CN1921827A - 去分化植物细胞的冻干粉剂在使皮肤脱色素和/或亮白中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及至少一种去分化植物细胞的冻干粉剂在化妆品或药物组合物中的应用以使表皮脱色素和/或亮白连同具有保护以及再生效果。此外，本发明的主题是包括至少一种这样的冻干粉剂的表皮施用的化妆品或药物组合物。

Description

去分化植物细胞的冻干粉剂 在使皮肤脱色素和/或亮白中的应用
本发明涉及至少一种去分化植物细胞的冻干粉剂在化妆品或药物组合物中的应用以使皮肤脱色素和/或亮白从而保护以及再生表皮。
本发明涉及至少一种去分化植物细胞的冻干粉剂在化妆品或药物组合物中的应用以使表皮脱色素和/或亮白连同具有保护以及再生效果。此外，本发明的主题是包括至少一种这样的冻干粉剂的表皮施用的化妆品或药物组合物。
皮肤是构成外界环境和内脏之间界面的保护包层。然而，皮肤不是密闭的并且作为吸收器官，可以使溶解的物质通过毛孔和毛囊渗透。
皮肤可以御寒，热，射线；抗压力，摩擦；抗化学制品引起的损害；抗微生物的侵入，水分以及热的损耗。
皮肤抗紫外线的天然保护效果通过褐色素，黑色素进行。黑色素存在于表皮的基底细胞层的黑色素细胞中。它合成自氨基酸，酪氨酸，所述酪氨酸由酪氨酸酶改性。黑色素的合成由紫外线诱导。皮肤的暗色是抵抗阳光的第一天然保护，但是对于非常白晰皮肤是非常不足的。棕褐色皮肤是UV作用，黑色素合成中黑色素细胞活性的增加以及角质细胞中黑色素储存的结果。
黑色素的量以及黑色素细胞的数目是决定皮肤颜色的遗传决定因素。
过量以及表皮产生黑色素产生如下斑点：雀斑，黄褐斑，晒斑或老年斑。的确，根据最近的命名法，老化斑点是老年斑，其它斑点是晒斑。
“老化斑点”较小，淡褐色，扁平，通常是圆点。它们最常出现在脸部，手背，颈部(décolleté)以及前臂。它们由阳光以及老化相结合的原因所引起。数目随年龄增加。在UV线的反复作用下，黑色素细胞终止黑色素的产量的增加。
斑点是褐色“雀斑”，在冬季不会消失，很小并且很多，彼此之间非常接近。它们最常出现在脸部，肩部以及颈部。它们应归于过量紫外线并且可以在非常年轻的时候就会出现。
“黄褐斑”表现为大的褐斑，具有不规则的轮廓，最常出现在脸上，有时为面具的形状。当这些斑点出现在怀孕期间，我们称作黄褐斑，否则称作黑斑病。它们由激素刺激(怀孕，内分泌治疗)连同暴露于UV线所引起。
所有这些类型的斑点也与遗传有关，因此可以遗传。
由于这种过度沉着的黑色素难看的表现，用于阻止和/或缓和其表现的表皮制剂的有效性是非常重要的。
化妆品以及药物制剂的生产商正在持续寻找非侵蚀性的活性成分，可以抑制或直接或间接阻断黑色素的合成，或抑制或阻断黑色素体向角质细胞的转移，因此使这些斑点亮白，同时保护这些区域对抗太阳引起的色素形成。同样化妆品制剂的生产商正在试图发现用于脱色素的非侵蚀性的活性成分以便满足黑人或亚洲人群对通过提供护肤品使其皮肤颜色亮白的日益增长的需求。
为了克服其它现有的繁琐和/或腐蚀性脱色素处理(激光，冷冻疗法)的缺点，这些活性成分应该可以同时保护皮肤和/或刺激构成皮肤的细胞的再生。
的确，皮肤防护和/或皮肤细胞再生的刺激可以同时对抗加重斑点的因素：由于多种原因引起的皮肤老化。
皮肤老化的首要原因是“程序性”老化，可以由于压力，烟瘾以及某些疾病而加速。长年累月，皮肤丧失弹性，因为真皮产生越来越少的骨胶原以及弹性蛋白纤维。因此结缔组织逐渐削弱并且皮肤松弛。由于新陈代谢的改变，表皮的更新能力也趋向降低，变得很干燥以及稀薄。日积月累，皮肤也失去光泽，导致面色暗淡并且也可以通过利用亮白处理对抗。
老化的第二原因是激素产量的降低，其导致组织，细胞以及有机机能的累进递减。激素，诸如生长激素(HGH)，睾丸激素，DHEA以及褪黑素在低于20岁的年龄高产量生成，它们有利于细胞更新。
这些不同的老化原因连同环境影响(各种污染：尾气，烟熏，工业烟尘，化学产品，等)导致自由基的过量产生，所述自由基靶向不同的细胞组分：蛋白，脂类，糖以及DNA，并且是皮肤老化进一步的原因。由某些外界影响的驱动，所述自由基不断地寻找其它分子以便形成键合。然后攻击皮肤的胶原纤维，细胞膜以及脂肪层。他们改变细胞的遗传，因此新的皮肤细胞的特性削弱。
身体通过对抗这些氧化反应(抗-氧化剂)的不同酶系保护自身对抗这些侵略者。但是从20岁开始，天然防护机制逐渐削弱，在某种意义上单独皮肤不再能防护其自身。
本申请人令人惊讶并料想不到的发现去分化植物细胞的冻干粉剂可以实现这种组合的预定效果：表皮脱色素和/或亮白，完全无害，同时保护以及再生表皮。
去分化细胞如干细胞一样保留全部的细胞潜能。他们表达其基因组的全部基因，因此表达能够使每种特化细胞保护其本身对抗外部环境的全部蛋白。
因此，本发明的第一方面是至少一种去分化植物细胞的冻干粉剂在生产化妆品或药物组合物中的应用，所述冻干粉剂可以使表皮脱色素和/或亮白从而保护以及再生表皮。
“去分化植物细胞”是指不存在特化特性并且本身可以再生产生其的植物的完整幼苗的任意植物细胞。这个细胞可以分离自完整植物或植物器官的任意样品，诸如叶子，茎，根，种子，花朵，花瓣，花药，果实等等，称作外植体。
优选地，使用叶子或种子的碎片作为外植体。
非常特别优选的是外植体的体外培养。通过“体外培养”是指利用本领域技术人员公知的现有技术的全部技术，在受完好控制的条件下可以从培养在限制培养基中或之上的外植体再生器官或整个植株。这些受完好控制的条件可以实现幼苗的完好再现性以及均一性。尤其是，这种培养方法提供了无限相同的克隆。在体外培养法中，可以列举的现有技术描述的培养基有Gamborg(1968)，Murashige以及Skoog(1962)，Morel(1970)等的培养基，在E.F.George，DJM Puttock以及H.J.George(Exegetics Ltd 1987)的“Plant Culture Media：formulationsand uses”中描述的制剂。
尤其是，优选利用嗜盐植物的去分化植物细胞，诸如Sa；icorniaramossisima(Salicorne)，Sueda vera，Beta maritima，Obioneportulacoides，海石竹，深海茴香(Crithmum maritimum)(地中海小兰花(Criste Marine))，Ophrys sphegodes，Artemia vulgaris，Muscariscomosum，刺芫荽(Eryngium maritimum)，地榆(Sanguisorba minor)，辣根菜，蓝堇，Vincetoxicum fullonum，起绒草，Heracleum spondylium，Inula crithmoides，欧亚旋覆花(Inula brittanica)，Inula viscosa，最优选地中海小兰花(深海茴香)的去分化植物细胞。嗜盐植物是耐受高盐量土壤的植物。他们发展了对抗其所定殖的腐蚀性的外部培养基的防御系统。尤其是，嗜盐植物是能够经受高盐量土壤，湿度以及风的海滨植物。他们为维持细胞中的渗透压力，防止水穿过原生质膜流向具有高钠含量的胞外区室而持续抗争。
当使用嗜盐植物时，尤其重要的是发展体外细胞培养，提供无限以及可重复的生物量以便保护这些物种，嗜盐植物正处于海洋污染的危险之中。
在本发明的特定实施方案中，也可以改变某些培养条件(pH，温度，周围环境气体组成，培养基组成，光亮度)。去分化细胞趋向产生或更多或更少的某些胞内物质。
本发明的第二方面是表皮施用的化妆品或药物组合物，其中组合物在生理可以接受的基质中包括从0.05至2％，优选从0.1到1％，最优选0.5％的至少一种在这里描述的冻干粉剂。
实际上，这种冻干粉剂可以用作本发明的组合物的唯一活性成分。然而，可以将几种冻干粉剂添加到本发明组合物的基质中。
在本发明第一特定实施方案中，至少一种去分化植物细胞的冻干粉剂被用于生产预计可以皮肤外表嫩化的化妆品或药物组合物。
在本发明第二特定实施方案中，至少一种去分化植物细胞的冻干粉剂被用于生产预计可处理称作痣的斑点的化妆品或药物组合物。
在本发明第三特定实施方案中，至少一种去分化植物细胞的冻干粉剂被用于生产预计可亮白黑人或亚洲人皮肤的化妆品或药物组合物。
下列实施例用于说明本发明而不是对其范围进行限制。
附图说明
图1：在简单重建的表皮SKINETHIC(角质细胞)上用苏木精/曙红(HES)染色的一般形态。
图2：用苏木精/曙红(HES)在简单重建的包含黑色素细胞的表皮SKINETHIC上染色的一般形态。
图3：标记聚角蛋白微丝蛋白。
图4：标记KI-67(评价有丝分裂的指数)。
实施例1：从植物组织体外培养去分化的地中海小兰花细胞：
1-获得最初的愈伤组织
利用一把剪刀在所选择的区域(最小3cm)将茎、叶子等切割组织碎片。从此操作阶段开始，必须在层流净化罩的无菌环境中进行全部操作。
为了对植物材料灭菌，将所述组织浸入乙醇30秒，然后除去溶剂，用3×100ml的无菌H2O冲洗组织，浸入次氯酸钠中15分钟，同时添加几滴吐温20并用3×100ml无菌H2O冲洗。
为了进行组织培养，将组织碎片置入无菌平皿(125mm)中，切割组织碎片(2至3mm)，处理除去被次氯酸钠漂白的部分。将由此获得的外植体稍微切割，并取出半埋在琼脂培养基(表1)中。
2-愈伤组织再植
在此操作阶段，必须在层流净化罩的无菌环境中进行全部操作。用刮铲从新鲜的培养基取出2至3细胞簇(1至2cm)的愈伤组织。
将这些细胞簇取出并分散在新鲜的培养基上。
固体培养基的配方：表1
    宏元素     mg/l
    KNO3     2500
    (NH4)2SO4     134
    CaCl2，2H2O     150
    NaH2PO4，2H2O     300
    MgSO4，7H2O     250
    微量元素，     mg/l
    MnSO4，H2O     16.9
    ZnSO4，7H2O     8.6
    H3BO3     6.2
    KI     0.83
    Na2MoO4，2H2O     0.25
    CuSO4，5H2O     0.025
    FeSO4，7H2O     27.8
    维生素     mg/l
    肌醇     100
    烟酸     1
    钙-D(+)panthotenate     1
    (+)生物素(biotine)     0.01
    吡哆醛盐酸盐     1
    二氯硫胺素     1
    有机化合物     g/l
    蔗糖     30
    植物激素     mg/l
    Naphtalene乙酸     1.5
    2，4-二氯苯氧乙酸     0.5
    激动素(kinetine)     0.5
    胶凝剂     g/l
    琼脂     9
3-在液体培养基中扩增愈伤组织
培养种子：
将愈伤组织细胞转移到等同于不含琼脂的固体培养基的液体培养基(表1)中。在搅拌(110rpm/分钟)条件下，于25℃，持续白光(3500lux，荧光灯管“日光”)在250mL锥形瓶中每一锥形瓶50mL的比率进行培养。
每10-11天对其进行稀释以1∶4的比例进行扩增，即将100mL稀释成400mL。
产生干燥物质
在5L锥形瓶中，以每锥形瓶2L，在搅拌条件下(110rpm/min)，于25℃在持续的白光(3500lux，荧光灯管“日光”)下培养细胞以1∶4稀释度扩增培养的种子12到13天。
应当指出，2，4-二氯-苯氧乙酸是完全代谢的并且在最终产品中不存在。
实施例2：制备去分化的地中海小兰花细胞的冻干粉剂：
将悬浮中的液体细胞培养物进行离心以便使细胞沉淀。
将细胞通过150-200μm的筛子，冷冻，然后在平板冷冻干燥机中冷冻干燥。
实施例3：在重建的表皮SKINETHIC上在含有去分化的地中海小兰花细胞的冻干粉剂的化妆品制剂不具有毒性
重建的表皮SKINETHIC是人表皮模型，由SkinEthic实验室公司(Nice，France)开发以及销售。
1-在重建的简单表皮SKINETHIC(仅由角质细胞构成)上：
将人源的角质细胞接种在限定(改性的MCDB 153)以及补料培养基中的0.63cm2的聚碳酸酯滤膜上。在空气/液体培养基界面培养细胞14天，每隔一天更换生长培养基。
从培养第17天起开始将由此形成的表皮用于进行研究。
进行预试验以便确定接触时间以及施用于重建表皮的产品的非-细胞毒性诱导量。
全部的试验一式两份进行：
批次1：不接受任何产品的对照表皮
批次2：接受乳膏PXTS+0.1％AK205处理的表皮
批次3：接受乳膏PXTS+0.5％AK205处理的表皮
批次4：接受细胞冻干粉剂(AK 205)产品处理的表皮
(AK 205)＝获自实施例1和2的去分化的地中海小兰花细胞的冻干粉剂
PXTS＝对于非常干燥的皮肤
将固定于10％甲醛溶液中的表皮包埋在石蜡块中。用苏木精/曙红对4微米的纵剖面进行染色病通过光学显微镜所代的照相机进行拍照。
培养物应该呈现出基底，刺状，粒状和完整的角膜细胞层，显示直角化症，并且表皮分层应该是规则且正常的。基础层细胞应该呈垂直极化。在角膜层以下的粒层中刚好可见大量透明角质颗粒(紫色)。
以每cm2 2μL的比率在处理24小时的重建的表皮上施加乳膏PXTS+0.1％ AK205以及乳膏PXTS+0.5％ AK205，与对照表皮相比并未诱导任何毒性。用苏木精/曙红染色后，所处理的表皮的组织学照片与那些对照表皮相当(参见图2)。
2-在包括黑色素细胞的重建的表皮SKINETHIC上：
将人源的角质细胞核黑色素细胞接种在限定(改性的MCDB 153)以及补料培养基中的0.63cm2的聚碳酸酯滤膜上。在空气/液体培养基界面培养细胞14天，每隔一天更换生长培养基。
从培养第10天起开始使用由此形成的IV型表皮(＝具有黑人特征的)。
进行预试验以便确定接触时间以及施用于重建表皮的产品的非-细胞毒性诱导量。
全部的试验一式两份进行：
批次1：不接受任何产品的对照表皮
批次2：接受2％曲酸的阳性对照表皮
批次3：接受乳膏PXTS+0.1％ AK205处理的表皮
批次4：接受乳膏PXTS+0.5％ AK205处理的表皮
(AK 205)＝获自实施例1和2的去分化的地中海小兰花细胞的冻干粉剂
将固定于10％甲醛溶液中的表皮包埋在石蜡块中。用苏木精/曙红对4微米的纵剖面进行染色病通过光学显微镜所代的照相机进行拍照。
培养物应该呈现出基底，刺状，粒状和完整的角膜细胞层，显示直角化症，并且表皮分层应该是规则且正常的。基础层细胞应该呈垂直极化。在角膜层以下的粒层中刚好可见大量透明角质颗粒(紫色)。
以每cm2 2μL的比率在处理24小时的重建的表皮上施加乳膏PXTS+0.1％ AK205以及乳膏PXTS+0.5％ AK205，与对照表皮相比并未诱导任何毒性。用苏木精/曙红染色后，所处理的表皮的组织学照片与那些对照表皮相当(参见图2)。
实施例4
在重建的含有黑色素细胞的表皮SKINETHIC上分析含有去分化的地中海小兰花细胞的冻干粉剂的化妆品制剂的去色素效果。
1-试验方案
将人源的角质细胞和黑色素细胞接种在限定(改性的MCDB 153)以及补料培养基中的0.63cm2的聚碳酸酯滤膜上。在空气/液体界面培养细胞10天，每天更换生长培养基。
从培养的第10天开始使用由此形成的IV型表皮(具有黑人特征的)。
所有试验一式两份进行：
批次1：不接受任何产品的对照表皮
批次2：接受2％曲酸的阳性对照表皮
批次3：接受乳膏PXTS+0.1％ AK205处理的表皮
批次4：接受乳膏PXTS+0.5％ AK205处理的表皮
AK 205＝获自实施例1和2的去分化地中海小兰花细胞的冻干粉剂。
通过分光光度计在475nm处测定细胞内黑色素的合成(定性)，然后悬浮细胞，并溶解在NaOH(1N)和二甲基亚砜中30分钟。
在培养阶段末期，回收培养基，用PBS(磷酸缓冲盐水)冲洗表皮并与1％的Triton X-100(Sigma，法国)接触，然后培养10分钟。通过添加10mM Ca2+-以及不含Mg2+-的L-多巴胺(Sigma，法国)的PBS溶液诱导酶促反应。
黑暗条件下在37℃培养1小时后，通过由分光光度计在475nm处测定吸光度评价酪氨酸酶的活性。
2-结果
a)黑色素的分析
所获的的结果概括在下表中
  吸光度(475nm)   ％
 阴性对照   0.160±0.02   -
 阳性对照   0.09±0.01   -44
 乳膏PXTS+0.1％ AK205   0.139±0.02   -13
 乳膏PXTS+0.5％ AK205   0.101±0.01   -37
获得的结果显示乳膏PXTS+0.5％ AK205诱导整合黑色素细胞的重建表皮黑色素水平显著的降低(-37％)。乳膏PXTS+0.1％ AK205与阳性对照2％曲酸相比(-44％)该比率只略微降低(-13％)。
b)酪氨酸酶活性的分析
获得的结果概括在下表中：
  吸光度(475nm)   ％
 阴性对照   0.245±0.03   -
 阳性对照   0.153±0.01   -38
 乳膏PXTS+0.1％ AK205   0.198±0.02   -19
 乳膏PXTS+0.5％ AK205   0.167±0.02   -32
所获的结果揭示产品乳膏PXTS+0.5％AK205与阳性对照(-38％)相比诱导整合黑色素细胞的重建表皮酪氨酸酶活性显著的降低(-32％)。用乳膏PXTS+0.1％ AK205产品处理后只观察到略微的降低(-19％)。
总之，在所应用的试验条件下，乳膏PXTS+0.5％AK205在整合黑色素细胞的重建表皮上显示净去色素活性。用乳膏PXTS+0.1％AK205只观察到更加有限但确实存在的活性。
实施例5：在重建的表皮SKINETHIC上检测含有去分化的地中海小兰花细胞冻干粉剂的抗辐射效果。
1-为什么分析丙醛？
在生物系统中，分子氧稳定存在并具有较低的反应活性。其作为电子受体，并且以产生水作为还原的终止。但是O2的不完全还原诱导产生自由基和诸如超氧阴离子O2-，毒性过氢氧化物自由基HO2 -(在亚铁的存在下，上述反应可以产生高度侵蚀性的OH-)或者过氧化氢H2O2的代谢产物。
超氧化物歧化酶(SOD)通过将O2 -非常迅速地歧化为H2O2保护细胞膜。相对稳定的H2O2通过触酶以及过氧化物酶还原为水(H2O)。由O2的不完全还原产生的这些自由基对于双键非常敏感，所述双键通过电子的非定域作用有助于其它自由基的出现。自由基链反应的起始发生在聚不饱和脂肪酸上。然后在细胞膜内触发链反应引起作为分解产品的丙醛(MDA)及其它醛和烷的释放。可以通过与硫代巴比妥酸(TBA)反应进行确定。
由于氧化过程和胁迫，作为主要细胞毒性标记物之一的MDA的分析提供了指示给定物质具有抗自由基活性的指示物。
2-试验方案：
将人源的角质细胞接种在限定(改性的MCDB 153)以及补料培养基中的0.63cm2的聚碳酸酯滤膜上。在空气/液体界面培养细胞14天，每隔一天更换生长培养基。
从培养的第17天开始使用由此形成的表皮进行研究。
将产品与表皮接触24小时后一式三份进行分析：
批次1：不接受任何产品的阴性对照表皮
批次2：接受乳膏PXTS+0.1％ AK205处理的表皮
批次3：接受乳膏PXTS+0.5％ AK205处理的表皮
批次4：接受细胞冻干粉剂(地中海小兰花)处理的表皮。
将所检验的产品施用到以2μL/cm2的比率处理的每一表皮的表面上。
丙醛萃取
产品与表皮接触24小时后，将它们悬浮于含有如下成分的液体中：
-含有0.1NaCl；20mM EDTA的250μL Tris 50mM缓冲液，pH8
-25μL的7％ SDS
-300μL HCl(0.1N)
-38μL的1％磷钨酸的水溶液
-300μL的0.67％的硫代巴比妥酸的水溶液
在黑暗条件下50℃培养1小时并在冰水中冷却后，将300ml的正-丁醇添加到每一个管中。在10000g，0℃离心10分钟。回收上清液分析MDA。
丙醛分析
通过用HPLC(高压液相色谱)分离MDA-TBA复合物后通过测定荧光强度分析MDA。
-泵Bischoff Model 2.200
-自动注射器Alcoot Model 788自动上样仪
-Ultrasep CIS柱(30cm×0.18cm)孔隙6mm
-荧光检测器，jasco 821-FI
利用在515nm的激发以及553nm的发射进行荧光检测。所使用的洗脱液包含甲醇∶水，40/60(V/V)，利用1M的KOH调节其pH。
利用计算机程序ICS(Pic 3)(Instrumentation，Consumable，Service)与作为样品处理的标准(0.125；0.25；0.5和1mM)相比进行定量。
蛋白分析
根据如下BRADFORD的方法进行蛋白分析。在595nm处吸光度的增加与由分光光度计UNI CAM 8625测定的蛋白的浓度成正比。
3-结果
a)生理脂过氧化
所获得的结果概括在下表中：
  MDA(μM/mg蛋白)   ％
 对照   652±31   -
 乳膏PXTS+0.1％ AK205   638±47   -2(ns)
 乳膏PXTS+0.5％ AK205   620±32   -5(ns)
 细胞冻干粉剂   594±57   -9(ns)
ns：不显著
结果显示所检验的产品在生理条件下与未处理的对照相比未诱导任何MDA的释放。
b)由UVB诱导的脂过氧化
所获得的结果概括在下表中：
  MDA(μM/mg蛋白)   ％
  对照   652±31   -
  UVB(150mJ/cm2)   832±63   +28*
  乳膏PXTS+0.1％AK205+UVB(150mJ/cm2)   660±51   -21**
  乳膏PXTS+0.5％AK205+UVB(150mJ/cm2)   625±42   -25**
  细胞冻干粉剂+UVB(150mJ/cm2)   602±37   -28**
*与阴性对照相比
**与UVB照射的阳性对照相比
所获得的结果显示施用到重建的表皮SKINETHIC上的产品乳膏PXTS+0.1％ AK205和乳膏PXTS+0.5％ AK205以及细胞冻干粉剂对由紫外线B(150mj/cm2)诱导的脂过氧化提供了显著的保护作用。
乳膏PXTS+0.1％ AK205，乳膏PXTS+0.5％ AK205以及细胞冻干粉剂(地中海小兰花)与辐射的表皮相比MDA的产量分别减少-21，-25和-28％。
用UVB辐射(阳性对照)诱导MDA产量增加+28％，曝光之前施用乳膏PXTS+0.1％ AK205，乳膏PXTS+0.5％ AK205以及细胞冻干粉剂(地中海小兰花)可以将MDA产量保持在其生理水平。
实例6：在重建的表皮SKINETHIC上确定含有去分化的地中海小兰花细胞的冻干粉剂的化妆品制剂的刺激效果：
1-刺激的评价标准
人角质细胞的细胞培养物可以更详细地描述维生素A衍生物对表皮逐渐分化的如下标记的具体效果：
上述基底层中KI-67的表达被激发，典型用于表皮增殖的角蛋白(K19，K13)的表达被诱导，观察到基底细胞层极性的丧失，然而聚角蛋白微丝蛋白(filaggrine)，负责角蛋白在角质层中的包装的蛋白的合成被抑制。在培养基中0.05％视黄酸(维生素A酸)存在下24h内，位于颗粒层中并具有高含量聚角蛋白微丝蛋白的透明角质颗粒消失。因此类视色素诱导增殖的全面刺激以及表皮分化的抑制(Rosdy，M.等，InVitro Toxicology，Vol.10n°1，p.39-47，1997，″Retinoic acid inhibitsepidermal differentiation when applied topically on the stratum corneum ofepidermis formed in vitro by human keratinocytes grown on definedmedium″)。
因此聚角蛋白微丝蛋白和蛋白KI-67可用作表皮分化的标记物。
2-表皮分化研究
方案
将人源化的角质细胞接种在限定(改性的MCDB 153)以及补料培养基中的0.63cm2的聚碳酸酯滤膜上。在空气/液体界面培养细胞14天，每隔一天更换生长培养基。
从培养的第17天将由此形成的表皮用于进行研究。
产品与表皮接触24小时之后一式三份进行分析：
批次1：不接受任何产品的阴性对照表皮
批次2：接受乳膏PXTS+0.1％ AK205处理的表皮
批次3：接受乳膏PXTS+0.5％ AK205处理的表皮
批次4：接受细胞冻干粉剂处理(地中海小兰花)的表皮。
将在24小时接触的时间内不接受任何产品的对照表皮以及接受所研究的产品的处理的表皮在-80℃冷冻。包埋在石蜡块中后，切割这些表皮，然后进行免疫组织化学分析。
利用聚角蛋白微丝蛋白重组的单克隆抗体进行所述反应。
结果：抑制表皮细胞的分化
重建的对照表皮和用乳膏PXTS+0.1％ AK205，乳膏PXTS+0.5％AK205和细胞冻干粉剂(地中海小兰花)处理的表皮的比较观测显示了聚角蛋白微丝蛋白在颗粒层标记强度的差异(参见图3)。
实际上，在生理条件下，用如下制剂处理获得如下结果：
-乳膏PXTS+0.1％ AK205：诱导表皮分化的净减少，与未处理的对照相比显示标记的聚角蛋白微丝蛋白的净减少，
-乳膏PXTS+0.5％ AK205：诱导表皮分化的净减少，与未处理的对照相比显示标记的聚角蛋白微丝蛋白的净减少，
-细胞冻干粉剂(地中海小兰花)：诱导表皮分化的净减少，与未处理的对照相比显示标记的聚角蛋白微丝蛋白的净减少。
3.表皮基底细胞层细胞增殖活性的研究
方案
将人源化的角质细胞接种在限定(改性的MCDB 153)以及补料培养基中的0.63cm2的聚碳酸酯滤膜上。在空气/液体界面培养细胞14天，每隔一天更换生长培养基。
从培养的第17天将由此形成的表皮用于进行研究。
通过免疫组化标记揭示产品的活性
产品与表皮接触24小时之后一式三份进行分析：
批次1：不接受任何产品的阴性对照表皮
批次2：接受乳膏PXTS+0.1％ AK205处理的表皮
批次3：接受乳膏PXTS+0.5％ AK205处理的表皮
批次4：接受细胞冻干粉剂处理(地中海小兰花)的表皮。
将不接受任何产品的对照表皮和接受所检验的产品24小时接触时间的处理的表皮固定在10％的甲醛中。在石蜡块中包埋后，切割这些表皮并通过免疫组织化学处理。
利用核抗原KI-67的重组肽，抗体MIB1(Immunotech)进行反应。
由热预处理对抗原解掩蔽后由过氧化物酶-抗过氧化物酶方法进行所述的揭示。
用色蛋白DAB标记显示在下列各细胞周期的时期表达的生长的细胞级分核位点KI-67的褐色
＝＞G1和S＝潜伏期和细胞合成期
＝＞G2＝细胞组分的两分期
＝＞M＝有丝分裂期
通过计算着色的核位点，通过放大×250的光学显微镜与对照表皮载玻片相比每载玻片10个视野的比率，有丝分裂指数被评价为6。
结果：表皮细胞增殖的刺激。
结果概括在下表中：
  由显微镜观察到的每个计数的视野着色的核的平均值
  对照   7±2
  乳膏PXTS+0.1％ AK205   8±2
  乳膏PXTS+0.5％ AK205   12±2
  细胞冻干粉剂   14±3
免疫组化处理后，所有样品的褐色核位点的计数显示：
-乳膏PXTS+0.1％ AK205：诱导基底层细胞较不显著的增殖。着色的核位点的数目与未处理的对照相当(参见图4)。
-乳膏PXTS+0.5％ AK205：与未处理的对照相比诱导基底层细胞较不显著的增殖。着色的核位点的数目比未处理的对照要多(参见图4)。
-细胞冻干粉剂(地中海小兰花)：与未处理的对照相比诱导基底层细胞显著的增殖。着色的核位点的数目比未处理的对照要多得多(参见图4)。

Claims (16)

1.至少一种去分化植物细胞的冻干粉剂在化妆品或药物组合物中的应用，所述冻干粉剂可以脱色素和/或亮白从而保护以及再生表皮。
2.根据权利要求1的应用，其中去分化的植物细胞获自体外培养。
3.根据权利要求2的应用，其中由体外培养获得的去分化的植物细胞是细胞系。
4.根据权利要求1至3任一项的应用，其中去分化的植物细胞是嗜盐植物细胞。
5.根据权利要求4的应用，其中的嗜盐植物是地中海小兰花(Criste Marine)。
6.根据权利要求1至5任一项的应用，其中冻干粉剂通过阻断酪氨酸酶活性使表皮脱色素和/或亮白。
7.根据权利要求1至5任一项的应用，其中冻干粉剂通过抗-自由基作用保护表皮。
8.根据权利要求1至5任一项的应用，其中冻干粉剂通过对表皮基底层细胞增殖的刺激作用使表皮再生。
9.根据权利要求1至5任一项的应用，其中冻干粉剂通过对表皮分化的抑制作用再生表皮。
10.表皮施用的化妆品或药物组合物，其中在生理可以接受的基质中含有至少一种权利要求1至9任一项所述的冻干粉剂。
11.表皮施用的化妆品或药物组合物，其中在生理可以接受的基质中含有0.05％至2％的至少一种权利要求1至9任一项所述的冻干粉剂。
12.表皮施用的化妆品或药物组合物，其中在生理可以接受的基质中含有0.1％至1％的至少一种权利要求1至9任一项所述的冻干粉剂。
13.表皮施用的化妆品或药物组合物，其中在生理可以接受的基质中含有0.5％的至少一种权利要求1至9任一项所述的冻干粉剂。
14.权利要求10至13任一项的组合物，用于皮肤外表的嫩化。
15.权利要求10至13任一项的组合物，用于色素斑点的处理。
16.权利要求10至13任一项的组合物，用于黑人或亚洲人皮肤的亮白。
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