CN102965425B - 药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用，所述药物筛选方法，用于筛选出对LOXL1基因表达有促进作用的物质，其中，所述药物筛选方法中，包括以下步骤：A、构建由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的二代慢病毒载体；B、用二代慢病毒载体感染人成纤维细胞，构建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞；C、药物筛选：将所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞接种于培养基中，将待测物质加入到人成纤维细胞的细胞培养基中；培养；通过检测绿色荧光强度是否增加来判断待测物质对LOXL1基因表达的促进作用。本发明所提供的方法操作简单，具有广泛的适用性。

Description

药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及一种药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用。
背景技术
弹性纤维为多种器官提供弹性， 而胶原蛋白为机体提供支撑作用。 现在已知，弹性纤维交联度的降低会导致一系列的结缔组织的病变，例如皮肤松弛、肺气肿、心血管异常、血管增生诱发的视网膜黄斑退变、性器官脱垂及尿失禁。这些病变均属老年性慢性病，虽然不致死但大大影响人们的生活质量。因此，探索提高机体的弹性纤维的维护是提高人们生活质量的重要手段。
弹性蛋白多聚体沉积是弹性纤维维持交联度的一个重要因素，早于2004及2006年，Liu 及其同事发现赖酰基氧化酶1 （Lysyl oxidase-like 1, LOXL1） 是特异地维护机体弹性纤维的发育及其更新的关键因子。没有LOXL1直接特异性地影响弹性纤维的交联形成，进而导致一系列的动态结缔组织的病变，包括皮肤松弛、肺气肿、心血管异常、血管增生诱发的视网膜黄斑退变、性器官脱垂及尿失禁。进一步研究发现，随着组织器官的老化，LOXL1的水平大大降低，并伴随着弹性纤维交联度的下降及弹性蛋白单体无序堆积的增加。这些发现揭示通过增强LOXL1蛋白的表达水平或活性能延缓生物有机体胞外基质的衰老过程（Nature Genetics 2004 (36):178， Am J Path 2006（168）: 519； IOVS 2008 （49）:2599；WO/2005/069975，US Patent 7255856，US Patent 7255857，European patent EP1706139）。
但是，现有技术还有没有出现一种药物筛选方法，能用于筛选出对LOXL1蛋白的表达水平或活性有效促进作用的物质。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用，旨在解决现有技术中没有方法能有效筛选出能用于筛选出对LOXL1蛋白的表达水平或活性有效促进作用的物质的问题。
本发明的技术方案如下：
一种药物筛选方法，用于筛选出对LOXL1基因表达有促进作用的物质，其中，所述药物筛选方法中，包括以下步骤： 
A、构建由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的二代慢病毒载体：将人LOXL1基因启动子片段克隆到慢病毒载体pLVX-ZsGreen上，并将慢病毒载体pLVX-ZsGreen上原有的CMV启动子置换下来，得到二代慢病毒载体pLenti-PLOXL1-ZsGreen，所述二代慢病毒载体pLenti-PLOXL1-ZsGreen含有由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的元件PLOXL1-ZsGreen；
B、用二代慢病毒载体感染人成纤维细胞，构建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞；
C、药物筛选：将所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞接种于培养基中，贴壁过夜；将待测物质溶解于DMSO中并加入到人成纤维细胞的细胞培养基中；经过培养后，检测人成纤维细胞的绿色荧光强度，通过检测绿色荧光强度是否增加来判断待测物质对LOXL1基因表达的促进作用。
所述的药物筛选方法，其中，所述步骤B的具体过程为：
将二代慢病毒包装体系包装并浓缩成滴度不低于1x107/ml 的病毒颗粒，按1：100 稀释，用于感染细胞密度为20%的人成纤维细胞，经流式分选仪筛选出稳定整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞系。
所述的药物筛选方法，其中，所述步骤C中，所述待测物质是以0.2-2 mg/ml溶解于DMSO中；所述细胞培养基中待测物质的最终浓度为1-10 μg/ml。
一种用于促进胞外基质交联的药物，其中，所述药物中包含有对LOXL1基因表达有促进作用的物质，所述物质为采用如上所述的药物筛选方法筛选所得。
所述的用于促进胞外基质交联的药物，其中，所述药物包括蕲蛇、大青叶、三尖杉、白芥子、白术、甘草、瓜萎、冬瓜皮、桑葚、米召、白前、马勃、月季花、儿茶、玫瑰、生地、泽兰、黄柏、老鸹草、藿香、佩兰、芥子、益母草、茺蔚、木蝴蝶、防己、五味子、刺葵藜、川贝、土茯苓、王木留、郁金、红景天或大黄素中的一种或多种。
一种如上所述的用于促进胞外基质交联的药物的应用，其中，将所述用于促进胞外基质交联的药物用作化妆品添加剂、食品添加剂，或用于制备治疗或改善因动态结缔组织病变所致的疾病的药物。
有益效果：本发明中提供了一种能用于筛选对人LOXL1启动子的活性和LOXL1的表达量有促进的药物的方法，此方法操作简单，而且本发明还具有广泛的适用性。本发明中通过对上千个中药提取物及化学小分子的筛选，发现了一系列能提高衰老的人成体细胞中LOXL1水平的中草药抽提物及小分子。这些物质都能有效地促进人LOXL1启动子的活性和LOXL1的表达量，从而促进胞外基质蛋白的交联，胞外基质蛋白包括但不局限于弹性蛋白和胶原蛋白。因此，可将所述用于促进胞外基质交联的药物用作化妆品添加剂、食品添加剂，或用于制备治疗或改善因动态结缔组织病变所致的疾病的药物。
附图说明
图1为本发明实施例1中人LOXL1基因启动子的克隆及其活性荧光示踪成细胞稳定株的构建的示意图。
图2为本发明实施例2中加与不加中草药处理后，ZsGreen荧光强度的检测结果图。
图3a为本发明实施例3中分别加入32种中草药处理后，ZsGreen荧光强度的检测结果图。
图3b为本发明实施例3中对数个经药物后的细胞抽提液进行免疫印迹实验的实验结果图。
图3c为本发明实施例3中对数个经药物后的细胞抽提液进行免疫印迹实验的实验结果图。
图4a为本发明实施例4中加与不加大黄素处理后，ZsGreen荧光强度的检测结果图。
图4b为本发明实施例4中加与不加大黄素处理后，细胞数的检测结果图。
图4c为本发明实施例4中用不同浓度的大黄素处理后，，ZsGreen荧光强度的检测结果图。
图5a1为本发明实施例5中加与不加大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中人LOXL1基因mRNA水平。
图5a2为本发明实施例5中加与不加大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中人LOXL1水平的免疫印迹试验结果图。
图5a3为本发明实施例5中用不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中人Dimer水平的免疫印迹试验结果图。
图5b1为本发明实施例5中加与不加大黄素处理后，人成纤维细胞系HF2中人LOXL1基因mRNA水平。
图5 b 2为本发明实施例5中加与不加大黄素处理后，人成纤维细胞系HF2中人LOXL1水平的免疫印迹试验结果图。
图5 b 3为本发明实施例5中用不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF2中人Dimer水平的免疫印迹试验结果图。
图6a1为本发明实施例6中加不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中锁链素（Desmosine）水平的免疫印迹试验结果图。
图6a2为本发明实施例6中加不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中羟基脯氨酸 (Hydroxylproline)水平的免疫印迹试验结果图。
图6b1为本发明实施例6中加不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF2中锁链素（Desmosine）水平的免疫印迹试验结果图。
图6b2为本发明实施例6中加不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF2中羟基脯氨酸 (Hydroxylproline) 水平的免疫印迹试验结果图。
图7a为本发明实施例7中加不同浓度的大黄素处理后，人皮肤组织中LOXL1 mRNA水平。
图7b为本发明实施例7中加浓度为4μM的大黄素处理后，人皮肤组织中人LOXL1水平的免疫印迹试验结果图。
图7c为本发明实施例7中加浓度为4μM的大黄素处理后，人皮肤组织中弹性蛋白单体（ELN monomer）和中间二聚体 （Dimer）水平的免疫印迹试验结果图。
具体实施方式
本发明提供一种药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提供药物筛选方法，能筛选出对人LOXL1启动子的活性和LOXL1的表达量有促进的药物。采用本发明所提供的药物筛选方法，通过对上千个中药提取物及化学小分子进行筛选，发现了一系列能提高衰老的人成体细胞中LOXL1水平的中草药抽提物及小分子，通过对其中一个称为大黄素（Emodin）的小分子进行系统研究发现，大黄素和34种中草药能有效地促进人LOXL1启动子的活性和LOXL1的表达量，从而促进胞外基质蛋白的交联，胞外基质蛋白包括但不局限于弹性蛋白和胶原蛋白。其中，大黄素对人成纤维组织细胞及人皮肤组织中LOXL1的表达其胞外基质交联的形成也有明显的促进作用。
具体地，所述药物筛选方法中，包括以下步骤：
S1、构建由人LOXL1基因启动子控制表达示踪标志荧光蛋白ZsGreen（绿色荧光蛋白）的二代慢病毒载体：通过Genscan软件预测人LOXL1基因片段大约为起始密码起上游的3 kb 的基因组DNA片段，即人LOXL1基因启动子（PLOXL1），将此片段克隆到慢病毒载体pLVX-ZsGreen（全称为pLVX-IRES-ZsGreen1）上，并将慢病毒载体pLVX-ZsGreen上原来的CMV启动子置换下来，得到的载体就是人LOXL1基因启动子控制下表达示踪标志荧光蛋白ZsGreen的二代慢病毒载体（pLenti-PLOXL1-ZsGreen）。
S2、用二代慢病毒载体感染人成纤维细胞，构建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞系：采用二代慢病毒包装体系包装并浓缩成滴度不低于1x107/ml 的病毒颗粒，按1：100 稀释感染细胞密度为20%的人成纤维细胞（Human fibroblast cells），经流式分选仪筛选出稳定整合有PLOXL1-ZsGreen元件的稳定的人成纤维细胞系。所述人成纤维细胞系整合了ZsGreen荧光强度示踪人LOXL1启动子活性的表达盒（PLOXL1-ZsGreen）。
S3、药物筛选：将所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞系接种于培养基中，贴壁过夜后将待测药物以0.2-2 mg/ml溶解于DMSO（二甲基亚砜）中，以1：200倍稀释加入到细胞培养基中，使其最终浓度为1-10 μg/ml。培养过夜（37℃，5%CO2）后，检测细胞的绿色荧光强度。本发明药物筛选方法通过荧光强度是否增加确定所加的待测药物是否能有效刺激人LOXL1启动子的活性，提高LOXL1的表达量，从而促进胞外基质蛋白的交联。
通过所述药物筛选方法，从两千多种中草药和多种化合物小分子中发现有34种中草药和大黄素都对LOXL1启动子活性有明显的促进作用。因此，本发明中还提供一种用于促进胞外基质交联的药物，所述药物包括蕲蛇、大青叶、三尖杉、白芥子、白术、甘草、瓜萎、冬瓜皮、桑葚、米召、白前、马勃、月季花、儿茶、玫瑰、生地、泽兰、黄柏、老鸹草、藿香、佩兰、芥子、益母草、茺蔚、木蝴蝶、防己、五味子、刺葵藜、川贝、土茯苓、王木留、郁金、红景天或大黄素中的一种或多种。
本发明中还提供所述用于促进胞外基质交联的药物的应用，将所述用于促进胞外基质交联的药物用作化妆品添加剂、食品添加剂或用于制备治疗或改善进动态结缔组织病变所致的疾病的药物。这类疾病包括胞外基质交联缺陷所致的组织老化性疾病如皮肤松弛、肺气肿、心血管异常、血管增生诱发的视网膜黄斑退变、性器官脱垂及尿失禁等。由于所述用于促进胞外基质交联的药物能有效地促进交联酶LOXL1的表达，提高了弹性纤维的交联效率，从而达到延缓生物有机体胞外基质的衰老过程，治疗或改善结缔组织的病变。
下面通过实施例是对本发明的进一步解释和说明。
实施例1：人LOXL1基因启动子的克隆及其活性荧光示踪成细胞稳定株的构建
通过Genscan软件预测人LOXL1基因片段大约为起始密码起上游的2.16 kb 的基因组DNA片段（PLOXL1），其序列如SEQ ID NO.1所示，将此片段克隆到慢病毒载体pLVX-ZsGreen上，并将慢病毒载体pLVX-ZsGreen原来的CMV启动子置换下来，得到的载体就是人LOXL1基因启动子控制下表达示踪标志荧光蛋白ZsGreen的二代慢病毒载体（pLenti-PLOXL1-ZsGreen）。 采用二代慢病毒包装体系包装并浓缩成滴度不低于1x107/ml 的病毒颗粒，按1：100 稀释感染细胞密度为20%的人成纤维细胞 （Human fibroblast cells），经流式分选仪筛选出稳定整合有PLOXL1-ZsGreen 元件的稳定细胞系，如图1所示。所述人成纤维细胞系整合了ZsGreen荧光强度示踪人LOXL1启动子活性的表达盒（PLOXL1-ZsGreen）。
实施例2：对人LOXL1基因启动子活性促进作用的中草药筛选
将所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞系以20%密度接种，贴壁过夜后将中草药抽提物以0.2-2 mg/ml溶解于DMSO中，以1：200倍稀释加入到细胞培养基中，使其最终浓度为1-10μg/ml。培养过夜（37℃，5%CO2）后，检测细胞绿色荧光强度。本发明通过荧光强度是否增加确定所加的中草药是否能有效刺激人LOXL1启动子的活性。从两千多种中草药中发现有32种中草药对LOXL1启动子活性有明显的促进作用。如图2所示，其中，对照（Control）为正常人成纤维细胞；未处理（Untreated）为未经药物处理的细胞是整合有PLOXL1-ZsGreen表达盒的人成纤维细胞稳定表达株；其他为在整合有PLOXL1-ZsGreen表达盒的人成纤维细胞稳定表达株的培养基中了添加蕲蛇、大青叶、三尖杉或白芥子。在添加蕲蛇、大青叶、三尖杉或白芥子的条件下，ZsGreen荧光强度有明显的增加，说明蕲蛇、大青叶、三尖杉及白芥子能促进人LOXL1启动子的活性。
实施例3：中草药对人LOXL1基因启动子活性及LOXL1表达的促进作用
将整合有PLOXL1-ZsGreen表达盒的人成纤维细胞稳定表达株以20%密度接种，贴壁过夜后将小分子单体化合物以0.2-2 mg/ml溶解于DMSO中，以1：200倍稀释加入到细胞培养基中，使其最终浓度为1-10μg/ml。培养过夜（37℃，5%CO2）后，检测细胞绿色荧光强度。如图3 a所示，对照为未经药物处理的整合有PLOXL1-ZsGreen表达盒的人成纤维细胞稳定表达株。未经药物处理的归一化为100%，数据为三次独立实验的平均值±SEM。图3a中显示的是32个对人LOXL1启动子活性有明显促进作用的中草药。其中，包括蕲蛇、大青叶、三尖杉、白芥子、白术、甘草、瓜萎、冬瓜皮、桑葚、米召、白前、马勃、月季花、儿茶、玫瑰、生地、泽兰、黄柏、老鸹草、藿香、佩兰、芥子、益母草、茺蔚、木蝴蝶、防己、五味子、刺葵藜、川贝、土茯苓、王木留、郁金及红景天。
随机选择数个药物处理之后的细胞抽提液进行免疫印迹实验，结果表明LOXL1蛋白均匀明显的提高 ，如图3b和3c所示。对照为未经药物处理但整合有PLOXL1-ZsGreen表达盒的人成纤维细胞稳定表达株，图中显示的是甘草、瓜萎、红景天、白术、冬瓜皮以及防己对人LOXL1的表达水平有明显促进作用。未经药物处理的归一化为1，数据为三次独立实验的平均值±SEM。因此，这些中草药增强LOXL1启动子的活性并提高细胞内LOXL1的表达量。
实施例4：大黄素对人成纤维细胞中LOXL1表达的促进作用
将整合有PLOXL1-ZsGreen表达盒的人成纤维细胞以20%密度接种，贴壁过夜后加入加一系列的小分子单体化合物。培养过夜（37℃，5%CO2）后，通过检测细胞绿色荧光强度，发现大黄素对人LOXL1启动子活性有明显的促进作用。如图4a所示，ZsGreen荧光强度示踪表明，大黄素有明显的促进人LOXL1启动子活性的作用 （4μM大黄素）。如图4b所示，ZsGreen荧光强度与细胞核染料DAPI指示的细胞数有明显的线性相关性；数据为5个独立检测值的平均值±SD。所以可以用ZsGreen的荧光强度来示踪启动子的活性。如图4c所示，ZsGreen荧光强度随着大黄素浓度的增加而增强，有明显的线性关系，其中，只加DMSO的对照归一化为1，数据为3个独立检测值的平均值±SEM，*P < 0.05；**P < 0.001；***P<0.0001。
实施例5：大黄素对人成纤维细胞中LOXL1表达的促进作用
两个整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞系（HF1及HF2）按20%密度接种，培养过夜（37℃，5%CO2）后，加入大黄素到细胞培养基中，使其最终浓度为4μM。继续培养过夜后，Real-Time及免疫印迹法分别测定LOXL1的mRNA水平和蛋白水平。其中，以只加入DMSO溶剂为对照，对照归一化为1，数据为三个独立测定值的平均值±SEM，*P < 0.05，**P < 0.001，***P<0.0001。如图5a1~5a3所示，在人成纤维细胞系HF1中，不同大黄素浓度对LOXL1表达及弹性蛋白二聚体（Dimer）中间物形成的促进作用；如图5b1~b3所示，在人成纤维细胞系HF2 中，不同大黄素浓度对LOXL1表达及弹性蛋白二聚体（Dimer）中间物形成的促进作用。在这两个细胞系，LOXL1的表达不紧在转录水平有明显的线性相关，LOXL1蛋白水平也有明显的增加，并伴随促进弹性蛋白（Elastin，ELN）二聚体 （Dimer）中间物的形成。通过本实施例揭示，在HF1及HF2细胞系中大黄素对 LOXL1的表达有明显的促进作用。
实施例6：大黄素对人成纤维细胞胞外基质交联度形成的促进作用
两个人整合有PLOXL1-ZsGreen元件的成纤维细胞系（HF1及HF2）按20%密度接种，培养过夜（37℃，5%CO2）后加入大黄素到细胞培养基中，以ELISA法测定锁链素（Desmosine）的含量以确定不同大黄素浓度对弹性蛋白交联的影响。
如图6a1~6a3所示，在人成纤维细胞系HF1 中，不同大黄素浓度对LOXL1表达及弹性蛋白交联度有明显的促进作用，表现为锁链素（Desmosine）中间体随加入的大黄素浓度增加而增加；同时也伴随胶原蛋白交联度的明显增加，表现为羟基脯氨酸 (Hydroxylproline)中间体随加入的大黄素浓度增加而增加。如图6b1~6b3所示，在人成纤维细胞系HF2 中，不同大黄素浓度对LOXL1表达及弹性蛋白交联度有明显的促进作用，表现为锁链素（Desmosine）中间体随加入的大黄素浓度增加而增加；同时也伴随胶原蛋白交联度的明显增加，表现为羟基脯氨酸 (Hydroxylproline)中间体随加入的大黄素浓度增加而增加。数据为三个独立测定值的平均值±SEM，*P < 0.05。
本实施例中以ELISA法通过测定羟基脯氨酸 (Hydroxylproline)的含量以确定不同大黄素浓度对胶原蛋白交联的影响，从实验结果可以看出，在HF1及HF2中均发现随着大黄素浓度的增加，弹性蛋白交联度逐渐增加而且，在两个细胞系中胶原蛋白交联度也随之增加。因此，大黄素对人成纤维细胞胞外基质的交联形成有广泛的促进作用。
实施例7：大黄素对人皮肤组织LOXL1的表达、弹性蛋白交联的促进作用
将大黄素添加到体外培养的人皮肤组织的培养基中，在加入大黄素1-3天之内检测人皮肤组织的LOXL1的水平及弹性蛋白的交联程度。以Real-Time及免疫印迹法分别测定LOXL1的mRNA水平和蛋白水平，同时也检测弹性蛋白（Monomer）及中间二聚体（Dimer）的量。其中只加入DMSO溶剂的对照归一化为1，数据为三个独立测定值的平均值±SEM，*P<0.01，***P<0.0001。
如图7a所示，大黄素浓度的增加伴随LOXL1 mRNA水平的增加；如图7b所示，大黄素的添加 (4μM) 明显提高了LOXL1的蛋白水平；如图7c所示，大黄素的添加 (4μM) 明显促进了弹性蛋白交联的形成，表现为弹性蛋白单体（ELN monomer）的降低和中间二聚体（Dimer）的增加。
本实施例的结果可以看出，随着大黄素浓度的增加，LOXL1 mRNA水平及LOXL1蛋白水平的逐渐增加，并伴随着弹性蛋白交联的增加。因此，大黄素对人皮肤组织LOXL1的表达以及弹性蛋白交联的形成有明显的促进作用。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110> 上海市第十人民医院
 
<120> 药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用
 
<160> 1
 
<210> 1
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> 人LOXL1基因启动子区序列
 
<400> 1
agggatacac cccactcttc agactgggaa agtaagcccc tgaggtgtgc cacgagggaa        60
aaggtgcagc tccagtgcct ctcttcgcag gcccaagagc tgcggtgcac ctgggacctg       120
gaattagaga gtggtccctg ttcagcatct ccccgaggag gcccaccaac aaagagggtg       180
tgtctttttt ttttttttct tcctattgag ggtgtgggat aatggtggaa ggaacatgca       240
aagagggtgt gtcttaatta gcactggctt tagggaacaa ggaaaaggga gaacccggga       300
gtacgggaag gaggctgggg cagacaggag tcagaggccc attccagccc aaacgagaag       360
ccagtgagca aggtggagac cagggatgct gtgaccaaag cagagaggaa tgggcggggt       420
ggtgctgaca ccccagcccc gttctgcctg ccagagcccc acttaccagg cccgagtccc       480
cagaggtccc ctcctactcc ctgctcgatt cccttcctca gaggcaggtc tgtggcttgg       540
ctgggaactc cagggactga gggagcactg cagctgtggg accggcgcat agctaaaagc       600
cggcgggcca tagggccccg cggaggaggc cccagcaggc ggaccaggag gccgaagcct       660
cccgacgctc ccagcctgtt gcttattcat tcagagtggg aaagcgccag ccgagcggcc       720
agccagtgcg gggctggcca tgtaaggccc acaggcggtc ctgcccgccc ggtgccctgc       780
ggagagcctc gtgcagccct gggcaccgcc cctgccctgc cctgacccct tggccttgaa       840
atgctgtcat cggaggagcc gtcccgctcg ggacaaggcc agcatggaca aagctagagc       900
tggggcaagc aaggagcctt cctgtcctcg aggccgtggg aagagaagca cgcccagggg       960
gccactcctg agagcctctc tgtccaccag gcctctgcag aggggtcacc accggtcgcc      1020
accatggccc agtccaagca cggcctgacc aaggagatga ccatgaagta ccgcatggag      1080
ggctgcgtgg acggccacaa gttcgtgatc accggcgagg gcatcggcta ccccttcaag      1140
ggcaagcagg ccatcaacct gtgcgtggtg gagggcggcc ccttgccctt cgccgaggac      1200
atcttgtccg ccgccttcat gtacggcaac cgcgtgttca ccgagtaccc ccaggacatc      1260
gtcgactact tcaagaactc ctgccccgcc ggctacacct gggaccgctc cttcctgttc      1320
gaggacggcg ccgtgtgcat ctgcaacgcc gacatcaccg tgagcgtgga ggagaactgc      1380
atgtaccacg agtccaagtt ctacggcgtg aacttccccg ccgacggccc cgtgatgaag      1440
aagatgaccg acaactggga gccctcctgc gagaagatca tccccgtgcc caagcagggc      1500
atcttgaagg gcgacgtgag catgtacctg ctgctgaagg acggtggccg cttgcgctgc      1560
cagttcgaca ccgtgtacaa ggccaagtcc gtgccccgca agatgcccga ctggcacttc      1620
atccagcaca agctgacccg cgaggaccgc agcgacgcca agaaccagaa gtggcacctg      1680
accgagcacg ccatcgcctc cggctccgcc ttgccctaac tcgagtctag agggccccga      1740
cgcgtctgga acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt      1800
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct      1860
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt      1920
tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac      1980
gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct      2040
ttccccctcc ctattgccac                                                  2060
 

Claims (4)

1.一种药物筛选方法，用于筛选出对LOXL1基因表达有促进作用的物质，其特征在于，所述药物筛选方法中，包括以下步骤： 
A、构建由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的二代慢病毒载体：将人LOXL1基因启动子片段克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1上，并将慢病毒载体pLVX-ZsGreen上原有的CMV启动子置换下来，得到二代慢病毒载体pLenti-PLOXL1-ZsGreen，所述二代慢病毒载体pLenti-PLOXL1-ZsGreen含有由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的元件PLOXL1-ZsGreen；
B、用二代慢病毒载体感染人成纤维细胞，构建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞；
C、药物筛选：将所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞接种于培养基中，贴壁过夜；将待测物质溶解于DMSO中并加入到人成纤维细胞的细胞培养基中；经过培养后，检测人成纤维细胞的绿色荧光强度，通过检测绿色荧光强度是否增加来判断待测物质对LOXL1基因表达的促进作用；
所述人LOXL1基因启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤B的具体过程为：
将二代慢病毒包装体系包装并浓缩成滴度不低于1x107/ml 的病毒颗粒，按1：100 稀释，用于感染细胞密度为20%的人成纤维细胞，经流式分选仪筛选出稳定整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞系。
3.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤C中，所述待测物质是以0.2-2 mg/ml溶解于DMSO中；所述细胞培养基中待测物质的最终浓度为1-10 μg/ml。
4. 用于促进胞外基质交联的药物的应用，所述药物中包含有对LOXL1基因表达有促进作用的物质，所述物质为采用如权利要求1所述的药物筛选方法筛选所得；所述药物包括蕲蛇、大青叶、三尖杉、白芥子、白术、甘草、瓜萎、冬瓜皮、桑葚、米召、白前、马勃、月季花、儿茶、玫瑰、生地、泽兰、黄柏、老鸹草、藿香、佩兰、芥子、益母草、茺蔚、木蝴蝶、防己、五味子、刺葵藜、川贝、土茯苓、王木留、郁金、红景天或大黄素中的一种或多种，其特征在于，将所述用于促进胞外基质交联的药物用作化妆品添加剂、食品添加剂，或用于制备治疗或改善因动态结缔组织病变所致的疾病的药物；因动态结缔组织病变所致的疾病包括皮肤松弛、肺气肿、心血管异常、血管增生诱发的视网膜黄斑退变、性器官脱垂及尿失禁。
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