UA95733C2 - Спосіб отримання ендотеліальних клітин (варіанти) - Google Patents

Abstract

Винахід належить до біотехнології, а саме - до отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини та їх застосування. Спосіб отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини передбачає диференціювання ЕСК людини на підкладці і в синтетичному середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини на основі суміші DMEM/FI2 з КО замінником сироватки з факторами росту VEGF SCF, BMP4, bFGF, TGFbeta в ефективних кількостях, причому TGFbeta додають на 3-6 день диференціювання. Також може бути використане середовище для диференціювання на основі суміші DMEM/FI2 з фетальною бичачою сироваткою з факторами росту VEGF, SCF, bFGF. Сепарацію проводять на 3-9 день методом імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для ендотеліальних клітин, після чого отримані ендотеліальні клітини культивують у вказаному середовищі при щільності посіву не менше 50000 клітин на 1 см.

Description

Винахід відноситься до біотехнології а саме - до отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини та їх застосування. Людські ембріональні стовбурові клітини (позначення, прийняте в світі - ПЕ5С5) потрібно розглядати, як цінне джерело для регенеративної медицини через їх здатність диференціюватися в усі типи клітин. Отримані в результаті диференціювання ендотеліальні клітини можуть знайти широке застосування в медичній практиці і у вивченні механізмів диференціювання.

Ендотеліальні клітини не тільки вистилають стінки кровоносної судини, але і також здатні мігрувати в потоці крові до різних місць. Таким чином, вони могли використовуватися не тільки для регенерації судин за допомогою їх інтеграції або секреції ростових факторів, а й слугувати транспортним засобом для терапевтичного гена або доставки препарату. Проте, потенційне клінічне застосування диференційованих іп міо клітин вимагає підтвердження, що бажаний клітинний фенотип буде підтриманий без повернення до плюрипотентного стану.

Попередній рівень техніки

На стадії розвитку бластоцисти відбувається формування внутрішньої клітинної маси бластоцисти (ВКМ), з якої і отримують лінії ЕСК. Здатність НЕЗС5 диференціюватися в деякі специфічні типи клітин в даний час інтенсивно вивчається. Загальна мета таких досліджень зазвичай полягає в тому, щоб отримувати спеціалізовані функціональні клітини. Однак подальша можливість застосування цих клітин для лікування людини може бути реалізована тільки за умови забезпечення стійкої клітинної спеціалізації. Таким чином, потрібно розглядати не тільки морфологічні, імунологічні, або функціональні властивості клітини, але також і генетичні та епігенетичні.

Диференціація ЕСК по визначеному шляху супроводжується зміною патерну експресії генів, від генів, характерних для плюрипотентного стану, до тканиноспецифічних генів. Зміна патерну експресії здійснюється за рахунок загасання експресії ключових факторів транскрипції що беруть участь у підтримці плюрипотентності, і експресією тканиноспецифічних транскрипційних факторів. Паралельно працюють епігенетичні механізми регуляції експресії генів, які репресують гени, необхідні для плюрипотентного стану, і активують тканиноспецифічні. Так як ЕСК - це іп міго аналог клітин епібласта, що штучно підтримуються в недиференційованому стані, при зміні умов культивування ЕСК спонтанно диференціюються в різні типи клітин. іп міо спонтанне диференціювання ЕСК людини спостерігається як при тривалому культивуванні прикріплених колоній, так і в процесі росту ембріоідних тілець (ЕТ) в суспензії. На відміну від ЕСК миші, не всі лінії ЕСК людини легко утворюють ембріоідні тільця, і ні одна лінія ЕСК не утворює ембріоідні тільця з поодиноких клітин.

Для ЕСК людини була показана здатність до диференціювання в багато типів клітин: нейрони і глія, ендотелій, кератиноцити, трофобласти, кардіоміоцити, остеобласти, клітини крові, гепатоцити, інсулін- продукуючі клітини та деякі інші.

Похідні ентодерми отримати виявилося найважче. У нещодавно опублікованих повідомленнях про диференціювання ЕСК людини в інсулін-секретуючі клітини (1) і гепатоцити (2), було показано, що за білковим і генетичним маркерами вони збігаються зі зрілими інсулін-секретуючими клітинами або гепатоцитами. Однак, чинники, що визначають диференціювання в ентодерму, погано охарактеризовані і майже відсутні маркери раннього ентодермального диференціювання.

На відміну від ЕСК миші, які легко диференціюються в кардіоміоцити у відсутності ІенКкетіа іппіріюгу тасіог

ІЕ, спонтанне диференціювання ЕСК людини спостерігається у різних ліній ЕСК у різному відсотку випадків - від ділянок, що спонтанно скорочуються в 7095 ЕТ до повної відсутності спонтанного диференціювання (3).

Показано, що кардіоміоцити, диференційовані з ЕСК людини, експресують транскрипційні фактори МкКх 2.5,

САТАА, а також - специфічні маркери кардіоміоцитів - тропонін 1 і важкий ланцюг альфа-міозину. Нещодавно була опублікована робота з диференціювання кардіоміоцитів у безсироваточному середовищі, минаючи стадію ембріоїдних тілець (4). При тривалому культивуванні ЕСК можуть піддаватися штучній випадковій селекції. Крім того, як виявилося, ЕСК, ідентичні за основними морфологічними характеристиками та експресії основних генів, можуть відрізнятися епігенетичним статусом у регуляторних областях деяких генів. Ці фактори можуть призводити до того, що клітинні лінії ЕСК будуть мати переважні шляхи диференціювання. Тобто, наприклад, ЕСК будуть легко диференціюватися в нейрони і погано - в кардіоміоцити. Можливо, саме різниця в епігенетичному статусі ЕСК миші і людини може пояснити настільки різний потенціал диференціювання.

При нормальному розвитку ембріона судинна тканина формується з мезодерми. Незабаром після гаструляції мезодерма формується, як окремий шар між екто-і ендодермою. Передбачається, що ендотеліальні і гематопоетичні клітини походять від спільного мезодермального попередника - гемангіобласта (5). Клітини-попередники, які потенційно здатні утворювати гематопоетичні і ендотеліальні клітини, були ідентифіковані на моделі мишачих ЕСК (6,7,8) і лише пізніше - іп мімо, при вивченні гаструляції мишачого ембріона (9). Існує три основних технічних підходи для вивчення диференціювання ЕСК в клітини ендотелію і гематопоетичні клітини. Перший - диференціювання ЕСК в ендотеліальні або гематопоетичні клітини через стадію ЕТ (10-15). Другий - спільне культивування ЕСК зі стромальних клітин (16, 17). Третій - диференціювання ЕСК в двовимірних умовах (18, 8).

Диференціація ЕСК через утворення ЕТ - це завжди спонтанне, ненаправлене диференціювання. Як вже згадувалося, ЕТ містить клітини, що походять з різних зародкових листків, і тому частка клітин необхідного типу мала. Відсоток клітин ендотелію в ембріоідних тільцях становить близько 2905. Крім того, цей підхід має ще кілька обмежень. Наприклад, важко спостерігати клітини в мікроскоп, проводити аналіз диференціювання одиничних клітин, важко розділяти клітини з агрегатів клітин в ЕТ. Однак, на сьогоднішній день у великій кількості публікацій використовується саме цей підхід. Це обумовлено, зокрема, тим, що спрямоване диференціювання клітин вимагає спеціального підбору умов, а ЕТ - грубий модельний аналог розвитку ембріону, в якому присутні різні клітини, в тому числі і необхідні досліднику.

Нами було перевірено, чи є ендотеліальні клітини в ЕТ, що були утворені з ліній ЕСК людини, що знаходились в нашому розпорядженні. Для аналізу були взяті лінії НЕ5МОЇ і пЕЗМОЗ. Ці лінії, виділені в лабораторії раніше, проявляли характерну для даного типу клітин морфологію, експресували відповідні маркери і мали нормальний каріотип (19). При переведенні в суспензійну культуру ЕСК формували ЕТ з характерною морфологією для даного типу структур. При імуногістохімічному аналізі ембріоідних тілець після 10-12 днів культивування були виявлені в невеликій кількості (не більш ніж 1-595) ендотеліоцитоподібні клітини, що експресують СОЗ1 (фіг. 1).

Диференціація ЕСК людини в клітини ендотелію у двовимірних умовах (минаючи стадію утворення ЕТ) використовувалася тільки однією групою дослідників (20). Відомий спосіб обраний нами в якості найближчого аналога. Спосіб передбачає диференціювання ЕСК людини в присутності людського фактору росту ендотелію судин (МЕСЕ) на підкладці з колагену ІМ. Селекція ендотеліальних клітин здійснювалася за розміром клітин за допомогою фільтрації через фільтр з діаметром пор 40 мкм. З робота не ясно, яку частку становили клітини ендотелію після селекції. Однак, вважаючи, що ендотеліальні клітини пов'язані з гематопоетичними клітинами і походять від спільного попередника гемангіобласта, механічний вибір не міг забезпечити бажану чистоту клітин. Швидше за все, даний метод селекції не варто використовувати, якщо необхідно отримати чисту популяцію клітин ендотелію.

Короткий опис фігур.

Фіг.1 Імуногістохімічний аналіз 1Омкм кріозрізу ЕТ 12 днів культивування. А-ЕТ лінії Е2МО1, забарвлення антитілами до СО31 (червоний); Б-ЕТ лінії Е5МОЗ, забарвлення антитілами до СО31 (червоний); ядра пофарбовані САРІ (синій). Вторинні антитіла доаї апії-тоизе АІеха Рішог 546.

Фіг2 Формування судиноподібних структур і моншару при диференціюванні ЕСК людини (8 днів). А - світле поле. Б - імуногістохімічне забарвлення антитілами до СОЗ1.

Фіг.З Оцінка життєздатності СО31 позитивних клітин після проведення іммуномагнітної сепарації. А - п'ятий день диференціювання; Б - сьомий день диференціювання. Живі клітини (зелений), мертві (помаранчевий). Фотографія отримана за допомогою флуоресцентного мікроскопа. фіг.4 Диференціація ЕСК людини в ендотеліальні клітини в двовимірній системі: А -недиференційовані колонії ЕСК на фідері МЕФ; Б - диференційовані похідні, З день культивування; В - диференційовані похідні, 5 день культивування; Г - судиноподібні структури, 7 день культивування.

Фіг.5 А - СОЗ31 клітини ендотелію, отримані з ЕСК через 24 години після селекції (фотографія в світлому полі). Б - імуногістохімічний аналіз ЕСК після проведення іммуномагнітної сепарації. Експресія. СОЗ31 (червоний); ядра пофарбовані САРІ (синій). Вторинні антитіла АІеха Рішог 546. В - Тест на матрігелі (Маїгде!

Аззау), що показує ендотеліальну природу виділених за допомогою іммуномагнітної сепарації клітин.

Фіг.б6 ЗТ-ПЛР аналіз генів МЕ-садпегіп, САТА-2, РІКІ, САРОН, САТА-3, еМмо5, СОЗ31 в недиференційованих

ЕСК лініях Е5БМОЗ (І), клітинах ендотелію з ЕСК лінії Е5МОЗ, отриманих за допомогою імуномагнітної сепарації (Е ) і в клітинах ендотелію з пуповинної вени (Н) людини. фіг.7 Результати бісульфітного секвенування промоторної області гена САТА-2 з 43 по -187 нуклеотид щодо старту транскрипції. (А) ЕСК людини, (Б) ендотелій, отриманий з ЕСК людини, (В) НОМЕС. фіг.8 Результати бісульфітного секвенування промоторної області гена САТА-3 з 228 по -115 нуклеотид щодо старту транскрипції (А) з ЕСК людини, (Б) ендотелій, отриманий з ЕСК людини, (В) НОМЕС фіг.9 Результати бісульфітного секвенування промоторної області гена еМмоз5 з 13 по -297 нуклеотид щодо старту транскрипції (А) з ЕСК людини, (Б) ендотелій отриманий, з ЕСК людини, (В) НОМЕС

Фіг. 10 Зміна щільності кровоносних судин через 30 днів після введення клітин ендотелію 10 а - до введення, 10 б - через 30 днів після введення. Фіг. 11. (А) матрігель, видалений з експериментальних тварин через 8 днів, що не містить клітини ендотелію, (б) матрігель, видалений з експериментальних тварин через 8 днів, що містить клітини ендотелію.

Розкриття винаходу Нами була поставлена задача розробити ефективний та відтворюваний метод диференціювання ПЕ5С5 в чисту популяцію функціональних ендотеліальних клітин, в якій зміни патерну генної регуляції відповідають зрілим ендотеліальним клітинам. На відміну від диференціювання через стадію

ЕТ, пряме диференціювання ЕСК просте для спостереження за клітинами і маніпуляцій з ними, однак вимагає попередніх досліджень з визначення умов диференціювання. Крім того, контрольоване диференціювання, по- перше, повинно приводити переважно до бажаного клітинного фенотипу. По-друге, повинна існувати можливість селекції потрібних популяцій клітин, причому сам процес селекції не повинен істотно впливати на життєздатність клітин та їх диференціювання. Наступним поставленим перед нами завданням є розробка методу сепарації попередників ендотелію та ендотеліальних клітин з диференційованих ЕСК людини.

Відсутність у літературі даних по диференціювання ЕСК людини в двовимірній системі без формування

ЕТ в ендотеліальні клітини вимагала визначення умов і середовищ для диференціювання. Було випробувано понад 15 способів культивування з різними поєднаннями середовищ, сироваток та ростових факторів. Для цього колонії ЕСК переміщували в чашки Петрі з ростовими середовищами різного складу (табл.1). Табл.1.

Порівняння різних середовищ для диференціювання ЕСК людини в ендотелій. Порівняння проводилося через 8 днів культивування на підставі імуногістохімічного аналізу.

Таблиця 1

Альфа-

Нусіопе Нусіопе св) сей жд 000 ЩЕ осю р гігей гігей сироватки

МЕСЕ МЕС СЕ,

Ростові Активін, МЕС ЕСЕ, ЕСЕ МЕСЕ МЕС ЕСЕ, СЕ " ВМРА фактори МЕСЕ ЗСЕ, ЕСЕ ває ЗСЕ, ЕСЕ ЕСЕ такгрега!

СРаЕ

ЇМ ІМ

Колаген клітин ендотелію, 0-2 5-8 5-8 10-15 25-40 »50 о

У процесі диференціювання були виявлені окремі клітини, що експресують ранній маркер ендотелію СОЗ1 і маркер пізнього, диференційованого ендотелію - фактор Вон Віллібрандта (УМ/Е).

Після застосування різних композицій середовищ в різних комбінаціях з факторами росту були виявлені ростові фактори, що забезпечують ефективне диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини. До таких ростових факторів білкової природи відносяться 5ієт сеї! гасіог 5СЕ (виробник Спетісоп), людський фактор росту ендотелію судин МЕСЕ (виробник Спетісоп), бопе тогрподепіс ргоїєїп ВМРА, Бравіс Яргобіаві дгоуйй Тасіог ОРСЕ (виробник Спетісоп), шШтог дгоуми Гасіог ТОгреїа.

Кількісні співвідношення даних ростових факторів залежить від складу середовища, наявності або відсутності в середовищі компонентів невизначеного походження, а також - можуть варіювати в залежності від ліній ЕСК, що використовувались. Кількість ростових факторів може бути підібрана експериментальним шляхом.

Протягом диференціювання в середовищі, що містить компоненти, необхідні для спрямованої диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, ми могли спостерігати зміни і в морфології клітин і в специфічній експресії маркерів ендотелію. Спочатку, на 4 день після індукції диференціювання, були виявлені

СО31 ендотеліальні маркери. Поява судиноподібних структур співпала з експресією УМ/Р. На день 6-7 майже 6095 клітин експресували СОЗ1 молекулу і до кінця процедури диференціювання (12-ий день), приблизно 5095 клітин експресували СО105 антиген (табл. 2). При цьому варто зауважити, що експресія СО133 молекули була висока в недиференційованих МПЕ5С5 і знижувалася протягом диференціювання в ендотеліальних попередниках. Досить високий відсоток диференціювання в ендотеліальні клітини дозволяв нам проводити тест на формування судин без селекції клітин.

Таблиця 2 ср 77/11. 11

МЕсаднениї 1777-1111. 111 сріз3/171711я3 Ї111сяю ЇЇ ЇЇ 11 -

МЕ 11117111 -11171- 1011-15 151 соло5 Її 7-17 - 1117-11-11 - 151 со834 77/17 - 1111717 - 1111515 1-1 хх .

СОЗ31 позитивні клітини представлені не тільки в складі судиноподібних структур, але і у вигляді моношару (Фіг.2). За даними досліджень, баланс між судиноподібнимі клітинами і моношаром залежить від концентрації

МЕС.

Для сепарації диференційованих з ЕСК людини ендотеліальних клітин нами було обрано метод імунологічної селекції з використанням поверхневих чи внутрішніх маркерів, специфічних для клітин ендотелію. Наприклад, в даному випадку використовувався метод імуномагнітної сепарації МАС5 (тадпеїйс асіїмагейа сеї! вопіпд) - ефективна технологія магнітного сортінга, заснована на поділі клітин по поверхневим антигенам (сМ.м/млиу. тікепуіріоїес.сот). Подібний метод дозволяє швидко і ефективно (з чистотою 9895 і більше) провести селекцію потрібної популяції клітин з поверхневими маркерами. Однак, може бути використаний і інший метод, наприклад - флуоресцентно-активований клітинний сортінг (РАС5) або будь-які інші, що дозволяють розділити клітини в залежності від поверхневих чи внутрішніх маркерів.

Для селекції ендотелію, отриманого з ЕСК у двовимірній системі, ми скористалися маркером СОЗ1, але можуть бути використані й інші маркери ендотелію, такі, як СО34, фактор УМ/Е або інші.

Селекцію на СОЗ31 проводили на 5-7 день диференціювання. Помічено, що життєздатність клітин, відібраних на 5 день, була вища, ніж відібраних на день 7 після початку диференціювання (Фіг.3). Цей факт можна пояснити тим, що на 7 день диференціювання клітини ендотелію вже формують структури, які досить важко зруйнувати ферментативною обробкою, а збільшення часу обробки та/або руйнування міжклітинних контактів, що вже сформувалися, веде до істотного зниження життєздатності. Отже, проведення селекції на 5 день диференціювання в наших умовах можна вважати оптимальним. При використанні для селекції інших маркерів, селекцію можна проводити на 3-9 дні диференціювання.

Виділені клітини висівали на чашки, покриті колагеном, в середовище для ендотеліального диференціювання. Клітини висівали у високій щільності (не менше 50000 клітин на 1сма2 і більше), так як посів у більш низькій щільності негативно впливав на життєздатність клітин.

Нами запропоновано 2 варіанти способу отримання ендотеліальних клітин з ЕСК людини.

Сутність першого варіанту способу отримання ендотеліальних клітин з ЕСК людини полягає в наступному: 1. Проведення диференціювання ЕСК людини на підкладці і в синтетичному середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, з МЕСЕ, 5СЕ, ВМР4А, рЕСЕ, тагреїа. Використання як основи синтетичного середовища суміші рідкої ОМЕМ/РІ2 з рідким КО замінником сироватки в кількості (06.95): рідка ОМЕМ/РІ2- 75-9595, рідка КО замінник сироватки - 5-2595. Причому ТаЕреїа вносять в синтетичне середовище на 3-6-ий день диференціювання. 2. Проведення імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для клітин ендотелію на 3-9 дні диференціювання. 3. Культивування ендотеліальних клітин при щільності посіву не менш 50000 клітин на 1сма2.

Сутність другого варіанту способу отримання ендотеліальних клітин з ЕСК людини полягає в наступному: 1 Проведение диференціювання ЕСК людини на підкладці і в середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, з МЕСЕ, 5СЕ, СЕС. Використання, як основи, середовища суміші рідкої ОМЕМ/РІ2 і фетальної бичачої сироватки в кількості (06.95): рідка ОМЕМ/РІ2- 75- 95905, рідка фетальна бичача сироватка - 5-2595. 2. Проведення імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для клітин ендотелію на 3-9 дні диференціювання. 3. Культивування ендотеліальних клітин при щільності посіву не менш 50000 клітин на 1см2.

У наших способах були випробувані лінії клітин ПНЕ5МОЇ1, ПЕБМОЗ НЕЗМО2, 04, НІ, НОЕ57, 8,9, при цьому отримані результати були близькими, що підтверджує можливість його застосування для диференціювання будь-яких ЕСК людини. Співвідношення компонентів середовища може оптимізуватися для кожної клітинної лінії окремо для досягнення максимальної ефективності. В якості середовища для культивування клітин можуть бути використані й інші синтетичні середовища повністю відомого і охарактеризованого складу.

Заявлені способи дозволяють отримати високий вихід клітин в кінці процедури диференціювання, що мають імунологічні маркери ендотелію, більшість з яких здатна брати участь у формуванні трубчастої мережі.

Навіть більше, диференціювання було відтворене з використанням замінника сироватки замість охарактеризованої фетальної бичачої сироватки (ЕВ5) що значно краще від існуючих методів диференціювання. Використання синтетичного середовища, що не містить компонентів тваринного походження, робить метод відтворюваним і незалежним від складу сироватки. Проте, навіть у цьому випадку, приблизно половина клітин була представлена невідомим типом клітин або незначною популяцією недиференційованих клітин. Важливо відзначити, що навіть маленький відсоток недиференційованих клітин або клітин, які диференціювалися в різні типи, може забруднити клітинну культуру. Ці сторонні популяції можуть мати великий вплив на безпеку і функціональну ефективність культури для терапевтичного застосування або подальшого вивчення. Таким чином, селекція специфічної популяції клітин важлива.

СО31 визнаний кращим імунологічним маркером ендотеліальних клітин, і в той же самий час його експресія була виявлена дуже рано, на 6 день ПЕ5С» диференціювання, що дозволило його використовувати в методі імуномагнітного сортінга. Однак, використання інших маркерів (наприклад, СОЗ34, фактор УМ/Е) та інших методів селекції (наприклад, ЕАС5) теж давало гарні результати.

Варіанти здійснення винаходу

Можливість здійснення способу підтверджується наступними прикладами його реалізації, які показують лише окремі випадки його виконання.

Приклад 1. Культивування ЕСК людини.

Лінії ЕСК людини культивували в середовищі, що містить 8095 КпоскОці ЮОМЕМ, 2095 КО замінника сироватки, глутамін 1 мм, 195 замінні амінокислоти, 50 пеніциліну ОД/мл, 50 мкг/мл стрептоміцину (виробник

Іпмігодеп), 0,1 мМ р-меркаптоетанолу (Зідта), і 4 мкг/мл БРаЕ (Спетісоп) на інгібованих мітоміцином С (10мкг/мл, бідта) мишачих ембріональних фібробластах (МІФ) при щільності 104 клітин/см2 в культуральних чашках, покритих 0,196-ним желатином (Мегск). Фібробласти готували з 12-денних мишачих ембріонів РІ (С57ВІ/6бухСвА/Са). НЕ5С колонії пасерували кожні 5-6 днів культивування обробкою колагенази типом ІМ (200Ш/ті, Іпмігодеп) і механічною диссекцією. Чашки з недиференційованими колоніями НЕ5С, вирощеними протягом 8 днів, обробляли колагеназою ІМ протягом 10 хвилин, змивали двічі ростовим середовищем, і збирали колонії з фідера механічно, наконечником мікропіпетки вручну. Плюрипотентні лінії клітин, ізольовані і вирощені на фідері, показували типову ЕСК морфологію клітини, експресували імунологічні маркери, характерні для недиференційованих клітин і підтримували нормальний каріотип. Ми не спостерігали навіть маленький відсоток СОЗ1 позитивних клітин в недиференційованих колоніях.

Приклад 2. Диференціація ЕСК людини в ендотеліальні клітини.

Середовище для диференціювання.

Для диференціювання використовували синтетичне середовище наступного складу: основа 8595 рідкої

ОМЕМ/Е12 (Нусіопе або аналог іншої фірми), 1595 рідкого КО замінник сироватки (Іпмийгодеп або аналог іншої фірми) з додаванням 1 95 замінних амінокислот, 2 мМ І-глутаміну, 50 од/мл пеніциліну, 50 мг/мл стрептоміцину, 50 нг/мл 5СЕ, 1О0нг/мл ВМРА, 50 нг/мл МЕС, активіна ІОнг/мл, 20 нг/мл СЕС, 2нг/мл ТОгБеїа.

ТОБ Брейа вносять на 4 день диференціювання. Концентрації і поєднання ростових факторів можуть відрізнятися від зазначених на 50-10095 залежно від клітинної лінії та індивідуальних умов культивування.

Спосіб приготування середовища.

Рідке середовище ОМЕМ/НІ2 змішували з рідким замінником сироватки, антибіотиками і глутаміном і для подальшого використання зберігалося при 40 С. Всі інші компоненти (ростові фактори тощо) додавалися в середовище безпосередньо перед додаванням до клітин. Повне середовище не зберігалося. Методика проведення диференціювання.

Чашки з недиференційованими колоніями ПЕС, вирощеними протягом 8 днів (фіг.4А), обробляли колагеназою ІМ протягом 10 хвилин, змивали двічі ростовим середовищем, колонії збирали вручну наконечником мікропіпетки, розрізаючи на фрагменти розміром 300-500 клітин. Колонії ЕСК для проведення диференціювання були переміщені в 35 мм чашки Петрі, покриті колагеном ІМ (70 цйд/ті) в середовищі, зазначеного вище складу (Фіг.48). На 4день диференціювання в середовище додавали 2нг/мл ТОРьеїа 1. На наступний після додавання день клітини набували морфологію диференційованих похідних (Фіг. 48). На 6-10 день культивування колонії містили кластери судиноподібних структур (Фіг. 4Г).

Приклад 3. Диференціація ЕСК людини в ендотеліальні клітини.

Відрізняється від прикладу 1 використанням середовища на основі суміші рідких ОМЕМ/Е12 (Нусіопе) і фетальної бичачої сироватки (Нусіопе спагасієгігед).

Середовище для диференціювання.

Для диференціювання використовували середовище наступного складу: основа 8595 рідкої ОМЕМ/Е12 (Нусіопе або аналог іншої фірми) і 1595 фетальної бичачої сироватки (Нусіопе, спагасієгі7гей або аналог іншої фірми), 2 мМ І!-глутаміну, 195 замінні амінокислоти, 50 одиниць/мл пеніциліну, 50 мг/мл стрептоміцину, (всі від

Іпмігодеп або аналог іншої фірми), 20 нг/мл СЕ (Спетісоп або аналог іншої фірми), від 10 до 50 нг/мл МЕСЕ (Спетісоп або аналог іншої фірми), 5 нг/мл БЕРСЕ (Спетісоп або аналог іншої фірми) Ростові фактори можуть варіювати, як зазначено в прикладі 1. Средовище готують, як описано в прикладі 1.

Клітини також на 3-6 день набували морфологію диференційованих похідних. На 6-10 день культивування колонії містили кластери судиноподібних структур.

Приклад 4. Сепарація ендотеліальних клітин.

Для СО31 ж клітинної селекції клітини на 5-7 день диференціювання були відокремлені обробкою колагенази ІМ (Іпийгодеп або аналог іншої фірми) при 377 С протягом 10 хвилин і змиті двічі забуференим фосфатом фізіологічним розчином (рпозрпаїє рийега заїйпе РВ5), який містить 0,595 альбуміну бичачої сироватки (В5А). Отримані клітини інкубували протягом ЗОхвилин з антитілами миші проти СО31 людини в порції 10 мкг на 105 клітин і потім з Їдс кози проти миші, пришитими до магнітних кульок (Мікепуї Віоїес або аналог іншої фірми) протягом 15 хв при 82С. СОЗ31 позитивні клітини були ізольовані, проходячи через фільтр і колонку М5, прикріплену до магнітного блоку Міпі-МАС5 верагайоп ипії (Мікепуї Віоїесп або аналог іншої фірми), щоб отримати збережену магнітом фракцію очищених СОЗ1 «ж клітин. Після елюції СОЗ31 позитивні клітини були поміщені на покриті колагеном ІМ плашки з щільністю посіву 50000 клітин на 1сма2 і клітини були вирощені в ендотелій - підтримуючому середовищі (Фіг. 5 А).

Промислова застосовність

Чистоту виділеної популяції визначали по імуноцитохімічному аналізу. Щоб дізнатися, чи є СОЗ1 «т клітини, елюйовані з колонки, клітинами ендотелію або їх попередниками, частину клітин піддавали функціональному тесту на приналежність клітин до ендотелію-тесту на матрігелі. Аналіз експресії генів, характерних для ендотелію, проводили методом напівкількісного ЗТ-ПЛР (Зворотньої транскрипції ПЛР).

Імуноцитохіміний аналіз.

Клітини фіксували 10095-м крижаним метанолом протягом 5 хвилин або 495 парафармальдегідом протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Слайди були промиті в трьох РВ5, 0,195 Тмеєп20 і інкубувались з вторинними антитілами: Аіеха РБійог 546-сопіпдаїей ІдсСх кози проти миші, АІеха Рішог 488- сопіпдаїєй Ідс; кози проти миші в розведенні 1:800. Первинні антитіла, що використовувались, були антилюдським СОЗ1, антилюдським УМ/Е, антилюдським СО105, антилюдським СО34, антилюдським СО133, антилюдським РІК-ї, антилюдським СО14, антилюдським СО45. Клітини були також пофарбовані 4,6- діамідинів-2-фенілондолом (ОАРІ). Після цього імуномічені клітини чи фрагменти були досліджені за допомогою флюоресценцентного мікроскопу. Щоб уникати артефактів у виявленні, ми використовували антитіла з різною специфікою для селекції клітин, що використовувались. Чистота популяції клітин була більше ніж 9095 (Фіг. 5 Б).

Випробування на здатність утворювати судиноподібні структури.

Випробування було проведене, як описано в (21). Матрігель додавався в 24 лунки планшета. 0,5-2х107 клітин були поміщені в лунки в 0,5 мл ростового середовища і инкубувались при 37С та 595 602. Морфологія клітин аналізувалася в фазовому контрасті на інвертованому світловому мікроскопі. Як видно на Фіг. 5В, клітини формують характерну для ендотелію комірчасту судиноподібну мережу.

Зворотньої транскрипції ПЛР (З3Т-ПЛР).

Тотальна РНК була ізольована від недиференційованих ПЕ5С5, СОЗ31 селектованих ендотеліальних клітин Її НОМЕСз (ендотеліальні клітини вени людської пуповини) використанням НАМеазу Міпі Кії (Оіадеп).

Зворотня реакція транскрипції була виконана, використовуючи РНК (1-2 мкг), випадкові шестинуклеотидні праймери (Ргіотеда), НемепАїЇй М-Миї М зворотню транскриптазу і реактиви (Рготеда) згідно з рекомендаціями виробника. Кодуюча ДНК була розчинена в кінцевому об'ємі 25 мл. Певну кількість КДНК (1-5мл) було піддано

ПЛР ампліфікації, використовуючи Тад ДНК полімеразу та реактиви (Рептепіавз). Всі зразки РНК були здатні призвести до рівної ампліфікації гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (ЗАРОН), як внутрішній стандарт.

Послідовності праймерів для ЗТ-ПЛР вказані в Таблиці 3. Продукти ампліфікації були сепаровані в 1,595 агарозному гелі.

Таблиця 3

Послідовність праймерів

МЕ-садветіп | УССООСОССААААСАСАбАЗ:

УСАСОСАСОССАТІСААСААСЗ"

САТА-? УСССТААССАОСОСАССААСАСЗ

У ТОСАСТІСТОСТОСАТОСАСТУ

САТА-3 УТСАСААААТОААСОПСАСАСААСІ

УСООТТАААСОАОСТОТІСТТО3" ємо УСТОАТООСССААОСОСАСТОАдАОЗ

УССОСАССССОААСАСАСАСААСІ

СО31 УСОСТОТТООТООСДАССАСТОСІ

УСААСТТООСТОСАСОТОСтТОЗ

ЕІКІ УТООАООТОАСТОАСТОСАСЗ"

УСАССАТОССАССАТАОСТОЗ"

ПРРАЗ УТАСТОСОТСОСАСАОТСТОТАСУ

УТТОООСТІСТААСАСАСАТОСЗІ"

ОРРА5 УАССТОАААСАТССАСАСООТОТЗ3" 5ССООСТТСАТТОСАТТООСТЗ"

ОоСст4 КСОАССАТСТОССОСТІТОАОЗ

УСССССТОТСССССАТТССТАЗ

МАМОС УАОСАТССОАСТОТАААСААТСТТСАСЗІ

УСООССАСТТОТТТТТСТОССАССТІ3

САРОН УСААООТОААООТСОСАОТСАЗ

УТТСАСАСССАТОАСОСААСАТІ

Ї Фактори транскрипції грають важливу роль протягом ембріонального розвитку в напрямку диференціювання і підтримки фенотипу. Особливо ендотелій-специфічні фактори транскрипції САТА-2 і 3, які майже повністю вимкнені в недиференційованих ПЕ5С5, хоча їх експресія в отриманій з пЕ5С5 чистій популяції ендотеліальних клітин була порівнянна з їх експресією в НОМЕС5. Ген еМмОбЗа не експресувався недиференційованими ПЕ5С», але після диференціювання в ендотелій його експресія була виявлена в чистій популяції ендотеліальних клітин на тому ж самому рівні, як в НОМС5. Таким чином, Аналіз експресії генів, характерних для ендотелію, методом напівкількісного ВЩ-ПЛР показав, що рівень експресії цих генів у клітинах ендотелію з ЕСК порівняний з експресією в НОМЕС (Ффіг.б6) Геномне бісульфітне секвенування.

Були виділені геномні ДНК від недиференційованих ПЕ5С5, СО31 відібраних ПЕ5ЗСз5-отриманих ендотеліальних клітин і НОМЕС Геномна ДНК була піддана обробці натрієм бісульфіта, використовуючи

СраОепоте "м Разі ОМА Моаісайоп Кії, Спетісоп. Аліквоти ДНК, модифікованої бісульфітом натрію (25-50ОНнГ), були використані для ПЛР при 45 циклах ампліфікації. Праймери для ПЛР у ділянках, що цікавили, були підібрані для натрію бісульфіт модифікованої матриці (Таблиця 4), Кінцеві ПЛР продукти були клоновані за допомогою набору рРОаЕМ-Т Еазу (А1360, Рготеда), і клони плазміди (10 для кожної ділянки) були секвеновані використанням автоматизованої АВІ Ргізт 377 ДНК бЗедиепсег (Арріїєа Віозузієтв).

Таблиця Ле 4 . Положення

Назва гену Послідовність праймерів праймерів відносно старту транскрипції єМО5 УТОАТТПТТООТООТТТТАТТТТОТІ3" -321 5СТСТТСАААТТАСССАТАТТАСТАТЗ" 37

САТА-? УАСТОТОСАТОТАТАСООТОТО3" -217

УАСАААСААТАААСАААСТТАААСААЗ 67

САТА-3 5УСАТОАТАТТАСАААТІТТТІТААСТТОУ -139

УААТССТОССАДАТААТТАААААСААЗ 252

Щоб підтвердити, що ендотеліальні клітини диференційовані з ПЕ5С5 мають правильний прояв епігенетичного статусу, ми порівняли профілі метилювання регулюючих ділянок САТА-2, -3, і генів еМмОсСа в

НЕ5С»5, ендотеліальних клітин диференційованих з ПЕС» і НОМЕС»5. Ми досліджували рівень метилювання кожного Сра в області відповідного селективного промотора гена САТА-2 (з 43 по -187 нуклеотид щодо старту транскрипції, що визначається, як 41) за допомогою бісульфітного секвенування. У недиференційованих

ПЕС ця область була високо метилована - майже до 8095 метилювання (фіг. 7). Рівні метилювання селективного промотора в НОМЕС та ендотеліальних клітинах, диференційованих з ПЕ5С», були низькими і варіювали від 20905 в ендотеліальних клітинах, диференційованих з ПЕБ5С»5, до 1090-в НОМЕС 5. бра розташовані в області від 228-115 нуклеотидів, були високо метиловані в недиференційованих клітинах (до 9095), але в отриманих з ПЕБС клітинах ендотелію і в НОМЕС»5, метилювання означеної області знижувалося до 15-2095 (Фіг. 8). Таким чином, незважаючи на гіперметилювання проксимального промотора, ген САТА-3 був слабо експресований в недиференційованих ПЕ5С»5, хоча гіпометілований промотор значно збільшив його експресію.

Згідно з даними Спап (22), в ендотеліальних клітинах найістотніші епігенетичні модифікації відбуваються в області промотора еМмОба, найближчою до сайту початку транскрипції. Ця область гена еМмО5а між 13 і-237 нуклеотидами була обрана для аналізу бісульфітного секвенування, який показав, що область була гіперметилована в недиференційованих ПЕ5С8 приблизно на тому ж самому рівні, як регулюючі області (САТА-2 і (ЩАТА-3 генів - від 70 до 9095 у кожному Срої положенні. Після ПЕ5С5 диференціювання в ендетеліальні походження метилювання цієї області зменшилося до 2095 у функціональних ендотеліальних клітинах, відібраних з НЕ5Сз і не перевищувало 1095 у НОМЕСз (Фіг.9).

Бісульфітное секвенування дозволило виявити, що область селективного промотора сАТА-2, гіперметилована в ПЕС» і гіпометилована в ПЕЗС5-отриманих ендотеліальних клітинах. Таким чином, ми показали, що статус метелування (ЇАТА-2 селективного промотора впливає на експресію цього фактора транскрипції.

Прийняттям до уваги кореляції експресії (ХАТА-2 і його промотора метилювання в пПЕЗС5-отриманих ендотеліальних клітинах ми могли визнати важливу роль селективного промотора САТА-2 в ендотелій- диференціюванні.

Незважаючи на гіперметилювання (34АТА-3 проксимального промотора, САТА-3 ген був слабо експресуваним в недиференційованих ПЕ5С5. Однак, ми не могли виключити, що в недиференційованих пЕЗС» САТА-3 ген запущений альтернативним промотором.

Проаналізувавши всі отримані дані ми можемо заключите, що іп міо зовнішні сигнали викликають складну комбінацію молекулярних механізмів, що закінчуються індукцією певних факторів транскрипції експресії. Навіть більше, вважаючи, що ДНК деметилювання є заключним кроком епігенетичних подій, що ведуть до активації гена, ця індукція постійна і необоротна. Безсумнівно, стовбурові клітини мають великий потенціал, однак цей потенціал повинен управлятися іп міо, інакше небажані наслідки можуть мати місце після неконтрольованого в природних умовах диференціювання.

Згідно з нашими даними, СПАТА-2 і еМмО5 промотори піддаються гіпометилуванню в ході ПЕбБС5 диференціювання в ендотелій. Отже, ми можемо заключити, що ендотелій-специфічна експресія еМмозЗа регулюється через подвійний негативний епігенетичний контроль. У недиференційованих ПЕ5С5 не тільки промотор еМОбЗа, але також і промотор його регулюючого чинника транскрипції (ЇАТА-2 був блокований метилюванням.

Наші дослідження демонструють суттєві відмінності в метилюванні областей промоторів трьох генів від

НЕБО» до з ПЕБС5-отриманим ендотеліальних клітин. Однак, ми спостерігали деякі відмінності між областями промоторів метилювання трьох генів, вивчених в ПЕ5Св5-отриманих ендотеліальних клітинах і НОМЕС В отриманих з пПЕ5С»5 ендотеліальних клітин області промоторів генів, що вивчались, були трохи більше метиловані, ніж відповідні області в НОМЕС, хоча це не закінчувалося придушенням транскрипції. Можливо, це відображає, що ендотеліальні клітини, які походять з ПЕ5С5, не були ендотеліальними клітинами вени пуповини, а скоріше представляли суміш спеціалізованих підтипів ендотеліальних клітин (наприклад, капілярні, аортальні ендотеліальні клітини, легеневі ендотеліальні клітини), де рівень метилювання є змінним.

Отримані ендотеліальні клітини могли бути піддані заморожуванню і зберіганню. При цьому клітини зберігали життєздатність і свої властивості.

Кріоконсервацію та відтавання ендотеліальних клітин здійснювали наступним чином.

Середовище для заморозки мало наступний склад: 9095 фетальна бичача сироватка (інактивована при

5620 протягом 45 хвилин) (Іпу/йгодеп або аналог іншої фірми), 1095 ОМ5О (ІСМ Віотеадіса!5, Іпсо. Або аналог іншої фірми).

З культивованих клітин видаляли середовище, промивали двічі РВ5, додавали трипсин/ЕДТА 2 мл на 100мм чашку або 75 см? флакон. інкубували при 372С 5 хвилин, нейтралізували трипсин/ЕДТА 5 мл культурального середовища і піпетувати, щоб отримати одноклітинну суспензію. Отриману суспензію переносили в 25 мл пробірку і центрифугували 5 хвилин при 1200грт. Осад суспендували в їІмл середовища для заморожування, потім переносили в кріовіалу і відразу поміщали на 24 години на -7020 На наступний день кріовіали переносили в рідкий азот для тривалого зберігання. В одній кріовіалі заморожували 1,5-Змлн клітин.

Кріовіали відтавали на водяній бані при 372, стерилізували 9595 етанолом. Вміст віали переносили в 15 мл пробірку і поступово додавали 9мл культурального середовища. Центрифугували 5 хвилин при 100Огрт, надосадову рідину видаляли, осад суспендували в 1 мл середовища і переносили в культуральну чашку або флакон з середовищем. Клітини рівномірно розподіляли по поверхні і поміщали в інкубатор при 37"С та 595

Со2г.

Методи, способи, застосування отриманих клітин ендотелію (ендотеліоцити). 1. Отримані описаним вище способом клітини ендотелію можуть бути застосовані для формування судинної мережі (колатералей) де помо за рахунок неоангіогенезу шляхом введення 104, 105, 106 або більшої кількості клітин у вену або артерію ссавців, включаючи людину (Фіг. 10). 2. Отримані клітини можуть бути застосовані для васкуляризації імплантанта шляхом додавання їх до біосумісного матеріалу, такого як желатин, хітозан, колаген, матрігель і інші або їх комбінації, що забезпечують формування тривимірної структури, до якої крім клітин ендотелію можуть входити такі клітини, як фібробласти, кардіоміоцити, гепатоцити, кератиноцити, нейрони, мультипотентні клітини кісткового мозку, гліальні клітини, хондроцити, остеоцити і інші клітинні типи або поєднання типів клітин і імплантування (запровадження) в організм ссавців, включаючи людину. Васкуляризація імплантанта може здійснюватися або за рахунок залучення ендотеліальних клітин організму, або за рахунок васкуляризації імплантованими клітинами, що містяться в тривимірній структурі для забезпечення імпланта (введеної тканинної або клітинної композиції) кровопостачанням (Фіг. 11). 3. Отримані клітини ендотелію можуть бути використані для виготовлення трубчастої структури, покритої ендотеліоцитами, шляхом нанесення їх на двовимірну підкладку з колагену, мтарігелю, хітозану, фібронектину і/або інших біосумісних матеріалів у поєднанні з іншими типами клітин або без них, яка може бути використана в якості трубки при операціях на судинах для відновлення порушеного або недостатнього кровообігу, шляхом заміни частини, фрагменту або повністю судини або її стентування. 4. Стримані стандартизованим методом із стандартної відновлюваної клітинної культури, клітини ендотелію можуть бути використані для тестування токсичності хімічних або біологічних субстанцій, або можуть бути використані для визначення ефективності речовин, здатних стимулювати ріст (проліферацію) клітин ендотелію шляхом визначення проліферації або загибелі клітин ендотелію за допомогою відомих методів. 5. Клітини ендотелію можуть бути використані для діагностичних або терапевтичних цілей для лікування генетичних захворювань або для доставки генів токсинів або самих токсинів в місця активного ангіогенезу (росту судин) для блокування останніх (наприклад, у випадку росту судин у пухлині) з метою припинення кровопостачання органа або тканини та її подальшою загибеллю шляхом їх генетичної модифікації, конструкціями, що містять гени репортери, наприклад, зелений флуоресцентний білок або аналогічні, або генетичними конструкціями, що містять гени токсинів, або генетичними конструкціями, що містять гени для відновлення роботи порушених генів і введення модифікованих клітин ендотелію в організм ссавців, зокрема людини. Ендотеліальні клітини, модифіковані генетичними конструкціями, що кодують фактори росту, можуть бути векторами для стимуляції росту певної тканини, клітин, групи клітин. 6. Поєднання перерахованих вище методів використання.

Таким чином, наша двовимірна система диференціювання дозволила нам продукувати ендотеліальні клітини з високою ефективністю, вибирати чисту популяцію функціональних ендотеліальних клітин, які набували той же самий епігенетичний статус ключових факторів транскрипції та гомеостазу підтримки генів, як їх аналоги, що диференціюються в ембріоні іп мімо. Отримані ендотеліальні клітини можуть знайти широке застосування в медичній практиці.

Відібрані пПЕЗС-отримані ендотеліальні клітини експресували ендотелій-специфічні гени, формували судиноподібні структури і морфологічно не відрізнялися від первинних ендотеліальних клітин. СОЗ1 відібрані ендотеліальні клітини, диференційовані з НЕ5С5, були здатні культивуватися іп міїго принаймні до 4 пасажів.

Використовуючи наш спосіб диференціювання, ми спостерігали СОЗ1 і МЕ-садпегіп експресію на 6 день.

Безсумнівно, це могло статися через відмінності між лініями клітин, хоча умови культивування (тобто середовище культивування, фактори росту, обробка) мають великий вплив на властивості диференціювання.

Цікаво те, що ми виявили МЕ садНегіп експресію на 6 день ПЕ5С» диференціювання, у той час як у природних умовах його експресія спостерігалася лише на 8-му тижні вагітності. Таким чином, маркер диференційованих ендотеліальних клітин МЕ-сайнегіп був виявлений дуже рано іп міїго.

Список літератури. 1. Ванагуапа, Н., дагагу, Н., Мавхзиті, М., Авпйапі, 5.К. Сепегайоп ої іпзиїп-зесгейпо сеїв їйїот питап етргуопіс віет сеї. Оем Стоп Орійег. 2006,48: 323-332. 2. Нау, О0.С., 7пао, О., Вов5, А., Мападаіат, А., Геркомуекі, 9У., Сиі, МУ. Оігесі Оібегепіайоп ої Нитап

Етбьгуопіс (ет СеїЇз ю Нерайосуїе-їїКе СеїЇІ Ехпірійпду Рипсіїопа! Асіїмйев. Сіопіпд 5іет СеїІв. 2007,9: 51-62 3. Непа, В.С., Наїдег, Н.КИ., біт, Е.К., Сас, Т., Мо, 5.0. Бігаіедієв юг аїгесіїпуд Ше айегепіайоп ої вієт сеїЇв їпо Ше сагаітуодепіс Іїпеаде іп міїго. Сагаіомазс Нез. 2004, 62:34-42. 4. Хи, С, Не, 9.О., Катр, Т.)., Роїїсе, 5., Нас, Х., О'Зйіймап, С, Сагрепієг, М.К., І еркомекі, у)., сої 90.

Нитап етрбгуопіс зієт сеїІ-депмей сагаіотуосуїез сап ре таїпіаїіпей іп дейпей тедінт м/о зепит. 5(ет СеїЇв

Оеєм. 2006, 15: 931 -941.

5. І асаца, сх., КеїПег, Ссх., КоизКой, М. Тгтаскіпд тезодегт Ююгтаїйоп апа 5ресійсайнйоп ю (Ше петаподіобіаві іп мікго. Тгепаз Сагаіїомазс Меа. 2004,14,314-317. 6. Спої, К., Кеппеду, М., Кагагоу. А., Рарадітйнои, 9.С., КеПег, Сх. А соттоп ргесигзог ог Нетайороієйс апа епаоїНеїїа! сеї. Оемеюртенпі. 1998, 125, 725-732. 7. Спипад, У.5., 2папо, МУ.)., Агепібзоп, Е., Кіподвзієу, Р.О., Раїїв, 9., Спої, К. Іпеаде апаїувів ої Ше

Нетапдіобріавзі аз деїпеа бу РІ Кі апа 5СІ. ехргеззіоп. ОемеІортепі. 2002, 129,5511-5520. 8. Мізпікама, 5.І., Мізпікажма, 5., Нігазпіта, М., Маїзцуознї, М., Кодата, Н. Ргодгезвіме ІІпеаде апаїувзіз бу сеї! вопіпд апа сийиге ідепійе5 ЕКІ-МЕ-садпегіп-- сеїї5 аї а аїмегдіпу роїпі ої епдоїШеїїаІ апа петороіеїйс

Іпеадев. ОемеІортепі. 1998, 125, 1747-1757. 9. Нибег, Т.І., КоизКой, М., Еепйіїпо, Н.)., Раїїв, у., КеПег, С. Наетапдіоріаві соттійтепі із іпійасей іп (Не ріїтййме 5ігеак ої Ше тоизе етбргуо. Машге. 2004432, 625-630. 10. Сегдап, С, Ношеєац, А., ВНайа, М., МЕСЕ-А1Т65 апдтепів егуїйпгороїєїс демеюртепі йот питап етбгуопіс 5іет сеїІв5. Віоса. 2004, 103,2504-12. 11. Снадміск, К., Мапа, І.., Ії, Ї., Мепепаел, Р., Мигаоси, В., Коціеаиц, А., Впайа, М. СуїюкКіпе5 апа ВМР-4 рготоїе петаїйороїеїйіс айегепіайоп ої питап етбгуопіс 5іет сеїІв. Віоса. 2003, 102, 906-915 12. І емепрегао, 5., СоїШб, 9.5., Атії, М., НеКомі2-ЕЇдог, у., Ії апдег, А. Епдоїнеїїа! сеї5 деймейа їот питап етбгуопіс зієт сеїІ5. Ргос Майї! Асай 5сі ОБА. 2002,99: 4391-4396. 13. Мо, Е.5., ЮОамів, В.Р., А2201а, І., Зіапівєу, Е.С, ЕІстапіу, АС. Рогсей аддгедайоп ої аейпей питрегв ої питап етбргуопіс віет сеїІв іп етбргуосід родієв ювіегв гориві, гергодисіріе петайюроїеїййс айегепііайоп. Віоса. 2005,106,1601-1603. 14. 7атріаїв, Е.Т., Реації, В., Рагк, Т.5., Вип, Е., Сіміп, С.І., Нетайороівїййс айегепііайоп ої питап етргуопіс віет сеї ргодгезвзев (Шгоцди зедиепііа! ПетайюепаоїНеїїаї, ріітійме, апа аеїйпйіме віаде5 гезетбріїпд питап усїк вас демеІортепі. Віоса. 2005, 106, 860-870. 15. пап, Х., Огамід, с, Ме, 7., Наттопа, Н., Зпатбріой, М., Сеагтай, 9У., Спепо, Г. ЕРипсійопа! апіїдеп- ргезепіїпд Іеисосуїгез дегпмей їот питап етбгуопіс вїет сеїЇв іп міо. апсеї. 2004, 364, 163-171 16. Кашїтап, О.5., Напзоп, Е.Т., І ем/ів, В.І.., Айеграсиі, А., Тпотвоп, У.А. Нетайороїєїїс соіопу-їоптіпд сеїЇв депймей їтот питап етрбгуопіс вієт сеїІв5. Ргос Маї! Асад 5сі ОБА. 2001,98,10716-10721. 17. Модуапік, М.А., Вогк, 9У.А., Тпотвоп, У.А., ЗІШКмУїп, І.І. Нитап етбгуопіс зіет сеїІ-деймеа СОЗ4-- сеїІв: ейісієпі ргодисіоп іп (їе сосишге мій ОРО віготаї! сеї апа апаїузіз ої Іутрпопетаїйороїеїййс роїепіа!. Віоса. 2005, 105, 617-626. 18. Нігазпіта, М., Каїаока, Н., Мізпікама, 5., Маїзцуозпї, М., Мізпікама, 5. Майшгайоп ої етргуопіс вієт сеїЇв їпюо епаоїпегїаї! сеїїв іп ап іп міо тоаеї ої мазсцодепезвів. Віоса. 1999,93,1253-1263. 19. І адаїкома, М.А., МоІспнКом, Р.У., І уакізпема, А.М., Рпйопепко, Е.5., КізеїІєм, 5.1. Юїмегзе ерідепеїйс ргойе ої поме! питап етргуопіс 5ієт сеї! Іпев. СеїЇ Сусіє. 2006, 5: 416-420. 20. Сегеспі-Міг, 5., 2і8Кіпа, А., Сопеп, 5., НеКоміс-ЕЇдог, 9. Нитап етрбгуопіс віет сеїЇ5 аз ап іп міго тоавє! юг пПитап мазсшаг демеіюртепі апа Ше іпдисіоп ої мазсшаг айегепіацйоп. І ав Іпмеві. 2003, 83: 1811-1820. 21. Вотраїз, Н. еї аі. Нитап епадоїпеїа! сеї дегпмей їот сігсшціайпу ргодепітшгв аїзріау зресійс псбопаї ргорепіє5з сотрагей м/п тайшге меззе! маї! епдоїпеїїа! сеїІв. Віоса 103, 2577-2584 (2004) 22. Спап, У., Ріви, 9У.Е., О'Абгео, С Те сеїІ-ресійс ехргеввіоп ої епдоїеїа! пііс-охіде зупіпазе: а гоїє г

ОМА теїпуїайоп. У Віо! Спет. 2004,279: 35087-35100.

і; 1

По о . о о. п. | чі

КЕ ; кі

ЕЕ с з с щ генів що щ спи ща пе ях ш ї їе нн ШЕ й ї щ : БО о х о . й о ще ва оон ще нн и. 5 я. НГ А о сви пе ї у ш- о о . о. . а о Се зЯ ся пт но пи ває Бе ПЕ що о п пк - 5 хх з їЗ й чо с с 3. с її її о у;

ПО в Як: 55555555 55555 у: а її я її

І ІМ ІМ І І ОХ

31 ч її

ІПЗОЇЇОТЦ4ЙЇЇІ ОА ОО ОО ОО ОО ОО ОО МО ІІІ МОВО

Фіг п Б 00 Еш пн . . с 0 НО І У ТОЙ с о | я я шЕ г п г ня г й я в пов с ов лоно п В В ОО В п оеВВх п пеня пев с 5 Б о шо ЕС шо ! с од

ДПЕ ЕК ПЕД ДЕ тин 0 її Б о 0: ШЕ: 55 я ше я 3 Б ОА ча пи щи ВЕ

Он пи ПИШИ И ОИК В м НН МК ШЕ вн пе 5 ІІ що и : и а

МЕ о З 0 нн и М В

ВЕ шо с й и о г М В я я ! ші пон т д пох ПОШИТИ с В М с КОХ не

Еш 000 ССС с

ПОД ДК в ще У, с пе ОО поет КК В СКК ОВ КО

ЕВ п и птн Ли п о ОК г пов В снНнСннСщшМСЖоооо.О- СО

ПП КОН ши ИН ПЕ с о. я 5 о

ПНО ННЯ ОН СПИ. «ПН ОО ПО п 3 5 І ПО с о.

ОК ПИКА ЗХ що ОК ОО ОХ КК КК 00 5 с

МО ОВ ОВ о п с

ХЕ в о в В Ве о. шо с

З 0: ПИ Е ОН ї п В 000 5 ЕЕ. о: ша А Ц Ф с 0 її ДЩ((-- п и г ша

Б ДОННВНЯ ОО ЕЕ КЕ ОВ в Я сг г с с. сг Й: с Бе ня ПЕПНШНИНИ НИ В й ВЕК ПЕН ой зав її я я о ос ЕЕ НН. ко а ОН Б ОО їх 0!

ПЕН в о В В ПП Кт ПК КВ ООН Я п й ес г СЕ В 5 ЕВ с я. ОВ

ОБ ОО 0! о пАТАЛ о о

Мк с шо ев випив

Фіг і

ІЩЕ ще й 0 вв з з з давав о чув вовюю тм» ях соопо250ове домом г бе шо м на! іЕ Б о Ендотелій із ЕСК 100

Я 5 2.

Кк т | 5 о 25 . в. (о) й "Й ай зззізЗз3ззхвоввчувьоюювю? тов особового очьошочьюхо в чо»

В Фо Фо че з : НОМУЕС В

Ф1100 2. щ 15 що дія ий в " пи ш и и и ви зз35а55зЗз5іововочоавовювюх тю» своп: в чо м

Фо» Ома

Положення Сро динуклеотидів в промоторі САТА-2

Фіг. 7

А

50 ЕЕ я 2 ЕЕ ІІ

Еш І й НИ! я 0 - пою О тот

З сват "вового ро Ендотелій із ЕСК Б

НІ 100 щ сі 15 о) 50 щ

ВУ І) о зоФоФошошвювоООовттитк т тт я дочвововго "85 о

Ж х НОМЕС В ге 100 о кі 15 50

Й і

А І І 1 ! і Р 1 І Мк ГВ ах о рак - й р сб ша ра мил знак я дечого завшйетюют

Положення Сро динуклеотидів в промоторі САТА-3

Фіг. 8

І хх 50 я 25 зх о

О в ов в а 8 8 8 в в

З Б: Іще ие ние пи п з ПИ нини

КЕ Ендотелій із ЕСК. Б (з 100 в. (о) 75 ж 5О

В 25 щ

В о ;

З во ьввоО З х І: Ше з» Пи: пи пи: п пня

Броою НОМЕС в 75 50 о

Авт о (се; (се) - Ф (65), гав) сл - (Са) о - - - - Гаю)

Положення Сро динуклеотидів в промоторі ЕеМО5

Фіг.9 кеенеенеинЕЕ я

ООН о. ї ОВ нн с с с ПОВЕ п ПЕВОЮ ОХ ОК п ; с а

ФНк НВ и сто де її п с г п о с

Claims (2)

1. Спосіб отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини, що передбачає диференціювання ЕСК людини на підкладці і в середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, з людським фактором росту ендотелію судин УЕСЕ, 1 сепарацію отриманих ендотеліальних клітин, який відрізняється тим, що використовують синтетичне середовище для диференціювання она основі суміш ЮМЕМ/КІ2 з КО замінником сироватки при співвідношенні: рідка ОМЕМ/НКІ2 - 75-95 96, рідкий КО замінник сироватки - 5-25 90, при цьому синтетичне середовище додатково містить чинники росту 5СЕ, ВМРА, БЕСЕ, ТОЕбеїа в ефективних кількостях, причому ТОЕрега додають на 3-6 день диференціювання, а сепарацію проводять на 3-9 день методом імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для клітин ендотелію, після чого отримані ендотеліальні клітини культивують у зазначеному синтетичному середовищі при щільності посіву не менше 50000 клітин на 1 см".

2. Спосіб отримання ендотеліальних клітин з ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) людини, що передбачає диференціювання ЕСК людини на підкладці і в середовищі, які забезпечують спрямоване пряме диференціювання ЕСК людини в ендотеліальні клітини, з людським фактором росту ендотелію судин УЕСЕ, 1 сепарацію отриманих ендотеліальних клітин, який відрізняється тим, що використовують середовище для диференціювання на основі суміші ЮМЕМ/КІ2 з фетальною бичачою сироваткою при співвідношенні: рідка ОРМЕМ/НІ2 - 75-95 90, рідка фетальна бичача сироватка - 5-25 9Уо, при цьому середовище додатково містить чинники росту 5СЕ 1 БЕОЕ в ефективних кількостях, а сепарацію проводять на 3-9 день методом імунологічної селекції з використанням маркерів, специфічних для ендотеліальних клітин, після чого отримані ендотеліальні клітини культивують у вказаному середовищі при щільності посіву не менше 50000 клітин на 1 см".