CN101311175A - 新的山酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类新的山酮类化合物，特别是F02ZA－1593B和F02ZA－1593B₂，以及含有上述化合物或其可药用盐的药物组合物，并且提供了利用微生物发酵制备该山酮类化合物的方法。本发明的化合物可用于制备抗高血糖剂、抗高血脂剂、胰岛素抵抗改善剂、糖尿病治疗药、糖尿病并发症、抗动脉粥样硬化剂、抗炎症剂以及代谢综合症和PPAR介导的其他疾病的预防和治疗药物。

Description

新的山酮类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明公开了一类新的山酮类化合物及其药物组合物，利用微生物发酵制备该山酮类化合物的方法，及其在制备用于抗高血糖剂、抗高血脂剂、胰岛素抵抗改善剂、糖尿病治疗药、糖尿病并发症、抗动脉粥样硬化剂、抗炎症剂以及代谢综合症和PPAR介导的其他疾病的预防和治疗药物中的用途。

背景技术

糖尿病是以高血糖、胰岛素抵抗为主要特征，同时伴随有脂质、糖类以及蛋白质代谢异常的一种慢性疾病，其中90％以上是II型糖尿病。胰岛素抵抗是指靶组织对正常浓度的胰岛素生理反应减弱，是大多数II型糖尿病患者的显著特点。胰岛素抵抗时会出现抑制糖异生能力减弱，葡萄糖摄取能力下降，并导致β细胞分泌胰岛素增加，引起代偿性高胰岛素血症。随着对胰岛素增敏剂尤其是噻唑烷二酮类药物作用机制的研究，发现这类药物的作用靶点可能在于一种核转录因子，即过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPAR)，因而掀起了研究PPAR的热潮。人们希望通过对PPAR与胰岛素抵抗之间关系的深入探讨，找到一条能够有效改善胰岛素抵抗的途径。

PPAR是一类核转录因子，属核受体超家族成员，它包括3种亚型：PPARα、PPARβ(或称PPARδ，Nuc-1或FAAR)以及PPARγ，这3种亚型在结构及功能上均表现有差异。PPAR与糖尿病、高血脂，高胆固醇，动脉粥样硬化，抗炎、抗氧化等各种代谢性疾病的关系已经被得到了深入地研究，成为此类药物的研发热点[Trends in Endocrinology and Metabolism，2006，17(7)：284-290]。

PPARα主要表达于脂肪酸氧化速度较快的肝细胞、心肌细胞、肠上皮细胞等，以单一形式存在。目前认为长链脂肪酸是其内源性配体，贝特类降脂药物可以与PPARα特异结合，通过调节多种脂代谢相关的重要基因对脂质紊乱起重要的调节作用[Ann Acad Med Singapore，1999，28：778-782]。

PPARγ主要表达于脂肪组织，体内外研究已经证明PPARγ参与体内细胞增殖、分化、凋亡、免疫、代谢等人体几乎所有的生理过程，与人类许多疾病如心血管疾病、糖尿病、痴呆症和癌症都有密切的关系。以PPARγ为靶点的噻唑烷二酮类药物作为胰岛素增敏剂在II型糖尿病临床治疗上取了得显著的效果，近年来随着对胰岛素增敏剂类药物作用机制的深入研究，发现PPARγ是该类药物的主要功能受体，于是展开了对于PPAR与胰岛素抵抗之间关系的研究。噻唑烷二酮(TZD)类药物激活PPARγ，可以改善胰岛素抵抗。

PPARβ/δ(NR1C2)是PPAR家族中表达比较广泛的一个亚型，在脂肪组织、骨骼肌、心脏、神经胶质细胞、巨噬细胞、胚胎组织、肿瘤组织、皮肤等均有表达。近年来由于利用PPARδ的激动剂在动物体内可以起到降低低密度脂蛋白(LDL)的水平，而增加HDL的水平，降低胰岛素浓度和减轻体重等，使PPARδ受到越来越多的关注，并逐渐成为药物研发的新热点。

PPARδ活化后，通过促进脂肪酸的β-氧化和解偶联氧化磷酸化，促进全身脂肪燃烧而起到降脂作用。PPARβ/δ另外可以通过调节脂肪吸收的相关蛋白，如脂肪酸结合蛋白(FABP)和脂肪酸移位酶(FAT)的基因表达控制小肠上皮细胞对脂质的吸收。体内外的研究结果表明PPARδ可以成为减肥药物研发的靶点。

研究发现，PPARβ/δ特异激动剂L-165041能中度升高db/db小鼠HDL水平，但对血糖和TG浓度无明显影响，但在具有胰岛素抵抗的肥胖中年恒河猴，效能更高的PPARβ/δ特异激动剂GW-501516不但能显著提高HDL-胆固醇水平，还能降低TG、LDL及胰岛素水平，增加胰岛素敏感性[Cell，2003，113(2)：159-70]。

PPARδ能够通过减少肌肉组织的脂肪含量，增加氧化肌纤维数目，阻碍肥胖的发生，而改善胰岛素抵抗，使血糖水平下降。PPARδ激动剂治疗肥胖的老鼠可以降低血清和血浆胰岛素水平。增加细胞外信号调节激酶(ERK1/2)促分裂原活性蛋白酶，和AMP活化蛋白酶的表达和磷酸化，但GLUT的表达水平没有变化。MAPK抑制剂可以抑制该作用。所以PPAR的糖代谢所用可能是通过激活MAPK和AMPK而不是增加葡萄糖载体的数量。最近研究发现，PPARδ基因多态性和空腹血糖水平与体重指数相关。总的说来，PPARδ主要通过改善胰岛素抵抗和胰岛素水平，以及直接增加糖摄取调节糖代谢，PPARδ激动剂有望成为新一代的抗糖尿病药物[Biochim Biophys Acta，2005，1740(2)：313-7]。

以PPAR为靶点寻找安全有效的新的预防和治疗糖尿病、高血脂、高胆固醇、动脉粥样硬化等各种代谢性疾病胰岛素增敏剂药物，目前已成为研究热点。

发明内容

发明人对PPAR介导的疾病的预防和治疗药物进行了大量研究，发现某些微生物的代谢产物对PPAR具有激动活性，可以用于抗高血糖、抗高血脂、胰岛素抵抗改善、预防或治疗糖尿病和糖尿病并发症、抗动脉粥样硬化、抗炎以及抗代谢综合症和PPAR介导的其他疾病的预防和治疗，因此完成本发明。

具体地，本发明涉及：

1、下式(I)或(II)的化合物及其可药用盐或溶剂化物：

2.一种制备项1任一化合物的方法，包括：培养产生所述化合物的微生物，然后对所得发酵液进行分离和纯化。

3.根据项2的方法，其中所述的微生物为曲霉(Aspergillus sp.)CGMCCNo.2037。

4.一种药物组合物，其含有项1任一化合物作为活性成份和可药用载体。

5.项1任一化合物在制备预防或治疗PPAR介导的疾病的药物中的用途。

6.项1任一化合物在制备预防或治疗高血糖、高血脂、胰岛素抵抗、糖尿病、糖尿病并发症、动脉粥样硬化、炎症以及抗代谢综合症的药物中的用途。

7.项1任一化合物在制备用于预防或治疗糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症的药物中的用途。

8.项6或7的用途，其中所述的糖尿病并发症选自由下列疾病组成的组：糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病神经系统疾病、糖尿病心脏病、糖尿病动脉硬化和糖尿病微血管病。

本发明涉及的具有上述用途的化合物不仅是化合物本身，适当时也可以是其药学上可接受的盐(酸或碱加成盐)或其溶剂化物(例如水合物、醇合物等)，下文中为简便起见，都简称为本发明的化合物。

上述药学可接受的加成盐包括化合物能够形成的治疗活性的非毒性酸和碱加成盐形式。碱性的化合物通过用适当的酸处理碱的形式可转化成它们的药学可接受的酸加成盐。酸的例子包括无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸；有机酸，诸如乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、乙醇酸、马来酸、丙二酸、草酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸、苯甲酸、抗坏血酸等。碱加成盐形式的例子是钠、钾、钙盐，以及与药学可接受的胺形成的盐，所述的胺是诸如氨、烷基胺、苯胺和氨基酸，诸如精氨酸和赖氨酸。

本发明还提供了制备上述化合物的方法，该方法包括：

1.提供能够通过发酵产生项1化合物的微生物，优选真菌，特别优选曲霉(Aspergillsu sp.)F02Z-1593。该菌种F02Z-1593已于2007年5月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.2037。

菌株来源：产生菌株F02Z-1593是从我国厦门戴云山自然保护区土壤样品中分离得到。

菌种鉴定：在PDA平板上，26℃，10-14天：菌落直径45-55mm，质地丝绒状至絮状，疏松或致密。菌落中央隆起，颜色呈浅棕色，较疏松，分生孢子结构大量。其他部分，较平坦，呈白色至灰绿色，较致密。边缘菌丝呈灰绿色，疏松。中央有渗出液，无色或浅棕色。菌落反面中央呈棕色，边缘也呈棕色、呈环形，其余部分呈浅灰绿色。

分生孢子梗生自基质或气生菌丝，带浅棕色，壁较厚，光滑；分生孢子头球形，全部表面可育；产孢结构双层；分生孢子稍大，球形，壁较粗糙。

根据以上培养特征可以确定该菌种F02Z-1593为曲霉Aspergillus sp.。

2.选择性地在种子培养基上培养微生物。

3.提供一种发酵培养基，该培养基为本领域常用培养基，优选含有下列成份：葡萄糖，酵母粉，NaCl，CaCO₃。

4.将微生物在发酵培养基中进行发酵。

5.选择性地对所得发酵液进行分离和纯化。

本发明的一个实施方案中，优选在pH约为7的条件下发酵。本发明另一实施方案中，分离包括离心发酵液，收集菌体，用溶剂提取菌体再除去溶剂，纯化包括硅胶柱层析和选择性的HPLC单组分制备。

本发明方法不受上述顺序的限制，并且所述培养基成分可以在本领域技术人员可预见的范围内改变。

另一方面，本发明还提供了一类药物组合物，其含有作为活性成分的上述项1任一化合物和可药用载体。药物组合物的制备方法为本领域常用方法。

本文所述的化合物或其药学上可接受的加成盐或水合物可以利用各种给药途径或方式给予患者。适合的给药途径包括但不限于口服、直肠、经粘膜、肠内和肠胃外给药，肠胃外给药包括肌内、皮下和静脉内注射。

本文所用的术语“给药”可涵盖所有直接与间接释放化合物到其预期作用部位的手段。

本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或水合物可以单独给药，与其他本发明化合物联合给药，和/或以与其他已知治疗剂联合的形式给药。

本发明的活性化合物可以本身形式给药的，或者以药物组合物形式给药，其中活性化合物是与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合的。按照本发明使用的药物组合物通常是按常规方式配制的，使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。

关于口服给药，化合物可以是这样配制的，将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体结合。这类载体使本发明化合物能够配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬液等，用于被所要治疗的患者口服。口服药物制剂可以这样得到，与固体赋形剂混合，可选地研磨所得混合物，加工颗粒的混合物，如果需要的话加入适合的助剂，得到片剂或锭剂芯。适合的赋形剂确切地是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖或甘露糖醇；纤维素制备物，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。

可以口服的药物制剂包括推入配合的胶囊剂，由明胶制成，以及软的密封胶囊剂，由明胶和一种增塑剂制成，例如甘油。推入配合的胶囊剂可以含有活性成分与下列成分的混合物：填充剂，例如乳糖；粘合剂，例如淀粉；和/或润滑剂，例如滑石粉或硬脂酸镁或微粉硅胶；和可选的稳定剂。在软胶囊剂中，活性化合物可以是溶解或悬浮在适合的液体中的，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。所有口服给药制剂都应当是适合于这类给药的剂量。

关于颊给药，组合物可以采取片剂或糖锭剂的形式，按常规方式配制。

关于通过吸入给药，按照本发明使用的化合物适宜以气雾剂的形式从加压包装或雾化器中释放出来，其中利用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气雾剂的情况下，通过提供计量释放的阀门可以确定剂量单位。用在吸入器或吹入器内的明胶胶囊和药筒可以配制成含有化合物与适合的粉末基质的粉末混合物，例如乳糖或淀粉。

化合物可以配制用于肠胃外给药，通过注射，例如急推注射或连续输注。注射用制剂可以是单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器内，其中加入防腐剂。组合物可以采取在油性或水性载体中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制用试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。

肠胃外给药用药物制剂包括水溶性活性化合物的水溶液。酌情可以制备活性化合物的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体，水性注射悬液可以含有增加悬液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠葡聚糖。可选地，悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以便制备高浓缩的溶液。

或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用适合的载体再生，例如无菌无热原的水。

化合物还可以配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯。

除了前述制剂以外，化合物还可以配制成药库制剂。这类长效制剂可以通过植入或经皮释放(例如皮下或肌内)、肌内注射或透皮贴剂给药。因而，例如，化合物可以与适合的聚合或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性盐。

药物组合物还可以包含适合的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物，例如聚乙二醇。

优选地，组合物是单位剂型，例如片剂或胶囊剂。

给药方式以及有效剂量的选择将尤其根据所治疗的疾病而异。给药方式和剂量的选择在本领域技术人员的能力范围内。

本发明化合物的单位剂型通常将含有0.1至99重量％活性物质，更通常为5至75重量％活性物质。举例来说，单位剂型可以含有1mg至1g化合物，更通常为10mg至500mg，例如在50mg与400mg之间，剂量通常为100mg至200mg。

每个剂量单位或每次口服给药优选地含有1至250mg(关于肠胃外给药，优选地含有0.1至25mg)的项1化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的化合物将按照有效提供所需治疗效果的量给药。提供所需治疗效果所必要的浓度将尤其根据疾病的明确性质、患者的年龄、体重和疾病的严重性而异。

给药剂量优选地将对患者是无毒的，不过在某些情况下所治疗疾病的严重性可能迫使给以导致一些毒性迹象的量的化合物。

通常，本发明化合物的给药量将在0.01mg/kg至100mg/kg体重的范围内，更优选为0.1mg/kg至10mg/kg体重，特别是1mg/kg至5mg/kg体重。

药学上可接受的本发明化合物正常地将按照每日剂量方案对受治疗者给药。关于成年患者，例如可以是项1化合物或其药学上可接受的盐的口服剂量在1mg与500mg之间，优选在1mg与250mg之间，或者静脉内、皮下或肌内剂量在0.1mg与100mg之间，优选在0.1mg与25mg之间，按照游离化合物计算，化合物每天分1至4次给药。因而，关于体重70kg的普通人，本发明化合物的典型每日剂量将在70mg至700mg的范围内。这样一种剂量例如可以每日分二至四次给药。

不过，给药剂量的大小和给药的频率最终将由治疗该患者的医师来决定和判断。

本发明的化合物还可以选择性地与已知的抗高血糖剂、抗高血脂剂、胰岛素抵抗改善剂、糖尿病治疗药、糖尿病并发症、抗动脉粥样硬化剂、抗炎症剂以及代谢综合症和PPAR介导的其他疾病的预防和治疗药物联合给药。当它与已知药物联合给药时，与它们可以同时、分别或顺序给药。

附图说明

图1为产生菌F02Z-1593的菌落形态照片；

图2为产生菌F02Z-1593的显微照片；

图3为F02ZA-1593B的HRMS图；

图4为F02ZA-1593B的¹H NMR图谱；

图5为F02ZA-1593B的¹³C NMR图谱；

图6为F02ZA-1593B₂的HRMS图；

图7为F02ZA-1593B₂的¹H NMR图谱；

图8为F02ZA-1593B₂的¹³C NMR图谱；

图9为F02ZA-1593B对PPARγ和PPARβ的上调倍数与浓度的关系图；

图10为F02ZA-1593B₂对PPARγ和PPARβ的上调倍数与浓度的关系图；

图11为F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂对脂肪细胞的糖消耗水平与浓度的关系图；

图12为F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂处理巨噬细胞后的显微镜镜检结果。

具体实施方式

下面实施例进一步详细说明本发明，但它们并非理解成对本发明范围的任何限制。

仪器与试剂为本领域技术人员常用的仪器与试剂。除非特别说明，本发明中所说的％均为重量百分比。

材料：L02细胞、3T3-L1前脂肪细胞、RAW264.7巨噬细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)，lipofectamine 2000，Superscript ∏ Reverse Transcriptase(购自Invitrogen公司)，肝组织和脂肪组织总RNA(购自Clontech公司)、pG5luc(购自promega公司)。

紫外光谱仪：Pharmacia公司Ultrospec 2100Pro型

核磁共振仪：Varian公司inova 500

高分辨质谱仪：Bruker Daltonics公司Apex II FT-ICRMS

细胞板读板仪：Perkin Elmer公司Victor² 1420 Multilabel Counter

实施例1菌种的培养

斜面培养基：PDA培养基。

种子培养基：淀粉2％，葡萄糖1％，热榨黄豆饼粉0.2％，麦牙粉0.6％，酵母粉0.3％，NaCl 0.2％，MgSO₄.7H₂O 0.1％，CaCO₃ 0.2％pH7.0。

发酵培养基：大米培养基为每100g大米中加入豆粉2.5g。

由真菌F02Z-1593斜面，接种于种子培养基，27℃，72hr培养后，接入内含量为100g大米培养基的750ml三角瓶中，于固体培养基中培养14天。

实施例2化合物F02ZA-1593B、F02ZA-1593B₂的分离及结构

F02Z-1593固体培养物2kg，用4000ml乙酸乙酯浸泡2小时，乙酸乙酯层经无水Na₂SO₄脱水后，浓缩抽干后，得到褐色物质13.0g。

取12.0g样品，用少量甲醇溶解后，使用硅胶柱(φ2.5×25cm)色谱进行进一步的分离纯化，层析柱的洗脱条件为100％的氯仿至100％的甲醇阶段洗脱，收集合并活性组分，浓缩抽干后得褐色固体980mg。

取上述活性物质，使用ODS反相柱(PHENOMENEX ODSφ21.2×250mm)在制备型HPLC(购自Waters公司，pump：600，Detector：2487，Injector：7725i)上进行单组分的制备[流动相为CH₃CN-(1‰CF₃COOH)H₂O(60∶40)，流速为6ml/min，检测波长为254nm]，得到淡黄色粉末状物质F02ZA-1593B 73mg、F02ZA-1593B₂ 86mg，保留时间分别为8.8min和12.0min。

(1)F02ZA-1593B：

分子量(ESI-MS)：426

高分辨质谱HSFAB-MS：测定值：353.1017；理论值：353.1019(C₂₀H₁₇O₆)；分子式：C₂₀H₁₆O₆

UVλ_max(in MeOH)：227，263，290，346nm

¹³C NMR(125MHz，CDCl₃，ppm)141.6(C-2)，112.3(C-3)，115.4(C-4)，112.0(C-4a)，158.9(C-5)，113.3(C-5a)，175.1(C-6)，113.6(C-6a)，160.7(C-7)，109.2(C-8)，133.9(C-9)，105.8(C-10)，157.1(C-10a)，156.8(C-11a)，95.0(C-12)，161.6(C-12a)，143.0(C-13a)，61.2(5-OCH₃)，56.5(7-OCH₃)，56.1(12a-OCH₃)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃，ppm)7.49(1H，t，J＝1.5)(H-2)，6.90(1H，d，J＝1.5)(H-3)，6.97(1H，d，J＝8.0)(H-8)，7.53(1H，t，J＝8.0)(H-9)，6.79(1H，d，J＝8.0)(H-10)，6.71(1H，s)(H-12)，7.86(1H，brs)(H-13a)，3.75(3H，s)(5-OCH₃)，4.01(3H，s)(7-OCH₃)，3.99(3H，s)(12a-OCH₃)

F02ZA-1593B结构式如下：

(2)F02ZA-1593B₂：

淡黄色粉末；UVλ_max(MeOH)：248，306，350nm

ESI-MS(+)，m/z 403.5[M+H]⁺；

HRFAB-MS(+)，m/z 403.0580[M+H]⁺(calcd 403.0579 for C₂₀H₁₆ClO₇)，分子式：C₂₀H₁₅ClO₇。

¹³C NMR(125MHz，CDCl₃，ppm)145.2(C-2)，103.2(C-3)，48.4(C-4)，118.8(C-4a)，151.2(C-5)，112.2(C-5a)，174.2(C-6)，118.0(C-6a)，155.8(C-7)，124.2(C-8)，134.5(C-9)，114.4(C-10)，155.1(C-10a)，150.7(C-11a)，128.3(C-12)，153.1(C-12a)，113.0(C-13a)，61.4(5-OCH₃)，61.9(7-OCH₃)，62.2(12-OCH₃)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃，ppm)6.49(1H，t，J＝2.5)(H-2)，5.37(1H，t，J＝2.5)(H-3)，4.77(1H，dt，J＝7.0，2.5)(H-4)，7.64(1H，d，J＝9.0)(H-9)，7.26(1H，d，J＝9.0)(H-10)，6.80(1H，d，J＝7.0)(H-13a)，4.00(3H，s)(5-OCH₃)，4.03(3H，s)(7-OCH₃)，4.05(3H，s)(12-OCH₃)

F02ZA-1593B₂结构式如下：

实施例3对PPAR的激动活性

(1)pBIND-PPARα-LBD表达质粒的构建

按照Superscript ∏ Reverse Transcriptase试剂盒说明书对肝总RNA进行反转录，再以cDNA为模板进行PCR，将PCR的产物进行胶回收，并连接到pGME-TVector，然后进行测序。将测序结果与Genebank上的目的序列进行比对。将序列正确的PPARα-LBD进行双酶切与pBIND Vector连接构成表达质粒pBIND-PPARα-LBD。

(2)PPAR的激动活性测定

将L02细胞以3×10⁵个/mL细胞数接种细胞于96孔板，24h后，将培养液换成含10％胎牛血清的无双抗的PRMI 1640培养基，用lipofectamine 2000将重组质粒的报告质粒pG5luc和pGAL4-PPAR-LBD嵌合表达质粒共转染入细胞中。6h加入不同浓度的药物诱导，DMSO作为空白对照。给药24h后，Victor²1420Multilabel Counter，利用Luciferase Assay System检测细胞中荧光素酶的活性。将F02ZA-1593B从2mg/ml的始浓度进行3倍的系列梯度稀释，在96孔板转染培养的细胞中加1μl样品，24h培养结束后检测对荧光素酶的诱导活性。药物的荧光素酶的活性值与空白DMSO孔的荧光素酶活性值的比值为表达上调倍增数，结果见图9。针对F02ZA-1593B₂，我们也做了相同的实验，取得了类似的结果，见图10。

结果表明，F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂对PPARγ/β都有较好的上调活性，是PPARγ/β的激动剂。(表1)

表1F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂对PPARγ和PPARβ的激动活性

实施例4细胞糖消耗的测定

3T3-L1细胞在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，并加入100U/ml青霉素，0.1mg/ml的链霉素，隔天换液1次。细胞汇合达70％～80％时，以0.25％胰蛋白酶消化、传代至24孔板。当细胞完全汇合后2d(此时为诱导分化的第0天)，加入分化诱导液(含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中加入0.5mmol/L IBMX(Sigma)、1μmol/L地塞米松(Sigma)、2μmol/L胰岛素(Sigma))，培养48h后，换成含有10％胎牛血清和2μmol/L胰岛素的DMEM/F12培养基，再培养48h后，换成仅含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养至85％～95％的3T3-L1细胞都分化为成熟的脂肪细胞。将96孔板中诱导分化成熟的脂肪细胞分为空白组，实验组(F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂)和对照组(insulin)。继续培养三天后，取细胞培养的上清液利用血糖测定试剂盒(南京建成生物公司)测定细胞培养液中的糖浓度。实验结果表明，F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂对脂肪细胞的糖吸收和消耗有明显的刺激作用(图11)。

实施例5对巨噬细胞泡沫化的抑制作用

实验组RAW264.7巨噬细胞用5μM F02ZA-1593B与氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)同时处理，孵育48小时。对照组RAW264.7巨噬细胞仅用OX-LDL处理，孵育48小时。显微镜镜检表明，对照组细胞形态不完整，呈泡沫化，有很多的油红染色的油滴。经过F02ZA-1593B处理的细胞形态比较完整，油红染色明显变浅。这说明F02ZA-1593B化合物对巨噬细胞的泡沫化有抑制作用。在相同的实验中，F02ZA-1593B₂也表现出相似的作用(图12)。

实施例6对糖尿病小鼠血糖的影响

利用糖尿病db/db小鼠(购自北京维通利华实验动物中心，无菌条件喂养，自由摄食，饮水)测定药物的降糖作用。将小鼠分为空白对照组、阳性对照组rosiglizaone(ROS，马来酸罗格列酮，葛兰素史克)和实验药物组，每组10只。各组血浆中的葡萄糖的平均值和标准差基本相等。将被检验化合物悬浮或溶解于5％阿拉伯胶溶液，阳性对照组ROS按4mg/kg，实验药物组按10mg/kg。给药组连续口服给药10天，在最后给药24小时后，在非绝食状态下从尾静脉取血，使用血糖测定试剂盒(南京建成生物公司)测定血浆中的葡萄糖浓度。结果表明，化合物F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂均可以有效降低小鼠的血糖浓度，见表2。

表2化合物对小鼠血糖和胰岛素的影响

^*与对照组相比p＜0.05

实施例7对糖尿病小鼠胰岛素的影响

将糖尿病db/db小鼠分为空白对照组、阳性对照组(ROS)和实验药物组，每组10只。将被检验化合物悬浮或溶解于5％阿拉伯胶溶液，阳性对照组ROS按4mg/kg，实验药物组按10mg/kg。给药组连续口服给药10天，在最后给药24小时后，在非绝食状态下从尾静脉取血，使用胰岛素测定试剂盒(南京建成生物公司)测定血浆中的胰岛素浓度。结果表明，F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂均可以增加小鼠胰岛素敏感性以及降低胰岛素含量(上表2)。

实施例8对糖尿病小鼠甘油三酯的影响

将糖尿病db/db雄性小鼠分为空白对照组、阳性对照组(ROS)组和实验药物组，每组10只。将被检验化合物的悬浮或溶解于5％的阿拉伯胶溶液，阳性对照组ROS按4mg/kg，实验药物组按10mg/kg。给药组连续口服给药10天，在最后给药24小时后，在非绝食状态下从尾静脉取血，使用甘油三酯测定试剂盒(南京建成生物公司)测定血浆中的甘油三酯浓度。结果表明，F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂均可以降低小鼠甘油三酯水平(表3)。

实施例9对糖尿病小鼠胆固醇的影响

将糖尿病db/db雄性小鼠分为空白对照组、阳性对照组(ROS)组和实验药物组，每组10只。将被检验化合物的悬浮或溶解于5％的阿拉伯胶溶液，阳性对照组ROS按4mg/kg，实验药物组按10mg/kg。给药组连续口服给药10天，在最后给药24小时后，在非绝食状态下从尾静脉取血，使用总胆固醇测定试剂盒(南京建成生物公司)测定血浆中的总胆固醇含量。结果表明，F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂均可以降低小鼠胆固醇水平(表3)。

表3化合物对小鼠甘油三酯和胆固醇的影响

^*与对照组相比p＜0.05

实施例10对糖尿病小鼠体重和腹部脂肪重量的影响

将糖尿病db/db雄性小鼠分为空白对照组、阳性对照组(ROS)和实验药物组，每组10只。将被检验化合物悬浮或溶解于5％的阿拉伯胶溶液，阳性对照组ROS按4mg/kg，实验药物组按10mg/kg。给药组连续口服给药15天，在第0天，5天，10天，15天测定动物体重，并在第15天测定小鼠的腹部脂肪重量。结果表明，在给药15天后，本发明的化合物对肥胖小鼠体重以及腹部脂肪含量没有明显影响(表4)。

表4化合物对小鼠体重和腹脂重量的影响

本发明的山酮化合物F02ZA-1593B和F02ZA-1593B₂及其药学上可接受的盐，通过对PPAR的激活作用，显示了较好的降血糖、降血脂及降胆固醇作用，并可用于改善胰岛素抵抗，可以作为抗高血糖剂、抗高血脂剂、胰岛素增敏剂、糖尿病治疗药、抗糖尿病并发症药物、抗动脉粥样硬化剂、抗炎症剂、抗代谢综合症药物以及PPAR介导的其他疾病的预防和治疗。

Claims (8)

1.下式(I)或(II)的化合物及其可药用盐或溶剂化物：

2.一种制备权利要求1任一化合物的方法，包括：培养产生所述化合物的微生物，然后对所得发酵液进行分离和纯化。

3.根据权利要求2的方法，其中所述的微生物为曲霉(Aspergillus sp.)CGMCCNo.2037。

4.一种药物组合物，其含有权利要求1任一化合物作为活性成份和可药用载体。

5.权利要求1任一化合物在制备预防或治疗PPAR介导的疾病的药物中的用途。

6.权利要求1任一化合物在制备预防或治疗高血糖、高血脂、胰岛素抵抗、糖尿病、糖尿病并发症、动脉粥样硬化、炎症以及抗代谢综合症药物中的用途。

7.权利要求1任一化合物在制备用于预防或治疗糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症的药物中的用途。

8.权利要求6或7的用途，其中所述的糖尿病并发症选自由下列疾病组成的组：糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病神经系统疾病、糖尿病心脏病、糖尿病动脉硬化和糖尿病微血管病。

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