CN110387328A - 一种悬浮培养生物反应器及其培养猪塞尼卡谷病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种悬浮培养生物反应器及其培养猪塞尼卡谷病毒的方法，在悬浮反应罐内沿罐壁周围及底部安装截留不同细胞的细胞过滤网。在悬浮培养细胞过程中及放大培养过程中通过提升细胞过滤网高度过滤悬浮细胞，通过底部排液口快速去除原培养液以更换新的培养液减少原有培养液中代谢物对细胞的影响。还设置两路进氧气调节口配合两路进氧气的切换程序，在细胞培养初期一路调节小压力供应氧，一路调节大压力供应氧，在细胞培养过程中当氧气供不足时自动切换至另一路增加氧气压力的进气调节系统，以满足细胞生长所需氧气需求。

Description

一种悬浮培养生物反应器及其培养猪塞尼卡谷病毒的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种悬浮培养生物反应器及其培养猪塞尼卡谷病毒的方法。
背景技术
现有塞尼卡谷病毒培养一般以转瓶培养为主，转瓶培养劳动强度大，费时费力，另一方面转瓶培养细胞密度小，培养的病毒效价不高。
部分厂家使用生物反应器培养，现有的悬浮培养反应器的培养悬浮细胞过程为：细胞上反应罐培养，在培养至细胞放大前的过程中营养液未进行更换，有时营养不够会进行添加部分营养液，当细胞要放大时只将原有反应罐细胞悬液按某个比例弃去部分细胞，留下部分细胞进行放大，并没有弃去原有培养液(原有的培养液存在大量的细胞代谢物)，然后直接补足添加部分新营养液。
在细胞生长的过程氧气的调节，虽然有自动控制系统，但是进气阀只有一路，而且需要手工进行调节，在细胞生长初期调至较小的压力，自动控制系统以较小的压力进行自动补充，在细胞生长的旺盛期时，原有的压力不能满足细胞的生长，需要手工将氧气阀调大，以满足细胞的生长需求，在细胞生长的不同时期所需的氧气量是不同的，所以前期阀门调小，中期需要调大，需要人员进生产线观察调节。
现有的反应器在悬浮培养细胞过程是不换液的，在细胞放大时也是直接放大，没有弃去原有的细胞培养液，细胞在培养过程当中营养消耗大，细胞代谢物增多时，会影响细胞的增殖，现有反应器无法在罐内进行换液，限制了细胞的增长，另一方面在细胞放大时无法在罐内去除原有培养液，原有培养液代谢物比较多，影响细胞的增长，影响细胞密度，从而影响培养病毒的毒价。
另一方面，反应器溶氧系统中只有一路氧气进口，细胞在生长初期时耗氧较小，氧气的进口阀的压力通过手工调节到到较小的压力，然后通过自动控制来补加氧气，当细胞增殖到高峰时，耗氧较大时，氧气处于持续添加的状态，而且仍然供应不足，细胞液缺氧，在没有人员进操作间进调节的话，氧气不足，液体缺氧将影响细胞的增殖，影响细胞密度，从而影响培养的病毒效价。
发明内容
本发明的目的在于提供一种悬浮培养生物反应器及培养猪塞尼卡谷病毒的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种悬浮培养生物反应器，其包括具有可拆卸上盖的罐体，罐体内设有搅拌器和生物反应探测电极，罐体的上表面对应设有搅拌器安装口和电极接口，搅拌器用于罐体内液体进行搅拌，罐体的底部设有排液口，排液口处设有排液阀门；罐体的沿罐壁四周以及罐体底部布设有细胞过滤网，细胞过滤网小于悬浮细胞的直径，细胞过滤网根据培养需要沿罐体内壁升降且细胞过滤网底部的上升高度不超过搅拌器的底部最低点；罐体上表面设有液料接口和至少两个进气口，两个进气口用于向罐体通入不同压力的供应氧，液料接口包括进液口、取样口和细胞进口，进液口用于培养过程中通入培养液，取样口用于通过管道取出样品进行观察及检测，细胞进口用于向罐体内添加悬浮细胞。
进一步地，细胞过滤网呈现与罐体的内壁相同桶形结构，细胞过滤网的上端安装固定于罐体的上端内侧壁上，细胞过滤网的下部设有一圈粗钢丝环，粗钢丝环的相对两侧分别安装一沿着罐体内壁设置的升降钢丝，升降钢丝的外侧套设有一软硅胶套，软硅胶套的的上端固定于罐体上端面，两侧的升降钢丝分别穿过罐体的上端面并相对软硅胶套相对滑动。
进一步地，两侧的升降钢丝的上端分别与一电机连接，电机由控制按钮控制转动，电机的转动带动升降钢丝升降。
进一步地，罐体上表面还设有备用口
进一步地，生物反应探测电极包括PH电极、温度电极和溶氧电极，电极接口包括PH电极接口、温度电极接口和溶氧电极接口。
进一步地，搅拌器包括搅拌轴，搅拌轴上分布有多个搅拌桨，搅拌器安装口设于罐体的上表面的中心处，搅拌轴的一端固定于搅拌器安装口，搅拌轴与搅拌桨构成搅拌器，搅拌器在罐体内呈竖直设置。
进一步地，一种悬浮培养生物反应器培养猪塞尼卡谷病毒的方法，其包括以下步骤：
步骤1，悬浮生物反应器的准备：向组装好的生物反应器的罐体内加入少量的PBS，并对生物反应器进行灭菌后待使用；
步骤2，摇床悬浮BHK-21的培养：两个进气口的压力分别调节为0.02-0.03MPa和0.07-0.08MPa，，将罐体内的PBS排出后加入悬浮细胞无血清营养液，摇床的悬浮细胞按0.5-1×106个/ml的密度添加至生物反应器并补足细胞营养液，连接碱瓶，碱瓶装有质量浓度7.5％的NaHCO3溶液。碱瓶通过硅胶管道连接至进液口或取样口中，硅胶管道连接一泵并通过泵进行补碱；同时开启通气系统、温度系统及搅拌器调节好各项培养参数进行培养48h，温度：36.5-37.5℃，DO：50-60％，PH：7.2-7.4，转数：40-60r/min；
步骤3，悬浮生物反应器的放大培养：当悬浮细胞培养至48h后取样进行细胞计数，根据细胞计数结果按细胞数量0.5-1×106个/ml的密度换算放大后罐体内所需细胞数量；
停止搅拌器并控制细胞过滤网升起，打开罐底部的排液阀将含代谢物的细胞培养液排出，排液结束后关闭排液阀并控制细胞过滤网降下，加入部分新的无血清营养液，开启搅拌器搅拌均匀，再根据计算出的放大用所需的细胞数量打入另一个准备好的生物反应器，并补足所需营养液，调节好各项培养参数再培养24h，
步骤4.塞尼卡谷病毒接种培养：当悬浮BHK-21细胞培养至24h后，将原细胞培养液排出，按体积百分比0.1％-1％的接毒量将猪塞尼卡谷谷病毒加入新的营养液通入罐体中，调节好各项培养参数再培养24h，
步骤5，抗原收获：当接毒BHK-21细胞培养至24-48h时，每4h观察不同时间细胞病变的结果，当细胞病变率达到80％以上时收获；将细胞病毒液从取样口排出收获，分装若干小样品用于效价的检测，并将样品及收获抗原液置-15度以下冰柜冷冻保存；
步骤6，抗原效价检测：将抗原样品用含2％的新生牛血清的MEM培养基作10倍系列稀释，对不同稀释度的抗原样品进行对照培养，观察细胞病变按Reed-Muench法计算TCID50，即病毒效价。
进一步地，步骤1中对生物反应器进行121～125度30分钟的灭菌。
进一步地，步骤2中的两个进气口的的氧气由一自动切换程序控制切换通气，以保证罐体的供氧。增加两路进氧气的切换程序，在细胞培养初期一路调节小压力供应氧，一路调节大压力供应氧，在细胞培养过程中当氧气供不足时不需人工进线手动调节阀门加大氧气供应，可通过的控制系统自动切换至另一路增加氧气压力的进气调节系统，以满足细胞生长所需氧气需求。
进一步地，步骤3或步骤4中的培养参数为：温度：36.5-37.5℃，DO：50-60％，PH：7.2-7.4，转数：40-60r/min。
进一步地，步骤6中分别取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，分别接种于已长成良好单层的96孔BHK-21细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照6孔，阳性对照6孔，置37℃5％CO2培养箱中培养3日，观察细胞病变(CPE)，按Reed-Muench法计算TCID50，即病毒效价。
本发明采用以上技术方案，在悬浮反应罐内沿罐壁周围及底部安装一个能截留不同细胞的细胞过滤网，过滤网的孔径选择1-5um，在罐顶上安装一个控制按钮，控制过滤网的升降，在罐的底部设置一个排液口安装排液阀，排液口在过滤网的外侧。在悬浮培养细胞过程中及放大培养过程中可以通过提升过滤网高度过滤悬浮细胞，通过底部阀门随时在罐内快速去除原有的培养液，更换新的培养液，从而增加细胞营养成份，减少原有培养液中代谢物对细胞的影响。
此外，在溶氧控制系统中设置两路进氧气调节口，增加两路进氧气的切换程序，在细胞培养初期一路调节小压力供应氧，一路调节大压力供应氧，在细胞培养过程中当氧气供不足时不需人工进线手动调节阀门加大氧气供应，可通过的控制系统自动切换至另一路增加氧气压力的进气调节系统，以满足细胞生长所需氧气需求。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明；
图1为本发明一种悬浮培养生物反应器的结构示意图；
图2为本发明一种悬浮培养生物反应器的外侧结构示意图；
图3为本发明一种悬浮培养生物反的细胞过滤网结构示意图。
具体实施方式
为了在细胞悬浮培养过程当中可随时更换液体增加营养，在细胞放大培养中去除原有培养液，大大减少细胞代谢物，更换新营养液培养细胞，提高细胞增长速度，提高细胞密度，从而提高培养的抗原效价。在细胞生长旺盛期能够通过自动控制满足细胞生长所需的氧气供应，促进细胞生长，提高细胞密度，从而提高培养的病毒效价。
如图1-3之一所示，本发明公开了一种悬浮培养生物反应器，其包括罐体1，罐体1内设有搅拌器2和生物反应探测电极3，罐体1的上表面对应设有搅拌器安装口20和电极接口4，搅拌器2用于罐体1内液体进行搅拌，罐体1的底部设有排液口11，排液口11处设有排液阀门12；罐体1的沿罐壁四周以及罐体1底部布设有细胞过滤网5，细胞过滤网5小于悬浮细胞的直径，细胞过滤网5由升降机构带动沿罐体1内壁升降且细胞过滤网5底部的上升高度不超过搅拌器2的底部最低点；罐体1上表面设有液料接口6和至少两个进气口7，两个进气口7用于向罐体1通入不同压力的供应氧，液料接口6包括进液口61、取样口62和细胞进口63，进液口61用于培养过程中通入培养液，取样口62用于通过管道从罐体1中取出样品，细胞进口63用于向罐体1内添加悬浮细胞。
进一步地，细胞过滤网5呈现与罐体1的内壁相同桶形结构，细胞过滤网5的上端安装固定于罐体1的上端内侧壁上；作为一种固定方式，罐体1的上端内壁四周均布有若干固定挂钩(图中未表示)，细胞过滤网5的上端对应固定挂钩设有若干挂环(图中未表示)，细胞过滤网5通过固定挂钩与挂环的配合固定于罐体上端。细胞过滤网5的下部设有一圈粗钢丝环8，粗钢丝环8的相对两侧分别安装一沿着罐体1内壁设置的升降钢丝9，升降钢丝9的外侧套设有一软硅胶套10，软硅胶套10的的上端固定于罐体1上端面，两侧的升降钢丝9分别穿过罐体1的上端面并相对软硅胶套10相对滑动。
进一步地，两侧的升降钢丝9的上端分别与一电机(图中未表示)连接，电机由控制按钮控制转动，电机的转动带动升降钢丝9升降。
进一步地，罐体1上表面还设有备用口64。
进一步地，生物反应探测电极3包括PH电极、温度电极和溶氧电极，电极接口4包括PH电极接口41、温度电极接口42和溶氧电极接口43。
进一步地，搅拌器2包括搅拌轴21，搅拌轴21上分布有多个搅拌桨22，搅拌器安装口20设于罐体1的上表面的中心处，搅拌轴21的一端固定于搅拌器安装口20，搅拌轴21与搅拌桨22构成搅拌器2，搅拌器2在罐体1内呈竖直设置。
进一步地，一种悬浮培养生物反应器培养猪塞尼卡谷病毒的方法，其包括以下步骤：
步骤1，悬浮生物反应器的准备：向组装好的生物反应器的罐体1内加入少量的PBS，并对生物反应器进行灭菌后待使用；
步骤2，摇床悬浮BHK-21的培养：两个进气口7的压力分别调节为0.02-0.03MPa和0.07-0.08MPa，，将罐体1内的PBS排出后加入悬浮细胞无血清营养液，摇床的悬浮细胞按0.5-1×106个/ml的密度添加至生物反应器并补足细胞营养液，并在液料接口处连接碱瓶进行补碱，碱瓶装有质量浓度7.5％的NaHCO3溶液；具体地，碱瓶通过硅胶管道连接至进液口61、取样口62中，碱瓶还通过硅胶管道连接一动力泵，并由动力泵进行补加；同时开启通气系统、温度系统及搅拌器2调节好各项培养参数进行培养48h，温度：36.5-37.5℃，DO：50-60％，PH：7.2-7.4，转数：40-60r/min；
步骤3，悬浮生物反应器的放大培养：当悬浮细胞培养至48h后取样进行细胞计数，根据细胞计数结果按细胞数量0.5-1×106个/ml的密度换算放大后罐体1内所需细胞数量；
停止搅拌器2并控制细胞过滤网5升起，打开罐底部的排液阀将含代谢物的细胞培养液排出，排液结束后关闭排液阀并控制细胞过滤网5降下，加入部分新的无血清营养液，开启搅拌器2搅拌均匀，再根据计算出的放大用所需的细胞数量打入另一个准备好的生物反应器，并补足所需营养液，调节好各项培养参数再培养24h，
步骤4.塞尼卡谷病毒接种培养：当悬浮BHK-21细胞培养至24h后，将原细胞培养液排出，按体积百分比0.1％-1％的接毒量将猪塞尼卡谷谷病毒加入新的营养液通入罐体1中，调节好各项培养参数再培养24h，
步骤5，抗原收获：当接毒BHK-21细胞培养至24-48h时，每4h观察不同时间细胞病变的结果，当细胞病变率达到80％以上时收获；将细胞病毒液从取样口62排出收获，分装若干小样品用于效价的检测，并将样品及收获抗原液置-15度以下冰柜冷冻保存；
步骤6，抗原效价检测：将抗原样品用含2％的新生牛血清的MEM培养基作10倍系列稀释，对不同稀释度的抗原样品进行对照培养，观察细胞病变按Reed-Muench法计算TCID50，即病毒效价。
进一步地，步骤1中对生物反应器进行121～125度30分钟的灭菌。
进一步地，步骤2中的两个进气口7的的氧气由一自动切换程序控制切换通气，以保证罐体1的供氧。增加两路进氧气的切换程序，在细胞培养初期一路调节小压力供应氧，一路调节大压力供应氧，在细胞培养过程中当氧气供不足时，即液体中溶氧持续10分钟为0时不需人工进线手动调节阀门加大氧气供应，可通过的控制系统自动切换至另一路增加氧气压力的进气调节系统，以满足细胞生长所需氧气需求。
进一步地，步骤3或步骤4中的培养参数为：温度：36.5-37.5℃，DO：50-60％，PH：7.2-7.4，转数：40-60r/min。
进一步地，步骤6中分别取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，分别接种于已长成良好单层的96孔BHK-21细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照6孔，阳性对照6孔，置37℃5％CO2培养箱中培养3日，观察细胞病变(CPE)，按Reed-Muench法计算TCID50，即病毒效价。
采用本发明设备及制备方法具有如下有益效果：
(1)、提高健康细胞密度。
使用10升的悬浮生物反应器培养5升的BHK-21细胞，，悬浮细胞上罐细胞密度为,0.7×106/ml，对比两种方法的培养BHK-21细胞至48h的细胞密度，用两种方法各生产5批。
(2)、提高接毒细胞密度，提高病毒效价.
使用10升的悬浮生物反应器培养5升的BHK-21细胞及塞尼卡谷病毒，悬浮细胞上罐细胞密度为0.8×106/ml，对比新旧两种方法的细胞增长最高倍数及培养病毒的毒价。用两种方法各生产5批。
本发明采用以上技术方案，在悬浮反应罐内沿罐壁周围及底部安装一个能截留不同细胞的细胞过滤网5，细胞过滤网5的孔径选择1-5um，且细胞过滤网5的升降可控制，在罐的底部设置一个排液口11安装排液阀，排液口11在过滤网的外侧。在悬浮培养细胞过程中及放大培养过程中可以通过提升细胞过滤网5高度过滤悬浮细胞，通过底部阀门随时在罐内快速去除原有的培养液，更换新的培养液，从而增加细胞营养成份，减少原有培养液中代谢物对细胞的影响。
同时在罐体1设置至少两路进氧气调节口，通过两路进氧气的切换程序在细胞培养初期一路调节小压力供应氧，一路调节大压力供应氧，在细胞培养过程中当氧气供不足时不需人工进生产线手动调节阀门加大氧气供应，可通过的控制系统自动切换至另一路增加氧气压力的进气调节系统，以满足细胞生长所需氧气需求。

Claims (10)

1.一种悬浮培养生物反应器，其包括具有可拆卸上盖的罐体，罐体内设有搅拌器和生物反应探测电极，罐体的上表面对应设有搅拌器安装口和电极接口，搅拌器用于罐体内液体进行搅拌，罐体的底部设有排液口，排液口处设有排液阀，其特征在于：罐体的沿罐壁四周以及罐体底部布设有细胞过滤网，细胞过滤网小于悬浮细胞的直径，细胞过滤网根据培养需要沿罐体内壁升降且细胞过滤网的底部的上升高度不超过搅拌器的底部最低点；罐体上表面设有液料接口和至少两个进气口，两个进气口用于向罐体通入不同压力的供应氧，液料接口包括进液口、取样口和细胞进口，进液口用于培养过程中通入培养液，取样口用于通过管道取出样品进行观察及检测，细胞进口用于向罐体内添加悬浮细胞。
2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养生物反应器，其特征在于：细胞过滤网呈现与罐体的内壁相同桶形结构，细胞过滤网的上端安装固定于罐体的上端内侧壁上，细胞过滤网的下部设有一圈粗钢丝环，粗钢丝环的相对两侧分别安装一沿着罐体内壁设置的升降钢丝，升降钢丝的外侧套设有一软硅胶套，软硅胶套的的上端固定于罐体上端面，两侧的升降钢丝分别穿过罐体的上端面并相对软硅胶套相对滑动。
3.根据权利要求1所述的一种悬浮培养生物反应器，其特征在于：两侧的升降钢丝的上端分别与一电机连接，电机由控制按钮控制转动，电机的转动带动升降钢丝升降。
4.根据权利要求1所述的一种悬浮培养生物反应器，其特征在于：所述生物反应探测电极包括PH电极、温度电极和溶氧电极，电极接口包括PH电极接口、温度电极接口和溶氧电极接口。
5. 根据权利要求1所述的一种悬浮培养生物反应器，其特征在于：所述搅拌器包括搅拌轴， 搅拌轴上分布有多个搅拌桨，搅拌器安装口设于罐体的上表面的中心处， 搅拌轴的一端固定于搅拌器安装口，搅拌轴与搅拌桨构成搅拌器，搅拌器在罐体内呈竖直设置。
6.一种悬浮培养生物反应器培养猪塞尼卡谷病毒的方法，其包括以下步骤：
步骤1，悬浮生物反应器的准备：向组装好的生物反应器的罐体内加入少量的PBS，并对生物反应器进行灭菌后待使用；
步骤2，摇床悬浮BHK-21的培养：两个进气口的压力分别调节为0.02-0.03MPa和0.07-0.08MPa，将罐体内的PBS排出后加入悬浮细胞无血清营养液，摇床的悬浮细胞按0.5-1×106个/ml的密度添加至生物反应器并补足细胞营养液，进液口或取样口连接碱瓶进行补碱，碱瓶装有质量浓度7.5%的NaHCO3溶液；同时开启通气系统、温度系统及搅拌器调节好各项培养参数进行培养48h，温度：36.5-37.5℃，DO：50-60%，PH：7.2-7.4，转数：40-60r/min；
步骤3，悬浮生物反应器的放大培养：当悬浮细胞培养至48h后取样进行细胞计数，根据细胞计数结果按细胞数量0.5-1×106个/ml的密度换算放大后罐体内所需细胞数量；
停止搅拌器并控制细胞过滤网升起，打开罐底部的排液阀将含代谢物的细胞培养液排出，排液结束后关闭排液阀并控制细胞过滤网降下，加入部分新的无血清营养液，开启搅拌器搅拌均匀，再根据计算出的放大用所需的细胞数量打入另一个准备好的生物反应器，并补足所需营养液，调节好各项培养参数再培养24h，
步骤4.塞尼卡谷病毒接种培养：当悬浮BHK-21细胞培养至24h后，将原细胞培养液排出，按体积百分比0.1%-1%的接毒量将猪塞尼卡谷谷病毒加入新的营养液通入罐体中，调节好各项培养参数再培养24h，
步骤5，抗原收获：当接毒BHK-21细胞培养至24-48h时，每4h观察不同时间细胞病变的结果，当细胞病变率达到80%以上时收获；将细胞病毒液从取样口排出收获，分装若干小样品用于效价的检测，并将样品及收获抗原液置-15度以下冰柜冷冻保存；
步骤6，抗原效价检测：将抗原样品用含2%的新生牛血清的MEM培养基作10倍系列稀释，对不同稀释度的抗原样品进行对照培养，观察细胞病变按Reed-Muench法计算TCID50，即病毒效价。
7.根据权利要求6所述的一种悬浮培养生物反应器培养猪塞尼卡谷病毒的方法，其特征在于：步骤1中对生物反应器进行121~125度30分钟的灭菌。
8.根据权利要求6所述的一种悬浮培养生物反应器培养猪塞尼卡谷病毒的方法，其特征在于：步骤2中的两个进气口的供应氧由一自动切换程序控制，在细胞培养初期一路调节小压力供应氧，一路调节大压力供应氧；在细胞培养过程中当氧气供不足即液体中溶氧持续10分钟为0时自动切换程序控制切换至另一路增加氧气压力的进气调节系统以满足细胞生长所需氧气需求。
9.根据权利要求6所述的一种悬浮培养生物反应器培养猪塞尼卡谷病毒的方法，其特征在于：步骤3或步骤4中的培养参数为：温度：36.5-37.5℃，DO：50-60%，PH：7.2-7.4，转数：40-60r/min。
10. 根据权利要求6所述的一种悬浮培养生物反应器培养猪塞尼卡谷病毒的方法，其特征在于：步骤6中分别取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，分别接种于已长成良好单层的96孔BHK-21细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照6孔，阳性对照6孔，置37℃ 5%CO2培养箱中培养3日，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50，即病毒效价。
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