CN116694577A - 一种利用wave波浪式生物反应器培养猪病病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用WAVE波浪式生物反应器培养猪病病毒的方法。属于猪病病毒培养领域。为了提供一种利用WAVE波浪式生物反应器驯化PK‑15悬浮细胞并培养猪病病毒的方法。本发明提供的方法为：1)利用WAVE波浪式生物反应器驯化全悬浮PK‑15细胞；2)全悬浮PK‑15细胞WAVE波浪式生物反应器放大培养；3)利用全悬浮PK‑15细胞在WAVE波浪式生物反应器上培养猪病病毒，所述猪病病毒为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、伪狂犬病毒或猪轮状病毒。本发明为利用悬浮细胞系培养和增殖猪病病毒提供了可能性。
Description
技术领域
本发明属于猪病病毒培养领域，具体涉及一种利用WAVE波浪式生物反应器培养猪病病毒的方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒以及猪轮状病毒均为感染猪的常见病原体，这些病毒有的能够引起仔猪爆发消化道机能紊乱，有的可导致妊娠母猪流产，对养猪业造成巨大损失，这些病毒在世界范围养猪厂内普遍存在，我国也有较高的阳性检出率，疫苗免疫是预防这些病毒现阶段最主要手段。目前，增殖这些病毒使用的细胞主要为贴壁细胞，细胞培养方式为单层静态培养，然而不论是实验室级别的方瓶培养还是工业化车间生产的转瓶培养，相比于悬浮培养方式都存在操作繁琐、占用空间大以及细胞密度较低等缺点。另外，在接毒的过程中由于部分病毒本身需要胰酶辅助增殖的特点，使得常规的有血清培养基细胞单层培养不得不增加换液的步骤，这造成了血清与培养基的极大浪费，增加了病毒的生产成本。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用WAVE波浪式生物反应器驯化PK-15悬浮细胞并培养猪病病毒的方法，操作简单，易于规模化生产，为了解决现有技术存在的贴壁细胞培养猪病病毒的缺陷以及突破悬浮细胞培养猪病病毒的瓶颈。
本发明提供了一种利用WAVE波浪式生物反应器培养猪病病毒的方法，所述方法的步骤如下：
(1)将PK-15细胞用EDTA-胰酶溶液进行消化，并转入到含有新生牛血清的DMEM培养基培养；
(2)待PK-15细胞长至单层，用EDTA-胰酶溶液进行消化，消化好的PK-15细胞用无血清全悬浮培养基吹打至少10次；
(3)将吹打好的PK-15细胞离心1000转/分钟，离心5分钟，室温，弃去上清，再次用无血清全悬浮培养基反复吹打至少10次；
(4)向吹打后获得PK-15细胞中添加无血清全悬浮培养基，控制细胞密度为1.0×106cells/ml，并导入细胞培养袋中，将培养袋置于WAVE波浪式生物反应器进行培养培养48-72小时；
(5)导出PK-15细胞后添加无血清全悬浮培养基，细胞密度控制为1.0×106cells/ml，将稀释好的PK-15细胞导入新的细胞培养袋，置于WAVE波浪式生物反应器培养，连续重复培养3-5代后，进行逐级放大驯化培养，可获得PK-15全悬浮细胞系；
(6)取PK-15全悬浮细胞，进行传代，然后接种猪病病毒。
进一步地限定，新生牛血清的质量分数为6％的新生牛血清。
进一步地限定，步骤所述EDTA-胰酶的质量体积分数为0.25％。
进一步地限定，所述的EDTA-胰酶溶液的规格为1:250的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液，所述1:250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。
进一步地限定，步骤(4)WAVE波浪式生物反应器的设置参数为：温度设定为37℃、通气流量设定为0.2L/min、二氧化碳含量设为5％、频率设定为20rpm和角度设定为6°。
进一步地限定，步骤(5)所述的扩大体积驯化的方法如下：当PK-15细胞适应100ml培养体系后扩大培养体积至300ml，连续驯化培养3-5代；当PK-15细胞适应300ml培养体系后扩大培养体积至1L，连续驯化培养3-5代；当PK-15细胞适应1L培养体系后继续扩大培养体积至3L，连续驯化培养3-5代；当PK-15细胞适应3L培养体系后扩大培养体积至5L，连续驯化培养3-5代。
进一步地限定，步骤(6)中传代PK-15全悬浮细胞的方法是：传代密度1.0×106cells/ml，培养48-72小时，当细胞密度增长至4.0×106cells/ml-6.0×106cells/ml时，将细胞密度稀释为2.0×106cells/ml-3.0×106cells/ml，然后接毒。
进一步地限定，所述猪病病毒为猪流行性腹泻病毒疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒疫苗株、伪狂犬病毒疫苗株或猪轮状病毒疫苗株。
进一步地限定，所述猪病病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株、猪传染性胃肠炎病毒华毒株、猪轮状病毒(G5型)NX株和伪狂犬病毒Bartha-K61株。
进一步地限定，步骤(6)猪病病毒的接毒量为0.01-0.1MOI。
本发明提供一种获得PK-15全悬浮细胞系的方法，所述步骤如下：
(1)将PK-15细胞用EDTA-胰酶溶液进行消化，并转入到含有新生牛血清的DMEM培养基培养；
(2)待PK-15细胞长至致密单层，用EDTA-胰酶溶液进行消化，消化好的PK-15细胞用无血清全悬浮培养基多次吹打；
(3)将吹打好的PK-15细胞离心弃去上清，再次用无血清全悬浮培养基反复吹打；
(4)向吹打后获得PK-15细胞中添加无血清全悬浮培养基，控制细胞密度为1.0×106cells/ml，并导入细胞培养袋中，将培养袋置于WAVE波浪式生物反应器进行培养，培养48-72小时；
(5)导出PK-15细胞后添加新鲜培养基，控制细胞密度控制为1.0×106cells/ml，将稀释好的PK-15细胞导入新的细胞培养袋，置于WAVE波浪式生物反应器培养，连续驯化培养3-5代后，进行扩大体积驯化，可获得PK-15全悬浮细胞系。
进一步地限定，新生牛血清的质量分数为6％的新生牛血清。
本发明提供上述的方法获得的PK-15全悬浮细胞系。
本发明还提供了上述获得PK-15全悬浮细胞系方法在获得MDCK、ST、BHK-21、BSR、MDBK、F81、CRFK、LMH、Vero、MA104或Marc-145全悬浮细胞中的应用。
本发明提供上述的培养猪病病毒的方法、或上述方法获得的全悬浮细胞或上述的获得PK-15全悬浮细胞系的方法在制备猪病病毒疫苗中的应用。
有益效果：WAVE波浪式生物反应器采用非介入的波浪式摇动混合方法，相比于搅拌罐反应器其避免了搅拌桨叶端产生的剪切力以及鼓泡对细胞的影响，培养方式更温和，利用它来驯化培养悬浮细胞可以极大提高细胞活率，增加驯化成功率。
本发明采用无血清全悬浮培养基对PK-15进行培养并增殖猪病病毒，避免了病毒增殖过程中血清对胰酶的干扰。
本发明采用无血清全悬浮培养方式，相比于微载体悬浮培养操作简单，细胞密度更大，病毒收获滴度更高。
本发明经过多次实验均可获得无血清培养的全悬浮PK-15细胞，表明利用WAVE波浪式生物反应器在不经过逐级降血清或更换低血清培养基的条件下亦可直接获得无血清培养的全悬浮PK-15细胞，该方法减少了驯化步骤，降低了驯化成本，缩短了驯化时间，增加了驯化成功率。
本发明获得的全悬浮PK-15细胞以1.0×106cells/ml密度接种传代，培养72小时，细胞密度最高可达6.0×106cells/ml，倍增时间为26-28小时，高于贴壁细胞的最大生长密度及倍增时间。
本发明获得的全悬浮PK-15细胞对猪病病毒易感，接毒后可产生明显病变且病毒滴度不低于贴壁培养水平。
本发明获得的全悬浮PK-15细胞实现了一种细胞培养多种病毒，增加了在未来的大规模生产中的病毒生产效率，减少了生产设备的使用量或使用频次。
本发明获得的全悬浮PK-15细胞具有在细胞生物培养罐上增殖病毒的潜力。
猪流行性腹泻病毒常规培养细胞为贴壁Vero细胞，贴壁PK-15细胞培养鲜有报道，全悬浮PK-15细胞培养则更少。
猪传染性胃肠炎病毒常规培养细胞为贴壁ST细胞，贴壁PK-15细胞培养有少量报道，全悬浮PK-15细胞培养鲜有报道。
猪轮状病毒常规培养细胞为贴壁Marc-145细胞，贴壁PK-15细胞培养鲜有报道，全悬浮PK-15细胞培养则更少。
伪狂犬病毒常规培养细胞为贴壁原代鸡成纤维细胞或贴壁ST细胞，贴壁PK-15细胞培养鲜有报道，全悬浮PK-15细胞培养则更少。
附图说明
图1为细胞密度及活率变化趋势；其中，横坐标是培养时间，纵坐标是细胞密度；
图2为1L培养系统；
图3为10L培养系统；
图4为健康细胞；
图5为接毒后细胞。
具体实施方式
PK-15细胞无血清全悬浮培养基购买厂家(甘肃健顺生物科技有限公司，货号：10701-259)。
猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、伪狂犬病毒或猪轮状病毒均是商业购买。
本发明用到的猪病病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株、猪传染性胃肠炎病毒华毒株、伪狂犬病毒Bartha-K61株和猪轮状病毒(G5型)NX株。
实施例1.一种利用WAVE波浪式生物反应器培养猪轮状病毒的方法
1.取生长于75cm2方瓶且状态良好的PK-15细胞(购买)，用EDTA-胰酶(质量体积分数为0.25％，所述的EDTA-胰酶溶液的规格为1:250的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液，所述1:250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶)溶液进行消化，将消化好的细胞转入225cm2方瓶并加入含6％新生牛血清的DMEM培养基继续培养2-3天；
待细胞长至单层，用EDTA-胰酶溶液(质量体积分数为0.25％，所述的EDTA-胰酶溶液的规格为1:250的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液，所述1:250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶)进行消化，消化好的细胞用无血清全悬浮培养基至少吹打10次(吹打次数过少会导致少量细胞结团、分散性差，无法获得足够数量的单个悬浮细胞，影响进一步的悬浮驯化)。
2.将吹打好的PK-15细胞离心，1000转/分钟，离心5分钟，室温，弃去上清，再次用无血清全悬浮培养基反复吹打至少10次，方法同上，进行二次吹打换液的目的首先是洗净胰酶(无血清培养基中由于没有血清的保护，残留的胰酶会对细胞造成损伤)，其次，二次吹打可以让PK-15细胞分散性更好，降低结团率。
3.向处理好的PK-15细胞中补加无血清全悬浮培养基至100ml(细胞密度控制为1.0×106cells/ml)，并导入最大培养体积1L最小培养体积0.1L的无菌无热源Cellbag一次性细胞培养袋(品牌：GE，货号：CB21012101)。
4.将培养袋放置于WAVE波浪式生物反应器(品牌：GE，型号：ReadyToProcessWAVE25)的摇动平台上，利用卡扣固定培养袋，连接进气管与排气管，关闭培养舱盖。
5.打开操控界面，启动加热程序，温度设定为37℃，打开通气，流量设定为0.2L/min(二氧化碳含量设为5％)，打开摇动程序，频率设定为20rpm，角度设定为6°，驯化培养48-72小时。
6.培养48-72小时进行细胞传代，暂停各控制原件，取下培养袋，无菌导出PK-15悬浮细胞，补加新鲜培养基至100ml，PK-15细胞密度控制为1.0×106cells/ml，将稀释好的细胞导入新的细胞培养袋，继续培养，连续驯化培养3-5代。
7.当细胞适应100ml培养体系后扩大培养体积至300ml，连续驯化培养3-5代。
8.当细胞适应300ml培养体系后扩大培养体积至1L，连续驯化培养3-5代。
9.当细胞适应1L培养体系后继续扩大培养体积至3L并换用最大培养体积10L最小培养体积1L的无菌无热源Cellbag一次性细胞培养袋(品牌：GE，货号：CB20092401)，连续驯化培养3-5代。细胞1L与10L培养系统如图2及图3所示
10.当细胞适应3L培养体系后扩大培养体积至5L，连续驯化培养3-5代。
11.随着培养体积增大以及驯化代次的增加，PK-15细胞最终成功适应无血清悬浮培养，细胞密度也从最初的1.0×106cells/ml增加至6.0×106cells/ml，得到PK-15悬浮细胞系，为健康PK-15全悬浮细胞如图4所示，细胞活率在95％以上，细胞大小均一，轮廓清晰，表面光滑，无结团细胞。
12.倍增时间为26-28小时，高于贴壁细胞的最大生长密度(约1.0×106cells/ml)及倍增时间(约36小时)。细胞密度及活率变化趋势如图1所示；
13.猪轮状病毒接种前应加入终浓度20-30μg/ml的胰酶于37℃活化1-2小时；取上述获得的PK-15全悬浮细胞系，无菌导入10L细胞培养袋，培养体积为5L，传代密度为1.0×106cells/ml，培养48-72小时，当细胞密度达到4.0×106cells/ml-6.0×106cells/ml时接种猪轮状病毒。
14.向5L健康细胞中加入同体积的PK-15无血清全悬浮培养基至最终体积10L，将细胞密度稀释为2.0×106cells/ml-3.0×106cells/ml，加入终浓度5μg/ml的胰酶及已活化的猪轮状病毒，接毒量为0.01-0.1MOI；细胞进行增殖后又稀释再接毒的主要目的是添加新鲜培养基，因为健康细胞培养一段时间会堆积代谢废物，添加新鲜培养基可以降低代谢废物浓度并为细胞补充足够的营养物质，利于细胞生长及病毒增殖。
15.接毒后继续培养48-72小时，从图5的病变细胞和图4的健康细胞对比可看出：细胞出现变大，胞内产生空泡等明显病变，待细胞活率降至50％-70％，收获P1代病毒，测定病毒滴度；
16.以P1代毒为种毒按照上述方法进行病毒的再次传代，共传5代(P1-P5)，各代病毒滴度见表1(各测定结果均为3次测定的平均结果)；P1到P5代病毒含量均高于108.0TCID50/ml，可应用于疫苗生产。
PK-15全悬浮细胞接种猪轮状病毒后病变情况如图5所示。
表1 不同代次病毒滴度测定结果
| 代次 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 |
| 滴度(TCID50/ml) | 108.36 | 108.26 | 108.5 | 108.57 | 108.5 |
实施例2.一种获得PK-15全悬浮细胞系的方法
1.取生长于75cm2方瓶且状态良好的PK-15细胞，用EDTA-胰酶溶液进行消化，将消化好的细胞转入225cm2方瓶并加入含6％新生牛血清的DMEM培养基继续培养2-3天。
2.待细胞长至单层，用EDTA-胰酶溶液进行消化，消化好的细胞用无血清全悬浮培养基多次吹打(吹打次数过少会导致少量细胞结团、分散性差，无法获得足够数量的单个悬浮细胞，影响进一步的悬浮驯化)。
3.将吹打好的细胞离心弃去上清，再次用无血清全悬浮培养基反复吹打，方法同上，进行二次吹打换液的目的首先是洗净胰酶(无血清培养基中由于没有血清的保护，残留的胰酶会对细胞造成损伤)，其次，二次吹打可以让细胞分散性更好，降低结团率。
4.向处理好的细胞中补加无血清全悬浮培养基至100ml(细胞密度控制为1.0×106cells/ml)，并导入最大培养体积1L最小培养体积0.1L的无菌无热源Cellbag一次性细胞培养袋(品牌：GE，货号：CB21012101)。
5.将培养袋放置于WAVE波浪式生物反应器(品牌：GE，型号：ReadyToProcessWAVE25)的摇动平台上，利用卡扣固定培养袋，连接进气管与排气管，关闭培养舱盖。
6.打开操控界面，启动加热程序，温度设定为37℃，打开通气，流量设定为0.2L/min(二氧化碳含量设为5％)，打开摇动程序，频率设定为20rpm，角度设定为6°，驯化培养48-72小时。
7.培养48-72小时进行细胞传代，暂停各控制原件，取下培养袋，无菌导出PK-15悬浮细胞，补加新鲜培养基至100ml，细胞密度控制为1.0×106cells/ml，将稀释好的细胞导入新的细胞培养袋，继续培养，连续驯化培养3-5代。
8.当细胞适应100ml培养体系后扩大培养体积至300ml，连续驯化培养3-5代。
9.当细胞适应300ml培养体系后扩大培养体积至1L，连续驯化培养3-5代。
10.当细胞适应1L培养体系后继续扩大培养体积至3L并换用最大培养体积10L最小培养体积1L的无菌无热源Cellbag一次性细胞培养袋(品牌：GE，货号：CB20092401)，连续驯化培养3-5代。
11.当细胞适应3L培养体系后扩大培养体积至5L，连续驯化培养3-5代。
12.随着培养体积增大以及驯化代次的增加，PK-15细胞最终成功适应无血清悬浮培养，细胞密度也从最初的1.0×106cells/ml增加至6.0×106cells/ml，得到PK-15悬浮细胞系，倍增时间为26-28小时，高于贴壁细胞的最大生长密度及倍增时间，细胞密度及活率变化趋势如图1所示。获得的PK-15悬浮细胞生长速度更快，细胞密度更大(均相比于贴壁细胞)图1可说明，且该细胞对猪轮状病毒敏感，猪轮状病毒可在该细胞上稳定生长；最主要的是将传统的贴壁培养方式更改为悬浮培养，自动化程度更高，稳定性更好，劳动强度更低，为大规模生产打下坚实基础。
实施例3.一种利用WAVE波浪式生物反应器培养猪流行性腹泻病毒的方法
培养方式与猪轮状病毒相同，参照实施例1，但病毒不需要提前胰酶活化。
PK-15全悬浮细胞接种猪流行性腹泻病毒后不同代次病毒滴度测定结果如表2所示，细胞出现变大，胞内产生空泡等明显病变，待细胞活率降至50％-70％，收获P1代病毒，测定病毒滴度；
以P1代毒为种毒按照上述方法进行病毒的再次传代，共传5代(P1-P5)，各代病毒滴度见表2(各测定结果均为3次测定的平均结果)；P1到P5代病毒含量均高于108.0TCID50/ml，可应用于疫苗生产。
表2 不同代次病毒滴度测定结果
| 代次 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 |
| 滴度(TCID50/ml) | 108 | 108.29 | 108 | 108.59 | 108.39 |
实施例4.一种利用WAVE波浪式生物反应器培养猪传染性胃肠炎病毒的方法
培养方式与猪轮状病毒相同，参照实施例1，但病毒不需要提前胰酶活化。
PK-15全悬浮细胞接种猪传染性胃肠炎病毒后不同代次病毒滴度测定结果如表3所示，细胞出现变大，胞内产生空泡等明显病变，待细胞活率降至50％-70％，收获P1代病毒，测定病毒滴度；
以P1代毒为种毒按照上述方法进行病毒的再次传代，共传5代(P1-P5)，各代病毒滴度见表3(各测定结果均为3次测定的平均结果)；P1到P5代病毒含量均高于108.0TCID50/ml，可应用于疫苗生产。
表3 不同代次病毒滴度测定结果
| 代次 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 |
| 滴度(TCID50/ml) | 108.33 | 108.5 | 108.61 | 108.59 | 108.71 |
实施例5.一种利用WAVE波浪式生物反应器培养伪狂犬病毒的方法
培养方式与猪轮状病毒相同，参照实施例1，但病毒不需要提前胰酶活化，接毒时不添加胰酶。
PK-15全悬浮细胞接种猪伪狂犬病毒后不同代次病毒滴度测定结果如表4所示，细胞出现变大，胞内产生空泡等明显病变，待细胞活率降至50％-70％，收获P1代病毒，测定病毒滴度；
18.以P1代毒为种毒按照上述方法进行病毒的再次传代，共传5代(P1-P5)，各代病毒滴度见表4(各测定结果均为3次测定的平均结果)；P1到P5代病毒含量均高于107.0TCID50/ml，可应用于疫苗生产。
表4 不同代次病毒滴度测定结果
| 代次 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 |
| 滴度(TCID50/ml) | 107.29 | 107.39 | 107.5 | 107.41 | 107.5 |
Claims (10)
1.一种利用WAVE波浪式生物反应器培养猪病病毒的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
(1)将PK-15细胞用EDTA-胰酶溶液进行消化，并转入到含有新生牛血清的DMEM培养基培养；
(2)待PK-15细胞长至单层，用EDTA-胰酶溶液进行消化，消化好的PK-15细胞用无血清全悬浮培养基吹打至少10次；
(3)将吹打好的PK-15细胞离心1000转/分钟，离心5分钟，室温，弃去上清，再次用无血清全悬浮培养基反复吹打至少10次；
(4)向吹打后获得PK-15细胞中添加无血清全悬浮培养基，控制细胞密度为1.0×106cells/ml，并导入细胞培养袋中，将培养袋置于WAVE波浪式生物反应器进行培养培养48-72小时；
(5)导出PK-15细胞后添加无血清全悬浮培养基，细胞密度控制为1.0×106cells/ml，将稀释好的PK-15细胞导入新的细胞培养袋，置于WAVE波浪式生物反应器培养，连续重复培养3-5代后，进行逐级放大驯化培养，可获得PK-15全悬浮细胞系；
(6)取PK-15全悬浮细胞，进行传代，然后接种猪病病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述EDTA-胰酶的质量体积分数为0.25％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的扩大体积驯化的方法如下：当PK-15细胞适应100ml培养体系后扩大培养体积至300ml，连续驯化培养3-5代；当PK-15细胞适应300ml培养体系后扩大培养体积至1L，连续驯化培养3-5代；当PK-15细胞适应1L培养体系后继续扩大培养体积至3L，连续驯化培养3-5代；当PK-15细胞适应3L培养体系后扩大培养体积至5L，连续驯化培养3-5代。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中传代PK-15全悬浮细胞的方法是：传代密度1.0×106cells/ml，培养48-72小时，当细胞密度增长至4.0×106cells/ml-6.0×106cells/ml时，将细胞密度稀释为2.0×106cells/ml-3.0×106cells/ml，然后接毒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中猪病病毒为猪流行性腹泻病毒疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒疫苗株、伪狂犬病毒疫苗株或猪轮状病毒疫苗株。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中猪病病毒的接毒量为0.01-0.1MOI。
7.一种获得PK-15全悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤如下：
(1)将PK-15细胞用EDTA-胰酶溶液进行消化，并转入到含有新生牛血清的DMEM培养基培养；
(2)待PK-15细胞长至单层，用EDTA-胰酶溶液进行消化，消化好的PK-15细胞用无血清全悬浮培养基多次吹打；
(3)将吹打好的PK-15细胞离心弃去上清，再次用无血清全悬浮培养基反复吹打；
(4)向吹打后获得PK-15细胞中添加无血清全悬浮培养基，控制细胞密度为1.0×106cells/ml，并导入细胞培养袋中，将培养袋置于WAVE波浪式生物反应器进行培养，培养48-72小时；
(5)导出PK-15细胞后添加新鲜培养基，细胞密度控制为1.0×106cells/ml，将稀释好的PK-15细胞导入新的细胞培养袋，置于WAVE波浪式生物反应器培养，连续驯化培养3-5代后，进行扩大体积驯化，可获得PK-15全悬浮细胞系。
8.权利要求7所述的方法在获得MDCK、ST、BHK-21、BSR、MDBK、F81、CRFK、LMH、Vero、MA104或Marc-145全悬浮细胞中的应用。
9.权利要求7所述的方法获得的PK-15全悬浮细胞系。
10.权利要求1-7任一项所述的培养猪病病毒的方法、权利要求8所述的获得全悬浮细胞或权利要求9所述的获得PK-15全悬浮细胞系的方法在制备猪病病毒疫苗中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202210183913.6A CN116694577A (zh) | 2022-02-24 | 2022-02-24 | 一种利用wave波浪式生物反应器培养猪病病毒的方法 |
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| CN202210183913.6A CN116694577A (zh) | 2022-02-24 | 2022-02-24 | 一种利用wave波浪式生物反应器培养猪病病毒的方法 |
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2022
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