CN103194528A - 通过端粒酶筛选抗癌中药的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药筛选方法，特别涉及一种通过端粒长度筛选抗衰老中药的方法；人胚肺二倍体成纤维细胞，在叔丁基过氧化氢的作用下加速其衰老，制作衰老细胞模型；在造模后，使用各种选取的中药浓缩复合物对细胞进行处理；处理结束后，提取细胞基因组DNA，检测其端粒长度，根据结果判断是否热性药物即具有抗衰老活性。
Description
技术领域
本发明涉及筛选药物的方法，特别涉及通过端粒酶筛选抗癌中药的方法。
背景技术
端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，能够维持染色体的完整。端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成的，染色体末端沿着5'到3' 方向的DNA链富含鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）两种核苷酸。在酵母和人中，端粒序列分别为C1－3A/TG1－3和TTAGGG/CCCTAA，并有许多蛋白与端粒DNA结合。端粒DNA主要功能有：第一，保护染色体不被核酸酶降解；第二，防止染色体相互融合；第三，为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。同时，端粒又是基因调控的特殊位点, 常可抑制位于端粒附近基因的转录活性（称为端粒的位置效应，TPE）。在大多真核生物中，端粒的延长是由端粒酶催化的，另外，重组机制也介导端粒的延长。
端粒酶与恶性肿瘤的关系非常密切。研究发现，在人类许多正常体细胞中检测不到端粒酶活性，而几乎所有的人类恶性肿瘤细胞中的端粒酶均呈现活性。代表性的研究是，Kim等利用高度敏感的TRAP-PCR方法，对代表人18种不同组织类型的具有永生性肿胞株的100个标本进行检测，结果显示其中98例呈端粒酶阳性，而22例正常组织标本端粒酶全部阴性；相似地，代表人12种组织学类型的102个肿瘤活检标本，共中90例呈端粒酶阳性，而50例正常体细胞端粒酶全部阴性。人端粒酶催化亚单位mRNA在大多数正常体细胞中不表达，但在原发性肿瘤、癌细胞系中却高表达。同时，有报道称大多肿瘤细胞在繁殖过程中由于端粒酶的作用而维持其最短长度，使细胞无法因为端粒的最终缺失而进入凋亡程序，因此肿瘤细胞的繁殖永无休止。许多人认为，端粒酶的异常激活是细胞癌变的重要一步。
发明内容
本发明提供一种新型筛选抗肿瘤中药的方法，
技术方案
通过端粒酶筛选抗癌中药的方法，其特征在于按如下步骤实施
1、选取端粒酶阳性细胞： HeLa细胞，乳腺癌MCF-7细胞, 白血病细胞U937，白血病细胞HL60，淋巴瘤细胞CA46；
2、含10%小牛血清的1640培养基培养肿瘤细胞，细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养，待长满90%以上时，弃去瓶中原有的培养基，用PBS清洗两次，弃去，加入2ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37℃培养箱中消化3min，转入刻度离心管中1000rpm离心3min，再加入2ml新鲜完全培养基重悬后，Cell Counter计数；
3 ）将重悬后的细胞稀释至5×103cell/ml，每孔加100ul接种96孔细胞培养板，次日换含不同浓度药物的培养基继续培养72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液12ul，于培养箱中继续培养4h。然后于平板离心机中，3000rpm离心5min后，吸出孔中溶液，加入150ul/孔DMSO溶液，再于微量振荡器上振荡10min，最后酶标仪上检测570nm和630nm处的吸光度值，则每个孔的吸光度值即为A570-A630。每个浓度的吸光度值取三个平行孔的平均值。细胞增殖率为：（A实-A阴对）/（A阴对-A空）。结果与对照组比较；
4 、将重悬后的肿瘤细胞稀释至5×103cell/ml，每孔加500ul接种24孔细胞培养板，次日换含不同浓度药物的培养基继续培养72h和96h后，分别取样，使用PCR-free方法测定端粒酶的活性，（n=3）。
有益效果；
1、由于端粒酶活性都远远高于普通细胞，因此端粒酶活性是早期癌症检测的其中一个指标。如果能够证明寒凉属性中药材，可以抑制端粒酶的活性，那么，通过检测病人的外周血细胞内的端粒酶活性，可以实现癌症的早期诊断，进而通过某些寒凉属性中草药一致早期癌症患者细胞内的端粒酶活性，增加患者的生存时间，甚至治愈癌症。因此本项目研究成果对发展防癌抗癌的新医学理论和治疗手段，造福人类，有非常重要的现实意义。
具体实施方式
实施例1
1）体外实验
试剂与细胞
a. 样品：寒性中药10组
b. 阳性对照中药: 端粒酶抑制剂小檗碱-黄连素，中等强度的端粒酶抑制剂，IC50值约为35μmol/L）;
c. 端粒酶阳性细胞： HeLa细胞（+），乳腺癌MCF-7细胞（+）, 白血病细胞U937（+），白血病细胞HL60（+），淋巴瘤细胞CA46（+）。
）细胞培养与消化传代
含10%小牛血清的1640培养基培养肿瘤细胞，细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养，待长满90%以上时，弃去瓶中原有的培养基，用PBS清洗两次，弃去，加入2ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37℃培养箱中消化3min，转入刻度离心管中1000rpm离心3min，再加入2ml新鲜完全培养基重悬后，Cell Counter计数。
3
）
MTT
法测定药物对肿瘤细胞增殖的影响
将重悬后的细胞稀释至5×103cell/ml，每孔加100ul接种96孔细胞培养板，次日换含不同浓度药物的培养基继续培养72h后，每孔加入5mg/ml
MTT溶液12ul，于培养箱中继续培养4h。然后于平板离心机中，3000rpm离心5min后，吸出孔中溶液，加入150ul/孔DMSO溶液，再于微量振荡器上振荡10min，最后酶标仪上检测570nm和630nm处的吸光度值，则每个孔的吸光度值即为A570-A630。每个浓度的吸光度值取三个平行孔的平均值。细胞增殖率为：（A实-A阴对）/（A阴对-A空）。结果与对照组比较。
4
）肿瘤细胞中端粒酶活性的测定
将重悬后的肿瘤细胞稀释至5×103cell/ml，每孔加500ul接种24孔细胞培养板，次日换含不同浓度药物的培养基继续培养72h和96h后，分别取样，使用PCR-free方法测定端粒酶的活性，（n=3），方法同上，此处略。
2
）体内实验
a）寒性中药提取物对S180、H22和EAC动物移植瘤的影响
本实验使用环磷酰胺（CTX）作为阳性对照；小鼠为昆明系小鼠，雌性，18-22g。
Ø
对小鼠移植瘤S180、H22的抑制作用
取接种7 d生长良好的S180、H22小鼠，无菌条件下用注射器抽取腹水，以灭菌的生理盐水l:4稀释，调节细胞数为2.5×10 个／mL，取0.2 mL接种于小鼠右侧腋窝皮下。接种24 h后称重，随机分为中药提取物高剂量组（1.2 g／kg）、中剂量组（0.6 g／kg）、低剂量组（0.3 g／kg）、CTX组（20 mg／kg）和空白对照组5组，每组10只。小鼠分别每天灌胃给药1次，每次0.4 mL，空白对照组灌胃等量的生理盐水，CTX组腹腔注射，连续给药10 d，每3 d称体重1次，第11 d处死全部小鼠，剥取肿瘤称重，计算抑瘤率，重复实验一次，以t检验方法进行统计学处理。
Ø 艾氏腹水瘤小鼠生存期的实验观察
取接种7天生长良好的EAC小鼠，在无菌操作下用注射器抽取腹水，以灭菌的生理盐水稀释，调细胞数为2.0×10 个／mL，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。接种24 h后称重，随机分为中药提取物高剂量组（1.2g／kg ）、中剂量组（0.6 g／kg）、低剂量组（0.3 g／kg）、CTX组（20 mg／kg）和空白对照组5组，每组10只。小鼠分别每天灌胃给药1次，每次0.4mL，空白对照组灌胃等量的生理盐水，CTX组腹腔注射，于第8 d停药，记录生存时间。根据有关规定，对照组20％动物存活时间不得超过4 周，故设第29 d终止实验，计算生命延长率，以t检验方法进行统计学处理，实验重复一次。
生命延长率=（T-C）/ C×100 %，式中 C为对照组平均生存天数，T为给药组平均生存天数。
b）寒性中药提取物对急性淋巴白血病小鼠的治疗效果
Ø 对移植性小鼠淋巴细胞白血病L1210生命延长作用
取DBA/2小鼠80只，18g～22g，雌雄各半，接种腹水型小鼠淋巴白血病细胞L1210腹水瘤，接种后随机分为8组，每组10只，雌雄各半，分别按以下三个剂量给药：中药提取物高剂量组（1.2g／kg ）、中剂量组（0.6 g／kg）、低剂量组（0.3 g／kg）；另设生理盐水空白对照组（0.9 % NaCl，0.4ml/ 20g）及阿霉素注射剂（2mg/ kg）组，于接种后24h腹腔注射，每天一次，共给药10d，给药后观察荷瘤DBA/ 2小鼠存活天数（存活 60d以上小鼠按 60d计），所得实验结果进行统计学（t检验）处理，试验重复三次。
Ø 对移植性小鼠淋巴细胞白血病 P388的生命延长作用
取DBA/2小鼠80只，18～22g，雌雄各半，接种腹水型小鼠淋巴白血病细胞P388腹水瘤。接种后，小鼠随机分为8组，每组10只，雌雄各半，分别按以下剂量给药：中药提取物高剂量组（1.2g／kg ）、中剂量组（0.6 g／kg）、低剂量组（0.3 g／kg）；另设生理盐水空白对照组（0.9% NaC1，0.4ml/20g）及DR注射剂（20mg/ kg）组。小鼠于接种后24h腹腔给药注射，每天一次，连续10d。给药后记录荷瘤DBA/2小鼠平均生存时间（存活 60d 以上小鼠按 60d计），计算给药组生命延长率，并分别进行统计学（t检验）处理，试验重复三次。
c）寒性中药提取物对肿瘤模型小鼠细胞端粒酶活性的影响
以上a、b两项实验结束后，取小鼠体内肿瘤组织或分离腹水中肿瘤细胞，使用PCR-free法检测细胞中端粒酶活性。具体方法同体内细胞实验部分所述，在此省略。
Claims (1)
1.通过端粒酶筛选抗癌中药的方法，其特征在于按如下步骤实施
A、选取端粒酶阳性细胞： HeLa细胞，乳腺癌MCF-7细胞, 白血病细胞U937，白血病细胞HL60，淋巴瘤细胞CA46；
B、含10%小牛血清的1640培养基培养肿瘤细胞，细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养，待长满90%以上时，弃去瓶中原有的培养基，用PBS清洗两次，弃去，加入2ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37℃培养箱中消化3min，转入刻度离心管中1000rpm离心3min，再加入2ml新鲜完全培养基重悬后，Cell
Counter计数；
C 、
将重悬后的细胞稀释至5×103cell/ml，每孔加100ul接种96孔细胞培养板，次日换含不同浓度药物的培养基继续培养72h后，每孔加入5mg/ml
MTT溶液12ul，于培养箱中继续培养4h；然后于平板离心机中，3000rpm离心5min后，吸出孔中溶液，加入150ul/孔DMSO溶液，再于微量振荡器上振荡10min，最后酶标仪上检测570nm和630nm处的吸光度值，则每个孔的吸光度值即为A570-A630；每个浓度的吸光度值取三个平行孔的平均值；
细胞增殖率为：（A实-A阴对）/（A阴对-A空）；结果与对照组比较；
D 、将重悬后的肿瘤细胞稀释至5×103cell/ml，每孔加500ul接种24孔细胞培养板，次日换含不同浓度药物的培养基继续培养72h和96h后，分别取样，使用PCR-free方法测定端粒酶的活性，（n=3）。
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| CN108279308A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-07-13 | 上海相宜本草化妆品股份有限公司 | 一种中草药抗衰老物质及其筛选方法 |
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