CN108279308B

CN108279308B - 一种中草药抗衰老物质及其筛选方法

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Publication number: CN108279308B
Application number: CN201711266950.9A
Authority: CN
Inventors: 洪民华; 王英存; 刘丹; 吕智; 孟乾; 周虎
Original assignee: Shanghai Inoherb Cosmetic Co ltd; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Inoherb Cosmetic Co ltd; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CN108279308A

Abstract

本发明提供一种中草药抗衰老物质的筛选方法，包括根据目标蛋白建立抗衰老模型；将待测物作用于所建立的抗衰老模型，筛选能够抑制或促进目标蛋白表达的物质，得到抗衰老物质。本发明还提供一种具有抗衰老活性物指示作用的靶点和一种抗衰老物质，该抗衰老物质能够抑制或促进目标蛋白表达。本发明利用国际上最先进的高科技细胞组学非标记定量蛋白质组技术，进行皮肤衰老研究，建立了皮肤细胞衰老模型的组学平台，系统评估了与衰老相关的蛋白靶点，为后续活性物筛选提供全新的思路，并能够大幅提高抗衰老活性物的筛选效率。用组学的方法考察本草提取物抗衰老活性更加准确，为抗衰老活性提取物的开发提供全新平台。

Description

一种中草药抗衰老物质及其筛选方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种中草药抗衰老物质及其筛选方法。

背景技术

皮肤老化主要受到两方面因素的影响，一、遗传因素，随着人年龄的增加，皮肤会逐渐老化。二、外界因素：外界因素包括光照、吸烟、营养不良等因素。其中80％以上的皮肤衰老是由光照引起的。

目前认为紫外线为代表的外界因素刺激引发皮肤老化的机理主要包括如下三个步骤：一、紫外照射引起胞外基质中弹性相关物质的降解；二、弹性相关物质的降解引发皮肤氧化应激机制；三、皮肤氧化应激机制导致皮肤细胞衰老和凋亡。

研究化妆品抗衰老能力的传统模式是在外界刺激，比如使用过氧化氢、紫外线照射等人工创造的环境模拟外界环境刺激，以考察活性物对人体皮肤的保护作用，从而筛选出能够有效对抗外界刺激的活性物，却比较少研究自然状态下的细胞衰老机制。

人类基因组测序的完成标志着后基因组时代的来临，而蛋白质组学是后基因组时代中最重要的领域之一。蛋白质组学的目的是通过系统地、定量地研究蛋白质在细胞组织中的表达情况，来揭示基因的功能、蛋白质之间的关系以及生命过程的运行机制。其主要任务包括：蛋白质序列鉴定、蛋白质修饰鉴定、蛋白质定量分析、蛋白质结构预测和蛋白质功能预测等问题，而确定出某种细胞器官或组织在一定条件下表达出了哪些蛋白质是其最基本任务之一。

通过蛋白质组学研究基因表达，并筛选出控制衰老、美白作用的基因，会大大加快化妆品行业的研究进展，但是目前还未看到将蛋白质组学研究与化妆品活性物测试结合的相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种能够提高SMC4蛋白表达的中草药抗衰老物质，以及筛选抗衰老物质的方法。

本发明的第一个方面在于提供一种中草药抗衰老物质的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

步骤1、根据目标蛋白建立抗衰老模型；其中，所述目标蛋白为随着细胞分裂次数的增加而一致上调或一致下调的蛋白；

步骤2、将待测物作用于所建立的抗衰老模型，筛选能够抑制或促进目标蛋白表达的物质，得到抗衰老物质。

其中，所述一致上调或一致下调指目标蛋白在细胞分裂过程中，随着细胞代数的增加，表达的蛋白的含量一直逐渐增加或一直逐渐减少，不会出现增加之后再减少或减少之后再增加的情况。

在一个优选实施例中，步骤1中所述目标蛋白包括DNA损伤修复相关蛋白、免疫应激相关蛋白、mRNA翻译相关蛋白、mRNA转录相关蛋白、mRNA成熟相关蛋白和氧化应激相关蛋白中的任意一种或几种组合。

在一个优选实施例中，步骤1中所述目标蛋白选自β-半乳糖酶、MCM家族蛋白、SMC家族蛋白、RFC家族蛋白、FEN1、PCNA蛋白、RPA家族蛋白和CDK家族蛋白中的任意一种或几种组合。

在一个优选实施例中，步骤1中所述目标蛋白包括β-半乳糖酶、MCM2、 MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、SMC2蛋白、SMC4蛋白和RFC3 蛋白、FEN1、PCNA、RPA1、RPA2、RPA3、RPA4、和CDK1中的任意一种或几种组合。

在一个优选实施例中，所述抗衰老物质为提取物。

在一个优选实施例中，所述抗衰老物质选自左旋维C、复方人参发酵、莲花、复方抗污染、刺玫果、蒲公英、人参皂苷Rg1、葛根素、三七皂苷R1、AA2G、人参皂苷Rb1、松口蘑、烟酰胺、黄芪甲苷、黄豆苷、栀皮苷中的任意一种或几种组合。

本发明的第二个方面在于提供一种具有抗衰老活性物指示作用的靶点，所述靶点选自β-半乳糖酶、MCM家族蛋白、SMC家族蛋白、RFC家族蛋白、FEN1、PCNA蛋白、RPA家族蛋白和CDK家族蛋白中的任意一种或几种组合。

在一个优选实施例中，所述靶点选自β-半乳糖酶、MCM2、MCM3、MCM4、 MCM5、MCM6、MCM7、SMC2蛋白、SMC4蛋白、RFC3蛋白、FEN1、PCNA、 RPA1、RPA2、RPA3、RPA4、和CDK1中的任意一种或几种组合。

本发明的第三个方面在于提供一种抗衰老物质，所述抗衰老物质为能够抑制或促进目标蛋白表达的物质。

在一个优选实施例中，所述目标蛋白选自β-半乳糖酶、MCM家族蛋白、 SMC家族蛋白、RFC家族蛋白、FEN1、PCNA蛋白、RPA家族蛋白和CDK 家族蛋白中的任意一种或几种组合。

本发明在国内首次利用了生命科学和医药领域研究中，国际上最先进的高科技细胞组学非标记定量蛋白质组技术，进行皮肤衰老研究，建立了皮肤细胞衰老模型的组学平台，对皮肤细胞传代衰老进行跟踪研究，系统评估了与衰老相关的蛋白靶点，为后续活性物筛选提供全新的思路，并能够大幅提高抗衰老活性物的筛选效率。用组学的方法考察本草提取物抗衰老活性更加准确，为抗衰老活性提取物的开发提供全新平台。

附图说明

图1A至图1C为细胞衰老表征结果图；其中，图1A为细胞倍增时间图；图 1B为细胞端粒长度检测结果；图1C为细胞β-半乳糖苷酶在不同时期的表达，记为P6-P8；P12-P15；晚期为P18-P21。

图2A至图2C为蛋白质组学分析结果，其中，图2A为蛋白质组学数据的箱线图；图2B为蛋白质组学数据的不同组之间比值的密度曲线图；图2C为蛋白质组学数据组间和组内之间的相关性图。

图3A为数据变异系数图，图3B为数据的PCA图。

图4A为差异蛋白聚类分析图，图4B为不同组之间差异表达的Venn图，图4C为不同组之间差异表达的火山图，其中，红色点表示上调蛋白，绿色点表示下调蛋白。

图5A为GO注释分子功能通路富集图，图5B为KEGG信号通路富集图，图中点的横坐标为基因比例；点的大小表示蛋白质数量的大小；点的颜色为多重校正后的p值。

图6A为差异蛋白Mfuzz模糊聚类分类，图6B为第4聚类和第7聚类的蛋白蛋白相互作用网络图。

图7A为MCM2在蛋白质组学数据中的定量结果，图7B为SMC4在蛋白质组学数据中的定量结果，图7C为SMC4的蛋白免疫印迹法验证结果。

具体实施方式

为了更清楚的说明本发明提供的能够提高SMC4蛋白表达的抗衰老物质，以及筛选抗衰老物质的方法，以下结合具体实施例进一步阐述，但需要说明的是，该具体实施例只是本发明的一个优选方案，并不是本发明保护范围的限定，任何在本发明基础上的近似修改均属于本发明的保护范畴。

皮肤细胞衰老模型的建立

试剂与耗材

本发明建立皮肤细胞衰老模型涉及的试剂与耗材如表1所示。

表1、建立皮肤细胞衰老模型涉及的试剂与耗材

1、配制溶液

1.1、配制SDS-PAGE胶

本发明配制SDS-PAGE胶涉及的试剂与耗材如表2、表3所示。

表2、10％分离胶各组分含量

成分	体积(mL)
		10％分离胶	10
蒸馏水	2.7
		30％丙烯酰胺溶液(29：1)	3.3
1M Tris，pH8.8	3.8
		10％SDS	0.1
10％过硫酸铵	0.1
		TEMED	0.004

表3、5％浓缩胶各组分含量

成分	体积(mL)
		5％浓缩胶	4.0
蒸馏水	2.7
		30％丙烯酰胺溶液(29：1)	0.67
1M Tris，pH8.8	0.5
		10％SDS	0.04
10％过硫酸铵	0.04
		TEMED	0.004

1.2、配制电泳缓冲液

将9g Tris base、43.2g Glycine和3.0gSDS溶解于3L水中即可。

1.3、配制上样(Loadingbuffer)缓冲液

将1.21g Tris-HCl、4g SDS、0.2g BPB、20ml的甘油和2mL的巯基乙醇溶解在40ml的水中，然后将pH调节至6.8。

1.4、配制SDT缓冲液

将8g SDS、3.085g DTT和2.4228g Tris-HCl溶解在200mL的双蒸水中，然后将pH调节至7.6。

1.5、配制样本稀释缓冲液

将8M的尿素溶解在20mM的Tris-HCl中，然后将PH调至7.6。

1.6、配制尿酸缓冲液

取12g尿素和0.3g Tris-HCl溶解在25ml的双蒸水中。

1.7、配制IAA溶液

取9.25mg IAA溶解在分装好的1mL尿酸缓冲液中，混合均匀。

1.8、配制固定液

向239mLPBS中加入5L甲醛和0.5mL戊二醛

1.9、配制洗涤液

将1mM MgCl₂加入PBS中，调节PH值至7.2。

1.10、配制X-gal染色液

【避光】首先配制20mg/mL X-gal的储存液，分装保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃，备用。

称量3.95mg铁氰化钾/9.5mg MgCl₂溶于95ml的PH＝6.0的PBS中，吸取5ml的配制的20mg/ml X-gal的储存液溶于PBS配制成1mg/ml的X-gal染色液。

2、实验方法

2.1、细胞培养

CCD-1079sk购买与ATCC细胞库，根据ATCC上的培养说明，使用DMEM 高糖培养液，添加10％的胎牛血清，放置于含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中进行培养。隔天换液，每3-4天进行传代，1：3-1：4传代。

2.2、β-半乳糖苷酶原位染色

1、清洗细胞：PBS清洗3遍，用真空泵吸干净PBS；

2、每孔加入1-2mL固定液、室温固定5min，用真空泵吸干净固定液；

3、清洗：清洗液清洗3次，每次3min，用真空泵吸干净清洗液；

4、染色：加入染色液后，避光存放于37℃，在无二氧化碳培养箱中过夜。

2.3、端粒长度检测

随着细胞代数的增加，线粒体长度逐渐缩短。采用RT-PCR的方法进行端粒长度的检测。

端粒引物tel1：

GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT(SEQ ID No.1)；

端粒引物tel2：

TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA(SEQ ID No.2)。

内参引物36B4u：

CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC(SEQ ID No.3)；

内参引物36B4d：

CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA(SEQ ID No.4)。

2.4、细胞倍增

10cm的细胞培养皿，每板种10⁵个细胞，培养96h后进行细胞计数。计算公式为：细胞倍增时间＝(lg2/lg10[(收细胞数量)/(种板数量)])。

2.5、色氨酸荧光定量

1、用SDT缓冲液将色氨酸配制成1μg/μL母液并稀释为300ng/μL、 200ng/μL、150ng/μL、100ng/μL、75ng/μL、50ng/μL、25ng/μL、0ng/μL的八个浓度梯度点的标准品。

2、将标准品和样品各取10μL加入1mL稀释液中，常温摇床5min震荡混合均匀，离心。

3、取用新的Nunc96孔黑板，将混合均匀的样品按照既定的顺序依次加入到对应的孔中，每个样品三个重复，每孔200μL(保证加样无气泡)。

4、将荧光分光光度计设定为激发光波长295nm、发射光波长350nm、光栅10nm的程序，检测色氨酸的荧光强度。

5、拷贝数据，用EXCEL处理，用标准液做出标准曲线，然后通过标准曲线公式计算样品中色氨酸的含量，最后通过色氨酸在蛋白中所占的比例(13‰) 换算得出蛋白的含量。

2.6、SDS-PAGE电泳胶

1、根据表2所示各组分的含量，首先配置10％分离胶至整块胶的75％左右，加入MILIQ水压胶，室温放置25min，然后按照表3所示各组分的含量配制5％浓缩胶并插入干净的梳子，室温静置25min。

2、取下梳子，将配置好的胶放置4℃保存，备用。

3、SDS-PAGE步骤。配制10孔或15孔的10％的SDS-PAGE电泳胶；每孔上(10-15)μg蛋白质样品，电泳梯度设置为60V跑30min，120V跑90min；后加入考马斯亮蓝配成的考染液进行染色30min，待电泳胶全部染成蓝色后将染色液倒入废液缸，使用MILIQ水清洗电泳胶后加入脱色液，每隔20min更换一次直至电泳胶完全脱色能看到清晰条带为止。

2.7超滤膜辅助酶解方法(FASP)酶解

1、取用30KD超滤膜，加入尿酸缓冲液清洗活化滤膜，10000g离心约 30min。

2、每个超滤管中加入100μg蛋白，并加入150μL尿酸缓冲液，震荡混合均匀，放入离心机，配平后旋紧盖子，将转速调至10000g离心30-40min，至液体全部离心进入收集管。

3、再次加入150μL尿酸缓冲液，震荡混合均匀，放入离心机，配平后旋紧盖子，将转速调至10000g离心30-40min，至液体全部离心进入收集管，重复2 次。

4、加入100μL的50mM IAA溶液，将样品放在暗处，避光静置20min，放入离心机，配平后旋紧盖子，将转速调至10000g离心30min，至液体全部离心进入收集管。

5、取150μL、0.1M TEAB缓冲液洗去盐离子，每次都在10000g下离心 30-40min；至液体全部离心进入收集管，重复4遍。

6、更换新的收集管，然后按质量比1：50的比例加入胰蛋白酶，将样品放于37℃震荡酶解过夜，酶解时间不超过16h。

7、第二次按质量比1：50的比例加入胰蛋白酶，将样品放于37℃震荡器酶解4h(总的酶解时间不要超过20h)，酶解完成后，12000g转速离心收集肽段，加入100μl 0.1M TEAB重复2次冻干，-80℃冻存备用。

2.8、蛋白质印迹法(Western Blot)

蛋白质印迹法(Western Blot)验证蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即 WesternBlot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

1、电泳。在步骤2.2所示方法制备的SDS-PAGE电泳胶中进行跑胶。

2、Western-Blot。①120V电压转膜3h；②5％牛奶或5％BSA封闭1小时以上，侧摆摇床缓慢摇动；③倒掉牛奶，用TBST清洗2×5min；④倒入经 BSA稀释的一抗，于4℃条件下过夜，其中一抗配制过程中已经加入叠氮化钠，以延长抗体使用寿命；⑤1×TBST洗膜，3×10min。⑥孵育二抗，室温60min，缓慢摇动(1：10000配制于1×TBST里面)；⑦1×TBST洗膜，3×5min；⑧加底物反应30s，显影。

2.9、色谱柱的灌制

1、石英毛细管的拉制

①激光拉制机拉制石英毛细管：打开激光拉制机，选择优化好参数的程序，稳定15min；②截取约45cm长的毛细管，切掉毛细管两端，防止大于75μm粒径的颗粒堵塞石英毛细管。在毛细管中段，用酒精灯烧掉适当长度的表面涂层，比如1-2cm，并用卫生纸蘸水擦掉烧焦涂层，用无尘纸擦净；③将毛细管固定在拉制机槽中，使没有涂层的毛细管中间能够恰好被激光照射。盖上拉制机遮光盖，按下“拉(PULL)”按钮。红灯闪烁几次后，柱子被拉断，打开盖子，小心取出，在显微镜下观察针头是否平整、开通。

2、C18RP色谱填料混悬液制备

①用1mL的无菌注射器和0.22μm的尼龙滤膜，将色谱纯的丙酮过滤至 1.5mL玻璃上样瓶中，清洗上样瓶3次，注入约1mL经过滤的丙酮；②用过滤的丙酮清洗磁转子并放入上样瓶中。用过滤的丙酮清洗小药匙并用无尘纸拭干； ③用药匙取适量粉末C18RP填料，放入装有丙酮的上样瓶中，盖好瓶盖。

3、毛细管色谱柱的装填

①用95％乙醇喷湿无尘纸，然后用无尘纸将灌柱装置的内部擦拭干净，把灌柱装置可拆卸部件用双蒸水超声三次并晾干；②用乙醇喷湿的无尘纸将装有 RP色谱填料混悬液的上样瓶外壁擦拭干净，取下瓶盖，将上样瓶放置到加压装置内部，固定好密封盖。将石英毛细管柱穿过螺帽和米粒子，将末端切平，然后调整石英毛细管柱下端的长度为5.5cm左右(保证毛细管下端位于进样瓶内部，并且触碰不到进样瓶底部的米粒子)；③擦净毛细管后，插入灌柱装置，密封固定。打开搅拌开关，缓慢升压到约700psi，压力迫使填料向毛细管柱中灌入； ④填充至适当长度后(比如25cm)，缓慢卸去氮气压力，防止填料松垮，关闭灌柱装置气阀，关闭搅拌开关，取出毛细管色谱柱。将填料瓶取出，密封保存。

2.10、液相色谱方法

肽段样本进样量：1ug；进样速度：20μL/min；上样：体积2μL，上样过程最大压力：300bar。

进样结束后，冲洗色谱柱的梯度如5所示：

表5、色谱柱冲洗梯度表

分析柱平衡：体积3μL，平衡过程最大压力300bar。

自动进样器清洗：冲洗体积100μL。

2.11、质谱方法

分级后的样本通过Orbitrap Elite采用的数据依赖性采集模式 (data-dependent analysis，DDA)，以最大化采集速率(top speed)进行二级质谱图采集。动态排除设置为：若某母离子鉴定到1次，则在接下来的2min内不再对该质量母离子进行检测。母离子碎裂模式采取HCD模式，一级谱图和二级谱图分辨率分别设置为60000和15000(在200m/z时)。C18反相色谱柱为自制75μm×150mm，3μm填料。

2.12、数据库搜索

质谱采集到的RAW文件用Maxquant1.5.1.0软件进行正反搜库，采用的数据库是Uniprot homo sapiens(2015年5月下载)数据库。搜库参数设置如下：报告离子搜库模式为LFQ，子离子质量偏差20ppm以内，蛋白酶设置为胰蛋白酶，最大允许漏切位点为2，可变修饰设置为蛋白N端乙酰化和甲硫氨酸氧化，蛋白质和肽段的假阳性率(false discoveryrate，FDR)设置为0.01。

2.13、生物信息学分析

1、论文中的统计学分析和作图都是使用R软件(http://www.r-project.org/) 来完成的。对原始数据通过中位数进行校正，并对五组样本做两两之间的t-test 检验，Fold＞1.5且Pvalue≤0.05的蛋白质被认为是差异表达蛋白。

2、GO分析点图展示是通过R软件的集群分析器(Cluster Profiler)分析包完成，并且通过使用GO SemSim进行简化。KEGG通路富集分析和通路图形展示同样通过集群分析器(Cluster Profiler)完成。

3、聚类分析聚类分析通过Cluster 3.0软件实现，选择非中心关联 (Correlation(uncentered))和完整连接(Complete linkage)方法进行分层聚类分析。聚类结果通过Java Treaview软件进行展示。

4、PPI蛋白相互作用网络经STRING网站形成相互作用数据，并在 CYTOSCAPE软件中进行差异展示。

5、Fuzzy c-means聚类分析是在R软件中利用Mfuzz包完成，该聚类方法是根据蛋白质的表达量变化趋势赋予其一个成员值(membership grade)，能够将变化趋势相似的蛋白质聚成一类。

6、WB结果统计分析是通过J图像(ImageJ)进行灰度值的统计，并在GraphPadPrism软件中进行分析，*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001。

3、实验结果

本发明在细胞衰老性能表征过程中，为了清楚的说明各阶段细胞的状态，根据细胞的年龄分为早期、中期和晚期三组。其中，早期为第6代至第8代细胞，中期为第12代至第15代细胞，晚期为第18至第21代细胞。分别记为P6-P8； P12-P15；晚期为P18-P21。早期、中期、晚期分别做5组平行试验，例如第6 代、第12代、第21代的平行试验分别记为P6-1、P6-2、……P6-5，P12-1、 P12-2、……P12-5，P21-1、P21-2、……P21-5。

3.1、细胞衰老表征的检测

如图1A至图1C所示结果，根据不同传代次数的细胞的倍增曲线、端粒长度和β-半乳糖苷酶染色的检测，发现皮肤细胞随着传代次数的增加，细胞倍增时间由早期的40h逐渐增加至晚期的80h。端粒长度相对T/S比率缩短，由早期的1.25逐渐缩短至晚期的0.5。β-半乳糖苷酶的表达量逐渐增加，通过这些数据可以确定细胞的传代性衰老情况。

3.2、蛋白组学数据的质量分析

由于蛋白质的浓度定量结果有可能存在些许的偏差，申请人将所得到的蛋白质浓度数据通过MaxQuant软件进行数据校正。对校正后的数据，采用了箱线图进行展示其表达量，如图2A可知，蛋白质在不同时期的15个样本中表现出较好的一致性，这说明定量结果之间的系统误差可以忽略。同时，通过对组与组的比值进行比值分布展示，结果如图2B所示，从图中可知，数据很好地拟合了正态分布。如图2C所示，15个样本定量信息的相关性数据可知，组内组间相关性都在0.9以上，并且同一组内相关性要明显高于组间相关性，相关系数甚至达到1，表明定量信息可靠性较高、再现性高。

如图3A所示，每组数据的5个重复样品之间的变异系数CV以2为底的对数值均小于0.2，说明数据的平行度高，组间的差异性小，数据的再现性较好，测定的数据重复性较高。图3B为15个样本的主成分分析展示，可以看出在两个成分维度可以将3组数据区分开，且每组数据相对聚集，这也说明数据组间有差异，而组内的重复性较好。

综上所述，检测获得的皮肤细胞的数据平行性、正态性、再现性均良好，数据无偏差，定量可信。

3.3、差异表达蛋白表达分析及抗衰老模型建立

将数据进行组与组之间的T-test分析和ANOVAR分析，综合ANOVAR和 T-test的p值<0.05和组与组变化倍性>1.5分析得到972个差异表达的蛋白。将得到的差异表达的蛋白进行层次聚类分析得到如图4A所示的聚类结果，表明这些差异表达的蛋白可以很好的将传代次数不同的细胞很好的区分开，并且可以发现蛋白的表达变化与细胞传代次数的有一定的相关性。

图4B是不同组之间差异表达蛋白的集合，可以看出P12到P21之间蛋白的差异变化较大。同时从图4C更直接的看出差异蛋白在各组之间的分布。随着传代次数的增加，蛋白的差异表达也在增加。

通过对差异蛋白汇总做GO和KEGG富集，可以了解这些差异表达蛋白可能参与的代谢或信号通路以及蛋白分子功能的改变。如图5A所示，从GO注释的蛋白分子功能来看，可以发现这些差异蛋白多是与细胞粘附、核功能相关的结合蛋白以及和氧化应激相关的功能蛋白。如图5B所示，通过KEGG的富集可以发现，蛋白多集中于剪接体、溶酶体、RNA转运、DNA复制和糖代谢相关的信号通路。表明在细胞经历复制性衰老的过程中细胞代谢、ROS、DNA复制的相关通路和功能发生了显著的改变。这些改变在细胞衰老的发生、发展过程中扮演重要的角色。其中DNA复制相关蛋白的功能和通路改变与衰老有着直接的关系。然后，将筛选得到的972个差异蛋白做Mfuzz模糊聚类分析，在既不冗余也不重叠的原则下，将差异蛋白聚类为7类，如图6A所示。根据实验的目的，随着细胞的分裂次数的增加，细胞衰老程度的加深，功能蛋白应该依赖时间梯度的持续下调或上调。因此，第4聚类和第7聚类中的蛋白被选为作为潜在目标蛋白，进一步分析研究。

将这两个聚类的蛋白影射在STRING网络中，并在CYTOSCAPE中进行展示，得到图6B。在图6B中，有一个节点蛋白得到富集，细胞周期蛋白CDK1 在细胞衰老过程中表达下调，同时发现与之有相互作用的MCM家族蛋白也得到富集。对于MCM家族是染色体维持蛋白，在以往的研究中表明MCM2在细胞的衰老中扮演重要的角色，已知和细胞衰老相关，而在得到的PPI图中，SMC4 与MCM家族有密切的关系。

在细胞衰老的过程中，对SMC4蛋白和MCM2蛋白的表达进行定量验证，结果如图7A至图7C所示，发现SMC4蛋白和MCM2蛋白的表达均随着细胞代数的增加，呈现持续下降的趋势。

DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程。其中微小染色体维持蛋白MCM参与了 DNA复制起始的调控。MCM蛋白家族有6个成员MCM2至MCM7，大小各不相同，但都拥有一个大约200多个氨基酸长度的具有DNA依赖性ATP酶基序的核心区域。另外MCM2、MCM4、MCM6、MCM7还有一个锌指区，具有解链酶活性。MCM蛋白能与复制子结合，使DNA复制成为可能，是DNA复制启动和延伸的必须因子之一，属于一种与DNA复制相关的解链酶。许多研究表明 MCM蛋白只在处于增值活动的周期细胞内表达。在肿瘤的研究中表明MCM能准确反映细胞的增值活性，同时，有研究表明MCM2与细胞衰老密切相关。

染色体结构维持蛋白(Structure Maintenance of Chromosome，SMC)是一种重要的染色体非组蛋白，研究发现其在有丝分裂染色体集缩中起着非常重要的作用。在真核生物细胞分裂过程中，染色体修复和分配的关键是三种相互联系的蛋白质复合物的参与：Cohesin、Condensin和SMC。其中Cohesin复合物能使拷贝的DNA不会过早的分离，Codensin复合物负责染色体的紧凑性，使其分离过程更容易进行。SMC在真核生物中分为SMC1至SMC6六个亚体。研究发现SMC4在有丝分裂染色体集缩中起重要的作用。

对MCM2和SMC4在蛋白质组学数据中做定量分析，结果如图7A所示。 SMC4的蛋白质印迹法验证结果，如图7B所示。通过对SMC4蛋白定量分析，建立抗衰老模型，并使用已知的MCM2蛋白校验，发现抗衰老模型的准确度较高。

第4聚类和第7聚类中的其他目标蛋白抗衰老模型的建立方法与SMC4的方法类似，此处不再赘述，比较类似的目标蛋白包括SMC2蛋白、SMC4蛋白和RFC3蛋白、FEN1、PCNA、RPA1、RPA2、RPA3、RPA4、和CDK1等。

4、利用抗衰老模型筛选活性物

材料与试剂

方法与步骤

铺板种细胞：用胰蛋白酶消化对数期的单层细胞，将细胞收集至细胞培养液中。用培养液重新悬浮细胞，计数。调整细胞悬液的浓度至5×10⁴个/mL，具体以细胞系的生长速度而定。铺24孔板，每孔细胞悬液0.9mL。最终所铺的细胞孔数取决于样品数，每个样品4个复孔。

加待测物：加入一定浓度待测物的提取物后继续培养12h。

提取细胞RNA，提取样本总RNA用超纯RNA提取试剂盒，每孔加150微升裂解液裂解细胞2分钟，结合RNA5分钟，用洗涤液1洗涤一次，洗涤液2 洗涤2次，最后用30μL无RNA酶水洗脱。

CDNA反转录，取400ng RNA，3.5μL缓冲液，10μL体系反转录。

ABI Q6 flex检测实时荧光定量。

以GAPDH为内参计算调节倍数，采用2－△△CT法进行数据的相对定量分析。

HAS3水平(F)计算公式为：

F＝2×待测组目的靶标平均Ct值－待测组管家内参[平均Ct值]－对照组目的靶标平均Ct值－对照组管家内参{[平均Ct值]}

结果如表6所示。

表6、不同待测物对SMC4蛋白表达的影响

其中，待测物的提取方法均采用现有技术。由表6和图7B、7C可知，向细胞液中加入10uM的左旋维C后，SMC4 mRNA的相对表达量为1.21，即左旋维C能够有效促进SMC4 mRNA的表达，具有较好的抗衰老性能。增加左旋维 C的浓度至50uM，SMC4 mRNA的相对表达量相应提高至1.47。

由对照组和左旋维C计算的标准差，可知，左旋维C促进SMC4mRNA的表达的重现性较高。

另外，莲花、复方抗污染、刺玫果、蒲公英、人参皂苷Rg1、葛根素、三七皂苷R1、黄芪甲苷、黄豆苷和栀皮苷等均能明显促进SMC4mRNA的相对表达，可以作为抗衰老物进行后续研究。

本发明提供的通过SMC4蛋白、SMC4mRNA的表达筛选活性物的方式，稳定性高，重现性好，可以用于特定目的化妆品的筛选，为后续研发提供了新的思路。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海相宜本草化妆品股份有限公司

中国科学院上海药物研究所

<120> 一种中草药抗衰老物质及其筛选方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtttttgag ggtgagggtg agggtgaggg tgagggt 37

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccgactat ccctatccct atccctatcc ctatcccta 39

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccattctat catcaacggg tacaa 25

Claims

1.一种中草药抗衰老物质的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、根据目标蛋白建立皮肤抗衰老模型，其中，所述目标蛋白为随着细胞分裂次数的增加而一致下调的蛋白；

步骤2、将待测物作用于所建立的皮肤抗衰老模型，筛选能够促进目标蛋白表达的物质，得到抗衰老物质；

其中所述目标蛋白为SMC4蛋白。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述抗衰老物质选自左旋维C、睡莲、刺玫果、蒲公英、人参皂苷Rg1、葛根素、三七皂苷R1、AA2G、人参皂苷Rb1、松口蘑、烟酰胺、黄芪甲苷、黄豆苷、栀皮苷中的任意一种或几种组合。

3.目标蛋白在制备用于根据权利要求1所述的中草药抗衰老物质的筛选方法的试剂中的用途，其特征在于，所述目标蛋白为SMC4蛋白。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抗衰老物质选自左旋维C、睡莲、刺玫果、蒲公英、人参皂苷Rg1、葛根素、三七皂苷R1、AA2G、人参皂苷Rb1、松口蘑、烟酰胺、黄芪甲苷、黄豆苷、栀皮苷中的任意一种或几种组合。