CN109106711A

CN109106711A - 双环醇及其可药用衍生物用于预防或治疗药物性肝损伤的用途

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Publication number: CN109106711A
Application number: CN201710485565.7A
Authority: CN
Inventors: 赵立敏; 李燕; 王晨
Original assignee: BEIJING UNION PHARMACEUTICAL FACTORY
Current assignee: BEIJING UNION PHARMACEUTICAL FACTORY
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-01-01

Abstract

本发明属于化学药物技术领域，涉及双环醇及其可药用衍生物用于预防或治疗药物性肝损伤的用途。用双环醇及其可药用衍生物预防或治疗药物性肝损伤，可以明显降低血清ALT和AST，明显恢复柠檬酸合成酶活性，使肝脏线粒体基因拷贝数明显增多，并明显提高肝脏自噬基因、肝脏氧化应激基因、肝脏内质网应激基因、肝脏线粒体Sab基因的表达。

Description

双环醇及其可药用衍生物用于预防或治疗药物性肝损伤的用途

技术领域

本发明属于化学药物技术领域，涉及双环醇及其可药用衍生物用于预防或治疗药物性肝损伤的用途。

背景技术

双环醇(Bicyclol)，化学名称为4，4'-二甲氧基-5，6，5'，6'-双(亚甲二氧基)-2-羟甲基-2'-甲氧羰基联苯，系中国医学科学院药物研究所研制的具有自主知识产权的抗肝炎创新药物，在16个国家和地区获得专利保护，目前上市剂型为口服片剂。

双环醇原料及其片剂于2001年获得国家新药证书和生产批件，由北京协和药厂独家生产。双环醇对四氯化碳、D-氨基半乳糖、扑热息痛引起的急性肝损伤的氨基转移酶升高、免疫性肝炎的氨基转移酶升高有降低作用，肝脏组织病理形态学损害有不同程度的减轻。此外，体外试验结果显示，双环醇对肝癌细胞转染人乙肝病毒的2.2.15细胞株具有抑制HBeAg、HBV DNA、HB分泌的作用。因此，双环醇及其衍生物适用于伴有氨基转移酶异常升高的慢性病毒性肝炎和非病毒性肝病的治疗，安全性高，停药后不易反弹。经北京、上海多家医院2200多例慢性乙肝、丙肝患者进行临床疗效观察，表明该药不但能降低血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，而且具有一定抑制肝病毒复制的作用，未发现明显副作用。

阿奇霉素是临床上经常使用的一种大环内酯类抗生素，双氯芬酸钠是临床上经常使用的一种非甾体抗炎药物。研究表明，长期、过量使用阿奇霉素、双氯芬酸钠均会导致患者的肝损伤，AST和ALT异常偏高。

发明内容

本发明的目的是提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途，以能够很好的预防或治疗药物性肝损伤。

为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途。

在一种优选的实施方案中，本发明提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途，其中所述的可药用衍生物为双环醇的盐、酯、溶剂合物、位置异构体或立体异构体。

在一种优选的实施方案中，本发明提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途，其中所述的药物性肝损伤是阿奇霉素导致的药物性肝损伤。

在一种优选的实施方案中，本发明提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途，其中所述的药物性肝损伤是双氯芬酸钠导致的药物性肝损伤。

在一种优选的实施方案中，本发明提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途，其中导致所述的肝损伤的药物的单次给药剂量为50-2000mg/kg体重。

在一种优选的实施方案中，本发明提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途，其中导致所述的肝损伤的药物的单次给药剂量为400-1000mg/kg体重。

在一种优选的实施方案中，本发明提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途，其中所述的双环醇的单次给药剂量为100-300mg/kg体重。

在一种优选的实施方案中，本发明提供双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途，其中所述的双环醇通过提高肝脏自噬基因、肝脏氧化应激基因、肝脏内质网应激基因、肝脏线粒体Sab基因的表达预防或治疗所述的药物性肝损伤。

本发明的有益效果在于，利用双环醇及其可药用衍生物预防或治疗药物性肝损伤，可以明显降低血清ALT和AST，明显恢复柠檬酸合成酶活性，使肝脏线粒体基因拷贝数明显增多，并明显提高肝脏自噬基因、肝脏氧化应激基因、肝脏内质网应激基因、肝脏线粒体Sab基因的表达，从而很好的预防或治疗药物性肝损伤。

附图说明

图1为双环醇对ALT和AST的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、低剂量预防组(Pre-BY-100mg/kg)、中剂量预防组(Pre-BY-200mg/kg)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、低剂量治疗组(Tre-BY-100mg/kg)、中剂量治疗组(Tre-BY-200mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图2为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏病理损伤的影响图，A、B、C、D分别为空白对照组、阿奇霉素肝损伤模型对照组、低剂量预防组、低剂量治疗组的病理切片(200×)。

图3为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏MDA、GSH、SOD的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图4为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠血清NO及肝脏TNOS及iNOS的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图5为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠血清TNF-α和IL-1β的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图6为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝线粒体膜电位改变的影响图，Control、AZM、Pre-BY-300mg/kg、Tre-BY-300mg/kg分别代表空白对照组、阿奇霉素肝损伤模型对照组、高剂量预防组、高剂量治疗组。

图7为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝线粒体膜电位的影响图，AZM、Control、Pre-BY-300mg/kg、Tre-BY-300mg/kg分别代表阿奇霉素肝损伤模型对照组、空白对照组、高剂量预防组、高剂量治疗组。

图8为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝线粒体MRC-I/IV活性的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图9为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝线粒体柠檬酸合酶活性的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图10为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝线粒体ATPase活性的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图11为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏线粒体基因拷贝数的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图12为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏自噬基因表达的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)；纵坐标为相对RNA水平(注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05)。

图13为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏氧化应激基因表达的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)；纵坐标为相对RNA水平(注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01)。

图14为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏内质网应激基因表达的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)；纵坐标为相对RNA水平(注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01)。

图15为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏Sab蛋白sh3bp5表达的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)；纵坐标为相对RNA水平(注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01)。

图16为双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏caspase-3活性的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、阿奇霉素肝损伤模型对照组(AZM)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)。

图17为双环醇对ALT和AST的影响图，横坐标自左至右分别为空白对照组(Control)、双氯芬酸纳肝损伤模型对照组(DIC)、低剂量治疗组(Tre-BY-100mg/kg)、中剂量治疗组(Tre-BY-200mg/kg)、高剂量治疗组(Tre-BY-300mg/kg)、低剂量预防组(Pre-BY-100mg/kg)、中剂量预防组(Pre-BY-200mg/kg)、高剂量预防组(Pre-BY-300mg/kg)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。

实施例1：双环醇预防或治疗阿奇霉素导致的药物性肝损伤的小鼠动物试验

取健康的雄性KM小鼠80只(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2012-0001)，随机分为8组，即空白对照组、阿奇霉素肝损伤模型对照组(模型对照组)、100mg/kg双环醇预防组(低剂量预防组)、200mg/kg双环醇预防组(中剂量预防组)、300mg/kg双环醇预防组(高剂量预防组)、100mg/kg双环醇治疗组(低剂量治疗组)、200mg/kg双环醇治疗组(中剂量治疗组)、300mg/kg双环醇治疗组(高剂量治疗组)，每组10只。

空白对照组的小鼠在整个试验期间正常饮食，不给予阿奇霉素和双环醇，并在其他组小鼠试验结束后处死眼眶取血和取肝组织。所取小鼠肝组织迅速置于10％(m/v)福尔马林溶液中浸泡保存，进行相关测定前按肝组织与生理盐水1:9的质量体积比加入生理盐水后制备成10％(m/v)肝组织匀浆，然后2500rpm离心10min取上清。以下小鼠所取肝组织按相同方法处理。

阿奇霉素肝损伤模型对照组的各小鼠分别以500mg/kg的剂量连续3次腹腔注射阿奇霉素，每次间隔12小时。在末次腹腔注射阿奇霉素后的第0、3、6、12、24小时对该组的各小鼠分别进行眼眶取血并分别处死2只取肝组织。

3组双环醇预防组的小鼠在首次腹腔注射阿奇霉素前一天的上午和晚上，以及首次腹腔注射阿奇霉素前1小时先分别各口服100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg的双环醇，然后开始分别以500mg/kg的剂量连续3次腹腔注射阿奇霉素，每次间隔12小时。在末次腹腔注射阿奇霉素后的第0、3、6、12、24小时对各组的各小鼠分别进行眼眶取血并分别处死2只取肝组织。

3组双环醇治疗组的各小鼠分别以500mg/kg的剂量连续3次腹腔注射阿奇霉素，每次间隔12小时，并在每次注射阿奇霉素后1小时每组分别各口服100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg的双环醇。在末次口服双环醇后的第0、3、6、12、24小时对各组的各小鼠分别进行眼眶取血并分别处死2只取肝组织。

上述各组小鼠的眼眶取血和取肝组织用于如下实施例2的各项研究。

上述试验中使用的阿奇霉素为注射用乳糖酸阿奇霉素(粉针剂)，由海南海灵化学制药有限公司生产，批号为1511051，使用前用生理盐水配成50mg/ml的溶液。

上述试验中使用的双环醇由北京协和药厂生产，为片剂，批号为120531H，使用前以0.5％(m/v)CMC-Na研磨制成混悬液。

实施例2：实施例1的小鼠动物试验留取血样和肝组织样品的检测

用南京建成生物工程研究所生产销售的相应试剂盒进行ALT、AST、MDA、GSH、CAT、SOD、NO、NOS、ATPase的测定；用大连宝生物公司生产销售的试剂盒提取DNA、RNA；用ELISA试剂盒测定血清中的炎症因子IL-1β、TNF-α；肝组织样品做病理切片，观察形态学改变。YBRGreen MIX购自南京爱必梦公司。

1、双环醇对阿奇霉素诱导肝损伤的保护作用

双环醇预防和治疗给药组对阿奇霉素诱导肝损伤小鼠血清ALT、AST升高均有降低作用，与模型对照组比较有显著差异，具有一定的量效关系。结果见表1和图1。

小鼠注射阿奇霉素后可出现肝组织病理变化，即部分肝窦狭窄，肝细胞明显可见胞浆疏松、嗜酸性变，且病变弥漫,以中央静脉内三分之一区较为明显。双环醇给药后对上述病理改变有一定作用，但无显著差异。结果见图2。

表1双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠血清ALT和AST升高的影响(6小时)

注：与空白对照组比较，***P<0.001

2、对氧化应激的影响

模型对照组小鼠的肝脏MDA显著升高，SOD、GSH和CAT应激性升高，提示氧化损伤的存在。小鼠口服双环醇后可使升高的MDA降至正常水平。结果见表2、表3和图3。

表2模型对照组阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏GSH、MDA、SOD、CAT经时变化

注：与空白对照组比较，###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

表3双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏MDA、GSH、SOD变化的影响

注：与空白对照组比较，###P<0.001，##P<0.01；与模型组比较，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

3、对硝化应激的影响

与空白对照组相比，模型对照组小鼠肝脏TNOS和iNOS显著增加，但血清NO无显著变化。双环醇预防组和治疗组可降低NO水平。结果见表4和图4。

表4双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠血清NO及肝脏TNOS及iNOS的影响

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，***P<0.001。

4、对血清中炎症因子IL-1β、TNF-α的影响

模型对照组小鼠可见血清TNF-α、IL-1β明显升高，预防组和治疗组可显著抑制TNF-α、IL-1β的升高，结果见表5和图5。

表5双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠血清TNFα和IL-1β的影响

注：与正常组比较，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*<0.05，***P<0.001。

5、对肝线粒体膜电位影响

1)线粒体膜电位测定方法

使用线粒体提取试剂盒提取肝脏线粒体，调整线粒体蛋白浓度到5mg/ml。

在96孔板中每孔加入192μl膜电位反应缓冲液和4μl 26uM R123，边加边混匀，荧光酶标仪测定激发波长503nm、发射波长527nm条件下的基础荧光值。然后加入4μl不同实验组线粒体，混匀后立即开始计时，连续测定5min内荧光值变化。每孔以加入线粒体前的荧光值为基础值(即荧光强度＝0)，加入线粒体之后的荧光强度以相应荧光值相对基础值的变化量来表示。

2)测定结果

正常小鼠肝脏线粒体加入反应液后，测定的荧光值大幅度降低，提示线粒体功能正常；模型对照组的测定荧光值下降幅度明显减少，说明线粒体膜电位异常和线粒体损伤。双环醇给药可显著改善阿奇霉素诱导的肝脏线粒体膜电位的改变。以上结果见图6。

6、对肝线粒体肿胀度测定

1)测定方法

将待测线粒体样品0.5mg与1ml测定液混匀，以参比杯调零。于25℃在0～10min内连续测定线粒体悬液在520nm处的吸光度值，以吸光度降低值反映线粒体肿胀变化。

2)测定结果

正常对照组肝脏线粒体中加入0.3mM氯化钙缓冲液后在520nm处的吸光度值急速下降，可持续10分钟，提示线粒体功能正常。模型对照组吸光度值亦有下降，但幅度较小，提示线粒体功能受损，对高钙敏感性降低。与模型对照组相比，双环醇给药组吸光度值下降幅度显著增加。上述结果表明，双环醇可明显改善阿奇霉素诱导的线粒体功能损伤，维持对高钙浓度的敏感性。结果见图7。

7、对肝线粒体MRC活性的影响

1)MRC I活性测定方法

测定体系总体积为1ml，其中含400μl缓冲液(K₃PO4 35mmol/L，MgCl₂ 5mmol/L，蔗糖50mmol/L，NaN₃ 2mmol/L，pH 7.2)，其它组分见下表。

上述各组分除NADH外，于30℃温孵5min，然后加入NADH启动反应，于340nm动态测定60秒内吸光度值的改变，间隔10秒读1次。以空白对照组的降低值为1，计算其他样本的活性比。

2)MRC IV活性测定方法

测定前将线粒体用分离液稀释至2mg/ml，反复冻融三次，使之成为线粒体片断，以达最大酶活性。

将氧化型细胞色素C加入一定量的连二亚硫酸钠还原至OD₅₅₀/OD₅₆₅＞12，且吸光度值稳定后，于冰浴中保存。

反应体系总体积为1ml，具体组成见下表：

除还原型细胞色素C外，上述各组分于25℃孵育2min。然后加入还原型细胞色素C，用紫外可见分光光度计测定550nm处吸光度值的降低，以空白对照组的降低值为1，计算其他样本的活性比。

2)测定结果

与空白对照组相比，模型对照组小鼠肝微粒体MRC I无明显变化，但IV活性显著下降。双环醇治疗给药可抑制IV活性下降，但因SD较大，无统计学差异，结果见表6和图8。

表6双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝线粒体MRC-I/IV活性的影响

注：与正常组比较，#P<0.05；

8、柠檬酸合酶活性测定

1)测定方法

按下表加入各组分：

之后加入草酰乙酸(10mM)50μL，混匀后，测定3min内吸光度的变化值，以空白对照组的降低值为1，计算其他样品的活性比。

2)测定结果

柠檬酸合酶是三羧酸循环中的关键酶，对ATP的产生具有重要作用。与正常对照组相比，模型对照组柠檬酸合酶明显下降，双环醇预防给药可明显恢复柠檬酸合酶的活性。结果见表7和图9。

表7双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝线粒体柠檬酸合酶活性的影响

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

9、对肝线粒体ATPase活性的影响

与正常对照组相比，模型对照组小鼠肝微粒体ATPase无明显下降。结果见表8和图10。

表8双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝线粒体ATPase活性的影响

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

10、对肝脏线粒体基因拷贝数的影响

1)测定方法

将小鼠断颈取肝，迅速提取小鼠肝脏DNA，通过real-time PCR测定线粒体基因的相对拷贝数，基因组基因为18S rna，线粒体单拷贝基因为16S rna。

2)测定结果

通过real-time PCR测定小鼠给予阿奇霉素后24h的肝线粒体基因拷贝数的相对表达水平。结果发现，给予阿奇霉素后模型对照组小鼠的肝线粒体基因拷贝数明显降低，而双环醇预防组和治疗组能够使线粒体基因拷贝数明显增多，为正常组的6.2和4.48倍。提示双环醇可抑制肝损伤小鼠肝脏线粒体基因拷贝数的下降。结果见表9和图11。

表9双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏线粒体基因拷贝数的影响

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，***P<0.001。

11、对肝脏自噬基因表达的影响

1)测定方法

将小鼠处死取肝组织，迅速提取RNA，通过real-time PCR测定自噬基因的表达量，内参基因为GAPDH。

2)测定结果

通过real-time PCR测定小鼠给予阿奇霉素后24h肝脏自噬及线粒体自噬基因的表达水平，结果发现，与正常对照组相比，模型对照组beclin表达下降，LC3表达无明显变化。双环醇给药后能使beclin的表达上调，预防给药可上调LC3基因表达。结果见图12。

12、肝脏氧化应激基因表达测定

1)测定方法

应用real-time PCR测定氧化应激基因nrf2、gclc、cyp2e1的表达水平，内参基因为β-actin。

2)测定结果

与正常对照组相比，模型对照组小鼠氧化应激基因nrf2、gclc、cyp2e1的表达水平均显著性下降，双环醇给药组的gclc表达上升，对其他基因改变无明显影响。结果见图13。

13、肝脏内质网应激基因表达测定

1)测定方法

应用real-time PCR测定bip、chop、ire1α的表达量，内参基因为β-actin。

2)测定结果

与正常对照组相比，模型对照组小鼠内质网应激bip、chop、ire1α表达水平均显著下降，双环醇给药后bip、ire1α表达显著上升，具统计学差异，对chop的表达无明显影响。结果见图14。

14、肝脏线粒体Sab基因(肝脏线粒体JNK信号相关基因)表达测定

1)测定方法

通过real-time PCR测定线粒体Sab蛋白基因sh3bp5的表达量，内参基因为β-actin。

2)测定结果

与正常对照组相比，模型对照组小鼠Sab蛋白sh3bp5的表达水平显著下降，双环醇给药后可明显增加sh3bp5的表达，具有统计学差异。结果见图15。

15、对肝脏Caspase 3酶活性的影响

使用试剂盒测定Caspase 3酶活性。与正常对照组相比，模型对照组小鼠肝脏Caspase 3无明显变化，双环醇给药后也无影响。结果见表10和图15。

表10双环醇对阿奇霉素肝损伤小鼠肝脏caspase-3酶活性的影响

由以上试验可以得出如下结论：

(1)双环醇对小鼠腹腔注射阿奇霉素诱导的肝损伤有显著保护作用，可降低升高的血清ALT、AST，并呈一定的量效关系；

(2)双环醇保护阿奇霉素诱导肝损伤的机制可能与改善氧化应激、抑制炎症因子、保护线粒体功能相关。

实施例3：双环醇预防或治疗双氯芬酸钠导致的药物性肝损伤的小鼠动物试验

取健康的雄性ICR小鼠80只(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2012-0001)，随机分为8组，即空白对照组、双氯芬酸钠肝损伤模型对照组(模型对照组)、100mg/kg双环醇预防组(低剂量预防组)、200mg/kg双环醇预防组(中剂量预防组)、300mg/kg双环醇预防组(高剂量预防组)，100mg/kg双环醇治疗组(低剂量治疗组)、200mg/kg双环醇治疗组(中剂量治疗组)、300mg/kg双环醇治疗组(高剂量治疗组)，每组10只。

空白对照组的小鼠在整个试验期间正常饮食，不给予双氯芬酸钠和双环醇，并在其他组小鼠试验结束后处死眼眶取血。

双氯芬酸钠肝损伤模型对照组的各小鼠分别以150mg/kg的剂量腹腔注射双氯芬酸钠。在腹腔注射双氯芬酸钠后的第1.5、3、6、12、24小时对该组的各小鼠分别进行眼眶取血。

3组双环醇预防组的小鼠在腹腔注射双氯芬酸钠前一天的上午和晚上，以及腹腔注射双氯芬酸钠前1小时先分别各口服100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg的双环醇，然后分别以150mg/kg的剂量腹腔注射双氯芬酸钠。在腹腔注射双氯芬酸钠后的第6小时处死各组的所有小鼠取血。

3组双环醇治疗组的各小鼠分别以150mg/kg的剂量腹腔注射双氯芬酸钠，并在腹腔注射双氯芬酸钠后1小时每组分别各口服100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg的双环醇。在口服双环醇后的第6小时处死各组的所有小鼠取血。

上述各组小鼠取血进行如下实施例4的ALT和AST的测定。

上述试验中使用的双氯芬酸钠为注射用双氯芬酸钠(白色粉末，纯度98％)，由百灵威科技有限公司生产，批号为588527，使用前用双蒸水超声溶解配制成15mg/ml的溶液。

实施例4：实施例3的小鼠动物试验留取血样的ALT和AST检测

双环醇预防组对双氯芬酸钠诱导肝损伤小鼠血清ALT、AST升高均有降低作用，与模型对照组比较有显著差异，具有一定的量效关系；但双环醇治疗组对双氯芬酸钠诱导肝损伤小鼠血清ALT、AST升高基本无降低作用，与模型对照组比较无显著差异。结果见表11和图17。

表11双环醇对双氯芬酸钠肝损伤小鼠血清ALT和AST升高的影响(6小时)

注：与空白对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，###P<0.001

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

Claims

1.双环醇及其可药用衍生物用于制备预防或治疗药物性肝损伤的药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的可药用衍生物为双环醇的盐、酯、溶剂合物、位置异构体或立体异构体。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：导致所述的肝损伤的药物的单次给药剂量为50-2000mg/kg体重。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：导致所述的肝损伤的药物的单次给药剂量为400-1000mg/kg体重。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的双环醇的单次给药剂量为100-300mg/kg体重。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的双环醇通过提高肝脏自噬基因、肝脏氧化应激基因、肝脏内质网应激基因、肝脏线粒体Sab基因的表达预防或治疗所述的药物性肝损伤。