ES2297526T3 - Utilizacion de un liofilizado de celulas vegetales desdiferenciadas con el fin de despigmentar y/o aclarar la piel. - Google Patents
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Abstract
Utilización en una composición cosmética de al menos un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, para despigmentar y/o aclarar y proteger la epidermis.
Description
Utilización de un liofilizado de células
vegetales desdiferenciadas con el fin de despigmentar y/o aclarar la
piel.
Utilización en una composición cosmética o
farmacéutica al menos de un liofilizado de células vegetales
desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas, con
el fin de despigmentar y/o aclarar, proteger y regenerar la
epidermis.
La invención se refiere a la utilización al
menos de un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las
cuales son células de plantas halófilas, en una composición
cosmética o farmacéutica con fines de despigmentación y/o aclarado
de la epidermis acompañada de un efecto protector y regenerador. La
invención tiene, además, por objeto una composición cosmética o
farmacéutica de uso tópico que incluye al menos tal liofilizado.
La piel es un sobreprotector que representa la
interfaz entre el medio exterior y los otros órganos internos. No
obstante no es hermética y, como órgano de absorción, permite a las
sustancias disueltas penetrar por medio de los poros y folículos
pilosos.
La piel protege contra el frío, el calor, la
radiación; contra la presión, la fricción; contra las lesiones
químicas; contra la penetración de los microorganismos; de la
pérdida de agua y calor.
La protección natural de la piel contra la
radiación ultravioleta pasa por un pigmento marrón, la melanina. La
melanina está presente en células de las capas básicas de la
epidermis: los melanocitos. Se sintetiza a partir de un aminoácido,
la tirosina, modificado por una enzima, la tirosinasa. La síntesis
de la melanina es inducida por los rayos UV. La coloración oscura
de la piel es una primera protección natural contra el sol, que es
bien insuficiente para las pieles más claras. El bronceado es la
consecuencia, bajo la acción de la UV, del aumento de la actividad
melanocítica de síntesis de la melanina y del almacenamiento de la
melanina en los queratinocitos.
La cantidad de melanina y el número de
melanocitos son factores programados genéticamente que dan su color
a la piel.
Una producción excesiva y localizada de melanina
causa la aparición de manchas: pecas, máscara de embarazo, lentigos
solares o seniles, etc. En efecto, según las últimas nomenclaturas,
las manchas de vejez corresponden a los lentigos seniles y los
lentigos solares son las otras manchas.
Las "manchas de vejez" son pequeñas manchas
marrón pálido, planas y generalmente redondas, generalmente sobre
la cara, la espalda de las manos, el cortada, los antebrazos. Son
causadas por la combinación del sol y el envejecimiento. Su número
aumenta con la edad. Bajo la acción repetida de los rayos UV, los
melanocitos terminan por producir la melanina.
Los lentigos son "pecas" que no desaparecen
en invierno, marrones, minúsculos y numerosos, muy cercanos una de
los otros. Se los encuentra generalmente sobre la cara, los hombros
y el cortada. Son causadas por una sobredosis de ultravioletas y
pueden formarse a partir de la más joven edad.
La "máscara de embarazo" se manifiesta por
grandes manchas marrones de contorno irregular, generalmente sobre
la cara, que toman a veces el aspecto de una máscara. Cuando estas
manchas aparecen durante el embarazo, se habla de cloasma, si no se
habla de melasma. Son causadas por un estímulo hormonal (embarazo,
hormonoterapia) combinado con la exposición a los rayos UV.
Todos estos tipos de manchas pueden también
vincularse con el patrimonio genético y en consecuencia con la
herencia.
Ante el aspecto desfavorable de estas
concentraciones máximas de melanina, es de un interés especialmente
importante el tener acceso a preparaciones de uso tópico que
permitan prevenir su aparición y/o reducirlos.
Los fabricantes de preparaciones cosméticas y
farmacéuticas están constantemente en busca de principios activos
no agresivos que permiten inhibir o bloquear la síntesis de la
melanina, directa o indirectamente, o inhibir o bloquear la
transferencia de los melanosomas a los queratinocitos, y en
consecuencia aclarar estas manchas protegiendo al mismo tiempo
estas zonas de una pigmentación solar. Del mismo modo, los
fabricantes de preparaciones cosméticas buscan principios activos
despigmentantes no agresivos ante el deseo creciente de las
poblaciones negras y asiáticas de aclarar su piel, proponiéndoles al
mismo tiempo un producto protector de la piel.
Para atenuar a las molestias de los otros
tratamientos disponibles engorrosos y/o agresivos (láser,
crioterapia) de despigmentación, estos principios activos deben
proteger la piel y/o al mismo tiempo estimular la regeneración de
las células que la constituyen.
En efecto, la protección de la piel y/o el
estímulo de la regeneración de las células de la piel permiten
luchar al mismo tiempo contra un factor agravante de las manchas: el
envejecimiento cutáneo por múltiples causas.
La primera causa del envejecimiento cutáneo es
el envejecimiento "programado" que puede ser acelerado por la
tensión, el tabaquismo y algunas enfermedades. Con los años, la piel
pierde su elasticidad ya que la dermis produce siempre menos fibras
de colágeno y elastina. De ahí el debilitamiento progresivo del
tejido conjuntivo y la relajación de la piel. La capacidad de
renovación de la epidermis tiende también a disminuir, ésta se
vuelve más seca y más fina ya que se altera su metabolismo. La piel
toma también con el tiempo un aspecto grisáceo que da un tinte mate
contra el cual también puede aplicarse un tratamiento de
aclarado.
La segunda causa del envejecimiento es la
disminución de la producción hormonal que implica la disminución
progresiva de las funciones de los tejidos orgánicos, celulares y
orgánicos. Las hormonas como la hormona de crecimiento (HGH), la
testosterona, el DHEA y la melatonina se producen en grandes
cantidades hasta la edad de 20 años y favorecen la renovación
celular.
La consecuencia de estas distintas causas del
envejecimiento combinadas con los efectos del medio ambiente
(distintas contaminaciones: gas de escape, humos de cigarrillos,
humos de fábricas, productos químicos...) llevan a la
superproducción de radicales libres que tienen como objetivo los
distintos componentes de la célula: proteínas, lípidos, azúcares y
el ADN y que constituyen así otra causa del envejecimiento cutáneo.
Algunas influencias exteriores les impulsan a entrar en reacción ya
que buscan constantemente otras moléculas a las cuales pueden
enlazarse. Atacan entonces las fibras de colágeno, las membranas
celulares y la capa grasa de la piel. Alteran el patrimonio
genético de las células, de modo que la calidad de las nuevas
células de la piel disminuye.
El cuerpo se protege contra estos agresores
mediante sistemas enzimáticos que se oponen a estas reacciones de
oxidación (antioxidantes). Pero a partir de la edad de veinte años,
los mecanismos de defensa naturales se debilitan progresivamente,
de modo que la piel no puede ya defenderse completamente sola.
El Solicitante descubrió de manera sorprendente
e inesperada que un liofilizado de células vegetales
desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas,
permite alcanzar esta combinación de efectos buscada: despigmenta
y/o aclara la epidermis con una perfecta inocuidad protegiéndola al
mismo tiempo que regenerándola.
Las células desdiferenciadas conservan todas las
potencialidades celulares como las células existentes. Expresan
todos los genes de su genoma pues sintetizan todas las proteínas que
permiten a cada tipo de célula especializada protegerse del medio
exterior.
La invención tiene pues por primer objeto la
utilización en o para la fabricación de una composición cosmética o
farmacéutica al menos de un liofilizado de células vegetales
desdiferenciadas, las cuales son células de plantas halófilas,
permitiendo dicho liofilizado despigmentar y/o aclarar, proteger y
regenerar la epidermis.
Se entiende por "célula vegetal
desdiferenciada" toda célula vegetal que no presenta ningún
carácter de especialización y que puede regenerar por sí sola una
planta entera de vegetal del que procede. Puede aislarse a partir de
toda muestra de planta entera u órgano como las hojas, los troncos,
las raíces, las semillas, las flores, los pétalos, las anteras, los
frutos, etc, mediante el llamado explante.
De manera preferida, se utilizan un trozo de
hoja o una semilla como explante.
Se prefiere muy especialmente cultivar el
explante "in vitro". Se entiende por "cultivo ``in
vitro''" el conjunto de las técnicas del arte previo
conocidas por el experto en el arte, que permiten en condiciones
perfectamente controladas regenerar un órgano o una planta entera a
partir de un explante cultivado en o sobre un medio nutritivo
definido. Estas condiciones perfectamente controladas permiten una
perfecta reproductividad y homogeneidad de las plantas. En
particular, este método de cultivo proporciona clones idénticos
ad infinitum. Entre los métodos y medios de cultivo "in
vitro" descritos en el arte previo, se pueden citar como
ejemplos los medios de Gamborg (1968), de Murashige et Skoog
(1962), de Morel (1970), etc..dont la formulation est décrite dans
"Plant Culture Media : Formulations and uses" de E.F. George,
DJM Puttock et H.J. George (Exegetics Ltd 1987).
En particular, se prefiere utilizar células
vegetales desdiferenciadas de vegetal halófilo como las especies
Salicornia ramossisima (Salicorne), Sueda vera, Beta maritima,
Obione portulacoides, Armeria maritima, Crithmum maritimum (Criste
Marina), Ophrys sphegodes, Artemia vulgaris, Muscaris comosum,
Eryngium maritimum, Sanguisorba minor, Cochlearia officinalis,
Fumaria officinalis, Vincetoxicum fullonum, Dipsacus fullonum,
Heracleum spondylium, Inula crithmoides, Inula brittanica, Inula
viscosa, muy especialmente células vegetales desdiferenciadas de
Criste Marine (Crithmum maritimum). Los vegetales halófilos,
también nombrados halófitos, son vegetales que toleran suelos ricos
en sal. Desarrollaron sistemas de defensa contra el medio exterior
agresivo que colonizan. En particular, los halófitos son vegetales
del borde del mar, capaces de soportar un suelo rico en sal, la
humedad y el viento. Luchan permanentemente para mantener la presión
osmótica en sus células, tendiendo el agua a atravesar la membrana
plásmica hacia el compartimento extracelular más salado.
En el caso de la utilización de vegetal
halófilo, es especialmente importante desarrollar un cultivo
"in vitro" de células que proporciona una biomasa
infinita y reproductible para proteger estas especies, estando los
halófitos en peligro ante la contaminación de los mares.
\newpage
En una realización particular de la invención,
es también posible modificar algunas condiciones de cultivo (pH,
temperatura, composición gaseosa ambiente, composición del medio de
cultivo, luminosidad). Las células desdiferenciadas tenderán
entonces a producir más o menos de algunas sustancias
intracelulares.
El segundo objeto de la invención es una
composición cosmética o farmacéutica de uso tópico caracterizada
porque incluye, en una base fisiológicamente aceptable, 0,05 al 2%,
preferiblemente 0,1 al 1%, de manera especialmente preferida 0,5% al
menos de un liofilizado tal como describe anteriormente.
En efecto, tal liofilizado puede utilizarse como
único principio activo de la composición según la invención. Sin
embargo, pueden añadirse varios liofilizados a la base de la
composición según la invención.
En un primer método de realización particular de
la invención, se utiliza al menos un liofilizado de células
vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas
halófilas, para la fabricación de una composición cosmética o
farmacéutica, destinadas a renovar el aspecto de la piel.
En un segundo método de realización particular
de la invención, se utiliza al menos un liofilizado de células
vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas
halófilas, para la fabricación de una composición cosmética o
farmacéutica destinada al tratamiento de las manchas llamadas
lentigos.
En un tercer método de realización particular de
la invención, se utiliza al menos un liofilizado de células
vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de plantas
halófilas, para la fabricación de una composición cosmética o
farmacéutica, destinada a aclarar las pieles negras o asiáticas.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención
sin por ello limitar el alcance.
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Figura 1: morfología general, coloración con
hematoxilina/eosina (HES) sobre epidermis reconstituida
SKINETHIC® simple (queratinocitos).
SKINETHIC® simple (queratinocitos).
Figura 2: Morfología general, coloración al
hematoxilina/eosina (HES) sobre epidermis reconstituida
SKINETHIC® que integra melanocitos.
SKINETHIC® que integra melanocitos.
Figura 3: Marcado de la filaggrina.
Figura 4: Marcado de KI-67
(evaluación del índice mitótico) Ejemplo 1: Cultivo "in
vitro" de células desdiferenciadas de Criste Marina a partir
de tejido vegetal: 1 obtención de callus primarios.
Con ayuda de tijeras se toman pedazos de tejidos
en la zona elegida (3 cm mínimo) de tronco, hojas. A partir de esta
fase de la de la manipulación, todo debe desarrollarse en atmósfera
estéril bajo una campana de flujo laminar.
Para esterilizar el material vegetal, se
sumergen los tejidos 30 s en etanol, luego se elimina el solvente,
se enjuagan con 3 x 100 ml de H_{2}O estéril, se sumergen 15
minutos en hipoclorito de sodio añadiendo algunas gotas de Tween 20
y se enjuagan con 3 x 100 ml de H_{2}O estéril. Para poner los
tejidos en cultivo, se depositan los fragmentos de tejidos en una
caja de Petri estéril (125 mm.), se recortan fragmentos de tejidos
(2 a 3 mm.) teniendo cuidado de eliminar las partes blanqueadas por
el agua de lejía. Los explantes así obtenidos se inciden
ligeramente y se depositan medio-insertados en el
medio nutritivo gelosado (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
En esta fase de manipulación, todo debe
desarrollarse en atmósfera estéril bajo una campana de flujo
laminar. Se toman al nivel del callus 2 a 3 aglomerados aglomerados
celulares (1 a 2 cm) con ayuda de una espátula.
Se depositan y se distribuyen estos aglomerados
sobre el nuevo medio.
\newpage
Composición del medio de cultivo sólido: Tabla
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las células del callus se transfieren a un medio
líquido idéntico al medio sólido sin agar (Tabla 1). Se cultivan
bajo agitación (110 revoluciones por minuto), a 25ºC en luz blanca
continua (3500 lux, tubos fluorescentes de "luz día") en
erlenmeyers de 250 mL, en torno al 50 mL por erlenmeyer. Se les
diluye del 10 a 11 días a 1/4 es decir, 100 mL en 400 mL.
Las células se cultivan a partir de una dilución
a 1/4 del inoculante de mantenimiento en erlenmeyers de 5L, a razón
de 2L de cultivo por erlenmeyer, bajo agitación (110 revoluciones
por minuto), a 25ºC en luz blanca continua (3500 lux, tubos
fluorescentes de "luz día") y esto durante 12 a 13 días.
Hay que señalar que el ácido 2,4
diclorofenoxiacético es metabolizado enteramente y no se encontrará
en el producto final.
El cultivo celular líquido en suspensión se
centrifuga para depositar las células.
Las células se pasan sobre un tamiz de 150 a 200
mm., son congeladas y luego liofilizadas en un liofilizador de
placas.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesta en evidencia sobre epidermis
reconstituida SKINETHIC® de la ausencia de toxicidad de una
reparación cosmética que contiene un liofilizado de células
desdiferenciadas de Criste Marina.
La epidermis reconstituida SKINETHIC® es un
modelo de epidermis humano desarrollado y comercializado por la
Sociedad SkinEthic Laboratories (Niza, Francia).
\vskip1.000000\baselineskip
1. Sobre epidermis reconstituida SKINETHIC®
simple (constituido solamente de queratinocitos):
Se siembran algunos queratinocitos de origen
humano sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio
definido (MCDB 153 modificado) complementado. Las células se
cultivan durante 14 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que
se cambia el medio de cultivo cada dos días.
Las epidermis así formadas se utilizaron para la
realización del estudio a partir del 17º día de cultivo.
Se efectuó una prueba preliminar con el fin de
determinar el tiempo de contacto y la cantidad de producto aplicado
sobre la epidermis reconstituida que no implica citotoxicidad. Se
condujeron todas las pruebas en duplicado con:
- Lote 1: epidermis testigo que no reciben producto
- Lote 2: epidermis tratadas que reciben crema PXTS + 0,1% AK205
- Lote 3: epidermis tratadas que reciben crema PXTS + 0,5% AK205
- Lote 4: epidermis tratadas que recibían el producto liofilizado de células (AK 205)
AK205 = liofilizado de células desdiferenciadas
de Criste Marina obtenido según los Ejemplos 1 y 2. PXTS = para
pieles muy secas.
Las epidermis fijadas en una solución de
aldehído fórmico al 10% se incluyeron en bloques en parafina. Los
cortes verticales de 4 micrones fueron coloreados con
hematoxilina/eosina y fotografiados bajo un microscopio óptico.
Los cultivos deben presentar capas celulares
básicas, espinosas, granulosas y córneas intactas, ortoqueratósicas,
y la estratificación epidérmica debe ser regular y normal. Las
células de la capa básica deben ser polarizadas verticalmente.
Numerosos granos de queratohialina deben ser visibles (en púrpura)
en la capa granulosa justo bajo la capa córnea.
Los productos, crema PXTS+0,1% AK205, crema
PXTS+0,5% AK205 y el producto liofilizado de células de Criste
Marina (AK 205) depositados en torno al 2 mL por cm^{2}, sobre
epidermis reconstituidas tratadas durante las 24, comparativamente
a epidermis testigo, no indujo ninguna toxicidad. Las imágenes
histológicas, después de coloración hematoxilina/éo, de epidermis
tratadas son comparables a las de las epidermis testigo (véase
Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Sobre epidermis reconstituida SKINZTHIC® que
integra melanocitos:
Queratinocitos de origen humano y los
melanocitos se siembran sobre filtros de policarbonato de 0,63
cm^{2}s en un medio definido (MCDB 153 modificado) y
complementado. Las células se cultivan durante 10 días en la
interfaz aire/líquido, asumiendo que se cambia el medio de cultivo
todos los días.
Las epidermis de tipo VI (= negroide) así
formadas se utilizaron a partir del 10.o día de cultivo.
Se efectuó una prueba preliminar con el fin de
determinar el tiempo de contacto y la cantidad de producto aplicado
sobre la epidermis reconstituida que no implicaba citotoxicidad.
La prueba se condujo en duplicado con:
- Lote 1: epidermis testigo que no reciben producto
- Lote 2: epidermis testigo positivas que reciben el ácido kójico, 2%
- Lote 3: epidermis tratadas que reciben crema PXTS + 0,1% AK205
- Lote 4: epidermis tratadas que recibían crema PXTS + 0,5% AK205
AK205 = liofilizado de células desdiferenciadas
de Criste Marina obtenido según los Ejemplos 1 y las 2.
Epidermis fijadas en una solución aldehído
fórmico 10% se incluyó en bloques en parafina. Los cortes verticales
de 4 micrones fueron coloreados con hematoxilina/eosina y
fotografiadas bajo un microscopio óptico.
Los cultivos deben presentar capas celulares
básicas, espinosas, granulosas y córneas intactas, ortoqueratósicas,
y la estratificación epidérmica deben ser regulares y normales. Las
células de la capa básica deben ser polarizadas verticalmente.
Numerosos granos de queratohialina deben ser visibles (en púrpura)
en la capa granulosa justa bajo la capa córnea.
Los productos, crema PXTS+0,1% AK205 y crema
PXTS+0,5% AK205 depositados en torno a 2 mL por cm^{2}, sobre
epidermis reconstituidas tratadas durante 24 h, comparativamente con
la epidermis testigo, no indujeron ninguna toxicidad. Las imágenes
histológicas, después de coloración con hematoxilina/eosina, de
epidermis tratadas son comparables a las de las epidermis testigo
(véase Figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Evaluación del efecto despigmentante de una
preparación cosmética que contiene un liofilizado de células
desdiferenciadas de Criste Marina sobre epidermis reconstituidas
SKINETHIC® que integran melanocitos:
\vskip1.000000\baselineskip
Queratinocitos de origen humano y melanocitos se
siembran sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un
medio definido (MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se
cultivan durante 10 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que
se cambia el medio de cultivo todos los días.
Las epidermis de tipo VI (= negroide) así
formadas se utilizaron a partir del 10.o día de cultivo.
Se condujeron Todas las pruebas en duplicado
con:
- Lote 1: epidermis testigo que no reciben producto
- Lote 2: epidermis testigo positivas que reciben el ácido kójico, 2%
- Lote 3: epidermis tratadas que reciben crema PXTS + 0,1% AK205
- Lote 4: epidermis tratadas que recibían crema PXTS + 0,5% AK205
AK205 = liofilizado de células desdiferenciadas
de Criste Marina obtenido según los Ejemplos 1 y 2.
La evaluación de la síntesis de la melanina
(estudio cualitativo) intracelular fue efectuada por espectrometría
a 475 nm después de que las células se pusieron en suspensión luego
disueltas en NaOH (1N) y dimetil sulfóxido durante 30 minutos.
Al final del período de incubación, se puso el
medio de cultivo, se tomaron luego las epidermis, se aclararon con
el PBS (Fosfato Parachoques Salina) y se puso en contacto con Tritón
X-100 (Sigma, Francia) a 1% y luego se incubaron
durante 10 minutos. La reacción enzimática fue iniciada por la
adición de L-Dopamina (Sigma, Francia) a 10 mM en
el PBS desprovisto de Ca^{2+} y de Mg^{2+}. Después de 1 hora de
incubación a 37ºC protegida de la luz, la actividad de la
tirosinasa fue evaluada por la medida de la absorción en 475 nm con
ayuda de un espectrofotómetro.
\newpage
Los resultados obtenidos se presentan en forma
de tabla:
Los resultados obtenidos revelaron que la crema
PXTS+0,5% AK205 implicó una disminución significativa del tipo de
melanina en las epidermis reconstituidas integrales de los
melanocitos (-37%). La crema PXTS+0,1% AK205 redujo ligeramente
este porcentaje (-13%) comparativamente al testigo positivo ácido
kojique 2% (-44%).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se presentan en forma
de tabla:
Los resultados obtenidos revelaron que el
producto crema PXTS+0,5% AK205 implicó una disminución significativa
de la actividad de la tirosinasa en las epidermis reconstituidas
integrales de los melanocitos (-32%) comparativamente al testigo
positivo (-38%). Se observó una ligera disminución (-19%) después de
tratamiento por el producto crema PXTS+0,1% AK205.
En conclusión, en las condiciones experimentales
elegidas el producto crema PXTS+0,5% AK205 presentó una actividad
despigmentante neta frente a las epidermis reconstituyentes
integrantes de los melanocitos. Se observó una actividad más
limitada pero más real con la crema PXTS+0,1% AK205.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesta en evidencia sobre epidermis
reconstituida SKINETHIC® del efecto antihomolítico de una
preparación cosmética que contiene un liofilizado de células
desdiferenciadas de Criste Marina:
\vskip1.000000\baselineskip
En los sistemas biológicos, el oxígeno molecular
es estable y poco reactivo. Se implica como aceptante de electrones
y su reducción consigue la producción de agua. Pero la reducción
incompleta del O_{2} consigue la producción de radicales libres y
metabolitos como el anión superóxido O_{2}-, el radical perhidróxi
HO_{2}- tóxico (en presencia de hierro ferroso, la reacción puede
conducir a OH-, muy agresivo) o el peróxido de hidrógeno
H_{2}O_{2}.
La superóxido dismutasa (SOD) protege las
membranas dismutantes muy rápidamente O_{2}- en H_{2}O_{2}.
El H_{2}O_{2}, relativamente estable, se reduce en agua (H2O)
por la catalasa y la peroxidasa. Estos radicales libres resultantes
de la reducción incompleta del O_{2} son sensibles en las dobles
conexiones, lo que favorece la aparición de otros radicales libres
por deslocalización electrónica. La iniciación de la reacción en
cadena homolítica se produce en los ácidos grasos poliinsaturadoss.
La reacción en cadena se desencadena entonces, dentro de la
membrana celular conduciendo a la liberación del malondialdehído
(MDA) así como otros aldehídos y de alcanos que son productos de
degradación. Estos últimos pueden ser puestos de relieve por
reacción con el ácido tiobarbitúrico (TBA).
Al proporcionar el MDA, que es uno de los
marcadores esenciales de la citotoxicidad por los procesos
oxidativos y la tensión, se dispone entonces de un índice que
informa sobre la actividad antirradical de una sustancia dada. 2
protocolo experimental:
Se siembran algunos queratinocitos de origen
humano sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio
definido (MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se
cultivan durante 14 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que
se cambia el medio de cultivo cada dos días.
Las epidermis así formadas se utilizaron para la
realización del estudio a partir del 17º día de cultivo.
La prueba se condujo en triplicado después de 24
h de contacto del producto con las epidermis:
- -
- Lote 1: epidermis testigo negativas que no reciben ningún producto.
- -
- Lote 2: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,1% AK205
- -
- Lote 3: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,5% AK205
- -
- Lote 4: epidermis tratadas que recibían el producto liofilizado de células (Criste Marina)
Los productos que deben estudiarse se aplicaron
a la superficie de cada epidermis tratada, en torno a 2
\muL/cm^{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Después de 24 h de contacto del producto con las
epidermis, estos últimos se volvieron a poner en suspensión en:
- -
- 250 \muL de tampón Tris 50 mM, pH 8 que contiene NaCl 0,1 M; EDTA 20 mM
- -
- 25 \muL de SDS al 7%
- -
- 300 \muL de HCl (0,1 N)
- -
- 38 \muL de ácido fosfotúngstico al 1% en agua
- -
- 300 \muL de ácido tiobarbitúrico al 0,67% en agua
Después de 1 hora de incubación en la oscuridad
a 50ºC y un enfriamiento en agua con hielo, se añadieron 300 ml
n-butanol en cada tubo. Éstos se centrifugaron a
10.000 g a 0ºC durante 10 minutos. La fase superior se recuperó para
la dosificación de MDA.
El MDA fue proporcionado por medida de la
fluorescencia después de separación del complejo
MDA-TBA por HPLC (Cromatografía Líquida Alta
Presión).
- -
- Bomba Bischoff Modelo 2.200
- -
- Inyector automático Alcoot Model 788 autosampler
- -
- Columna Ultrasep C18 (30 cm x 0,18 cm) 6 mm. de porosidad
- -
- Detector de fluorescencia, Jasco 821-FI
Se efectuó la detección de la fluorescencia con
una excitación a 515 nm y una emisión a 553 nm. El eluyente
utilizado está formado por metanol:agua, 40:60 (v/v) cuyo pH se
ajustó con KOH 1M.
La cuantificación se hizo con relación a
estándares tratados como las muestras (0,125; 0,25; 0,5 y 1 mM) con
ayuda de un programa informático ICS (Pico 3) (Instrumentationón,
Consommable Service). => Dosificación de las proteínas
La dosificación de las proteínas se realizó
según el método de BRADFORD. El aumento de la absorbancia a 595 nm
es proporcional a la concentración de las proteínas determinadas con
ayuda de un espectrofotómetro UNICAM8625.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se presentan en forma
de tabla:
Los resultados ponen de manifiesto que los
productos estudiados no inducen ninguna liberación del MDA en las
condiciones fisiológicas, con relación al testigo no tratado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se presentan en forma
de tabla:
Los resultados obtenidos revelaron una
protección significativa de los productos, crema PXTS+0,1% AK205,
crema PXTS+0,5% AK205 y liofilizado de células (Criste Marina),
aplicados a la superficie de la epidermis reconstituida SKINETHIC
®, frente a lipoperoxidación causada por los rayos ultravioletas B
(150 mJ/cm^{2}).
El porcentaje de reducción de la producción de
MDA es del -21, -25 y -28% respectivamente para crema
PXTS+
0,1% AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y el producto liofilizado de células (Criste Marina) en comparación con las epidermis irradiadas.
0,1% AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y el producto liofilizado de células (Criste Marina) en comparación con las epidermis irradiadas.
La irradiación WB (testigo positivo) que causa +
un 28% de aumento de la producción de MDA, la aplicación de los
productos crema PXTS+0,1% AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y produce
liofilizado de células (Criste Marina) antes de la irradiación
permitió mantener la producción de MDA a su nivel fisiológico.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesta en evidencia sobre epidermis
reconstituida SKINETHIC® del efecto que estimula de una reparación
cosmética que contiene un liofilizado de células desdiferenciadas de
Criste Marina:
El cultivo celular de los queratinocitos humanos
permitió describir más en detalle los efectos específicos de los
derivados de la vitamina A sobre los marcadores de la diferenciación
graduada de la epidermis: la expresión de KI-67 en
la capa suprabásica se estimula, se induce la expresión de
queratinas típicas de la hiperproliferación epidérmica (K19, K13),
hay pérdida de la polaridad de las células de la capa básica,
mientras que se inhibe la síntesis de filaggrina, proteína
responsable del embalaje de las queratinas en la capa córnea. Los
granos de queratohialina, situados en la capa granulosa y ricos en
filaggrina, desaparecen en 24 h en presencia de ácido retinóico, de
un 0,05% (ácido de la vitamina A) en el medio de cultivo. Los
retinoides inducen pues globalmente un estímulo de la proliferación
y una inhibición de la diferenciación epidérmica. (Rosdy, M. et
al., In vitro Toxicology, Vol. 10 nº 1, p.
39-47, 1997, "Retinoic acid inhibits epidermal
differentiation when applied topically on the stratum corneum of
epidermis formed in vitro by human keratinocytes grown on
defined medium").
La filaggrina y la proteína
KI-67 puede pues utilizarse como marcadores de la
diferenciación epidérmica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se siembran algunos queratinocitos de origen
humano sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio
definido (MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se
cultivan durante 14 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que
se cambia el medio de cultivo cada dos días.
Las epidermis así formadas se utilizaron para la
realización del estudio a partir del 17º día de cultivo.
La prueba se conduce en triplicado después de 24
horas de contacto de los productos con las epidermis:
- -
- Lote 1: epidermis testigo negativas que no reciben ningún producto.
- -
- Lote 2: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,1% AK205
- -
- Lote 3: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,5% AK205
- -
- Lote 4: epidermis tratadas que recibían el producto liofilizado de células (Criste Marina)
Las epidermis testigo que no recibían ningún
producto y las epidermis tratadas que recibían los productos en
estudio durante 24 horas de contacto, se congelaron a -80ºC. Después
de inclusión en bloques de parafina, las epidermis se cortaron y
luego se trataron con immunohistoquímica.
Esta reacción se realizó con un anticuerpo
monoclonal que recombinaba la filaggrina.
\vskip1.000000\baselineskip
La observación comparativa de las epidermis
reconstituidas testigo y tratadas con los productos, crema PXTS+0,1%
AK205, crema PXTS+0,5% AK205 y liofilizado de células (Criste
Marina), reveló una diferencia de densidad de marcado de la
filaggrina en la capa granulosa (véase Figura 3). En efecto, en las
condiciones fisiológicas, el tratamiento de las epidermis por:
- crema PXTS+0,1% AK205: a inducido una neta
disminución de la diferenciación epidérmica que se traduce en la
neta disminución del marcado de la filaggrina en comparación con los
testigos no tratados,
- crema PXTS+0,5% AK205: a inducido una neta
disminución de la diferenciación epidérmica que se traduce en la
neta disminución del marcado de la filaggrina en comparación con los
testigos no tratados,
- liofilizado de células (Criste Marina): a
inducido una disminución significativa de la diferenciación
epidérmica que se traduce en la neta disminución del marcado de la
filaggrina en comparación con el testigo no tratado.
\vskip1.000000\baselineskip
Queratinocitos de origen humano se siembran
sobre filtros de policarbonato de 0,63 cm^{2} en un medio definido
(MCDB 153 modificado) y complementado. Las células se cultivan
durante 14 días en la interfaz aire/líquido, asumiendo que se cambia
el medio de cultivo cada dos días.
Las epidermis así formadas se utilizaron para la
realización del estudio a partir del 17º día de cultivo.
La actividad de los productos fue revelada por
un marcado immunohistoquímico.
La prueba se conduce en triplicado después de 24
horas de contacto del producto con las epidermis:
- -
- Lote 1: epidermis testigo negativas que no reciben ningún producto.
- -
- Lote 2: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,1% AK205)
- -
- Lote 3: epidermis tratadas que reciben el producto crema PXTS+0,5% AK205 - Lote 4: epidermis tratadas que recibían el producto liofilizado de células (Criste Marina)
Las epidermis testigo que no recibían ningún
producto y las epidermis tratadas que recibían los productos en
estudio durante 24 horas de contacto, se fijaron con aldehído
fórmico 10%. Después de inclusión en bloques de parafina, se
cortaron estas epidermis y luego se trataron con
immunohistoquímica.
Esta reacción se realizó con el anticuerpo MIB1
(Immunotech), péptido recombinante del antígeno nuclear
KI-67.
El revelado fue hecho por el método
peroxidasa-antiperóxido después de
desenmascaramiento antigénico por tratamiento al calor.
El marcado por cromógeno DAD revela en marrón
los lugares nucleares KI-67 de la fracción de las
células en crecimiento expresado en fases:
- => G1 y S = fases de latencia y síntesis de la célula
- => G2 = fase de desdoblamiento de los constituyentes celulares
- => M = mitosis
El índice mitótico fue evaluado por recuento de
los lugares nucleares coloreados, en torno a los 10 campos por
lámina al microscopio óptico, ampliación x 250, comparativamente con
los cortes de epidermis testigos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se presentan en forma
de tabla:
El recuento de los lugares nucleares coloreados
al marrón de todas las muestras, después de tratamiento
immunohistoquímica, reveló que el producto:
- crema PXTS+0,1% AK205: implicó un escaso
aumento, pero significativo, de la multiplicación de las células de
la capa básica. El número de lugares nucleares coloreados es
comparable a el de los testigos no tratados (véase Figura 4).
- crema PXTS+0,5% AK205: implicó un escaso
aumento, pero significativo, de la multiplicación de las células de
la capa básica en comparación con el testigo no tratado. El número
de lugares nucleares coloreados es superior a el de los testigos no
tratados (véase Figura 4).
- liofilizado de células (Criste Marina):
implicó un aumento significativo de la multiplicación de las células
de la capa básica en comparación con el testigo no tratado. El
número de lugares nucleares coloreados es ampliamente superior a el
de los testigos no tratados (véase Figura 4).
Claims (16)
1. Utilización en una composición cosmética de
al menos un liofilizado de células vegetales desdiferenciadas, las
cuales son células de plantas halófilas, para despigmentar y/o
aclarar y proteger la epidermis.
2. Utilización de al menos un liofilizado de
células vegetales desdiferenciadas, las cuales son células de
plantas halófilas, para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a una utilización para despigmentar y/o
aclarar, proteger y regenerar la epidermis.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque las células vegetales desdiferenciadas
son obtenidas por cultivo "in vitro".
4. Utilización según la reivindicación 3,
caracterizada porque las células vegetales desdiferenciadas
obtenidas por cultivo "in vitro" son cepas.
5. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la planta
halófila es el Criste Marina.
6. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque el liofilizado
despigmenta y/o aclara la epidermis bloqueando la actividad de la
tirosinasa.
7. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el liofilizado
protege la epidermis por un efecto antihomolítico.
8. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque el liofilizado
regenera la epidermis por un efecto que estimula la proliferación de
las células de la capa básica de la epidermis.
9. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque el liofilizado
regenera la epidermis por un efecto que inhibe la diferenciación
epidérmica.
10. Composición cosmética o farmacéutica de uso
tópico caracterizada porque incluye, en una base
fisiológicamente aceptable, al menos un liofilizado tal como se
describe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Composición cosmética o farmacéutica de uso
tópico caracterizada porque incluye, en una base
fisiológicamente aceptable, del 0,05% al 2% al menos de un
liofilizado tal como describe según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
12. Composición cosmética o farmacéutica de uso
tópico caracterizada porque incluye, en una base
fisiológicamente aceptable, del 0,1% al 1% al menos de un
liofilizado como describe según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
13. Composición cosmética o farmacéutica de uso
tópico caracterizada porque incluye, en una base
fisiológicamente aceptable, un 0,5% al menos de un liofilizado tal
como describe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
9.
14. Composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, destinada a renovar el aspecto de la
piel.
15. Composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, destinada al tratamiento de las manchas
pigmentarias.
16. Composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, destinada a aclarar las pieles negras o
asiáticas.
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