. Jelöljük továbbá a releváns hasítóhelyeket.
A 8. ábra egy „helyettesítő” vektor szerkezetét mutatja, amit helyspecifíkus mutációval állítunk elő. A csillag azt a D csoportot jelöli, amelyet helyspecifikus mutációval C csoportra cserélünk, és így új Aatl 1 helyet képezünk.
A 9. ábra a pMT7-HÍV előállításához alkalmazott oligonukletidok nukleotidszekvenciáját és a felső (pozitív) szál által kódolt aminosavszekvenciát (A), valamint a VP23 szerkezetét (B) mutatja a HIV-specifikus oligonukleotidok beépítése után. A nyíllal jelzett szakasz a beépített HIV-epitóp kiterjedését mutatja. Jelöljük továbbá a bevitt szekvenciában található diagnosztikai Pvul helyet.
A 10. ábra a pMT7-HRV előállításánál alkalmazott oligonukleotidok nukleotidszekvenciáját és a felső (pozitív) szál által kódolt aminosavszekvenciát (A), valamint a VP23 szerkezetét (B) mutatja a HRV specifikus oligonukleotidok beépítése után. A nyíllal jelzett szakasz a bevitt HRV-epitóp kiterjedését mutatja. Jelöljük továbbá a bevitt szakaszban található diagnosztikai Clal helyet.
A 11. ábra a pMT7-HIV és pMT7-HRV plazmidok szerkezetét mutatja. A különböző CPMV-specifikus szakaszokat a 3. ábrához hasonló módon jelöljük. A VP23-ba bevitt HÍV- és HRV-specifikus szakaszokat a CPMV-specifikus kódolószakaszban található fekete szegmens jelöli.
A 12. ábra pMT7-FMDV-l és PBT7-123 átiratok elegyével inokulált öt tehénborsónövény leveleiből extrahált fehéijék (A-E mezők) Western foltanalízisét mutatja. A foltot az FMDV-epitópra specifikus szérummal vizsgáljuk. Az „utánzat” és „wt” mezők olyan levelek extraktumát mutatják, amelyeket vagy hamisan, vagy vad típusú CPMV RNS-sel inokuláltunk. A „vírus” jelölésű mező tisztított, vad típusú CPMV-t mutat. A markerfehérjék méretét a folt jobb oldalán mutatjuk be.
A komovírusok csoportja legalább tizennégy növényi vírusból áll, amelyek elsősorban hüvelyeseket fertőznek. A genom két darab egyszálú, pozitív irányítottságú, különböző méretű RNS-molekulából áll, amelyek egymástól elkülönítve mintegy 28 nm átmérőjű, izometrikus részecskékbe vannak beburkolva. A magfehér4 je-részecskék két típusát középső (M) és alsó (B) komponensnek nevezik a cézium-klorid-sűrűséggradiensben mutatott viselkedésük alapján. A részecskéken belüli RNS-molekulákat ennek megfelelően M RNS-nek és B RNS-nek nevezik. Mindkét részecsketípus azonos fehérje-összetétellel rendelkezik, és 60 másolat nagyméretű burokfehérjét (VP37) és kisméretű burokfehérjét (VP23) tartalmaznak. A magfehérje-részecskék mellett a komovírus-preparátumok különböző mennyiségű üres (csak fehérje-) burkolatot tartalmaznak, amit felső (T) komponensnek neveznek.
A komovírusok tipikus képviselőjénél, a tehénborsó-mozaikvírusnál (CPMV) ismert, hogy mind az M, mind a B RNS poliadenilezett formában fordul elő, és 5’-terminális részén kovalens kötéssel kapcsolódó kis fehérjét (VPg) hordoz. Más komovírusoknál végzett, általános jellegű vizsgálatok alapján feltételezik, hogy ez a jellemző a csoport minden tagjának RNS-ében előfordul. A CPMV esetében mindkét RNS-t szekvenálták, és kimutatták, hogy az M RNS 3481, és a B RNS 5889 nukleotidból áll a poli(A) farok kivételével [Van Wezenbeek és munkatársai (1983); valamint Lomonossoff és Shanks (1983) idézett művei]. Mindkét RNS egyedi, hosszú, nyílt leolvasókeretet tartalmaz, a vírusgéntermékek kifejezése nagy prekurzorpolipeptidek szintézisén és ezt követő lehasításán keresztül valósul meg. Bár a teljes növény fertőzéséhez mindkét RNS-re szükség van, a nagyobb B RNS a protoplasztban önálló replikációra képes, de ebben az esetben vírusrészecskék nem termelődnek [Goldbach és munkatársai (1980)]. Ez a megfigyelés a korábbi genetikai vizsgálatokkal együtt megalapozza azt a feltételezést, hogy a burokfehérjéket az M RNS kódolja.
A CPMV 3,5 angström méretű elektronsűrűség-térképe szerint egyértelmű rokonság van a CPMV és a T=3 növényi vírusok, így -rombuszvírusok, elsősorban paradicsom bokros növekedésvírus (TBSV), valamint szobemovírusok, elsősorban déli babmozaikvírus (SBMV) között. Ez utóbbi vírusok fehérjeköpenye 180 egyforma burokfehérje-alegységből épül fel, amelyek mindegyike egyedi β-hengerdomént tartalmaz. Ezek három különböző pozícióban (A, B és C pozícióban) kapcsolódhatnak a virionon belül (1. ábra). A CPMV két burokfehérjéje három különböző β-hengerdomént tartalmaz, amelyek közül kettő a VP37 részből és egy a VP23 részből származik. így a T=3 vírusokhoz hasonlóan mindegyik CPMV-részecske 180 β-hengerszerkezetből áll. A VP23 egyetlen doménje a TBSV és SBMV A típusú alegységéhez hasonló pozíciót, míg a VP37 N- és C-terminális doménje a megfelelő C és B típusú alegységekkel azonos pozíciót vesz fel (1. ábra).
A CPMV és a csoporthoz tartozó egy másik vírus a babhüvelyfoltosodás-vírus (BPMV) kristályainak röntgendiffrakciós analízise szerint a BPMV és a CPMV háromdimenziós szerkezete nagyon hasonló, és általában a komovíruscsoportra jellemző.
A CPMV és a BPMV szerkezetében mindegyik βhenger lényegében nyolc szál antiparallel β-burkolatot tartalmaz, amelyek különböző hosszúságú burkokkal kapcsolódnak egymáshoz. A szálak kapcsolódását és nómenklatúráját a 2. ábra mutatja. A lapos β-burkolatokat B, C, D, E, F, G, H és I burkolatoknak nevezzük, míg az összekötő hurkokat βΒ-βΕ, βϋ-βΕ, βΡ-βϋ és βΗ-βΙ hurkoknak nevezzük.
A komovírusok szerkezete rokonságban van az állati pikomavírusok szerkezetével is. A pikomavírusok fehérjeköpenye 60 másolatban előforduló három különböző burokfehérjéből (VP1, VP2 és VP3 fehérjéből) áll, amelyek mindegyike egyetlen β-hengerdomént tartalmaz. A komovírusokhoz hasonlóan ezek a burokfehérjék a prekurzorpoliprotein hasításával szabadulnak fel, és VP2-VP3-VP1 sorrendben szintetizálódnak. A CPMV és a pikomavírus háromdimenziós szerkezetének összehasonlításából adódik, hogy a VP37 N és C terminális doménje ekvivalens a VP2 és VP3 megfelelő részeivel, míg a VP23 ekvivalens a VPl-gyel (1. ábra). A strukturális pozíciók és a génsorrend ekvivalenciája arra utal, hogy a VP37 a két pikomavírus burokfehérje, a VP2 és VP3 fehérje hasítatlan formájának felel meg.
A komovírusok és a pikomavírusok közötti lényeges különbségek egyike, hogy a komovírus fehérjealegységei nem tartalmazzák azokat a nagyméretű inszertált szakaszokat, amelyek megtalálhatók a pikomavírus β-hengereinek szálai között, bár a részecskék alapvető felépítése nagyon hasonló. A β-burkolatok közötti négy hurok (βΒ-βΰ, βϋ-βΕ, [IF-fiG és βΗ-βΙ, lásd a 2. ábrát) nem kritikus a virionok strukturális integritásának fenntartása szempontjából, de a találmány értelmében az idegen peptidszekvenciák, így állati vírusokból származó antigénhelyek kifejeződési helyeként felhasználhatók.
A CPMV-vírus módosítását az alábbiak szerint végezzük.
A CPMV-hez tartozó burokfehérjébe történő inszertálás érdekében szükség van egy olyan eszközre, amely lehetővé teszi a vírus genomjának manipulálását. A pPMI transzkripciós vektorban megtalálható a CPMV M RNS-ének teljes hosszúságú cDNS-klónja (pPMM2902, 3A. Ábra) [Ahlquist és Janda (1984); Holness és munkatársai (1989); valamint Holness (1989)]. Kimutattuk, hogy a pPMM2902 átiratai sokszorosíthatók, ha megfelelően tisztított virion B RNS jelenlétében tehénborsó mezofil protoplasztba visszük be elektroporációval. Ez lehetővé teszi a vírushoz tartozó burokfehérjék módosítását a szaporodás és a vírus megfelelő illeszkedésének megzavarása nélkül.
Mivel fennáll annak a veszélye, hogy a virionból a pPMM2902 vírusos replikációjához szükséges fehétjék előállítása érdekében tisztított B RNS-szennyeződésként vad típusú M RNS-t tartalmaz, előállítottuk a pBT7-123 B RNS-ének teljes hosszúságú cDNS-klónját (3B. ábra). A B RNS teljes hosszúságú másolata közvetlenül a módosított T7 promoter alatt található. Miül restrikciós enzimmel végzett linearizálás után T7 RNS-polimerázzal a természetes B RNS-sel azonos méretű átiratok szintetizálhatok. A pPMM2902 és pBT7-123 átiratainak elegyét elektroporációval tehénborsó-protoplasztba bevive teljes vírusfertőzést kapunk, vagyis az elegy helyettesíti a természetes B RNS-t.
Az idegen peptid beépítéséhez a VP23-ban található βΒ-βΕ hurkolt választottuk. Ez a hurok tisztán megkülönböztethető a vírusrészecske felületén, és a komputeres modellezés szerint ezen a helyen akár nagyméretű hurok beépítése sem befolyásolja a fehérjeköpeny szerkezetéért és stabilitásáért felelős szomszédos alegységek közötti kölcsönhatást. Ez a hurok egy egyedi Nhel helyet tartalmaz az M RNS-specifikus szekvencia 2708-as helyén, ahova az idegen szekvencia beépíthető (4. ábra).
Állati vírusok elleni vakcina találmány szerinti előállításának bemutatására a pikomavírusokhoz tartozó száj- és körömfáj ás vírus (FMDV) és humán rinovírus (HRV), valamint a lentiretrovírusok közé tartozó humán immunhiányvírus (HÍV) antigénhelyeit alkalmazzuk.
Az FMDV-hurokfehérje egy szegmensét kódoló DNS-inszertet tartalmazó CPMV M RNS teljes hosszúságú cDNS-klónjának, vagyis a pFMDV-plazmid előállítását és szerkezetét az alábbiakban ismertetjük.
Az „FMDV hurok”-nak a CPMV VP23 részének βΒ-βϋ hurokjába történő beépítéséhez két, egyenként 81 maradékból álló komplementer oligonukleotidot szintetizálunk kémiai úton. Ezek szekvenciáját az 5A. ábra mutatja. A pozitív irányítottságú oligonukleotid tartalmazza a BFS 1860 törzsbe tartozó O[ szerotípusú FMDV VP1 részének 136-160 aminosavmaradékát kódoló szekvenciát. Az oligonukleotidok nukleotidszekvenciájának kialakítása során figyelembe vettük a CPMV-ben preferált kodonokat, és a vizsgálat elősegítése érdekében a szekvencia közepén található Bglll helyet. Összekapcsolás után az oligonukleotidok Nhel kompatibilis véggel rendelkező, kétszálú DNS-szekvenciát adnak. Az oligonukleotidok ezért a pPMM2902 egyedi Nhel helyére inszertálhatók. A VP23-ból származó szekvenciába történő inszertálás hatását az 5B. ábra mutatja. Az FMDV-hurok beépülésének elősegítése érdekében az FMDV-specifikus oligonukleotidokat a pPMM2902 M13 szubklónjába ligáljuk, amely tartalmazza a VP23 részt kódoló szekvenciát. Ez lehetővé teszi az FMDV-specifikus szekvenciát hordozó kiónok szekvenciaanalízissel történő egyszerű azonosítását. A szokásos DNS-manipulációkat Maniatis és munkatársai (1982) idézett műve szerint végezzük. A pFMDV kialakítását az alábbiakban részletezzük, és a 6. ábrán mutatjuk be.
1. lépés
A pPMM2902 plazmidot Sstl restrikciós enzimmel emésztjük, amely a CPMV M RNS-specifikus szekvenciáját a 2296 és 3423 pozícióknál kétszer hasítja, de nem hasítja a pPMl plazmid szekvenciáját. Agarózgélelektroforézis után a gélről elektroelúcióval egy nagy (6,0 kb) és egy kis (1,1 kb) fragmenst tisztítunk. Az
1,1 kb Sstl fragmenst az M13mpl8 bakteriofágból származó DNS Sstl-gyel emésztett és foszfatázzal kezelt replikátumába ligáljuk. A ligálóeleggyel M101 E. coli törzset transzformálunk a kalcium-klorid-eljárással. Az M RNS 1,1 kb Sstl fragmensét tartalmazó plakkokat Lac komplementációs vizsgálattal és DNS-szekvenciaanalízissel azonosítjuk, és a további munkához kiválasztunk egy plakkot, az M13-JR1 plakkot.
2. lépés
Az M13—JR1 DNS-ének kétszálú replikátumát izoláljuk a fertőzött JM101 E. coli törzs sejtjeiből, Bimbóim és Doly (1979) módszerével. A tisztított DNS-t Nhel restrikciós enzimmel végzett emésztéssel linearizáljuk, és a linearizált plazmidot boíjúbélfoszfatázzal kezeljük. Az FMDV-ből származó VP1 136-160 aminosavmaradékait kódoló, és Nhel kompatibilis végekkel rendelkező két oligonukleotidot ATP-vel foszforilezzük polinukleotid-kináz alkalmazásával, és forralással és lassú hűtéssel összekapcsoljuk. Az összekapcsolt oligonukleotidokat Nhel enzimmel emésztett Ml3-JR 1-be ligáljuk, a ligálóeleggyel JM101 E. coli törzset transzformálunk, és a transzformálóelegyet JM101 alapon lemezre visszük. A lemezen nagyszámú plakk található, amelyek közül húszat kiválasztunk a szekvenciaanalízishez. A bakteriofágot JM101 alapon elszaporítjuk, és az egyszálú DNS-t Sanger és munkatársai (1980) módszerét pontosan követve izoláljuk. A bakteriofág DNS-nek az Nhel hely körüli nukleotidszekvenciáját Biggin és munkatársai (1983) szerint módosított didezoximódszerrel határozzuk meg primerként az M RNS-szekvencia 2735-2752 nukleotidjaival komplementer 18mer (5’ AGT-TAC-TGC-TGT-AAC-GTC-3 ’) alkalmazásával. A vizsgált plakkok közül egy, az M13-ushal jelű, egyetlen másolatban tartalmazza a megfelelő orientációjú kívánt szekvenciát.
3. lépés
Az M13-ushal-et JM101 E. coli törzsben elszaporítjuk, és a DNS replikátumát a fertőzött sejtekből Bimbóim és Doly (1979) módszerével izoláljuk. A DNS-t Sstl enzimmel emésztjük, és az 1,1 kb fragmenst agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a fragmenst a pPMM2902 plazmidból származó nagyméretű (6,0 kb) Sstl fragmenshez (lásd fent) ligáljuk, amit boíjúbélfoszfatázzal kezeltünk. A ligálóeleggyel JM83 E. coli törzset transzformálunk a kalcium-klorid-módszerrel. A transzformálóelegyet 100 pg/ml karbenicillint tartalmazó L-agar lemezekre visszük, és a lemezeket egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. További vizsgálatokhoz tizenkettő, karbenicillinrezisztens telepet szelektálunk. A telepeket 1 ml L-táptalajon tenyésztjük, plazmid „minipreps” preparátumot készítünk, és restrikciós enzimes emésztéssel analizáljuk. Az Sstl, Bglll és EcoRV enzimekkel végzett emésztéssel kapott mintából következik, hogy négy telep tartalmazza a teljes hosszúságú CPMV-klónt, amely megfelelő orientációban magában foglalja az FMDV-specifikus oligonukleotidok szekvenciáját. Ezek egyikét, a pFMDV-t nagy mennyiségben elszaporítjuk, és a plazmid DNS-t Bimbóim és Doly (1979) módszerével izoláljuk, majd centrifügálással cézium-klorid/etidium-bromid gradiens mellett tisztítjuk [Maniatis és munkatársai (1982)].
A pFMDV-átiratok tulajdonságait az alábbiak szerint vizsgáljuk:
1. Tisztított pFMDV DNS-t EcoRI enzimes emésztéssel linearizálunk, majd a pPMM2902 vonatkozásában Holness és munkatársai (1989) által leírt módon E. coli RNS-polimeráz alkalmazásával átírjuk. A terméket
HU 218 010 Β formaldehidet tartalmazó agarózgélen [Lehrach és munkatársai (1977)] elektroforézissel vizsgálva igazoljuk az autentikus vírus-M RNS-sel együtt migráló átiratok jelenlétét.
2. DNAsel enzimes kezelés után a templát DNS-t lítium-kloriddal kicsapjuk, majd az átiratokat in vitro közléstől függő nyúlretikulocita-rendszerre [Pelham és Jackson (1976)] visszük át 35S-metionin jelenlétében. A termékeket SDS-t tartalmazó poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel [Laemmli (1970)] vizsgáljuk, és a szárított gélen autoradiográfiásan láthatóvá tesszük. Az autoradiogram igazolja két, 105 kDa és 95 kDa méretű fehérje jelenlétét, amelyek együtt migrálnak a természetes M RNS transzlációs termékével.
3. A pFMDV-átiratok azon képességét, hogy növényi sejtekben szaporodnak-e, a következő kísérlettel ellenőrizzük.
Tehénborsó mezofil protoplasztot állítunk elő Varennes és munkatársai (1985) módszerével. A pFMDV-átiratokat pBT7-123-ból (teljes hosszúságú B RNS-másolatot tartalmazó plazmid) származó átiratokkal keverjük, és Holness és munkatársai (1989) módszerével elektroporációval bevisszük a protoplasztokba. Kontrollként a protoplasztok ugyanazon készítményének egy mintáját pBT7-123 és pPMM2902 átiratok elegyével elektroporáljuk. 72 óra elteltével a protoplasztokat összegyűjtjük, a nukleinsavakat de Varennes és munkatársai (1985) módszerével extraháljuk, az RNS mintákat formaldehidtartalmú agarózgélen [Lehrach és munkatársai (1977)] elektroforetikusan vizsgáljuk, és a nukleinsavak foltjait Hybond N membránokra (Amersham International) visszük át. A nukleinsavakat UV-fénnyel történő besugárzással keresztkötéssel rögzítjük a membránon. A membránokat M RNS-szekvenciákra vizsgáljuk az M RNS 482-2211 nukleotidjainak megfelelő pPMM2902-ből származó Hindi 11 fragmens alkalmazásával, amit előzetesen Feinberg és Vogelstein (1983) módszerével 32P-vel jelöltünk. A pBT7-123-mal és/vagy pPMM2902-vel vagy pFMDV-l-gyel elektroporált protoplasztok mintám az M RNS-specifikus szekvenciák kimutathatók, ami igazolja, hogy az FMDVhurkot kódoló szekvencia jelenléte nem gátolja az átirat replikációját. Annak ellenőrzése érdekében, hogy a pFMDV-replikáció során keletkező utódok megtartják az FMDV-hurkot kódoló szekvenciát, a replikációs membránokat pozitív irányítottságú FMDV-oligonukleotiddal vizsgáljuk, amit előzetesen „oligo jelöltünk” [Feinberg és Vogelstein (1983)], amelynek során a pozitív irányítottságra specifikus próbát kapunk. A pBT7-123 és pFMDV-átiratok elegyével elektroporált protoplasztok mintái a várt helyen az M RNS-re utaló egyértelmű jelet adnak, míg a pPMM2902 kontrolinál a jel hiányzik.
4. Annak igazolására, hogy az FMDV-hurkot tartalmazó fehérjealegységek virionná illeszkednek össze, a fertőzött protoplasztokból származó extraktumokban immunoszorbens elektronmikroszkopikusan vizsgáltuk vírusrészecskék jelenlétét. A pBT7-123 és pFMDV-átiratok elegyével elektroporált protoplasztok mintáját egy 23-as méretű tűn történő többszöri áthajtással roncsoljuk. Az extraktumokat Eppendorf-mikrocentrifugában centrifugáljuk, és a felülúszót vizsgáljuk. A felülúszó 10 μΐ-es részletét anti-CPMV-antiszérummal bevont arany elektronmikroszkópos (em) rácsokkal inkubáljuk. Mosás és uranil-acetáttal végzett megfestés után a rácsokat JEOL 1200 elektronmikroszkóppal vizsgáljuk. 28 nm átmérőjű részecskék láthatók, amelyek a CPMV-virionok jellemző megjelenési formáját mutatják. Ez igazolja, hogy az FMDV-huroknak a VP23-ban való jelenléte nem befolyásolja a vírus illeszkedését.
Az alábbiakban azt vizsgáljuk, hogy a találmány szerint módosított növényi vírus képes arra, hogy növényi protoplasztba elektroporálva szaporodjon és vírusrészecskékké illeszkedjen. Nagy mennyiségű módosított növényi vírus előállításához olyan szerkezetet kell előállítani, amely közvetlenül a teljes növénybe inokulálható, és amely a fenti protoplasztrendszerhez hasonlóan a növényben is szaporodik és vírusrészecskékké illeszkedik. A pPMM2902 plazmidot ezért úgy módosítjuk, hogy a kapott átirat 5’-végén egy „fedél”-szerkezetet tartalmaz, és az RNS-szintézist egy sokkal hatékonyabb promoterrel irányítjuk. A pPMM2902 módosításának lépéseit, amelynek során pMT7-601 (7. ábra) keletkezik, az alábbiakban részletezzük.
A teljes tehénborsónövény fertőzésére alkalmas rendszer kialakításához először pMT7-601 plazmidot állítunk elő. Ehhez a következő lépéseket végezzük el:
1. Tisztított CPMV M RNS-ből egyszálú cDNS-t állítunk elő Lomonossoff és munkatársai (1982) módszerét követve, amelynek során primerként pdT12_18-at alkalmazunk. A második szál szintézise során primerként a következő oligonukleotidot alkalmazzuk:
Pstl T7 promoter M RNS 5’-vége ’ CCCTGCAGTAATACGACTCACTATAGTATTAAAATCTTAATAG
A szintézis körülményeit Lomonossoff és munkatársai (1982), valamint Shanks és munkatársai (1986) ismertetik.
2. A kétszálú cDNS-t Pstl és BamHl restrikciós enzimekkel emésztjük (mely utóbbi az M RNS szekvenciát az 1504 pozíciónál hasítja), és az 1,5 kb Pstl/BamHl fragmenst Pstl és BamHl enzimekkel emésztett M13mp 18-ba ligáljuk. A ligálóeleggyel JM101 E. coli törzset transzformálunk. Az inszerteket hordozó rekombináns fágokat Lac komplementációs vizsgálattal azonosítjuk, és a megfelelő inszert jelenlétét „T-track” analízissel [Sanger és munkatársai (1980)] ellenőrizzük Biggin és munkatársai (1983) módosításai szerint. A további analízishez egy kiónt, az M13-MT7-6 kiónt szelektáljuk, és az M RNS-specifikus szekvencia 5'-terminális 200 nukleotidját Biggin és munkatársai (1983) módszerével szekvenáljuk, ami az eredmények szerint azonos a pPMM2902 ekvivalens szekvenciájával.
3. A kétszálú replikációs DNS-t izoláljuk az M13-MT7-6 kiónnal fertőzött JM101 E. coli törzs sejtjeiből, amit Bimbóin és Doly (1979) módszerével végzünk. A kétszálú DNS-t Pstl és Bglll enzimekkel
HU 218 010 Β emésztjük, amely utóbbi az M RNS-szekvenciát a 189 pozíciónál hasítja, és a 200 bp fragmenst elektroforézissel és az agarózgélről végzett elektroelúcióval [Maniatis és munkatársai (1982)] szabadítjuk fel és tisztítjuk.
4. A pPMM2902 plazmidot [Holness és munkatársai (1989)] Pstl és Bgll 1 enzimekkel emésztjük, és így
1,1 kb 6,0 kb DNS-fragmenseket állítunk elő. A kisebb,
1,1 kb fragmens a CPMV M RNS-szekvencia első 189 nukleotidjához kapcsolódva E. coli promoterszekvenciát, míg a nagyobb, 6,0 kb fragmens a Puc9-hez kapcsolódva a maradék M RNS-szekvenciát tartalmazza. Az emésztett elegyet borjúbélfoszfatázzal kezeljük, és a két fragmenst agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk, majd a 6,0 kb fragmenst elektroelúcióval feltárjuk.
5. Az M13-MT7-6 200 bp Pstl/Bgll 1 ffagmensét a pPMM2902 6,0 kb ffagmensével ligáljuk [Maniatis és munkatársai (1982)], és az eleggyel JM83 E. coli törzset transzformálunk. Azonosítjuk a karbenicillinrezisztens telepek számát, és egyet, a pMT7-601 jelűt, vizsgálva ellenőrizzük a kívánt szerkezetet. A pMT7-601 plazmidot a pFMDV-plazmidnál leírt módon nagy mennyiségben előállítjuk.
6. A pMT7-601 plazmid EcoRl enzimmel végzett linearizálás után T7 RNS-polimerázzal átírható, és így olyan RNS-t kapunk, amely formaldehidtartalmú agarózgélen [Lehrach és munkatársai (1977)] végzett analízis szerint méretében azonos a természetes virion M RNS-sel. Az átírás kitermelése mintegy 1 pg teljes hosszúságú M átirat 1 pg linearizált templát DNS-re vonatkoztatva.
7. A pMT7-601 és pBT7-123 plazmidok T7 átiratainak elegyét tehénborsó mezőül protoplasztba elektroporáljuk, az utód RNS-eket Northern foltanalízissel vizsgáljuk, amely igazolja, hogy a pMT7-601 átiratai biológiailag aktív származékok. A protoplaszt izolálását és a nukleinsav analízisét a pFMDV biológiai tulajdonságainak analízisénél használt módszerekkel végezzük.
Lezárt pBT7-123 és pMT7-601 átiratok elegyének tehénborsónövényre gyakorolt fertőzőképességének vizsgálatához a pBT7-123 és pMT7-601 mintáit Miül és EcoRl enzimekkel linearizáljuk. A linearizált templátok egy részét T7 RNS-polimeráz segítségével GpppG jelenlétében átírjuk Ziegler-Graaf és munkatársai (1988) módszerével. A transzkripciós reakcióelegy 0,1 mg/ml linearizált DNS templátot, 40 mmol/1 Trisz-HCl-t (pH = 8,0), 25 mmol/1 NaCl-ot, 8 mmol/1 MgCl2-ot, 2 mmol/1 spermidin-hidrokloridot, egyenként 0,5 mmol/1 UTP-t, ATP-t és CTP-t, 0,025 mmol/1 GTP-t, 0,5 mmol/1 GpppG-t, 0,05 mg/ml BSA-t, 10 mmol/1 DTT-t, 200 egység/ml RNS-guard-t tartalmaz, és az átírást 1400 egység/ml végső koncentrációban T7 RNS-polimeráz hozzáadásával indítjuk. Az elegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A 30, 60 és 90 perces részletekhez (5 pl 1 ml transzkripciós reakcióelegyre vonatkoztatva) 5 mmol/1 GTP oldatot adunk az elegyhez. Az átírás után 15 mmol/1 végső koncentrációban EDTA-t adagolunk, és az átiratokat formaldehidtartalmú agarózgélen végzett elektroforézissel ellenőrizzük. A transzkripciós elegyet 2 térfogatrész fenol/kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével extraháljuk, és a nukleinsavakat etanollal kétszer kicsapjuk. A nukleinsavakat centrifugálással összegyűjtjük, etanollal mossuk, és vákuumban szárítjuk. Ezután 5 mmol/1 Trisz-foszfátban (pH=8,0) oldjuk a növény inokulálásához.
napos tehénborsónövény (Vigna unguiculata var. Califomia blackeye) primer leveleit megszórjuk szilícium-karbid-porral, és a pMT7-601 és pBT7-123 plazmidokból származó átiratok 1:1 tömegarányú elegyével enyhén bedörzsöljük. Az átiratokat különböző koncentrációkban alkalmazzuk, de a végső inokulum térfogata minden esetben 50 pl. A kapott eredmények szerint, ha az egyes átiratokat 5 pg összmennyiségben alkalmazzuk primer levelenként, akkor az inokulált növények 100%-osan mutatják a CPMV-fertőzés szimptómáit. A CPMV-specifikus szekvenciák jelenlétét az inokulált és a felső levelekben „Dót biot” analízissel ellenőrizzük. Az inokulált levelekből és a hármas levelekből mintát veszünk egy 10-es számú magfúróval, maceráljuk, és 0.4 ml 10 mmol/1 nátrium-foszfáttal extaháljuk. A mintákat centrifugáljuk, és 5 pl felülúszót 20XSSC-vel előnedvesített nitro-cellulóz-szűrőre visszük. A nukleinsavat keresztkötésekkel a membránhoz kötjük UV-fénnyel történő besugárzás segítségével, majd az M RNS specifikus szekvenciákat 32P „oligojelölt” [Feinberg és Vogelstein (1983)] próbával vizsgáljuk, amely az M RNS-szekvencia 482-2211 nukleotidjait tartalmazza. A hibridizálást és a szűrőről való lemosást Maniatis és munkatársai (1982) módszerével végezzük. Szárítás után a szűrőt autoradiográfiásan vizsgáljuk. Az erős hibridizációs jel a CPMV-specifikus szekvenciák jelenlétére utal.
A pMT7-FMDV-I előállításához a pMT7-601 és pFMDV-plazmidókat Sstl restrikciós enzimmel emésztjük, és a pMT7-601 emésztésével kapott ffagmenseket borjúbélfoszfatázzal kezeljük. Az Sstl enzim mindkét plazmidot az M RNS-specifikus szakasz 2296 és 3423 pozíciójában hasítja, és így 1,1 kb fragmens keletkezik. Mint fent említettük, ez az Sstl fragmens tartalmazza azt a VP23 szakaszt, amely körbefogja a βΒ-βϋ hurkot, ahol az FMDV-hurkot inszertáltuk. Agarózgélen végzett elektroforézis után a pFMDV 1,1 kb ffagmensét és a pMT7-601 5,1 kb ffagmensét, amely körbeveszi a vektorszekvenciát, és az M RNS-specifikus szekvencia maradék részét elektroelúcióval feltáljuk. A két Sstl fragmenst összekapcsoljuk, és az elegyet JM83 E. coli törzsbe transzformáljuk. A karbenicillinrezisztens telepek számát feljegyezzük, majd „minipreps” után a plazmid DNS-t restrikciós enzimes emésztéssel vizsgálva azonosítjuk az FMDV-hurkot tartalmazó rekombinánsokat. Az egyik ilyen kiónt azonosítottuk, és pMT7-FMDV-I jellel jelöltük, és nagy mennyiségben előállítottuk. A DNSmanipulációkat a pFMDV és pMT7-601 előállításánál ismert módon végeztük.
Mind a pFMDV, mind annak származéka, a pMT7-FMDV-I egyenesen előre irányulva inszertálódik a VP23 βΒ-βΩ hurokjába. Annak érdekében, hogy korlátozzuk a huroknak az idegen szekvencia beépítésének hatására bekövetkező méretnövekedését, egy helyettesítő vektort állítunk elő, ahol az idegen szekvencia inkább helyettesíti a VP23 természetes βΒβC hurkát, mint hogy ahhoz hozzáadódjon. A CPMV
HU 218 010 Β genomjának a VP23-at kódoló szakasza nukleotidszekvenciájában a 2740 pozíciójú néma bázist kicserélve (U helyett C) egy egyedi Aatll helyet kapunk a 27. valinaminosavnál. Az M RNS szekvenciájában végrehajtott cserét a 8. ábra mutatja. Az Aatl 1 hely kialakítása lehetővé teszi azt, hogy a CPMV természetes βΒPC hurkából Nhel és Aatl 1 enzimekkel végzett emésztéssel hat aminosavat kódoló nukleotidszekvenciát eltávolítsunk. A szekvencia ezután bármely, Nhel- és Aatl 1-kompatibilis véggel rendelkező szekvenciával helyettesíthető.
A mutált M RNS-szekvencia Nhel és Aatl 1 helyei között található szekvencia helyettesítésére két különböző szekvenciát állítunk elő. A VP23-ba beépítendő első szekvencia a humánimmunhiány-vírusból (H1V-1) származó gp41 transzmembrán-glikoprotein 735-752 maradékát kódoló oligonukleotidot tartalmazza. A fenti szakasz vonatkozásában szintetikus pepiidként választott szekvencia enzimmel összekapcsolt immunoszorbens vizsgálatban (ELISA) AlDS-szeropozitív betegekből származó antiszérum által kerül felismerésre, és különböző H1V-1 izolátumok semlegesítésére alkalmas antitesteket indukál [Kennedy és munkatársai (1986); Chanh és munkatársai (1986); Dagleish és munkatársai (1988)]. A második szekvencia a humán rinovírus 14-ből (HRV14) származó VP1 85-99 maradékát kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazza. Az oligonukleotidokat mindkét esetben úgy alakítottuk ki, hogy a vizsgálatokat gyorsító restrikciósenzim-helyekkel rendelkezzenek. Az oligonukleotidok szekvenciáját és a VP23 aminosavszekvenciájának helyettesítésével kiváltott hatást a 9. és 10. ábra mutatja. A pMT7-HIV és pMT7-HRV plazmidok előállításának lépéseit az alábbiakban részletezzük, és a 11. ábrán ábrázoljuk.
1. lépés
CJ236 E. coli törzsben M13-JR-l-et (6. ábra) szaporítunk el, és a dU-t tartalmazó egyszálú DNS-t Kunkel (1985) módszerével izoláljuk. A dU-t tartalmazó egyszálú Ml3-JR1 DNS-oligonukleotid specifikus mutációjával az M RNS-szekvencia 2740 pozíciójában T helyett C bázist viszünk be, amelyhez CTG-CTGTGA-CGT-CTG-AAA-A szekvenciájú prímért alkalmazunk. Az eljárást Kunkel (1985) módszerével végezzük. Ennek eredményeként M13-JRAatll kiónt kapunk. A mutációt az egyszálú DNS didezoxi-szekvenciaanalízisével [Biggin és munkatársai (1983)] és a kétszálú DNS-replikációs forma restrikciós enzimes emésztésével ellenőrizzük.
2. lépés
Az M13-JRAatll DNS-ének replikációs formáját izoláljuk, és Nhel és Aatl 1 enzimekkel emésztjük, végül borjúbélfoszfatázzal kezeljük. A 9. és 10. ábrán ábrázolt oligonukleotid-párokat ATP-vel foszforilezzük polinukleotid-kináz alkalmazásával, forralással és lassú lehűtéssel összekapcsoljuk, majd Nhel és Aatll enzimekkel emésztett M13-JRAatl 1-be Egáljuk. Az inszertált szekvenciát hordozó rekombináns M13 kiónokat a pFMDV esetében leírt módon az egyszálú bakteriofág DNS-szekvencia analízisével azonosítjuk. Két olyan kiónt, M13-HIV és M13-HRV, azonosítunk, amely tartalmazza a kívánt szekvenciákat, és izoláljuk a restrikciós enzimes emésztés után a várt fragmenseloszlást mutató kétszálú DNS-replikációs formát.
3. lépés
Az M13-HIV és M13-HRV DNS-ének replikációs formáját Sstl enzimmel emésztjük, és az 1,2 kb M RNS-specifikus fragmenst agarózgélen végzett elektroforézis után elektroelúcióval elválasztjuk. Az 1,2 kb fragmenseket a pMT7-FMDV-I előállításánál ismert módon a pMT7-601 nagyméretű Sstl fragmensébe ligáljuk. A ligálóeleggyel JM83 E. coli törzset transzformálunk, és szelektáljuk a karbenicillinrezisztens telepeket. Két klón, a pMT7-HIV és pMT7-HRV, restrikciós enzimes térképezés és nukleotidszekvencia-analízis szerint a kívánt szerkezetet mutatja.
A transzkripcióhoz a pMT7-HIV-et és pMT7-HRV-t EcoRl enzimes emésztéssel linearizáljuk. Az átírást T7 RNS-polimeráz alkalmazásával a pMT7-601 és pBT7-123 vonatkozásában ismertetett módon végezzük. A kapott átiratok mérete azonos a természetes virion RNS méretével.
Annak vizsgálatához, hogy a pMT7-FMDV-I és pMT7-HIV átiratok képesek tehénborsó-protoplasztokban szaporodni, a pMT7-601, pMT7-FMDV-I vagy pMT7-HIV in vitro átiratainak 10 pg-os mintáját a pBT7-123 átiratok 15 pg-os mintájával keverjük, és 106 tehénborsó mezofil protoplaszttal elektroporáljuk. Azonnal (0 óra) és 25 °C hőmérsékleten fény mellett 72 órán keresztül végzett inkubálás után mintát veszünk. A minták negyedéből extraháljuk a nukleinsavakat, és 1 % formaldehidet tartalmazó agarózgélen a fent leírt módon elektroforetikusan vizsgáljuk. A nukleinsavakat foltátvitellel Hybond N membránra visszük, UVsugárzással kialakított keresztkötésekkel rögzítjük, és a fent leírt módon CPMV vonatkozásában M RNS-specifikus szekvenciával vizsgáljuk. Minden esetben erős hibridizációs jelet kapunk az M RNS-nek megfelelő pozícióban a 72 órás mintában, ami hiányzik a 0 órás mintában, igazolva, hogy mind a négy szerkezet átirata szaporodik a tehénborsó-protoplasztban.
A protoplaszt minták fennmaradó háromnegyed részét a fent leírt módon roncsoljuk, és anti-CPMV-szérummal bevont elektronmikroszkóp-rácsra visszük. A rácsokat JEOL 1200 elektronmikroszkópon vizsgáljuk. A pMT7-601, pMT7-FMDV-I és pMT7-HIV átiratokkal elektroporált protoplasztok 72 órás mintájában nagyszámú részecske látható. Az eredmények azt igazolják, hogy a pMT7-FMDV-I és pMT7-HIV által kódolt módosított burokfehérjék virionná illeszkednek össze.
Annak vizsgálatához, hogy a pMT7-FMDV-I és pMT7-HIV átiratok képesek az egész tehénborsónövényben a pBT7-123-ból származó átiratok jelenlétében replikálódni, GpppG-vel lezárt átiratokat állítunk elő a fent leírt módon. 5 és 10 napos tehénborsónövényekből hat csoportot képezünk, és a fent leírt módon a kapott átiratokkal inokuláljuk. Az inokulátumok mennyiségét egy levélre vonatkoztatva az alábbiakban soroljuk fel.
HU 218 010 Β
1. csoport: utánzat 50 mmol/1 Trisz-foszfáttal, pH = 8,0
2. csoport: 1,5 pg természetes CPMV virion RNS
3. csoport: 5 pg pMT7-601 átirat és 5 pg pBT7-123 átirat
4. csoport: 5 pg pMT7-FMDV-I átirat és 5 pg pBT7-123 átirat
5. csoport: 5 pg pMT7-HIV átirat és 5 pg pMT7-123 átirat.
A szimptómákat naponta megfigyeljük, és minden növényből az inokulációt követő 11 nap elteltével levélszövetmintát veszünk „Dót biot” analízishez, amit a fent leírt módon végzünk. A 4. és 5. csoportba tartozó növényekről begyűjtjük a levélszövet maradékát, és a további felhasználáshoz lefagyasztjuk.
Az eredmények szerint az 1. csoportba tartozó növények egyikén sem jelentkezik szimptóma a fertőzést követő 11 nap elteltével, és a levélszövetben „Dót biot” analízissel CPMV-specifikus nukleinsav nem mutatható ki. Ez arra utal, hogy a vizsgálat során a tehénborsónövények véletlenszerű CPMV-fertőzése nem következett be. A 2. és 3. csoportba tartozó növények (virionRNS-sel vagy pMT7-601 és pBT7-123 átiratok elegyével inokulált növények) erős szimptómákat mutatnak az inokulált és a szisztémiás leveleken a fertőzést követő 7 nap elteltével. A levélszövetek „Dót biot” analízise igazolja nagy mennyiségű vírusspecifikus RNS jelenlétét mind az inokulált, mind a szisztémiás levelekben. Ez alátámasztja azt, hogy a kísérletben alkalmazott növények CPMV-fertőzésre fogékonyak akár virion-RNS, akár a vad típusú átiratok elegyének alkalmazásával.
A 4. csoportba tartozó növények (pMT7-FMDV-I átirattal inokulált növény) levelei a fertőzést követő 11 nap elteltével olyan foltosodást mutatnak, amelynek megjelenése eltér a vad típusú vírusfertőzés során normálisan jelentkező foltosodástól. Ez arra utal, hogy a pMT7-FMDV-I átiratai elszaporodnak, és sejtről sejtre az egész tehénborsónövényben szétterjednek.
Az 5. csoportba tartozó öt növény (pMT7-HIV átiratokkal fertőzött növények) közül négy szisztémiás levelein a fertőzést követő 11 nap elteltével jelentkeznek a szimptómák. A „Dót biot” analízis szerint a szimptómákat mutató növények lényeges mennyiségű vírusspecifikus szekvenciát tartalmaznak az inokulált és a szisztémiás levelekben. Ez arra utal, hogy a pMT7-HIV átiratai elszaporodnak, és elterjednek az egész tehénborsónövényben.
Annak igazolására, hogy a 4. csoportba tartozó növények inokulált leveleiben a módosított vírus burokfehérjéi szintetizálódnak, a levélszövet fagyasztott mintáját finoman porítjuk, és az egyik Laemmli mintapufferrel extraháljuk. Az extraktumokat 15% poliakrilamid SDS gélen elektroforetikusan vizsgáljuk, és a fehérjéket Biorad szemi-száraz transzfer sejt alkalmazásával nitro-cellulóz-membránra visszük. A membránokat teljes CPMV vírusrészecskékkel szembeni szérummal vagy a VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(CG) szintetikus oligopeptiddel szembeni szérummal vizsgáljuk, ahol az oligopeptid az O[ FMDV törzsből származó VP1 141-160 maradékainak felel meg. Ez a szekvencia a pMT7-FMDV-ben a
VP23-ba inszertált epitópnak felel meg. Mindkét antiszérumot nyulakban fejlesztjük ki. Második antitestként lúgos foszfatázzal konjugált kecske antinyúl IgG-t alkalmazva Western foltanalízist végzünk. A 4. csoportba tartozó valamennyi növény fehérjeextraktuma reakcióba lép az anti-CPMV-szérummal, ami arra utal, hogy a 4. csoportba tartozó növények inokulált leveleiben szintetizálódnak a vírus burokfehérjéi. Ha ugyanezt a foltvizsgálatot anti-FMDV-oligopeptid-szérummal végezzük, egyetlen sáv jelentkezik a 4. csoportba tartozó növényekből kapott extraktumokban (11. ábra). Ez a sáv 24 kDa látszólagos móltömeggel migrálódik, ami pontosan megfelel az FMDV hurkot hordozó VP23 feltételezett méretének. Azonos méretű termék nem található a kontroll vak és a vad típusú CPMV-vel inokulált levelek extraktumában (11. ábra). Hasonlóképpen, a tisztított vad típusú CPMV-burokfehérjék reagálnak az FMDV-specifikus antiszérummal. Emellett, ha az anti-FMDV-szérumot a kialakításához alkalmazott pepiiddel előkezeljük, akkor megszűnik a 4. csoportba tartozó növények extraktumára gyakorolt reakció, ami az immunológiai reakció specifikusságát mutatja. Ezek az eredmények igazolják, hagy a
4. csoportba tartozó növények inokulált levelei tartalmazzák az FMDV-hurkot hordozó CPMV-burokfehérjéket.
Mint fent említettük, az 5. csoportba tartozó növények inokulált és szisztémiás leveleinek „Dót biot” analízise azt mutatta, hogy a pMT7-HIV átiratai szaporodnak és elterjednek az egész növényben. A kapott jelek szintje, és az a tény, hogy a fertőzés szisztémiásan folyik le, arra utal, hogy az RNS utódja betokosodik. Annak igazolására, hogy a HIV-specifikus inszert megmarad az RNS-utódban is, az 5. csoportba tartozó növények extraktumait „Dót biot” analízissel vizsgáljuk HIV-inszertre specifikus próbával. Ezt a pMT7-HIV előállításánál alkalmazott, pozitív irányítottságú oligonukleotid (9. ábra) oligojelölésével végezzük. Az eredmények szerint a HIV-szekvencia a szimptómákat mutató négy növény inokulált leveleiből kapott extraktumokban kimutatható.
A pMT7-FMDV-I átirataival kapott eredményeknek az FMDV epitópot hordozó CPMV-re történő kiterjesztése érdekében egyenként öt tehénborsónövényből öt csoportot képezünk, és a fent leírt módon előállított lezárt átiratokkal inokuláljuk az alábbiak szerint.
1. csoport: utánzat 50 mmol/1 Trisz-foszfáttal, pH = 8,0
2. csoport: 0,5 pg természetes CPMV virion-RNS
3. csoport: 5 pg GpppG-vel lezárt pMT7-601 és pBT7-123 átirat
4. csoport: 5 pg GpppG-vel lezárt pMT7-FMDV-I és pBT-123 átirat
A szimptómákat naponta vizsgáljuk. Az inokulálást követő 13 nap elteltével az egyes növényeken kiválasztunk egy inokulált levelet és egy hármas levelet, és ezekből hármaslevéllemez-mintát veszünk, és az alábbiak szerint kezeljük.
1. minta (nyershomogenizátum)
0,4 ml 10 mmol/1 nátrium-foszfát-pufferrel (pH = 7,0) homogenizáljuk, centrifugáljuk, és a felülúszót feltárjuk.
2. minta (RNS-extraktum)
Folyékony nitrogénben fagyasztjuk, finoman őröljük és a nukleinsavakat fenol/kloroform eleggyel extraháljuk. Etanolos kicsapás után a nukleinsavakat 0,1 ml vízben szuszpendáljuk.
3. minta (fehérjeextraktum)
Folyékony nitrogénben fagyasztjuk, finoman őröljük, és a port 0,1 ml IX Laemmli mintapufferben oldjuk.
„Dót biot” vizsgálathoz az 1. és 2. minta 5 ml-es alikvot részeit a CPMV M RNS 482-2211 nukleotidjaira specifikus, és a fent leírt módon előállított próbával (CPMV-specifikus próba), vagy az FMDV-specifikus inszertre specifikus próbával vizsgáljuk. Ez utóbbit az 5. ábra szerinti pozitív irányítottságú oligonukleotid oligojelölésével állítjuk elő. A 3. minta alikvot részével Western foltvizsgálatot végzünk a fent ismertetett FMDV-specifikus epitóppal próbálva. Az 1. minta alikvot részével ISEM-vizsgálatot végzünk.
Az 1. csoport növényein (kontrollként szolgáló utánzat) szimptómák nem fejlődnek ki. A nyers homogenizátum vagy RNS-extraktum „Dót biot” vizsgálata szerint sem az inokulált, sem a 3. levél extraktumával CPMV-specifikus vagy FMDV-specifikus szekvencia nem található. A nyershomogenizátum anti-CPMV-szérummal bevont elektronmikroszkopikus rácson végzett ISEM-vizsgálata vírusrészecskéket nem mutat ki. A fehérjeextraktum FMDV-specifikus szérummal végzett Western foltanalízise FMDV-epitópokat nem mutat ki. A kapott eredmények a további kísérletekhez negatív kontrollként szolgálnak.
A 2. csoportba (virion-RNS-sel inokulált) és a 3. csoportba (pMT7-601 és pBT7-123 eleggyel inokulált) tartozó valamennyi növény inokulált, és 3. levelén a fertőzést követő 7. napon kialakulnak a megfelelő szimptómák. A fertőzés utáni 11 nap elteltével a primer levelek sérülése eléri a 2-3 mm átmérőt. A nyershomogenizátum és az RNS-extraktum „Dót biot” analízise igazolja a CPMV-specifikus szekvenciák jelenlétét, de FMDV-specifikus szekvencia nem mutatható ki. Az anti-CPMV-szérummal bevont rácson végzett ISEMvizsgálat szerint mind az inokulált, mind a 3. levelek nyershomogenizátumában számos CPMV-részecske van jelen. A fehérjeextraktumok Western foltanalízise szerint FMDV-epitóp nem található.
A 4. csoportba (pMT7-FMDV-l és pBT7-123 eleggyel inokulált) tartozó növények inokulált levelein a fertőzést követő 11 nap elteltével kisméretű (mintegy 1 mm átmérő) sérülés mutatható ki. A levelek RNS-extraktumával (2. minta) végzett „Dót biot” analízis szerint a 4. csoportba tartozó öt növény közül három inokulált növényben CPMV- és FMDV-specifikus szekvenciák mutathatók ki. Anti-CPMV-szérummal bevont rácsokkal végzett ISEM-vizsgálat szerint a 4. csoportba tartozó öt növény közül négy inokulált leveleinek nyershomogenizátumában CPMV-szerű vírusrészecskék vannak jelen. A proteinextraktum (3. minta) Western foltanalízise szerint mind a négy növény extraktumában a kisméretű burokfehérjén FMDV-epitóp mutatható ki. Ezek az eredmények igazolják, hogy a pMT7-FMDV-I átiratai az egész tehénborsónövényben elszaporodnak, és az ilyen növényekben vírusrészecskék termelődnek.
A pMT7-FMDV-I-gyel fertőzött levélszövetekből vírusrészecskék izolálhatok a következő módon.
Egyenként 5 pg pBT7-123 és pMT7-FMDV átirattal inokulált tehénborsónövényekről az inokulálást követő 16 nap elteltével 22 g primer levelet gyűjtünk be. A leveleket 2 térfogatrész (mintegy 50 ml) 0.1 mol/1 nátrium-foszfátban (pH=7,0) homogenizáljuk 4 °C hőmérsékleten. A folyadékot két réteg muszlinszöveten átszűrjük, 15 percen keresztül 15 000 g értéken centrifugáljuk, és a felülúszót elválasztjuk. A pelletet néhány ml 0,1 mol/1 nátrium-foszfát-pufferrel (pH=7,0) ismét centrifugáljuk. A felülúszókat egyesítjük, és Beckman 30 rotoron 4 órán keresztül, 4 °C hőmérsékleten 27 000 fordulat/perc értéken centrifugáljuk. A kapott pelletet egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten 3,5 ml 0,1 mol/1 nátrium-foszfát-pufferben (pH = 7,0) szuszpendáljuk, és Eppendorf-centrifugában 10 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszót elválasztjuk, 0,1 mol/1 nátrium-foszfáttal (pH = 7,4) 4 ml-re töltjük, és 1 ml oldattal, amely 1 mol/1 NaCl-ot és 20% PEG 6000-t tartalmaz, elegyítjük, és 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. A kapott csapadékot Eppendorf-centrifugában 10 percen keresztül centrifugálva elválasztjuk, 0,25 ml 10 mmol/1 nátriumfoszfátban (pH = 7,0) szuszpendáljuk, és az oldatot Eppendorf-centrifugában 10 percen keresztül centrifugálva tovább tisztítjuk. A felülúszót, amely tartalmazza a vírusrészecskéket, eltávolítjuk, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk. Spektrofotometriás mérés szerint a végső szuszpenzió víruskoncentrációja mintegy 1,5 mg/ml. A vírus FMDV-specifikus antiszérummal végzett Western foltanalízise szerint a kimér vírusrészecskék kis burokfehérje-alegységével asszociálódva FMDV-antigén mutatható ki.
Nagy mennyiségű kimér vírus lehető leghatékonyabb előállítása érdekében az átiratokkal inokulált növényekből extrahált RNS-t növényekbe visszük át. A pMT7-FMDV-I-gyel inokulált levelekből extrahált RNS 5 μΐ-es mintáját Trisz-foszfáttal (pH=8,0) 50 μΐ-re töltjük, és 5 tehénborsónövény primer leveleire inokuláljuk. Valamennyi növényen kifejlődnek a CPMV-fertőzésre jellemző szimptómák. A fertőzést követő 23 nap elteltével begyűjtjük a növények primer leveleit. A leveleket 0,1 mol/1 nátrium-foszfát-pufferben homogenizáljuk, és a vírust a fent leírt módon extraháljuk azzal a különbséggel, hogy elhagyjuk a kezdeti nagy sebességű pelletálólépést. Ily módon összesen 3,0 mg vírust izolálunk 0,5 mg/ml végső koncentrációjú, 10 mmol/1 nátrium-foszfátban (pH = 7,0) felvett oldat formájában. Ezt a preparátumot Centriprep koncentrátorban (Amicon) 1.4 mg/ml végső koncentrációra állítjuk be, és Pl jellel jelöljük.
A Pl mintáit SDS gélen elektroforetikusan vizsgáljuk, és Coomassie Blue festékkel megfestjük. Az eredmények igazolják a burokfehérjék várt mintáját. AntiFMDV-szérummal végzett Western foltanalízissel az FMDV-hurkot tartalmazó kis burokfehérjék mutathatók ki. A vírusrészecskékből extrahált RNS a CPMV M és B RNS-ének megfelelő, várt méretet mutatja. Mindez azt igazolja, hogy a kimér vírus az átiratokkal inokulált levelekből származó RNS átvitelével termelhető.
A Pl vírus-preparátumból kísérleti vakcinát állítunk elő úgy, hogy a preparátumot 1 mg/ml végső koncentrációban steril, foszfátpufferolt sóoldatban (PBS) diszpergáljuk. Tengerimalacokat 40 pg Pl vakcinával kezelünk a 0. és a 28. napon. Az előzetes eredmények szerint az állatok FMDV-hurok elleni antitesteket termelnek, de vad típusú vírussal végzett kezelés esetén válasz nem jelentkezik.
Irodalmi források
Ahlquist, P., és Janda, M.: Mól. Cell Bioi. 4.,
2876-2882.(1984);
Biggin, M. D., Gibson, T. J. és Hong, G. F.: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80., 3963-3965. (1983);
Bimbóim, H. C. és Doly, 1: Nucleic Acids Rés. 7.,
1513-1523. (1979);
Chanh, T. C., Dreesman, G. R., Randa, P., Linette,
G. P., Sparrow, J. T., Ho, D. D. és Kennedy, R. C.:
EMBO I, 5. 3065-3071. (1986);
Dalgleish, A. G., Chanh, T. C., Kennedy, R. C., Kanda,
P., Clapham, P. R. és Weiss, R. A.: Virology, 165.,
209-215 (1988);
De Varennes, A. és Maule, A. J.: Virology, 144,
495-501,(1985);
Dessens, J. T. és Lomonossoff, G. P.: Virology, 184.,
738-746. (1991);
Feinberg, A. P. és Vogelstein, B.: Analytical Biochem.
/32,6-13.(1983);
Goldbach, R., Rezelman, G. és van Kammen, A.:
Natúré, 286., 297-300. (1980);
Holness, C. L.: Doktori disszertáció, University of
Worwick, (1989);
Holness, C. L., Lomonossoff, G. P., Evans, D. és
Maule. A. 1: Virology, /72., 311-320. (1989); Kennedy, R. C., Henkel, R. D., Pauletti, D., Allan,
J. S., Lee, T. H., Essex, M. és Dreesman, G. R.:
Science, 23/., 1556-1559. (1986);
Kunkel, T. A.: Proc. Natl. Acad Sci. USA 82.,
488-492. (1985);
Laemmli, U. K.: Natúré, 227., 680-685. (1970); Lehrach, H., Diamond, D., Wozney, J. M. és Boedtker,
H. : Biochemistry, /6.,4743-4751. (1977); Lomonossoff, G. P. és Shanks, M.: EMBO J. 2.,
2253-2258. (1983);
Lomonossoff, G. P., Shanks, M., Matthes, H. D.,
Singh, M. és Gait, M. J.: Nucleic Acids Research /0.,4861-4872. (1982);
Maniatis, T., Fritsch, E. F. és Sambrooke, J.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982);
Pelham, H. R. B. és Jackson, R. J.: Eur. J. Biochem. 67., 247-256. (1976);
Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H. és Roe, B. A.: J. Mól. Bioi. 143., 161-178. (1980);
Shanks, M., Stanley, J. és Lomonossoff, G. P.: Virology, 155., 697-706. (1986);
van Wezenbeek, P., Verver, J., Harmsen, J. Vos, P. és van Kammen, A.: EMBO J. 2., 941-946. (1983);
Ziegler-Graff, V., Bouzoubaa, S., Jupin, I., Guilley, H., Jonard, G. és Richards, K.: J. Gén. Virol. 69.,
2347-2357. (1988).

Claims (34)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy növényi vírus összeillesztett részei, azzal jellemezve, hogy a vírusfehérje-köpeny részeként meghatározott idegen pepiidet tartalmaznak, ahol a részek teljes növényben vagy növényi sejtben vannak összeillesztve.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy idegen pepiidként olyan, biológiailag funkcióképes peptidet tartalmaz, amelynél a biológiai hatás kiváltásához vagy fokozásához a peptid egy nagyméretű molekulával vagy részecskével társult formában van jelen.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy pepiidként antigént tartalmaznak.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy antigénként vírusantigént tartalmaznak.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy antigénként humán vagy állati vírusantigént tartalmaznak.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy az idegen peptid a növényi vírus fehérjeköpenyének szabadon álló felületébe van beépülve.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy a növényi vírus egy RNS-vírus.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy a vírus-burokfehérje β-hengerszerkezettel rendelkezik.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy az idegen peptid a növényi vírus burokjának β-hengeréhez kapcsolódó hurokba van beépítve.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vírusreszecskék, azzal jellemezve, hogy a növényi vírus egy komovírus.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy a komovírus tehénborsó-mozaikvírus (CPMV).
  12. 12. A 9., 10. vagy 11. igénypont szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy az idegen peptid a növényi vírus βΒ-βϋ hurokjába van beépítve.
  13. 13. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy a beépített idegen peptid a meglévő hurokhoz kapcsolódik.
  14. 14. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy a beépített idegen peptid a meglévő hurok egy részét helyettesíti.
  15. 15. Az 1-14, igénypontok bármelyike szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy az idegen peptid szájés körömfáj ás vírusból (FMDV) származó állati vírusantigén.
  16. 16. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy az idegen peptid humánimmunhiány-vírusból (HÍV) származó állati vírusantigén.
  17. 17. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti vírusrészecskék, azzal jellemezve, hogy az idegen peptid humán rinovírusból (HRV) származó állati vírusantigén.
  18. 18. Humán vagy állati patogének elleni védelmet biztosító vakcina, azzal jellemezve, hogy immunogén komponensként a 3-17. igénypontok bármelyike szerinti, összeillesztett növényi vírusrészeket tartalmaz.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti állati vírusvakcina, azzal jellemezve, hogy immunogén komponensként 5. igénypont szerinti vírusrészecskéket tartalmaz.
  20. 20. Eljárás az 1 -17. igénypontok bármelyike szerinti, növényi vírusrészecskék előllítására, azzal jellemezve, hogy a fehérjeköpenyt kódoló növényi vírusnukleinsav módosítására idegen peptidet kódoló nukleotidszekvenciát építünk be, növényt, növényi szövetet, növényi sejtet vagy protoplasztot a módosított vírusnukleinsavval fertőzünk, és a módosított vírus összeillesztett részecskéit összegyűjtjük.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beépített nukleotidszekvenciát a növényi vírus nukleinsavnak a fehérjeköpeny szabadon álló részét kódoló szakaszába inszertáljuk.
  22. 22. A 20. igénypont szerinti eljárás RNS növényi vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy a növényi vírusnak a fehérjeköpeny szabadon álló részét kódoló RNSének megfelelő cDNS-be az idegen peptidet kódoló DNS-szekvenciát viszünk be, az így módosított cDNSről RNS-átiratot képezünk, növényt, növényi szövetet, növényi sejtet vagy protoplasztot az átirattal inokulálunk, kívánt esetben a szaporodáshoz szükséges valamely más RNS-sel együtt, a növényi anyagban összeillesztjük a vírusrészecskéket, és a módosított vírus összeillesztett részeit elválasztjuk.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított cDNS előállításához az idegen peptidet kódoló DNS-t a növényi vírus cDNS-ből kivágott DNS-fragmensbe visszük be, és a módosított fragmens rekombinálásával módosított formában visszaállítjuk a növényi vírus-cDNS-t.
  24. 24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított, módosított vírust vagy az abból extrahált RNS-t valamely növénybe visszük át, és a módosított vírust nagy mennyiségben előállítjuk.
  25. 25. Eljárás humán vagy állati patogének elleni védelmet biztosító vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy immunogén komponensként a 3 -17. igénypontok bármelyike szerinti, összeillesztett növényi vírusrészeket megfelelő hordozóanyaggal vagy hígítóanyaggal keverünk.
  26. 26. CPMV-fehérjeköpeny cDNS-ének ffagmense, azzal jellemezve, hogy a fehérjeköpeny szabadon álló felületének megfelelő helyen idegen peptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti fragmens, azzal jellemezve, hogy egy Sstl fragmens.
  28. 28. Eljárás CPMV-fehérjeköpeny cDNS-e módosított fragmensének előállítására, azzal jellemezve, hogy a fragmensbe a fehérjeköpeny szabadon álló felületének megfelelő helyen idegen peptidet kódoló DNSszekvenciát viszünk be.
  29. 29. Vektor, azzal jellemezve, hogy a 26. vagy 27. igénypont szerinti fragmenst tartalmaz.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a CPMV M RNS-ének megfelelő, teljes hosszúságú cDNS-t tartalmaz, amely a fehérjeköpeny szabadon álló felületének megfelelő helyen idegen peptidet kódoló DNS-inszertet tartalmaz.
  31. 31. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy CPMV-fehérjeköpeny cDNS-ének fragmensébe idegen peptidet kódoló DNS-szekvenciát viszünk be, és kapott módosított fragmenst egy DNS-vektorba illesztjük.
  32. 32. A 26-29. igénypontok bármelyike szerinti fragmens vagy a 29-30. igénypontok bármelyike szerinti vektor RNS-átirata.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti RNS-átirat, azzal jellemezve, hogy burkolattal van ellátva.
  34. 34. Eljárás RNS-átirat előállítására, azzal jellemezve, hogy átírunk egy 28. igénypont szerint előállított fragmenst vagy egy 31. igénypont szerint előállított vektort.
HU9302954A 1991-04-19 1992-04-02 Vektorként alkalmazható módosított növényi vírusok HU218010B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB919108386A GB9108386D0 (en) 1991-04-19 1991-04-19 Modified plant viruses as vectors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9302954D0 HU9302954D0 (en) 1994-01-28
HUT65554A HUT65554A (en) 1994-06-28
HU218010B true HU218010B (hu) 2000-05-28

Family

ID=10693567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9302954A HU218010B (hu) 1991-04-19 1992-04-02 Vektorként alkalmazható módosított növényi vírusok

Country Status (16)

Country Link
US (4) US6110466A (hu)
EP (1) EP0580635B2 (hu)
JP (1) JP3236614B2 (hu)
AR (1) AR248426A1 (hu)
AT (1) ATE154635T1 (hu)
AU (1) AU661479B2 (hu)
CA (1) CA2108777C (hu)
DE (1) DE69220485T3 (hu)
DK (1) DK0580635T4 (hu)
ES (1) ES2106173T5 (hu)
GB (1) GB9108386D0 (hu)
GR (2) GR3024739T3 (hu)
HU (1) HU218010B (hu)
NZ (1) NZ242430A (hu)
WO (1) WO1992018618A1 (hu)
ZA (1) ZA922604B (hu)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5977438A (en) * 1988-02-26 1999-11-02 Biosource Technologies, Inc. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US6660500B2 (en) 1988-02-26 2003-12-09 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US6846968B1 (en) 1988-02-26 2005-01-25 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
US7033835B1 (en) 1988-02-26 2006-04-25 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
GB9108386D0 (en) 1991-04-19 1991-06-05 Agricultural Genetics Co Modified plant viruses as vectors
US6034298A (en) * 1991-08-26 2000-03-07 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
US5612487A (en) * 1991-08-26 1997-03-18 Edible Vaccines, Inc. Anti-viral vaccines expressed in plants
US5484719A (en) 1991-08-26 1996-01-16 Edible Vaccines, Inc. Vaccines produced and administered through edible plants
GB9414118D0 (en) * 1994-07-13 1994-08-31 Axis Genetics Ltd Modified plant viruses as vectors of heterologous peptides
EP0787193A1 (en) 1994-10-18 1997-08-06 Scottish Crop Research Institute Method of producing a chimeric protein
CA2232023A1 (en) * 1995-09-15 1997-03-20 John A. Howard Expression cassettes and methods for delivery of animal vaccines
US6042832A (en) * 1996-08-28 2000-03-28 Thomas Jefferson University Polypeptides fused with alfalfa mosaic virus or ilarvirus capsid proteins
US7393529B2 (en) 1998-04-09 2008-07-01 Idexx Laboratories, Inc. Methods and compositions for inhibiting binding of IgE to a high affinity receptor
CA2329074A1 (en) * 1998-10-30 2000-05-11 Thomas Jefferson University Production of biomedical peptides and proteins in plants using plant virus vectors
GB9921337D0 (en) * 1999-09-09 1999-11-10 Axis Genetics Plc Modified plant viruses
GB9924351D0 (en) 1999-10-14 1999-12-15 Brennan Frank Immunomodulation methods and compositions
GB9924352D0 (en) * 1999-10-14 1999-12-15 Hellendoorn Koen Methods,compositions and applications relating to the generation of novel plant viral particles
US7135282B1 (en) * 1999-10-14 2006-11-14 The Dow Chemical Company Viral particles with exogenous internal epitopes
CA2414396A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agricul Ture Production of vaccines using transgenic plants
US6800748B2 (en) 2001-01-25 2004-10-05 Large Scale Biology Corporation Cytoplasmic inhibition of gene expression and expression of a foreign protein in a monocot plant by a plant viral vector
US20040170606A1 (en) * 2002-06-07 2004-09-02 Palmer Kenneth E. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
AU2003237528A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 Kentucky Bioprocessing, Llc Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
EP1549140A4 (en) 2002-09-03 2009-04-29 Kentucky Bioproc Llc PRODUCTION OF PEPTIDES IN PLANTS IN THE FORM OF HYBRID VIRAL HULL PROTEINS
WO2004044161A2 (en) * 2002-11-06 2004-05-27 Fraunhofer Usa Expression of foreign sequences in plants using trans-activation system
US7683238B2 (en) * 2002-11-12 2010-03-23 iBio, Inc. and Fraunhofer USA, Inc. Production of pharmaceutically active proteins in sprouted seedlings
US7692063B2 (en) * 2002-11-12 2010-04-06 Ibio, Inc. Production of foreign nucleic acids and polypeptides in sprout systems
EP1594956A4 (en) 2003-02-03 2007-08-01 Fraunhofer Usa Inc SYSTEM FOR EXPRESSION OF GENES IN PLANTS
MXPA06006221A (es) * 2003-12-01 2008-02-13 Dow Global Technologies Inc Produccion de particula tipo virus icosaedrico recombinante en organismos del genero pseudomonas.
WO2005081905A2 (en) 2004-02-20 2005-09-09 Fraunhofer Usa Inc. Systems and methods for clonal expression in plants
EP1720990A4 (en) 2004-02-27 2008-04-30 Dow Global Technologies Inc HIGHLY EFFICIENT PEPTIDE PRODUCTION IN PLANT CELLS
EP1732615A4 (en) * 2004-03-25 2009-09-16 Kentucky Bioproc Llc PRODUCTION OF PEPTIDES IN PLANTS IN THE FORM OF FUSION OF VIRAL ENVELOPE PROTEINS
WO2005091753A2 (en) * 2004-03-25 2005-10-06 Large Scale Biology Corporation Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
US8715923B2 (en) * 2004-07-30 2014-05-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Protein scaffolds and viral particles for detecting analytes
US20060216238A1 (en) * 2005-02-28 2006-09-28 Marianne Manchester Compositions and methods for targeting or imaging a tissue in a vertebrate subject
WO2006107954A2 (en) * 2005-04-05 2006-10-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for designing nucleic acid molecules for polypeptide expression in plants using plant virus codon-bias
BRPI0611336A2 (pt) 2005-06-01 2010-08-31 Dow Global Technologies Inc método para produzir uma partìcula multivalente semelhante a vìrus, partìcula multivalente semelhante a vìrus, método de aumentar a solubilidade de uma partìcula multivalente semelhante a vìrus e vacina
AU2006270065A1 (en) * 2005-07-19 2007-01-25 Dow Global Technologies Inc. Recombinant flu vaccines
EP1989326A4 (en) 2006-01-17 2009-09-30 Health Research Inc HETERO DUPLEX TRACKING TEST
US7618815B2 (en) * 2006-03-08 2009-11-17 University Of Kentucky Research Foundation Viral vectors useful in soybean and methods of use
US7923823B2 (en) * 2007-01-23 2011-04-12 Infineon Technologies Ag Semiconductor device with parylene coating
WO2009014782A2 (en) * 2007-04-27 2009-01-29 Dow Global Technologies Inc. Improved production and in vivo assembly of soluble recombinant icosahedral virus-like particles
WO2011119920A2 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
DK2691530T3 (en) 2011-06-10 2018-05-22 Univ Oregon Health & Science CMV GLYCOPROTEIN AND RECOMBINANT VECTORS
AU2012216792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-28 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
MX364778B (es) 2012-09-05 2019-05-06 Medicago Inc Produccion de particulas similares a picornavirus en plantas.
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
CN106573031B (zh) * 2014-04-15 2021-05-28 加利福尼亚大学董事会 双末端聚乙二醇化整合素-结合肽及其使用方法
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4407956A (en) * 1981-03-13 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Cloned cauliflower mosaic virus DNA as a plant vehicle
CA1192510A (en) * 1981-05-27 1985-08-27 Lawrence E. Pelcher Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom
US4593002A (en) * 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
US5173410A (en) 1984-02-15 1992-12-22 Lubrizol Genetics Inc. Transfer vector
US4885248A (en) 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
GB8421282D0 (en) * 1984-08-22 1984-09-26 Connaught Lab Multispecific antigenic proteins
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
CA1288073C (en) * 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US4956282A (en) * 1985-07-29 1990-09-11 Calgene, Inc. Mammalian peptide expression in plant cells
DE3686633T2 (de) * 1985-10-25 1993-04-15 David Matthew Bisaro Pflanzenvektoren.
GB8608850D0 (en) * 1986-04-11 1986-05-14 Diatech Ltd Packaging system
ES2060646T3 (es) * 1987-02-09 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Virus rna hibrido.
US5316931A (en) * 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
DE68929521T2 (de) * 1988-02-26 2006-02-23 Large Scale Biology Corp., Vacaville Nicht-nukleare chromosomale Transformation
CA1339841C (en) * 1988-07-15 1998-04-28 Robert L. Erwing Synthesis of stereospecific enzyme by non-chromosomal transformation a host
US5596132A (en) * 1990-03-12 1997-01-21 Cornell Research Foundation, Inc. Induction of resistance to virus diseases by transformation of plants with a portion of a plant virus genome involving a read-through replicase gene
WO1991013994A1 (en) 1990-03-13 1991-09-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene expression
WO1991015587A1 (en) 1990-04-06 1991-10-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Self-polymerising expression system based on modified potyvirus coat proteins
EP0452223A3 (en) * 1990-04-13 1994-06-08 Digital Equipment Corp Telecommunications network with plesiochronous transfer mode
GB9108386D0 (en) 1991-04-19 1991-06-05 Agricultural Genetics Co Modified plant viruses as vectors
DE69232393T2 (de) 1991-08-01 2002-08-29 Large Scale Biology Corp., Vacaville Rekombinierte virale nukleinsäure aus pflanzen
US5437976A (en) * 1991-08-08 1995-08-01 Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA
WO1995021248A1 (en) 1994-02-03 1995-08-10 The Scripps Research Institute Method for using tobacco mosaic virus to overproduce peptides and proteins
GB9414118D0 (en) * 1994-07-13 1994-08-31 Axis Genetics Ltd Modified plant viruses as vectors of heterologous peptides

Also Published As

Publication number Publication date
AU1447992A (en) 1992-11-17
JP3236614B2 (ja) 2001-12-10
ES2106173T3 (es) 1997-11-01
DE69220485T2 (de) 1997-10-09
CA2108777A1 (en) 1992-10-20
GB9108386D0 (en) 1991-06-05
DE69220485T3 (de) 2001-06-07
CA2108777C (en) 2000-07-18
GR3024739T3 (en) 1997-12-31
EP0580635B2 (en) 2001-02-21
US6884623B1 (en) 2005-04-26
ES2106173T5 (es) 2001-08-01
AR248426A1 (es) 1995-08-18
JPH06506583A (ja) 1994-07-28
NZ242430A (en) 1993-06-25
DK0580635T4 (da) 2001-03-19
WO1992018618A1 (en) 1992-10-29
GR3035521T3 (en) 2001-06-29
ATE154635T1 (de) 1997-07-15
EP0580635A1 (en) 1994-02-02
US7208655B1 (en) 2007-04-24
HUT65554A (en) 1994-06-28
DK0580635T3 (da) 1998-01-19
US6110466A (en) 2000-08-29
EP0580635B1 (en) 1997-06-18
AU661479B2 (en) 1995-07-27
HU9302954D0 (en) 1994-01-28
DE69220485D1 (de) 1997-07-24
ZA922604B (en) 1992-12-30
US5874087A (en) 1999-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU218010B (hu) Vektorként alkalmazható módosított növényi vírusok
Porta et al. Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides
JP2593295B2 (ja) 組換え体表面タンパク質を持つウイルス
JP3281512B2 (ja) ウイルス耐性の植物の生産方法
JPS63301787A (ja) ハイブリッドｒｎａウイルス
JPH09504961A (ja) 異種ペプチドのベクターとしての改質植物ウイルス
JPH0773498B2 (ja) 植物感染性キャップ化ｒｎａ分子
CN109536461B (zh) 一种o型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用
JPH03502524A (ja) Ｆｏｗｌｐｏｘウィルスの非必須領域
Lomonossoff et al. Cowpea mosaic virus-based vaccines
JPH03280883A (ja) Ｒｎａ型ウイルス由来の配列を包含する組換えｄｎａおよびそれを用いる遺伝子操作方法
JPH03228679A (ja) 有機化合物に関する改良
CN114854698B (zh) 一种复制滴度提高的o型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用
CN101586120B (zh) 狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体
US20020138873A1 (en) Multiple component RNA vector system for expression of foreign sequences
Osman et al. Molecular studies on bromovirus capsid protein
JP5284086B2 (ja) サケ科魚類のアルファウイルスのｃＤＮＡ構築物
US6177075B1 (en) Insect viruses and their uses in protecting plants
Mawassi et al. Replication of heterologous combinations of helper and defective RNA of citrus tristeza virus
CN106754982B (zh) 表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用
CN112301042B (zh) A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用
Zhang et al. Limitations to tobacco mosaic virus infection of turnip
Zhang et al. Recombinant genomic RNA of coronavirus MHV-A59 after coreplication with a DI RNA containing the MHV-RI spike gene
US20030041349A1 (en) Insect viruses and their uses in protecting plants
Ahlquist et al. United States Patent, Number: 5,602,242: HYBRID RNA VIRUS

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: PURDUE RESEARCH FOUNDATION, US

Owner name: AXIS GENETICS PLC, GB

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: PURDUE RESEARCH FOUNDATION, US

Owner name: DOW CHEMICAL CO., US

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees