UA95733C2 - Спосіб отримання ендотеліальних клітин (варіанти) - Google Patents
Спосіб отримання ендотеліальних клітин (варіанти) Download PDFInfo
- Publication number
- UA95733C2 UA95733C2 UAA201007592A UAA201007592A UA95733C2 UA 95733 C2 UA95733 C2 UA 95733C2 UA A201007592 A UAA201007592 A UA A201007592A UA A201007592 A UAA201007592 A UA A201007592A UA 95733 C2 UA95733 C2 UA 95733C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- endothelial cells
- differentiation
- human
- escs
- Prior art date
Links
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 104
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 98
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 87
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 6
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 4
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 28
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 abstract 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 abstract 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 abstract 2
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 abstract 2
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 abstract 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 abstract 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 abstract 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 abstract 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 abstract 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 abstract 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 20
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 12
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 12
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 12
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 9
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 9
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 7
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 102100035475 Blood vessel epicardial substance Human genes 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 101001094636 Homo sapiens Blood vessel epicardial substance Proteins 0.000 description 5
- 101000608194 Homo sapiens Pyrin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000595404 Homo sapiens Ribonucleases P/MRP protein subunit POP1 Proteins 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 2
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000181331 Saron Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000009762 endothelial cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 210000003566 hemangioblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- -1 mtarigel Polymers 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 2
- 101100122469 Arabidopsis thaliana CYT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035131 DNA demethylation Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150033052 MAS5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001611408 Nebo Species 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100344462 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YDJ1 gene Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 108010051583 Ventricular Myosins Proteins 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000002403 aortic endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000029803 blastocyst development Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000000487 effect on differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002336 epiblast cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007608 epigenetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=CC(O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Винахід належить до біотехнології, а саме - до отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини та їх застосування. Спосіб отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини передбачає диференціювання ЕСК людини на підкладці і в синтетичному середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини на основі суміші DMEM/FI2 з КО замінником сироватки з факторами росту VEGF SCF, BMP4, bFGF, TGFbeta в ефективних кількостях, причому TGFbeta додають на 3-6 день диференціювання. Також може бути використане середовище для диференціювання на основі суміші DMEM/FI2 з фетальною бичачою сироваткою з факторами росту VEGF, SCF, bFGF. Сепарацію проводять на 3-9 день методом імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для ендотеліальних клітин, після чого отримані ендотеліальні клітини культивують у вказаному середовищі при щільності посіву не менше 50000 клітин на 1 см.
Description
Винахід відноситься до біотехнології а саме - до отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини та їх застосування. Людські ембріональні стовбурові клітини (позначення, прийняте в світі - ПЕ5С5) потрібно розглядати, як цінне джерело для регенеративної медицини через їх здатність диференціюватися в усі типи клітин. Отримані в результаті диференціювання ендотеліальні клітини можуть знайти широке застосування в медичній практиці і у вивченні механізмів диференціювання.
Ендотеліальні клітини не тільки вистилають стінки кровоносної судини, але і також здатні мігрувати в потоці крові до різних місць. Таким чином, вони могли використовуватися не тільки для регенерації судин за допомогою їх інтеграції або секреції ростових факторів, а й слугувати транспортним засобом для терапевтичного гена або доставки препарату. Проте, потенційне клінічне застосування диференційованих іп міо клітин вимагає підтвердження, що бажаний клітинний фенотип буде підтриманий без повернення до плюрипотентного стану.
Попередній рівень техніки
На стадії розвитку бластоцисти відбувається формування внутрішньої клітинної маси бластоцисти (ВКМ), з якої і отримують лінії ЕСК. Здатність НЕЗС5 диференціюватися в деякі специфічні типи клітин в даний час інтенсивно вивчається. Загальна мета таких досліджень зазвичай полягає в тому, щоб отримувати спеціалізовані функціональні клітини. Однак подальша можливість застосування цих клітин для лікування людини може бути реалізована тільки за умови забезпечення стійкої клітинної спеціалізації. Таким чином, потрібно розглядати не тільки морфологічні, імунологічні, або функціональні властивості клітини, але також і генетичні та епігенетичні.
Диференціація ЕСК по визначеному шляху супроводжується зміною патерну експресії генів, від генів, характерних для плюрипотентного стану, до тканиноспецифічних генів. Зміна патерну експресії здійснюється за рахунок загасання експресії ключових факторів транскрипції що беруть участь у підтримці плюрипотентності, і експресією тканиноспецифічних транскрипційних факторів. Паралельно працюють епігенетичні механізми регуляції експресії генів, які репресують гени, необхідні для плюрипотентного стану, і активують тканиноспецифічні. Так як ЕСК - це іп міго аналог клітин епібласта, що штучно підтримуються в недиференційованому стані, при зміні умов культивування ЕСК спонтанно диференціюються в різні типи клітин. іп міо спонтанне диференціювання ЕСК людини спостерігається як при тривалому культивуванні прикріплених колоній, так і в процесі росту ембріоідних тілець (ЕТ) в суспензії. На відміну від ЕСК миші, не всі лінії ЕСК людини легко утворюють ембріоідні тільця, і ні одна лінія ЕСК не утворює ембріоідні тільця з поодиноких клітин.
Для ЕСК людини була показана здатність до диференціювання в багато типів клітин: нейрони і глія, ендотелій, кератиноцити, трофобласти, кардіоміоцити, остеобласти, клітини крові, гепатоцити, інсулін- продукуючі клітини та деякі інші.
Похідні ентодерми отримати виявилося найважче. У нещодавно опублікованих повідомленнях про диференціювання ЕСК людини в інсулін-секретуючі клітини (1) і гепатоцити (2), було показано, що за білковим і генетичним маркерами вони збігаються зі зрілими інсулін-секретуючими клітинами або гепатоцитами. Однак, чинники, що визначають диференціювання в ентодерму, погано охарактеризовані і майже відсутні маркери раннього ентодермального диференціювання.
На відміну від ЕСК миші, які легко диференціюються в кардіоміоцити у відсутності ІенКкетіа іппіріюгу тасіог
ІЕ, спонтанне диференціювання ЕСК людини спостерігається у різних ліній ЕСК у різному відсотку випадків - від ділянок, що спонтанно скорочуються в 7095 ЕТ до повної відсутності спонтанного диференціювання (3).
Показано, що кардіоміоцити, диференційовані з ЕСК людини, експресують транскрипційні фактори МкКх 2.5,
САТАА, а також - специфічні маркери кардіоміоцитів - тропонін 1 і важкий ланцюг альфа-міозину. Нещодавно була опублікована робота з диференціювання кардіоміоцитів у безсироваточному середовищі, минаючи стадію ембріоїдних тілець (4). При тривалому культивуванні ЕСК можуть піддаватися штучній випадковій селекції. Крім того, як виявилося, ЕСК, ідентичні за основними морфологічними характеристиками та експресії основних генів, можуть відрізнятися епігенетичним статусом у регуляторних областях деяких генів. Ці фактори можуть призводити до того, що клітинні лінії ЕСК будуть мати переважні шляхи диференціювання. Тобто, наприклад, ЕСК будуть легко диференціюватися в нейрони і погано - в кардіоміоцити. Можливо, саме різниця в епігенетичному статусі ЕСК миші і людини може пояснити настільки різний потенціал диференціювання.
При нормальному розвитку ембріона судинна тканина формується з мезодерми. Незабаром після гаструляції мезодерма формується, як окремий шар між екто-і ендодермою. Передбачається, що ендотеліальні і гематопоетичні клітини походять від спільного мезодермального попередника - гемангіобласта (5). Клітини-попередники, які потенційно здатні утворювати гематопоетичні і ендотеліальні клітини, були ідентифіковані на моделі мишачих ЕСК (6,7,8) і лише пізніше - іп мімо, при вивченні гаструляції мишачого ембріона (9). Існує три основних технічних підходи для вивчення диференціювання ЕСК в клітини ендотелію і гематопоетичні клітини. Перший - диференціювання ЕСК в ендотеліальні або гематопоетичні клітини через стадію ЕТ (10-15). Другий - спільне культивування ЕСК зі стромальних клітин (16, 17). Третій - диференціювання ЕСК в двовимірних умовах (18, 8).
Диференціація ЕСК через утворення ЕТ - це завжди спонтанне, ненаправлене диференціювання. Як вже згадувалося, ЕТ містить клітини, що походять з різних зародкових листків, і тому частка клітин необхідного типу мала. Відсоток клітин ендотелію в ембріоідних тільцях становить близько 2905. Крім того, цей підхід має ще кілька обмежень. Наприклад, важко спостерігати клітини в мікроскоп, проводити аналіз диференціювання одиничних клітин, важко розділяти клітини з агрегатів клітин в ЕТ. Однак, на сьогоднішній день у великій кількості публікацій використовується саме цей підхід. Це обумовлено, зокрема, тим, що спрямоване диференціювання клітин вимагає спеціального підбору умов, а ЕТ - грубий модельний аналог розвитку ембріону, в якому присутні різні клітини, в тому числі і необхідні досліднику.
Нами було перевірено, чи є ендотеліальні клітини в ЕТ, що були утворені з ліній ЕСК людини, що знаходились в нашому розпорядженні. Для аналізу були взяті лінії НЕ5МОЇ і пЕЗМОЗ. Ці лінії, виділені в лабораторії раніше, проявляли характерну для даного типу клітин морфологію, експресували відповідні маркери і мали нормальний каріотип (19). При переведенні в суспензійну культуру ЕСК формували ЕТ з характерною морфологією для даного типу структур. При імуногістохімічному аналізі ембріоідних тілець після 10-12 днів культивування були виявлені в невеликій кількості (не більш ніж 1-595) ендотеліоцитоподібні клітини, що експресують СОЗ1 (фіг. 1).
Диференціація ЕСК людини в клітини ендотелію у двовимірних умовах (минаючи стадію утворення ЕТ) використовувалася тільки однією групою дослідників (20). Відомий спосіб обраний нами в якості найближчого аналога. Спосіб передбачає диференціювання ЕСК людини в присутності людського фактору росту ендотелію судин (МЕСЕ) на підкладці з колагену ІМ. Селекція ендотеліальних клітин здійснювалася за розміром клітин за допомогою фільтрації через фільтр з діаметром пор 40 мкм. З робота не ясно, яку частку становили клітини ендотелію після селекції. Однак, вважаючи, що ендотеліальні клітини пов'язані з гематопоетичними клітинами і походять від спільного попередника гемангіобласта, механічний вибір не міг забезпечити бажану чистоту клітин. Швидше за все, даний метод селекції не варто використовувати, якщо необхідно отримати чисту популяцію клітин ендотелію.
Короткий опис фігур.
Фіг.1 Імуногістохімічний аналіз 1Омкм кріозрізу ЕТ 12 днів культивування. А-ЕТ лінії Е2МО1, забарвлення антитілами до СО31 (червоний); Б-ЕТ лінії Е5МОЗ, забарвлення антитілами до СО31 (червоний); ядра пофарбовані САРІ (синій). Вторинні антитіла доаї апії-тоизе АІеха Рішог 546.
Фіг2 Формування судиноподібних структур і моншару при диференціюванні ЕСК людини (8 днів). А - світле поле. Б - імуногістохімічне забарвлення антитілами до СОЗ1.
Фіг.З Оцінка життєздатності СО31 позитивних клітин після проведення іммуномагнітної сепарації. А - п'ятий день диференціювання; Б - сьомий день диференціювання. Живі клітини (зелений), мертві (помаранчевий). Фотографія отримана за допомогою флуоресцентного мікроскопа. фіг.4 Диференціація ЕСК людини в ендотеліальні клітини в двовимірній системі: А -недиференційовані колонії ЕСК на фідері МЕФ; Б - диференційовані похідні, З день культивування; В - диференційовані похідні, 5 день культивування; Г - судиноподібні структури, 7 день культивування.
Фіг.5 А - СОЗ31 клітини ендотелію, отримані з ЕСК через 24 години після селекції (фотографія в світлому полі). Б - імуногістохімічний аналіз ЕСК після проведення іммуномагнітної сепарації. Експресія. СОЗ31 (червоний); ядра пофарбовані САРІ (синій). Вторинні антитіла АІеха Рішог 546. В - Тест на матрігелі (Маїгде!
Аззау), що показує ендотеліальну природу виділених за допомогою іммуномагнітної сепарації клітин.
Фіг.б6 ЗТ-ПЛР аналіз генів МЕ-садпегіп, САТА-2, РІКІ, САРОН, САТА-3, еМмо5, СОЗ31 в недиференційованих
ЕСК лініях Е5БМОЗ (І), клітинах ендотелію з ЕСК лінії Е5МОЗ, отриманих за допомогою імуномагнітної сепарації (Е ) і в клітинах ендотелію з пуповинної вени (Н) людини. фіг.7 Результати бісульфітного секвенування промоторної області гена САТА-2 з 43 по -187 нуклеотид щодо старту транскрипції. (А) ЕСК людини, (Б) ендотелій, отриманий з ЕСК людини, (В) НОМЕС. фіг.8 Результати бісульфітного секвенування промоторної області гена САТА-3 з 228 по -115 нуклеотид щодо старту транскрипції (А) з ЕСК людини, (Б) ендотелій, отриманий з ЕСК людини, (В) НОМЕС фіг.9 Результати бісульфітного секвенування промоторної області гена еМмоз5 з 13 по -297 нуклеотид щодо старту транскрипції (А) з ЕСК людини, (Б) ендотелій отриманий, з ЕСК людини, (В) НОМЕС
Фіг. 10 Зміна щільності кровоносних судин через 30 днів після введення клітин ендотелію 10 а - до введення, 10 б - через 30 днів після введення. Фіг. 11. (А) матрігель, видалений з експериментальних тварин через 8 днів, що не містить клітини ендотелію, (б) матрігель, видалений з експериментальних тварин через 8 днів, що містить клітини ендотелію.
Розкриття винаходу Нами була поставлена задача розробити ефективний та відтворюваний метод диференціювання ПЕ5С5 в чисту популяцію функціональних ендотеліальних клітин, в якій зміни патерну генної регуляції відповідають зрілим ендотеліальним клітинам. На відміну від диференціювання через стадію
ЕТ, пряме диференціювання ЕСК просте для спостереження за клітинами і маніпуляцій з ними, однак вимагає попередніх досліджень з визначення умов диференціювання. Крім того, контрольоване диференціювання, по- перше, повинно приводити переважно до бажаного клітинного фенотипу. По-друге, повинна існувати можливість селекції потрібних популяцій клітин, причому сам процес селекції не повинен істотно впливати на життєздатність клітин та їх диференціювання. Наступним поставленим перед нами завданням є розробка методу сепарації попередників ендотелію та ендотеліальних клітин з диференційованих ЕСК людини.
Відсутність у літературі даних по диференціювання ЕСК людини в двовимірній системі без формування
ЕТ в ендотеліальні клітини вимагала визначення умов і середовищ для диференціювання. Було випробувано понад 15 способів культивування з різними поєднаннями середовищ, сироваток та ростових факторів. Для цього колонії ЕСК переміщували в чашки Петрі з ростовими середовищами різного складу (табл.1). Табл.1.
Порівняння різних середовищ для диференціювання ЕСК людини в ендотелій. Порівняння проводилося через 8 днів культивування на підставі імуногістохімічного аналізу.
Таблиця 1
Альфа-
Нусіопе Нусіопе св) сей жд 000 ЩЕ осю р гігей гігей сироватки
МЕСЕ МЕС СЕ,
Ростові Активін, МЕС ЕСЕ, ЕСЕ МЕСЕ МЕС ЕСЕ, СЕ " ВМРА фактори МЕСЕ ЗСЕ, ЕСЕ ває ЗСЕ, ЕСЕ ЕСЕ такгрега!
СРаЕ
ЇМ ІМ
Колаген клітин ендотелію, 0-2 5-8 5-8 10-15 25-40 »50 о
У процесі диференціювання були виявлені окремі клітини, що експресують ранній маркер ендотелію СОЗ1 і маркер пізнього, диференційованого ендотелію - фактор Вон Віллібрандта (УМ/Е).
Після застосування різних композицій середовищ в різних комбінаціях з факторами росту були виявлені ростові фактори, що забезпечують ефективне диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини. До таких ростових факторів білкової природи відносяться 5ієт сеї! гасіог 5СЕ (виробник Спетісоп), людський фактор росту ендотелію судин МЕСЕ (виробник Спетісоп), бопе тогрподепіс ргоїєїп ВМРА, Бравіс Яргобіаві дгоуйй Тасіог ОРСЕ (виробник Спетісоп), шШтог дгоуми Гасіог ТОгреїа.
Кількісні співвідношення даних ростових факторів залежить від складу середовища, наявності або відсутності в середовищі компонентів невизначеного походження, а також - можуть варіювати в залежності від ліній ЕСК, що використовувались. Кількість ростових факторів може бути підібрана експериментальним шляхом.
Протягом диференціювання в середовищі, що містить компоненти, необхідні для спрямованої диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, ми могли спостерігати зміни і в морфології клітин і в специфічній експресії маркерів ендотелію. Спочатку, на 4 день після індукції диференціювання, були виявлені
СО31 ендотеліальні маркери. Поява судиноподібних структур співпала з експресією УМ/Р. На день 6-7 майже 6095 клітин експресували СОЗ1 молекулу і до кінця процедури диференціювання (12-ий день), приблизно 5095 клітин експресували СО105 антиген (табл. 2). При цьому варто зауважити, що експресія СО133 молекули була висока в недиференційованих МПЕ5С5 і знижувалася протягом диференціювання в ендотеліальних попередниках. Досить високий відсоток диференціювання в ендотеліальні клітини дозволяв нам проводити тест на формування судин без селекції клітин.
Таблиця 2 ср 77/11. 11
МЕсаднениї 1777-1111. 111 сріз3/171711я3 Ї111сяю ЇЇ ЇЇ 11 -
МЕ 11117111 -11171- 1011-15 151 соло5 Її 7-17 - 1117-11-11 - 151 со834 77/17 - 1111717 - 1111515 1-1 хх .
СОЗ31 позитивні клітини представлені не тільки в складі судиноподібних структур, але і у вигляді моношару (Фіг.2). За даними досліджень, баланс між судиноподібнимі клітинами і моношаром залежить від концентрації
МЕС.
Для сепарації диференційованих з ЕСК людини ендотеліальних клітин нами було обрано метод імунологічної селекції з використанням поверхневих чи внутрішніх маркерів, специфічних для клітин ендотелію. Наприклад, в даному випадку використовувався метод імуномагнітної сепарації МАС5 (тадпеїйс асіїмагейа сеї! вопіпд) - ефективна технологія магнітного сортінга, заснована на поділі клітин по поверхневим антигенам (сМ.м/млиу. тікепуіріоїес.сот). Подібний метод дозволяє швидко і ефективно (з чистотою 9895 і більше) провести селекцію потрібної популяції клітин з поверхневими маркерами. Однак, може бути використаний і інший метод, наприклад - флуоресцентно-активований клітинний сортінг (РАС5) або будь-які інші, що дозволяють розділити клітини в залежності від поверхневих чи внутрішніх маркерів.
Для селекції ендотелію, отриманого з ЕСК у двовимірній системі, ми скористалися маркером СОЗ1, але можуть бути використані й інші маркери ендотелію, такі, як СО34, фактор УМ/Е або інші.
Селекцію на СОЗ31 проводили на 5-7 день диференціювання. Помічено, що життєздатність клітин, відібраних на 5 день, була вища, ніж відібраних на день 7 після початку диференціювання (Фіг.3). Цей факт можна пояснити тим, що на 7 день диференціювання клітини ендотелію вже формують структури, які досить важко зруйнувати ферментативною обробкою, а збільшення часу обробки та/або руйнування міжклітинних контактів, що вже сформувалися, веде до істотного зниження життєздатності. Отже, проведення селекції на 5 день диференціювання в наших умовах можна вважати оптимальним. При використанні для селекції інших маркерів, селекцію можна проводити на 3-9 дні диференціювання.
Виділені клітини висівали на чашки, покриті колагеном, в середовище для ендотеліального диференціювання. Клітини висівали у високій щільності (не менше 50000 клітин на 1сма2 і більше), так як посів у більш низькій щільності негативно впливав на життєздатність клітин.
Нами запропоновано 2 варіанти способу отримання ендотеліальних клітин з ЕСК людини.
Сутність першого варіанту способу отримання ендотеліальних клітин з ЕСК людини полягає в наступному: 1. Проведення диференціювання ЕСК людини на підкладці і в синтетичному середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, з МЕСЕ, 5СЕ, ВМР4А, рЕСЕ, тагреїа. Використання як основи синтетичного середовища суміші рідкої ОМЕМ/РІ2 з рідким КО замінником сироватки в кількості (06.95): рідка ОМЕМ/РІ2- 75-9595, рідка КО замінник сироватки - 5-2595. Причому ТаЕреїа вносять в синтетичне середовище на 3-6-ий день диференціювання. 2. Проведення імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для клітин ендотелію на 3-9 дні диференціювання. 3. Культивування ендотеліальних клітин при щільності посіву не менш 50000 клітин на 1сма2.
Сутність другого варіанту способу отримання ендотеліальних клітин з ЕСК людини полягає в наступному: 1 Проведение диференціювання ЕСК людини на підкладці і в середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, з МЕСЕ, 5СЕ, СЕС. Використання, як основи, середовища суміші рідкої ОМЕМ/РІ2 і фетальної бичачої сироватки в кількості (06.95): рідка ОМЕМ/РІ2- 75- 95905, рідка фетальна бичача сироватка - 5-2595. 2. Проведення імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для клітин ендотелію на 3-9 дні диференціювання. 3. Культивування ендотеліальних клітин при щільності посіву не менш 50000 клітин на 1см2.
У наших способах були випробувані лінії клітин ПНЕ5МОЇ1, ПЕБМОЗ НЕЗМО2, 04, НІ, НОЕ57, 8,9, при цьому отримані результати були близькими, що підтверджує можливість його застосування для диференціювання будь-яких ЕСК людини. Співвідношення компонентів середовища може оптимізуватися для кожної клітинної лінії окремо для досягнення максимальної ефективності. В якості середовища для культивування клітин можуть бути використані й інші синтетичні середовища повністю відомого і охарактеризованого складу.
Заявлені способи дозволяють отримати високий вихід клітин в кінці процедури диференціювання, що мають імунологічні маркери ендотелію, більшість з яких здатна брати участь у формуванні трубчастої мережі.
Навіть більше, диференціювання було відтворене з використанням замінника сироватки замість охарактеризованої фетальної бичачої сироватки (ЕВ5) що значно краще від існуючих методів диференціювання. Використання синтетичного середовища, що не містить компонентів тваринного походження, робить метод відтворюваним і незалежним від складу сироватки. Проте, навіть у цьому випадку, приблизно половина клітин була представлена невідомим типом клітин або незначною популяцією недиференційованих клітин. Важливо відзначити, що навіть маленький відсоток недиференційованих клітин або клітин, які диференціювалися в різні типи, може забруднити клітинну культуру. Ці сторонні популяції можуть мати великий вплив на безпеку і функціональну ефективність культури для терапевтичного застосування або подальшого вивчення. Таким чином, селекція специфічної популяції клітин важлива.
СО31 визнаний кращим імунологічним маркером ендотеліальних клітин, і в той же самий час його експресія була виявлена дуже рано, на 6 день ПЕ5С» диференціювання, що дозволило його використовувати в методі імуномагнітного сортінга. Однак, використання інших маркерів (наприклад, СОЗ34, фактор УМ/Е) та інших методів селекції (наприклад, ЕАС5) теж давало гарні результати.
Варіанти здійснення винаходу
Можливість здійснення способу підтверджується наступними прикладами його реалізації, які показують лише окремі випадки його виконання.
Приклад 1. Культивування ЕСК людини.
Лінії ЕСК людини культивували в середовищі, що містить 8095 КпоскОці ЮОМЕМ, 2095 КО замінника сироватки, глутамін 1 мм, 195 замінні амінокислоти, 50 пеніциліну ОД/мл, 50 мкг/мл стрептоміцину (виробник
Іпмігодеп), 0,1 мМ р-меркаптоетанолу (Зідта), і 4 мкг/мл БРаЕ (Спетісоп) на інгібованих мітоміцином С (10мкг/мл, бідта) мишачих ембріональних фібробластах (МІФ) при щільності 104 клітин/см2 в культуральних чашках, покритих 0,196-ним желатином (Мегск). Фібробласти готували з 12-денних мишачих ембріонів РІ (С57ВІ/6бухСвА/Са). НЕ5С колонії пасерували кожні 5-6 днів культивування обробкою колагенази типом ІМ (200Ш/ті, Іпмігодеп) і механічною диссекцією. Чашки з недиференційованими колоніями НЕ5С, вирощеними протягом 8 днів, обробляли колагеназою ІМ протягом 10 хвилин, змивали двічі ростовим середовищем, і збирали колонії з фідера механічно, наконечником мікропіпетки вручну. Плюрипотентні лінії клітин, ізольовані і вирощені на фідері, показували типову ЕСК морфологію клітини, експресували імунологічні маркери, характерні для недиференційованих клітин і підтримували нормальний каріотип. Ми не спостерігали навіть маленький відсоток СОЗ1 позитивних клітин в недиференційованих колоніях.
Приклад 2. Диференціація ЕСК людини в ендотеліальні клітини.
Середовище для диференціювання.
Для диференціювання використовували синтетичне середовище наступного складу: основа 8595 рідкої
ОМЕМ/Е12 (Нусіопе або аналог іншої фірми), 1595 рідкого КО замінник сироватки (Іпмийгодеп або аналог іншої фірми) з додаванням 1 95 замінних амінокислот, 2 мМ І-глутаміну, 50 од/мл пеніциліну, 50 мг/мл стрептоміцину, 50 нг/мл 5СЕ, 1О0нг/мл ВМРА, 50 нг/мл МЕС, активіна ІОнг/мл, 20 нг/мл СЕС, 2нг/мл ТОгБеїа.
ТОБ Брейа вносять на 4 день диференціювання. Концентрації і поєднання ростових факторів можуть відрізнятися від зазначених на 50-10095 залежно від клітинної лінії та індивідуальних умов культивування.
Спосіб приготування середовища.
Рідке середовище ОМЕМ/НІ2 змішували з рідким замінником сироватки, антибіотиками і глутаміном і для подальшого використання зберігалося при 40 С. Всі інші компоненти (ростові фактори тощо) додавалися в середовище безпосередньо перед додаванням до клітин. Повне середовище не зберігалося. Методика проведення диференціювання.
Чашки з недиференційованими колоніями ПЕС, вирощеними протягом 8 днів (фіг.4А), обробляли колагеназою ІМ протягом 10 хвилин, змивали двічі ростовим середовищем, колонії збирали вручну наконечником мікропіпетки, розрізаючи на фрагменти розміром 300-500 клітин. Колонії ЕСК для проведення диференціювання були переміщені в 35 мм чашки Петрі, покриті колагеном ІМ (70 цйд/ті) в середовищі, зазначеного вище складу (Фіг.48). На 4день диференціювання в середовище додавали 2нг/мл ТОРьеїа 1. На наступний після додавання день клітини набували морфологію диференційованих похідних (Фіг. 48). На 6-10 день культивування колонії містили кластери судиноподібних структур (Фіг. 4Г).
Приклад 3. Диференціація ЕСК людини в ендотеліальні клітини.
Відрізняється від прикладу 1 використанням середовища на основі суміші рідких ОМЕМ/Е12 (Нусіопе) і фетальної бичачої сироватки (Нусіопе спагасієгігед).
Середовище для диференціювання.
Для диференціювання використовували середовище наступного складу: основа 8595 рідкої ОМЕМ/Е12 (Нусіопе або аналог іншої фірми) і 1595 фетальної бичачої сироватки (Нусіопе, спагасієгі7гей або аналог іншої фірми), 2 мМ І!-глутаміну, 195 замінні амінокислоти, 50 одиниць/мл пеніциліну, 50 мг/мл стрептоміцину, (всі від
Іпмігодеп або аналог іншої фірми), 20 нг/мл СЕ (Спетісоп або аналог іншої фірми), від 10 до 50 нг/мл МЕСЕ (Спетісоп або аналог іншої фірми), 5 нг/мл БЕРСЕ (Спетісоп або аналог іншої фірми) Ростові фактори можуть варіювати, як зазначено в прикладі 1. Средовище готують, як описано в прикладі 1.
Клітини також на 3-6 день набували морфологію диференційованих похідних. На 6-10 день культивування колонії містили кластери судиноподібних структур.
Приклад 4. Сепарація ендотеліальних клітин.
Для СО31 ж клітинної селекції клітини на 5-7 день диференціювання були відокремлені обробкою колагенази ІМ (Іпийгодеп або аналог іншої фірми) при 377 С протягом 10 хвилин і змиті двічі забуференим фосфатом фізіологічним розчином (рпозрпаїє рийега заїйпе РВ5), який містить 0,595 альбуміну бичачої сироватки (В5А). Отримані клітини інкубували протягом ЗОхвилин з антитілами миші проти СО31 людини в порції 10 мкг на 105 клітин і потім з Їдс кози проти миші, пришитими до магнітних кульок (Мікепуї Віоїес або аналог іншої фірми) протягом 15 хв при 82С. СОЗ31 позитивні клітини були ізольовані, проходячи через фільтр і колонку М5, прикріплену до магнітного блоку Міпі-МАС5 верагайоп ипії (Мікепуї Віоїесп або аналог іншої фірми), щоб отримати збережену магнітом фракцію очищених СОЗ1 «ж клітин. Після елюції СОЗ31 позитивні клітини були поміщені на покриті колагеном ІМ плашки з щільністю посіву 50000 клітин на 1сма2 і клітини були вирощені в ендотелій - підтримуючому середовищі (Фіг. 5 А).
Промислова застосовність
Чистоту виділеної популяції визначали по імуноцитохімічному аналізу. Щоб дізнатися, чи є СОЗ1 «т клітини, елюйовані з колонки, клітинами ендотелію або їх попередниками, частину клітин піддавали функціональному тесту на приналежність клітин до ендотелію-тесту на матрігелі. Аналіз експресії генів, характерних для ендотелію, проводили методом напівкількісного ЗТ-ПЛР (Зворотньої транскрипції ПЛР).
Імуноцитохіміний аналіз.
Клітини фіксували 10095-м крижаним метанолом протягом 5 хвилин або 495 парафармальдегідом протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Слайди були промиті в трьох РВ5, 0,195 Тмеєп20 і інкубувались з вторинними антитілами: Аіеха РБійог 546-сопіпдаїей ІдсСх кози проти миші, АІеха Рішог 488- сопіпдаїєй Ідс; кози проти миші в розведенні 1:800. Первинні антитіла, що використовувались, були антилюдським СОЗ1, антилюдським УМ/Е, антилюдським СО105, антилюдським СО34, антилюдським СО133, антилюдським РІК-ї, антилюдським СО14, антилюдським СО45. Клітини були також пофарбовані 4,6- діамідинів-2-фенілондолом (ОАРІ). Після цього імуномічені клітини чи фрагменти були досліджені за допомогою флюоресценцентного мікроскопу. Щоб уникати артефактів у виявленні, ми використовували антитіла з різною специфікою для селекції клітин, що використовувались. Чистота популяції клітин була більше ніж 9095 (Фіг. 5 Б).
Випробування на здатність утворювати судиноподібні структури.
Випробування було проведене, як описано в (21). Матрігель додавався в 24 лунки планшета. 0,5-2х107 клітин були поміщені в лунки в 0,5 мл ростового середовища і инкубувались при 37С та 595 602. Морфологія клітин аналізувалася в фазовому контрасті на інвертованому світловому мікроскопі. Як видно на Фіг. 5В, клітини формують характерну для ендотелію комірчасту судиноподібну мережу.
Зворотньої транскрипції ПЛР (З3Т-ПЛР).
Тотальна РНК була ізольована від недиференційованих ПЕ5С5, СОЗ31 селектованих ендотеліальних клітин Її НОМЕСз (ендотеліальні клітини вени людської пуповини) використанням НАМеазу Міпі Кії (Оіадеп).
Зворотня реакція транскрипції була виконана, використовуючи РНК (1-2 мкг), випадкові шестинуклеотидні праймери (Ргіотеда), НемепАїЇй М-Миї М зворотню транскриптазу і реактиви (Рготеда) згідно з рекомендаціями виробника. Кодуюча ДНК була розчинена в кінцевому об'ємі 25 мл. Певну кількість КДНК (1-5мл) було піддано
ПЛР ампліфікації, використовуючи Тад ДНК полімеразу та реактиви (Рептепіавз). Всі зразки РНК були здатні призвести до рівної ампліфікації гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (ЗАРОН), як внутрішній стандарт.
Послідовності праймерів для ЗТ-ПЛР вказані в Таблиці 3. Продукти ампліфікації були сепаровані в 1,595 агарозному гелі.
Таблиця 3
Послідовність праймерів
МЕ-садветіп | УССООСОССААААСАСАбАЗ:
УСАСОСАСОССАТІСААСААСЗ"
САТА-? УСССТААССАОСОСАССААСАСЗ
У ТОСАСТІСТОСТОСАТОСАСТУ
САТА-3 УТСАСААААТОААСОПСАСАСААСІ
УСООТТАААСОАОСТОТІСТТО3" ємо УСТОАТООСССААОСОСАСТОАдАОЗ
УССОСАССССОААСАСАСАСААСІ
СО31 УСОСТОТТООТООСДАССАСТОСІ
УСААСТТООСТОСАСОТОСтТОЗ
ЕІКІ УТООАООТОАСТОАСТОСАСЗ"
УСАССАТОССАССАТАОСТОЗ"
ПРРАЗ УТАСТОСОТСОСАСАОТСТОТАСУ
УТТОООСТІСТААСАСАСАТОСЗІ"
ОРРА5 УАССТОАААСАТССАСАСООТОТЗ3" 5ССООСТТСАТТОСАТТООСТЗ"
ОоСст4 КСОАССАТСТОССОСТІТОАОЗ
УСССССТОТСССССАТТССТАЗ
МАМОС УАОСАТССОАСТОТАААСААТСТТСАСЗІ
УСООССАСТТОТТТТТСТОССАССТІ3
САРОН УСААООТОААООТСОСАОТСАЗ
УТТСАСАСССАТОАСОСААСАТІ
Ї Фактори транскрипції грають важливу роль протягом ембріонального розвитку в напрямку диференціювання і підтримки фенотипу. Особливо ендотелій-специфічні фактори транскрипції САТА-2 і 3, які майже повністю вимкнені в недиференційованих ПЕ5С5, хоча їх експресія в отриманій з пЕ5С5 чистій популяції ендотеліальних клітин була порівнянна з їх експресією в НОМЕС5. Ген еМмОбЗа не експресувався недиференційованими ПЕ5С», але після диференціювання в ендотелій його експресія була виявлена в чистій популяції ендотеліальних клітин на тому ж самому рівні, як в НОМС5. Таким чином, Аналіз експресії генів, характерних для ендотелію, методом напівкількісного ВЩ-ПЛР показав, що рівень експресії цих генів у клітинах ендотелію з ЕСК порівняний з експресією в НОМЕС (Ффіг.б6) Геномне бісульфітне секвенування.
Були виділені геномні ДНК від недиференційованих ПЕ5С5, СО31 відібраних ПЕ5ЗСз5-отриманих ендотеліальних клітин і НОМЕС Геномна ДНК була піддана обробці натрієм бісульфіта, використовуючи
СраОепоте "м Разі ОМА Моаісайоп Кії, Спетісоп. Аліквоти ДНК, модифікованої бісульфітом натрію (25-50ОНнГ), були використані для ПЛР при 45 циклах ампліфікації. Праймери для ПЛР у ділянках, що цікавили, були підібрані для натрію бісульфіт модифікованої матриці (Таблиця 4), Кінцеві ПЛР продукти були клоновані за допомогою набору рРОаЕМ-Т Еазу (А1360, Рготеда), і клони плазміди (10 для кожної ділянки) були секвеновані використанням автоматизованої АВІ Ргізт 377 ДНК бЗедиепсег (Арріїєа Віозузієтв).
Таблиця Ле 4 . Положення
Назва гену Послідовність праймерів праймерів відносно старту транскрипції єМО5 УТОАТТПТТООТООТТТТАТТТТОТІ3" -321 5СТСТТСАААТТАСССАТАТТАСТАТЗ" 37
САТА-? УАСТОТОСАТОТАТАСООТОТО3" -217
УАСАААСААТАААСАААСТТАААСААЗ 67
САТА-3 5УСАТОАТАТТАСАААТІТТТІТААСТТОУ -139
УААТССТОССАДАТААТТАААААСААЗ 252
Щоб підтвердити, що ендотеліальні клітини диференційовані з ПЕ5С5 мають правильний прояв епігенетичного статусу, ми порівняли профілі метилювання регулюючих ділянок САТА-2, -3, і генів еМмОсСа в
НЕ5С»5, ендотеліальних клітин диференційованих з ПЕС» і НОМЕС»5. Ми досліджували рівень метилювання кожного Сра в області відповідного селективного промотора гена САТА-2 (з 43 по -187 нуклеотид щодо старту транскрипції, що визначається, як 41) за допомогою бісульфітного секвенування. У недиференційованих
ПЕС ця область була високо метилована - майже до 8095 метилювання (фіг. 7). Рівні метилювання селективного промотора в НОМЕС та ендотеліальних клітинах, диференційованих з ПЕ5С», були низькими і варіювали від 20905 в ендотеліальних клітинах, диференційованих з ПЕБ5С»5, до 1090-в НОМЕС 5. бра розташовані в області від 228-115 нуклеотидів, були високо метиловані в недиференційованих клітинах (до 9095), але в отриманих з ПЕБС клітинах ендотелію і в НОМЕС»5, метилювання означеної області знижувалося до 15-2095 (Фіг. 8). Таким чином, незважаючи на гіперметилювання проксимального промотора, ген САТА-3 був слабо експресований в недиференційованих ПЕ5С»5, хоча гіпометілований промотор значно збільшив його експресію.
Згідно з даними Спап (22), в ендотеліальних клітинах найістотніші епігенетичні модифікації відбуваються в області промотора еМмОба, найближчою до сайту початку транскрипції. Ця область гена еМмО5а між 13 і-237 нуклеотидами була обрана для аналізу бісульфітного секвенування, який показав, що область була гіперметилована в недиференційованих ПЕ5С8 приблизно на тому ж самому рівні, як регулюючі області (САТА-2 і (ЩАТА-3 генів - від 70 до 9095 у кожному Срої положенні. Після ПЕ5С5 диференціювання в ендетеліальні походження метилювання цієї області зменшилося до 2095 у функціональних ендотеліальних клітинах, відібраних з НЕ5Сз і не перевищувало 1095 у НОМЕСз (Фіг.9).
Бісульфітное секвенування дозволило виявити, що область селективного промотора сАТА-2, гіперметилована в ПЕС» і гіпометилована в ПЕЗС5-отриманих ендотеліальних клітинах. Таким чином, ми показали, що статус метелування (ЇАТА-2 селективного промотора впливає на експресію цього фактора транскрипції.
Прийняттям до уваги кореляції експресії (ХАТА-2 і його промотора метилювання в пПЕЗС5-отриманих ендотеліальних клітинах ми могли визнати важливу роль селективного промотора САТА-2 в ендотелій- диференціюванні.
Незважаючи на гіперметилювання (34АТА-3 проксимального промотора, САТА-3 ген був слабо експресуваним в недиференційованих ПЕ5С5. Однак, ми не могли виключити, що в недиференційованих пЕЗС» САТА-3 ген запущений альтернативним промотором.
Проаналізувавши всі отримані дані ми можемо заключите, що іп міо зовнішні сигнали викликають складну комбінацію молекулярних механізмів, що закінчуються індукцією певних факторів транскрипції експресії. Навіть більше, вважаючи, що ДНК деметилювання є заключним кроком епігенетичних подій, що ведуть до активації гена, ця індукція постійна і необоротна. Безсумнівно, стовбурові клітини мають великий потенціал, однак цей потенціал повинен управлятися іп міо, інакше небажані наслідки можуть мати місце після неконтрольованого в природних умовах диференціювання.
Згідно з нашими даними, СПАТА-2 і еМмО5 промотори піддаються гіпометилуванню в ході ПЕбБС5 диференціювання в ендотелій. Отже, ми можемо заключити, що ендотелій-специфічна експресія еМмозЗа регулюється через подвійний негативний епігенетичний контроль. У недиференційованих ПЕ5С5 не тільки промотор еМОбЗа, але також і промотор його регулюючого чинника транскрипції (ЇАТА-2 був блокований метилюванням.
Наші дослідження демонструють суттєві відмінності в метилюванні областей промоторів трьох генів від
НЕБО» до з ПЕБС5-отриманим ендотеліальних клітин. Однак, ми спостерігали деякі відмінності між областями промоторів метилювання трьох генів, вивчених в ПЕ5Св5-отриманих ендотеліальних клітинах і НОМЕС В отриманих з пПЕ5С»5 ендотеліальних клітин області промоторів генів, що вивчались, були трохи більше метиловані, ніж відповідні області в НОМЕС, хоча це не закінчувалося придушенням транскрипції. Можливо, це відображає, що ендотеліальні клітини, які походять з ПЕ5С5, не були ендотеліальними клітинами вени пуповини, а скоріше представляли суміш спеціалізованих підтипів ендотеліальних клітин (наприклад, капілярні, аортальні ендотеліальні клітини, легеневі ендотеліальні клітини), де рівень метилювання є змінним.
Отримані ендотеліальні клітини могли бути піддані заморожуванню і зберіганню. При цьому клітини зберігали життєздатність і свої властивості.
Кріоконсервацію та відтавання ендотеліальних клітин здійснювали наступним чином.
Середовище для заморозки мало наступний склад: 9095 фетальна бичача сироватка (інактивована при
5620 протягом 45 хвилин) (Іпу/йгодеп або аналог іншої фірми), 1095 ОМ5О (ІСМ Віотеадіса!5, Іпсо. Або аналог іншої фірми).
З культивованих клітин видаляли середовище, промивали двічі РВ5, додавали трипсин/ЕДТА 2 мл на 100мм чашку або 75 см? флакон. інкубували при 372С 5 хвилин, нейтралізували трипсин/ЕДТА 5 мл культурального середовища і піпетувати, щоб отримати одноклітинну суспензію. Отриману суспензію переносили в 25 мл пробірку і центрифугували 5 хвилин при 1200грт. Осад суспендували в їІмл середовища для заморожування, потім переносили в кріовіалу і відразу поміщали на 24 години на -7020 На наступний день кріовіали переносили в рідкий азот для тривалого зберігання. В одній кріовіалі заморожували 1,5-Змлн клітин.
Кріовіали відтавали на водяній бані при 372, стерилізували 9595 етанолом. Вміст віали переносили в 15 мл пробірку і поступово додавали 9мл культурального середовища. Центрифугували 5 хвилин при 100Огрт, надосадову рідину видаляли, осад суспендували в 1 мл середовища і переносили в культуральну чашку або флакон з середовищем. Клітини рівномірно розподіляли по поверхні і поміщали в інкубатор при 37"С та 595
Со2г.
Методи, способи, застосування отриманих клітин ендотелію (ендотеліоцити). 1. Отримані описаним вище способом клітини ендотелію можуть бути застосовані для формування судинної мережі (колатералей) де помо за рахунок неоангіогенезу шляхом введення 104, 105, 106 або більшої кількості клітин у вену або артерію ссавців, включаючи людину (Фіг. 10). 2. Отримані клітини можуть бути застосовані для васкуляризації імплантанта шляхом додавання їх до біосумісного матеріалу, такого як желатин, хітозан, колаген, матрігель і інші або їх комбінації, що забезпечують формування тривимірної структури, до якої крім клітин ендотелію можуть входити такі клітини, як фібробласти, кардіоміоцити, гепатоцити, кератиноцити, нейрони, мультипотентні клітини кісткового мозку, гліальні клітини, хондроцити, остеоцити і інші клітинні типи або поєднання типів клітин і імплантування (запровадження) в організм ссавців, включаючи людину. Васкуляризація імплантанта може здійснюватися або за рахунок залучення ендотеліальних клітин організму, або за рахунок васкуляризації імплантованими клітинами, що містяться в тривимірній структурі для забезпечення імпланта (введеної тканинної або клітинної композиції) кровопостачанням (Фіг. 11). 3. Отримані клітини ендотелію можуть бути використані для виготовлення трубчастої структури, покритої ендотеліоцитами, шляхом нанесення їх на двовимірну підкладку з колагену, мтарігелю, хітозану, фібронектину і/або інших біосумісних матеріалів у поєднанні з іншими типами клітин або без них, яка може бути використана в якості трубки при операціях на судинах для відновлення порушеного або недостатнього кровообігу, шляхом заміни частини, фрагменту або повністю судини або її стентування. 4. Стримані стандартизованим методом із стандартної відновлюваної клітинної культури, клітини ендотелію можуть бути використані для тестування токсичності хімічних або біологічних субстанцій, або можуть бути використані для визначення ефективності речовин, здатних стимулювати ріст (проліферацію) клітин ендотелію шляхом визначення проліферації або загибелі клітин ендотелію за допомогою відомих методів. 5. Клітини ендотелію можуть бути використані для діагностичних або терапевтичних цілей для лікування генетичних захворювань або для доставки генів токсинів або самих токсинів в місця активного ангіогенезу (росту судин) для блокування останніх (наприклад, у випадку росту судин у пухлині) з метою припинення кровопостачання органа або тканини та її подальшою загибеллю шляхом їх генетичної модифікації, конструкціями, що містять гени репортери, наприклад, зелений флуоресцентний білок або аналогічні, або генетичними конструкціями, що містять гени токсинів, або генетичними конструкціями, що містять гени для відновлення роботи порушених генів і введення модифікованих клітин ендотелію в організм ссавців, зокрема людини. Ендотеліальні клітини, модифіковані генетичними конструкціями, що кодують фактори росту, можуть бути векторами для стимуляції росту певної тканини, клітин, групи клітин. 6. Поєднання перерахованих вище методів використання.
Таким чином, наша двовимірна система диференціювання дозволила нам продукувати ендотеліальні клітини з високою ефективністю, вибирати чисту популяцію функціональних ендотеліальних клітин, які набували той же самий епігенетичний статус ключових факторів транскрипції та гомеостазу підтримки генів, як їх аналоги, що диференціюються в ембріоні іп мімо. Отримані ендотеліальні клітини можуть знайти широке застосування в медичній практиці.
Відібрані пПЕЗС-отримані ендотеліальні клітини експресували ендотелій-специфічні гени, формували судиноподібні структури і морфологічно не відрізнялися від первинних ендотеліальних клітин. СОЗ1 відібрані ендотеліальні клітини, диференційовані з НЕ5С5, були здатні культивуватися іп міїго принаймні до 4 пасажів.
Використовуючи наш спосіб диференціювання, ми спостерігали СОЗ1 і МЕ-садпегіп експресію на 6 день.
Безсумнівно, це могло статися через відмінності між лініями клітин, хоча умови культивування (тобто середовище культивування, фактори росту, обробка) мають великий вплив на властивості диференціювання.
Цікаво те, що ми виявили МЕ садНегіп експресію на 6 день ПЕ5С» диференціювання, у той час як у природних умовах його експресія спостерігалася лише на 8-му тижні вагітності. Таким чином, маркер диференційованих ендотеліальних клітин МЕ-сайнегіп був виявлений дуже рано іп міїго.
Список літератури. 1. Ванагуапа, Н., дагагу, Н., Мавхзиті, М., Авпйапі, 5.К. Сепегайоп ої іпзиїп-зесгейпо сеїв їйїот питап етргуопіс віет сеї. Оем Стоп Орійег. 2006,48: 323-332. 2. Нау, О0.С., 7пао, О., Вов5, А., Мападаіат, А., Геркомуекі, 9У., Сиі, МУ. Оігесі Оібегепіайоп ої Нитап
Етбьгуопіс (ет СеїЇз ю Нерайосуїе-їїКе СеїЇІ Ехпірійпду Рипсіїопа! Асіїмйев. Сіопіпд 5іет СеїІв. 2007,9: 51-62 3. Непа, В.С., Наїдег, Н.КИ., біт, Е.К., Сас, Т., Мо, 5.0. Бігаіедієв юг аїгесіїпуд Ше айегепіайоп ої вієт сеїЇв їпо Ше сагаітуодепіс Іїпеаде іп міїго. Сагаіомазс Нез. 2004, 62:34-42. 4. Хи, С, Не, 9.О., Катр, Т.)., Роїїсе, 5., Нас, Х., О'Зйіймап, С, Сагрепієг, М.К., І еркомекі, у)., сої 90.
Нитап етрбгуопіс зієт сеїІ-депмей сагаіотуосуїез сап ре таїпіаїіпей іп дейпей тедінт м/о зепит. 5(ет СеїЇв
Оеєм. 2006, 15: 931 -941.
5. І асаца, сх., КеїПег, Ссх., КоизКой, М. Тгтаскіпд тезодегт Ююгтаїйоп апа 5ресійсайнйоп ю (Ше петаподіобіаві іп мікго. Тгепаз Сагаіїомазс Меа. 2004,14,314-317. 6. Спої, К., Кеппеду, М., Кагагоу. А., Рарадітйнои, 9.С., КеПег, Сх. А соттоп ргесигзог ог Нетайороієйс апа епаоїНеїїа! сеї. Оемеюртенпі. 1998, 125, 725-732. 7. Спипад, У.5., 2папо, МУ.)., Агепібзоп, Е., Кіподвзієу, Р.О., Раїїв, 9., Спої, К. Іпеаде апаїувів ої Ше
Нетапдіобріавзі аз деїпеа бу РІ Кі апа 5СІ. ехргеззіоп. ОемеІортепі. 2002, 129,5511-5520. 8. Мізпікама, 5.І., Мізпікажма, 5., Нігазпіта, М., Маїзцуознї, М., Кодата, Н. Ргодгезвіме ІІпеаде апаїувзіз бу сеї! вопіпд апа сийиге ідепійе5 ЕКІ-МЕ-садпегіп-- сеїї5 аї а аїмегдіпу роїпі ої епдоїШеїїаІ апа петороіеїйс
Іпеадев. ОемеІортепі. 1998, 125, 1747-1757. 9. Нибег, Т.І., КоизКой, М., Еепйіїпо, Н.)., Раїїв, у., КеПег, С. Наетапдіоріаві соттійтепі із іпійасей іп (Не ріїтййме 5ігеак ої Ше тоизе етбргуо. Машге. 2004432, 625-630. 10. Сегдап, С, Ношеєац, А., ВНайа, М., МЕСЕ-А1Т65 апдтепів егуїйпгороїєїс демеюртепі йот питап етбгуопіс 5іет сеїІв5. Віоса. 2004, 103,2504-12. 11. Снадміск, К., Мапа, І.., Ії, Ї., Мепепаел, Р., Мигаоси, В., Коціеаиц, А., Впайа, М. СуїюкКіпе5 апа ВМР-4 рготоїе петаїйороїеїйіс айегепіайоп ої питап етбгуопіс 5іет сеїІв. Віоса. 2003, 102, 906-915 12. І емепрегао, 5., СоїШб, 9.5., Атії, М., НеКомі2-ЕЇдог, у., Ії апдег, А. Епдоїнеїїа! сеї5 деймейа їот питап етбгуопіс зієт сеїІ5. Ргос Майї! Асай 5сі ОБА. 2002,99: 4391-4396. 13. Мо, Е.5., ЮОамів, В.Р., А2201а, І., Зіапівєу, Е.С, ЕІстапіу, АС. Рогсей аддгедайоп ої аейпей питрегв ої питап етбргуопіс віет сеїІв іп етбргуосід родієв ювіегв гориві, гергодисіріе петайюроїеїййс айегепііайоп. Віоса. 2005,106,1601-1603. 14. 7атріаїв, Е.Т., Реації, В., Рагк, Т.5., Вип, Е., Сіміп, С.І., Нетайороівїййс айегепііайоп ої питап етргуопіс віет сеї ргодгезвзев (Шгоцди зедиепііа! ПетайюепаоїНеїїаї, ріітійме, апа аеїйпйіме віаде5 гезетбріїпд питап усїк вас демеІортепі. Віоса. 2005, 106, 860-870. 15. пап, Х., Огамід, с, Ме, 7., Наттопа, Н., Зпатбріой, М., Сеагтай, 9У., Спепо, Г. ЕРипсійопа! апіїдеп- ргезепіїпд Іеисосуїгез дегпмей їот питап етбгуопіс вїет сеїЇв іп міо. апсеї. 2004, 364, 163-171 16. Кашїтап, О.5., Напзоп, Е.Т., І ем/ів, В.І.., Айеграсиі, А., Тпотвоп, У.А. Нетайороїєїїс соіопу-їоптіпд сеїЇв депймей їтот питап етрбгуопіс вієт сеїІв5. Ргос Маї! Асад 5сі ОБА. 2001,98,10716-10721. 17. Модуапік, М.А., Вогк, 9У.А., Тпотвоп, У.А., ЗІШКмУїп, І.І. Нитап етбгуопіс зіет сеїІ-деймеа СОЗ4-- сеїІв: ейісієпі ргодисіоп іп (їе сосишге мій ОРО віготаї! сеї апа апаїузіз ої Іутрпопетаїйороїеїййс роїепіа!. Віоса. 2005, 105, 617-626. 18. Нігазпіта, М., Каїаока, Н., Мізпікама, 5., Маїзцуозпї, М., Мізпікама, 5. Майшгайоп ої етргуопіс вієт сеїЇв їпюо епаоїпегїаї! сеїїв іп ап іп міо тоаеї ої мазсцодепезвів. Віоса. 1999,93,1253-1263. 19. І адаїкома, М.А., МоІспнКом, Р.У., І уакізпема, А.М., Рпйопепко, Е.5., КізеїІєм, 5.1. Юїмегзе ерідепеїйс ргойе ої поме! питап етргуопіс 5ієт сеї! Іпев. СеїЇ Сусіє. 2006, 5: 416-420. 20. Сегеспі-Міг, 5., 2і8Кіпа, А., Сопеп, 5., НеКоміс-ЕЇдог, 9. Нитап етрбгуопіс віет сеїЇ5 аз ап іп міго тоавє! юг пПитап мазсшаг демеіюртепі апа Ше іпдисіоп ої мазсшаг айегепіацйоп. І ав Іпмеві. 2003, 83: 1811-1820. 21. Вотраїз, Н. еї аі. Нитап епадоїпеїа! сеї дегпмей їот сігсшціайпу ргодепітшгв аїзріау зресійс псбопаї ргорепіє5з сотрагей м/п тайшге меззе! маї! епдоїпеїїа! сеїІв. Віоса 103, 2577-2584 (2004) 22. Спап, У., Ріви, 9У.Е., О'Абгео, С Те сеїІ-ресійс ехргеввіоп ої епдоїеїа! пііс-охіде зупіпазе: а гоїє г
ОМА теїпуїайоп. У Віо! Спет. 2004,279: 35087-35100.
і; 1
По о . о о. п. | чі
КЕ ; кі
ЕЕ с з с щ генів що щ спи ща пе ях ш ї їе нн ШЕ й ї щ : БО о х о . й о ще ва оон ще нн и. 5 я. НГ А о сви пе ї у ш- о о . о. . а о Се зЯ ся пт но пи ває Бе ПЕ що о п пк - 5 хх з їЗ й чо с с 3. с її її о у;
ПО в Як: 55555555 55555 у: а її я її
І ІМ ІМ І І ОХ
31 ч її
ІПЗОЇЇОТЦ4ЙЇЇІ ОА ОО ОО ОО ОО ОО ОО МО ІІІ МОВО
Фіг п Б 00 Еш пн . . с 0 НО І У ТОЙ с о | я я шЕ г п г ня г й я в пов с ов лоно п В В ОО В п оеВВх п пеня пев с 5 Б о шо ЕС шо ! с од
ДПЕ ЕК ПЕД ДЕ тин 0 її Б о 0: ШЕ: 55 я ше я 3 Б ОА ча пи щи ВЕ
Он пи ПИШИ И ОИК В м НН МК ШЕ вн пе 5 ІІ що и : и а
МЕ о З 0 нн и М В
ВЕ шо с й и о г М В я я ! ші пон т д пох ПОШИТИ с В М с КОХ не
Еш 000 ССС с
ПОД ДК в ще У, с пе ОО поет КК В СКК ОВ КО
ЕВ п и птн Ли п о ОК г пов В снНнСннСщшМСЖоооо.О- СО
ПП КОН ши ИН ПЕ с о. я 5 о
ПНО ННЯ ОН СПИ. «ПН ОО ПО п 3 5 І ПО с о.
ОК ПИКА ЗХ що ОК ОО ОХ КК КК 00 5 с
МО ОВ ОВ о п с
ХЕ в о в В Ве о. шо с
З 0: ПИ Е ОН ї п В 000 5 ЕЕ. о: ша А Ц Ф с 0 її ДЩ((-- п и г ша
Б ДОННВНЯ ОО ЕЕ КЕ ОВ в Я сг г с с. сг Й: с Бе ня ПЕПНШНИНИ НИ В й ВЕК ПЕН ой зав її я я о ос ЕЕ НН. ко а ОН Б ОО їх 0!
ПЕН в о В В ПП Кт ПК КВ ООН Я п й ес г СЕ В 5 ЕВ с я. ОВ
ОБ ОО 0! о пАТАЛ о о
Мк с шо ев випив
Фіг і
ІЩЕ ще й 0 вв з з з давав о чув вовюю тм» ях соопо250ове домом г бе шо м на! іЕ Б о Ендотелій із ЕСК 100
Я 5 2.
Кк т | 5 о 25 . в. (о) й "Й ай зззізЗз3ззхвоввчувьоюювю? тов особового очьошочьюхо в чо»
В Фо Фо че з : НОМУЕС В
Ф1100 2. щ 15 що дія ий в " пи ш и и и ви зз35а55зЗз5іововочоавовювюх тю» своп: в чо м
Фо» Ома
Положення Сро динуклеотидів в промоторі САТА-2
Фіг. 7
А
50 ЕЕ я 2 ЕЕ ІІ
Еш І й НИ! я 0 - пою О тот
З сват "вового ро Ендотелій із ЕСК Б
НІ 100 щ сі 15 о) 50 щ
ВУ І) о зоФоФошошвювоООовттитк т тт я дочвововго "85 о
Ж х НОМЕС В ге 100 о кі 15 50
Й і
А І І 1 ! і Р 1 І Мк ГВ ах о рак - й р сб ша ра мил знак я дечого завшйетюют
Положення Сро динуклеотидів в промоторі САТА-3
Фіг. 8
І хх 50 я 25 зх о
О в ов в а 8 8 8 в в
З Б: Іще ие ние пи п з ПИ нини
КЕ Ендотелій із ЕСК. Б (з 100 в. (о) 75 ж 5О
В 25 щ
В о ;
З во ьввоО З х І: Ше з» Пи: пи пи: п пня
Броою НОМЕС в 75 50 о
Авт о (се; (се) - Ф (65), гав) сл - (Са) о - - - - Гаю)
Положення Сро динуклеотидів в промоторі ЕеМО5
Фіг.9 кеенеенеинЕЕ я
ООН о. ї ОВ нн с с с ПОВЕ п ПЕВОЮ ОХ ОК п ; с а
ФНк НВ и сто де її п с г п о с
Claims (2)
1. Спосіб отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини, що передбачає диференціювання ЕСК людини на підкладці і в середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, з людським фактором росту ендотелію судин УЕСЕ, 1 сепарацію отриманих ендотеліальних клітин, який відрізняється тим, що використовують синтетичне середовище для диференціювання она основі суміш ЮМЕМ/КІ2 з КО замінником сироватки при співвідношенні: рідка ОМЕМ/НКІ2 - 75-95 96, рідкий КО замінник сироватки - 5-25 90, при цьому синтетичне середовище додатково містить чинники росту 5СЕ, ВМРА, БЕСЕ, ТОЕбеїа в ефективних кількостях, причому ТОЕрега додають на 3-6 день диференціювання, а сепарацію проводять на 3-9 день методом імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для клітин ендотелію, після чого отримані ендотеліальні клітини культивують у зазначеному синтетичному середовищі при щільності посіву не менше 50000 клітин на 1 см".
2. Спосіб отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини, що передбачає диференціювання ЕСК людини на підкладці і в середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, з людським фактором росту ендотелію судин УЕСЕ, 1 сепарацію отриманих ендотеліальних клітин, який відрізняється тим, що використовують середовище для диференціювання на основі суміші ЮМЕМ/КІ2 з фетальною бичачою сироваткою при співвідношенні: рідка ОРМЕМ/НІ2 - 75-95 90, рідка фетальна бичача сироватка - 5-25 9Уо, при цьому середовище додатково містить чинники росту 5СЕ 1 БЕОЕ в ефективних кількостях, а сепарацію проводять на 3-9 день методом імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для ендотеліальних клітин, після чого отримані ендотеліальні клітини культивують у вказаному середовищі при щільності посіву не менше 50000 клітин на 1 см".
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008210110 | 2008-03-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
UA95733C2 true UA95733C2 (uk) | 2011-08-25 |
Family
ID=50836710
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
UAA201007592A UA95733C2 (uk) | 2008-03-19 | 2008-12-24 | Спосіб отримання ендотеліальних клітин (варіанти) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
UA (1) | UA95733C2 (uk) |
-
2008
- 2008-12-24 UA UAA201007592A patent/UA95733C2/uk unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5902092B2 (ja) | 心筋細胞の生成 | |
US8415153B2 (en) | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells | |
RU2359030C1 (ru) | Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты) | |
US20100166714A1 (en) | Cardiovascular stem cells, methods for stem cell isolation, and uses thereof | |
WO2003018780A1 (en) | De-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies | |
EP1487968A1 (en) | Methods of inducing differentiation of stem cells into a specific cell lineage | |
Wei et al. | Cell culture purity issues and DFAT cells | |
EP3747991A1 (en) | Cell induction method | |
EP3985104A1 (en) | Method for producing renal interstitial cell | |
Van Vranken et al. | The differentiation of distal lung epithelium from embryonic stem cells | |
KR102218549B1 (ko) | 인간 타액선 세포의 배양 방법 | |
UA95733C2 (uk) | Спосіб отримання ендотеліальних клітин (варіанти) | |
JP7198488B2 (ja) | 多能性幹細胞マーカーを発現するスフェロイドの製造方法および多能性幹細胞マーカーを発現させる方法 | |
US20230078230A1 (en) | Methods for the production of committed cardiac progenitor cells | |
Petrakova et al. | Effect of 3D cultivation conditions on the differentiation of endodermal cells | |
US20240139256A1 (en) | Methods for the production of cardiac fibroblasts | |
CN117467599B (zh) | 一种重编程鸡性腺体细胞为鸡多能干细胞的化学诱导剂及重编程方法 | |
Shen et al. | In vitro hematopoietic differentiation of murine embryonic stem cells | |
Roche et al. | Insulin-producing cells from embryonic stem cells experimental considerations | |
Aghami et al. | ESC cardiac differentiation and applications | |
JP2004159614A (ja) | 表面細胞マーカーを指標に精製した中胚葉系幹細胞 | |
Parashurama | Stem cell engineering of the endoderm: Approaches to controlling endoderm induction and differentiation from embryonic stem cells | |
Fatima et al. | In Vitro Differentiation and Expansion of Vascular Endothelial Cells Derived from Mouse Embryonic Stem Cells | |
Zhu | Reconstitution of Three-dimensional Neuroepithelia from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells | |
AU2003209830A1 (en) | Methods of inducing differentiation of stem cells into a specific cell lineage |