CN1939254A - 黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤用化妆品及其制法，它是由黄芪甲苷，油质原料和乳化剂，碱剂，保湿剂，抗氧剂，防腐剂，香精，水按一定比例所制成，其制法是将油质原料和乳化剂加热时加入黄芪甲苷搅匀，然后将碱剂、保湿剂、防腐剂和水混合搅拌加热溶解、灭菌，最后将油、水二相成分混合搅拌乳化，加入香精制成油/水型护肤膏剂或水/油型护肤霜剂；经药理试验表明，使用黄芪甲苷后，表皮细胞增生活跃，表皮处于快速更新状态，表皮的蛋白合成和营养交换作用加强，能明显提高表皮角朊细胞能量代谢水平，能明显提高老年小鼠皮肤SOD活性，明显降低老年小鼠皮肤脂褐素的含量，综上所述，将黄芪甲苷制成护肤化妆品对抗皮肤衰老具有较强的防治作用。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种护肤化妆品及其制法，具体地说是涉及一种黄芪甲苷的抗皮肤衰老护肤化妆品及其制备方法。
二、背景技术
由于皮肤暴露于体外，因而在老化中表现得最为明显，预防和延缓皮肤衰老已成为医学科学研究的热点之一。现已明确皮肤衰老是内源性因素和外源性因素共同作用的结果，内源性衰老(自然衰老)为不可避免的渐进过程，外源性衰老(如风、光、热、烟、化学物质等)中以紫外线作用(光衰老)最为明显。国内外学者对皮肤自然衰老和光衰老的组织细胞学改变、分子遗传机理以及临床治疗都作了深入的研究对皮肤衰老的治疗主要包括两个方面：即药物疗法和外科手术。药物治疗皮肤衰老的效果在幼年明显好于成年，目前已经应用的有维甲酸(RA)、α-羟基酸(AHAs)及抗氧剂，尤其是全反式维甲酸的治疗效果已在临床、病理学、组织学以及分子水平得到明确证实；相对而言手术治疗在成人中疗效更明显，主要方法有充填疗法、化学剥脱、皮肤消磨术、激光重建等；中草药有效成分抗皮肤衰老作用表现在可明显促进皮肤角月元细胞DNA、蛋白质以及成纤维细胞的胶原和弹性蛋白的合成，并在适当浓度下有较强的抗氧自由基能力，增强细胞内SOD活性；由于紫外线照射还可引起真皮层炎症细胞增加，局部应用抗炎药也有抗衰老作用(甲硝唑)；此外，褪黑素、激素和雌激素等亦有相关报道.
中医理论认为，皮肤衰老以及整个机体衰老的直接原因是五脏虚损、气血失调。研究发现，许多中药含有各种氨基酸、脂类、多糖、果胶、维生素、微量元素、有机酸、生物碱、皂苷等多种成分，具有清除体内自由基，增强机体抗氧化能力，改善皮肤微循环，提高皮肤胶原纤维及胶原蛋白含量，调节免疫功能等作用。如人参、黄芪、茯苓、珍珠、白芷、红花等中药均具有养颜防衰、祛斑防晒、除皱增白的作用。
黄芪为扶正固本，补气生阳之中药，具有抗衰老的作用。近年来的科学研究证实，黄芪水煎剂可使人胎肾细胞和地鼠及小鼠肾细胞体外寿命延长一倍，并可使活细胞数明显增多。黄芪还可延长人胎肺二倍体细胞的传代数，并且延长每代细胞的维持时间。此外，黄芪还能提高果蝇的平均寿命，使家蚕的生存时限显著延长。但是黄芪的组成相当复杂，含有多糖、氨基酸、苷类及多种微量元素等成分，而长期以来，关于黄芪的活性成分对其抗衰老作用的影响，缺少系统的实验研究，黄芪甲苷是从黄芪中提取出来的一种单体化合物，经检索，至今尚未见报导黄芪甲苷有抗皮肤衰老的作用.
本发明的目的在于提供一种黄芪甲苷黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤用化妆品及其制备方法
1982年，本课题组成功地从黄芪中提取出了有效活性成分黄芪甲苷(Astragaloside IV，简称AGS-IV)。十多年来，通过大量的实验研究证实，AGS-IV具有抗生物氧化作用，并可促进小鼠肝脏蛋白质合成及再生肝DNA合成，对干扰素、自然杀伤细胞白细胞介素系统有免疫调节作用，能明显促进小鼠淋巴结B淋巴细胞增殖分化和巨噬细胞的吞噬功能，刺激和维持小鼠腹腔巨噬细胞的生长，诱生干扰素，对各种伤害子(低温、高温、60Co照射、缺氧等)有非特异性增强抵抗力作用。尽管机体衰老的机理十分复杂，但目前已形成几种比较成熟的学说，如自由基学说，免疫功能下降学说。因此黄芪甲苷具有的上述作用提示黄芪的抗衰老作用可能与黄芪甲苷有关。
随着细胞生物学和分子生物学的发展，生命科学的研究已从整体动物、离体器官和组织水平向细胞和分子水平方向发展，衰老的研究也不例外。体外培养细胞的衰老试验是一种离体的纵向研究，它排除了个体遗传异质性的影响，人工合成培养基的应用更使实验条件比较固定，避免了体内各种复杂因素的干扰，细胞培养还可观察到药物对细胞的直接作用并可借助显微镜直接观察药物对活细胞影响的动态过程，可节约动物及药品，提高效率。皮肤作为人体的屏障，其衰老易于察觉，皮肤是估计机体年龄的第一个指标，而且人体皮肤取材方便，避免了种属差异的影响，因此皮肤是研究离体细胞衰老的极好材料。本课题主要通过人体皮肤表皮角朊细胞的培养，结合动物实验，综合细胞化学、生物化学等方法和借助流式细胞仪、电子显微镜等先进仪器对黄芪甲苷对皮肤衰老的影响及其机制作了研究，以期在细胞和分子水平上阐明中药黄芪抗衰老的科学内涵，为发展黄芪甲苷成为抗老化新药提供理论基础和实验依据。
黄芪甲苷是从黄芪中提取出来的一种单体化合物，其化学结构式如下：
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤用化妆品及其制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的；
一种黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品，其特征在于该化妆品由下列重量配比的原料药所制成：
黄芪甲苷(或黄芪总苷) 0.0001-0.03％(0.0016-0.05％)
油质原料和乳化剂 10-70％
碱剂 0.2-2％
保湿剂 5-21％
抗氧剂 0.0005％-0.2％
防腐剂 0.1-0.2％
香精 0.5-1.5％
精制水 20-80％
上述的油质原料和乳化剂包括：
硬脂酸，棕榈酸异丙酯，硬脂酸单甘油脂，十六醇，十八醇，白油，茶油，花油，椰子油，貂油，杏仁油，橄榄油，羊毛酯，凡士林，蜂蜡，液体及固体石蜡，失水山梨醇单油酸酯(Span80)，斯盘-60(Span 60)，失水山梨醇单棕榈酸酯(Span20)，聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物(AtlasG-1704)，聚氧乙烯羊毛脂衍生物(AtlasG-1790)，聚氧乙烯油醇(AtlasG-3920)，聚氧乙烯醚(AtlasG-3930)，吐温-60，聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(Tween 80)；
上述的碱剂为：氢氧化钠，氢氧化钾，三乙醇胺，硼砂等.
上述的保湿剂为：甘油，丙二醇，1，3-丁二醇，聚乙二醇，山梨酸，卵磷酯或由其制得的脂质体，透明质酸，或吡咯烷酮羧酸钠.
上述的抗氧剂有：二羟基酚，愈创木酚，没食子酸及其丙酯与戊酯，2，5-二叔丁基甲酚、2，5-二叔丁基对苯二酚、愈创树脂、去甲二氢愈创酸，抗坏血酸、乙二胺四乙酸(EDTA)或维生素E.
上述的防腐剂为：对羟基苯甲酸酯类有尼泊金甲酯，尼泊金乙酯，尼泊金丙酯，尼泊金丁酯；其它有凯松，苯扎溴铵或苯扎氯铵。
黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品的制备方法，，其制备步骤为：
按处方定量比例的油质原料和乳化剂加热至70-90℃时加入黄芪甲苷搅拌均匀，使黄芪甲苷全部溶解，备用；然后将按处方定量比例的碱剂，保湿剂，防腐剂和水混合，不断搅拌加热至70℃-90℃，搅拌均匀至全部溶解，经维持20min灭菌后备用，最后将上述备用的二相成分相混，搅拌乳化，至45-50℃时加入香精和抗氧剂，搅拌均匀，静置过夜再经匀质器(三滚机或胶体磨)均匀后，脱气，检验合格后，即可制成油/水型护肤膏剂或水/油型护肤霜剂.
通过人体皮肤表皮角朊细胞的培养，结合动物实验，综合细胞化学、生物化学等方法和借助流式细胞仪、电子显微镜等先进仪器对黄芪甲苷对皮肤衰老的影响及其机理进行研究.结果表明：：
1/.黄芪甲苷对培养的人皮肤组织块生长寿及超微结构的影响研究证明：能明显提高由培养的人皮肤组织块长出的表皮细胞的生长速度和培养寿命，并呈剂量依赖关系，其延长寿命作用对老年供体更明显。皮肤组织块进行透射电镜观察，表明，用药后(1)表皮细胞增生活跃；(2)表皮处于快速更新状态；(3)表皮的蛋白合成和营养交换作用加强。
2/.黄芪甲苷对培养的人表皮角朊细胞(KC)有明显的剂量有关的增殖作用。明显提高表皮角朊细胞能量代谢水平，抑制表皮角朊细胞腺苷酸环化酶活性，促进表皮细胞增殖；明显提高表皮角朊细胞S期比例和增殖指数(PI)。
3/.黄芪甲苷对老年小鼠抗皮肤生物氧化的作用研究证明：黄芪甲苷能明显降低表皮角朊细胞内丙二醛(MDA)含量，明显提高老年小鼠皮肤SOD活性，明显降低老年小鼠皮肤脂褐素的含量。
从以上实验研究的结果，可以看出本发明具有以下优点：
(1)本发明的黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品的药理效果好，作用强，；对已知黄芪甲苷发现了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，
(2)本发明有关黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤用化妆品的制备工艺简单，生产操作方便，从而有利于工业化生产，预示着有良好的应用前景，
四、具体实施方式
实施例1.
A：
精制水 72.0％
甘油 8.0％
氢氧化钾 0.5％
B：
硬脂酸 14.0％
硬脂酸单甘油酯 1.5％
十八醇 1.5％
甘油 1.85％
C：黄芪甲苷 0.0004％
D：尼泊金丁酯 0.2％
E：二叔丁基甲酚 0.02％
F：香精 0.5％
制法：先将B项(硬脂酸，硬脂酸单甘油酯，甘油，十八醇)按处方混合搅拌，加入黄芪甲苷在B相中充分溶解，A相(精制水，甘油，氢氧化钾)也按各组分比例混合搅拌；A相和B相分别加热至90℃；然后将A相缓缓加入B相中继续搅拌乳化。待温度降至45℃时，按组分加入D(尼泊金丁酯)，E(二叔丁基甲酚)和F(香精)，并使混合均匀，放置24h后分装，制成的护肤膏剂略呈弱碱性.
实施例2.
A：白油 29.0％
凡士林 7.0％
蜂蜡 8.0％
羊毛脂 10.0％
斯盘-60(Span-60) 2.0％
吐温-60(Twin-60) 3.0％
吡咯烷酮羧酸钠 1％
B：精制水 32.0％
硼砂 0.7％
尼泊金甲酯 0.15％
C：黄芪甲苷 0.005％
D：没食子酸丙脂 0.05％
E：香精 0.8％
制法：将A项中的白油，凡士林，蜂蜡，羊毛脂，斯盘-60，吐温-60，吡咯烷酮羧酸钠按各组分置于乳化器中混合，、加热至80-90℃，使其搅拌混匀，在搅拌下将组成量的黄芪甲苷加入使其充分溶解.将B相中的硼砂，尼泊金甲酯，在精制水中混合搅拌，溶解；然后将A，B两相进行搅拌乳化.当温度降至45℃时加入D(没食子酸丙脂)和E(香精)，搅拌均匀即成护肤霜剂。
实施例3.
A：硬脂酸 6％
棕榈酸异丙酯 6％
聚氧乙烯月桂醚 4％
白凡士林 6％
液体石蜡 8.4％
聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯 4.4％
B：甘油 20％
精制水 33％
尼泊金乙酯 0.2％
山梨酸 0.2％
C：黄芪甲苷 0.005％
D：去甲二氢愈创酸， 0.01％
F：香精 0.7％
制法：
取处方量A相的硬脂酸、棕榈酸异丙酯、聚氧乙烯月桂醚先研磨均匀再加入白凡士林、液体石蜡，聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯加热75℃搅拌混匀，再加入黄芪甲苷加热在75℃下继续搅拌至均匀体；在75℃下，取处方量B相的的甘油，尼泊金乙酯，和山梨酸和水搅拌混匀，当温度降至45℃时再加入组分的香精，搅拌均匀即成护肤膏剂。
实施例4.
A：十六醇 10％
硬酯酸 4％
橄榄油 5％
白油 23％
羊毛脂 11％
聚氧乙烯油醇 6％
B：三乙醇胺 2％
精制水 36.2％
尼泊金乙酯 0.18％
凯松， 0.05％
C：黄芪总苷 0.03％
D：维生素E 0.1％
D：香精 1％
制法：
取处方量A相的硬脂酸、十六醇，聚氧乙烯油醇，橄榄油，白油，羊毛脂，加热80℃搅拌混匀，再加入黄芪总苷加热在80℃下继续搅拌至均匀体；在80℃下，取处方量B相的三乙醇胺，凯松，尼泊金乙酯，和水搅拌混匀，当温度降至45℃时再加入组分的维生素E和香精，搅拌均匀即成护肤霜剂。
实施例5.黄芪甲苷对培养的人皮肤组织块生长寿及超微结构的影响
1材料和方法
1.1材料
1.1.1药品与试剂：黄芪甲苷(Astragaloside IV，简称AGS-IV)从山东膜荚黄芪(Astragalus membranaceus Bge)根中提取，由我校化学教研室提供，经薄层、红外、质谱鉴定其化学结构符合文献报道。黄芪甲苷为白色粉末状，脂溶性，由含0.05％二甲基亚砜(DMSO)的DMEM培养液配制成溶液，0.22μm滤膜无菌过滤，4℃保存。
1.1.2.培养基：DMEM(GIBCO，U.S.A)，内含20％小牛血清(上海第二医科大学科技实验中心二室)，10ng/ml表皮生长因子(EGF，本校生化教研室提取)，10μg/ml胰岛素(徐州生化制药厂)，0.4μg/ml氢化可的松(扬州制药厂)，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素。
1.1.3.其它试剂：无钙镁Hank液(简称D-Hank液)，每1000ml液体含NaCl8.0g，KCl0.4g，Na2PO4·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g。
1.1.4.仪器和设备：细胞培养室常规设备，H-3000型透射电镜(日立公司)，目镜测微尺。
1.2.方法
1.2.1皮肤组织块的培养
取外科手术切下的正常人皮肤，供体年龄分别为24岁和72岁。将切下的皮肤立即置于含青霉素400u/ml，链霉素200μg/ml的D-Hank液中，4℃放置1小时，然后在超净工作台上用D-Hank液将皮肤漂洗二次，洗尽血迹，再用消毒手术器械将皮下组织尽可能剔净。将皮肤剪成1mm×1mm大小的组织块，均匀贴于培养瓶中，37℃培养箱静置3小时，然后分别加入DMEM培养液和加黄芪甲苷的DMEM培养液。37℃条件下继续培养，每隔4天换一次培养液。
1.2.2.皮肤电镜标本的制备
供体年龄为24岁的皮肤组织块培养35天后，分别取未加药的皮肤组织块、给予2.55μmol·L-1黄芪甲苷和1.28μmol·L-1黄芪甲苷的皮肤组织块，
立即置于4％戊二醛溶液中4℃下固定2小时，然后用pH7.4的0.1mol·L-1磷酸缓冲液反复冲洗2小时，用1％锇酸在室温下固定1小时，梯度酒精脱水，Epson 812环氧树脂包埋，切半薄切片，经H.E染色、定位后，在LKB-V型超薄切片机上切成薄片，H-3000型透射电镜下观察及摄影。
1.2.3.组织块生长速度的记录
待皮肤组织块四周生长出表皮细胞生长晕后，在生长晕最外缘取不同方向的四点，用经过校准的目镜测微尺(1格＝10.1μm)量取各点与组织块外缘的垂直距
离，求出平均值，即为该组织块生长晕的大小尺寸。每实验组测定8块组织块的生长晕，求得平均值，即为该实验组组织块平均生长晕大小。
1.2.4..表皮细胞寿命的记录
以生长晕中出现空洞，细胞开始脱落为衰老的标志。每组记录8块组织块的细胞寿命，其平均值即为该实验组细胞的平均寿命．
2.统计学分析：
定量指标均以x±s表示，各用药组与对照组之间以t检验进行显著性检验，对方差不齐者，采用t’检验。
3.结果
3.1.黄芪甲苷对人皮肤组织块表皮细胞生长及寿命的作用：
来自于年青供体的皮肤组织块接种以后，第5天表皮细胞开始从组织块周围萌出，第10天用药组和对照组生长晕大小并无显著区别。第12天，2.55μmol·L-1黄芪甲苷组的细胞生长晕开始明显大于对照组，至培养第20天，黄芪甲苷的三个剂量组的细胞生长晕大小与对照组均有显著差异，并呈剂量反应关系，以2.55μmol·L-1黄芪甲苷对表皮细胞生长的促进作用最强，0.64μmol·L-1黄芪甲苷作用最弱(见表1，)。
至培养第35天左右，对照组表皮细胞生长晕最外缘表皮细胞细胞核消失，出现角化现象，生长晕内部细胞胞浆颗粒增多，细胞之间境界模糊，生长晕出现空洞，培养液中有不少脱落细胞，其平均寿命为38.25天。而加药组的细胞生长晕仍继续增大，细胞形态完好，细胞之间境界清晰，细胞排列紧密如铺路石子状。至培养第45天左右，0.64μmol·L-1黄芪甲苷作用的细胞生长晕开始出现上述老化现象，其平均寿命为45.88天。而2.55μmol·L-1和1.28μmol·L-1黄芪甲苷作用的皮肤组织块表皮生长晕则继续增大，并分别在第45天与第50天与相邻组织块的生长晕融合，长成片状，这两个用药组的最终平均寿命分别为67.38天和60天。与对照组相比，0.64μmol·L-1、1.28μmol·L-1和2.55μmol·L-1黄芪甲苷作用的皮肤组织块平均寿命分别延长19.9％，56.9％和76.2％(见表2A)。来自于年老供体的皮肤组织块接种之后，第10天表皮细胞开始从组织块周围萌出，前16天用药组和对照组相比生长晕大小无显著差别。第20天以后，用药组的生长晕明显大于对照组。与对年青供体的作用一样，黄芪甲苷对年老供体的表皮细胞生长晕大小也呈剂量反应关系，并以2.55μmol·L-1黄芪甲苷促进生长作用最强。(见表1B，)至培养第25天左右，对照组的生长晕表皮细胞出现明显的老化表现，其平均寿命为25.5天。而2.55μmol·L-1、1.28μmol·L-1和0.64μmol·L-1黄芪甲苷的三个剂量组的平均寿命分别为59.38天、48.25天和37.63天，其延寿率分别为132.9％，89.2％和47.6％(见表2B)。
3.2.黄芪甲苷对培养的人皮肤组织块超微结构的影响：
供体年龄为24岁的皮肤组织块培养35天后作电镜标本观察，用药组与对照组超微结构有明显差异，而两种不同剂量的用药组的超微结构无明显差别。电镜下见对照组表皮明显变薄，细胞层次少，表真皮交界处相对平坦；基底细胞核仁不明显，细胞侧面见较多桥粒)；棘细胞胞浆中有许多粗大的张力原纤维束，并通过
许多桥粒与周围细胞连接，颗粒细胞中还可见较多的电子致密，形状不规则的透明角质颗粒。而用药组表皮较厚，细胞层次多，可见基底细胞明显增生，不少细胞内可见两个核仁，表真皮交界处呈波浪状；基底细胞的核仁明显，细胞侧面桥粒少；棘细胞张力原纤维束比较细小，细胞间桥粒少，颗粒细胞中透明角质颗粒不多。
4.讨论
黄芪甲苷对年青供体和年老供体都能明显促进表皮细胞的生长，并延长其寿命，说明黄芪甲苷有明显的预防细胞衰老和抗细胞衰老的作用。我们在实验中还发现，黄芪甲苷对年老皮肤的延寿率较长，如2.55μmol·L-1黄芪甲苷能使年老皮肤表皮细胞寿命延长133％，而对年青皮肤表皮细胞寿命只延长76％.。在体外衰老的情况下，表真皮交界面也变得相对平坦，在表皮角化的过程中，基底细胞不断向上移行形成角质细胞，张力原纤维逐渐增多并成束，透明角质颗粒变大增多。。黄芪甲苷组的表真皮交界处呈波浪状；表皮较厚，细胞层次多，可见基底细胞明显增生，说明表皮处于一种更新状态，因而表皮各层细胞相对比较幼稚。黄芪甲苷组细胞核仁清晰，有不少细胞出现两个核仁，核仁的主要功能是合成rRNA和组装核糖核蛋白体亚单位，与蛋白质合成关系密切，因此用药后，表皮细胞的蛋白合成作用也可能增强。黄芪甲苷组细胞侧面桥粒少；桥粒对表皮细胞主要起支持及保持相互位置的作用，在表皮更新的过程中，桥粒可以分离，用药组桥粒的减少也从一个侧面说明表皮处于活跃的快速更新状态。表现在棘细胞中张力原纤维束比较细小，不如对照组稠密，颗粒细胞中透明角质颗粒相对较少。基底细胞是表皮的干细胞，具有很强的分裂能力，这可能也是用药后表皮细胞生长速度较快的原因。
表1 黄芪甲苷对培养的人表皮细胞生长速度的影响 (x±s，n＝8)
表1A 供体年龄24岁
| 组别 | 培养后不同天数的生长晕(格，1格＝10.1μm) | ||||||||
| 8 | 12 | 16 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | |
| 对照组2.55μmol·L-1黄芪甲苷组1.28μmol·L-1黄芪甲苷组0.64μmol·L-1黄芪甲苷组 | 10.25±3.5412.25±4.5011.63±4.7510.88±3.76 | 46.88±7.1055.5±6.26*54.38±7.2349.63±7.42 | 60±7.0388.13±9.33**79.25±8.88**67±6.52 | 68.38±8.35111.88±10.95**95.25±8.17**82.25±8.32** | 78±5.38140.88±11.17**117±13.11**96.63±8.35** | 88.13±10.67177.5±12.25**134.38±10.16**113.63±8.53** | 83.5±12.73203.75±14.08**158.75±14.58**126.25±10.61** | 245.88±10.34196.25±14.08136.5±8.59 | +237.88±13.05129.25±13.21 |
与对照组比较：*P＜0.05：**P＜0.01。-：细胞衰老；+：生长晕相互融合。
表1B 供体年龄72岁
| 组别 | 培养后不同天数的生长晕(格，1格＝10.1μm) | ||||||||||
| 12 | 16 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | |
| 对照组2.55μmol·L-1黄芪甲苷组1.28μmol·L-1黄芪甲苷组0.64μmol·L-1黄芪甲苷组 | 14.50±4.9013.5±5.9312.38±4.3712.25±4.68 | 34.63±7.1537.25±7.1740.13±8.8136.88±5.59 | 53.75±6.3778.63±7.41**69.25±6.86**60±8.43 | 52.63±7.05102.5±12.25**90±8.85**75.88±7.32** | 139.63±10.06113.63±11.67100.13±9.33 | 177.88±10.30134.88±11.28111.13±6.73 | 204.75±13.86145.88±10.71106.63±7.41 | 204.38±13.28160.63±9.68 | 276.38±10.73150±6.74 | 282.5±11.34 | 277.38±12.89 |
与对照组比较：**P＜0.01。-：细胞衰老。
表2 黄芪甲苷(黄芪甲苷)对培养的人表皮细胞平均寿命的影响
A.供体年龄24岁
| 组别 | 平均寿命(天)(x±s，n＝8) | 延寿率(％) |
| 对照组2.55μmol·L-1黄芪甲苷组1.28μmol·L-1黄芪甲苷组0.64μmol·L-1黄芪甲苷组 | 38.25±4.6267.38±6.32**60.00±4.57**45.88±3.91** | 76.256.919.9 |
与对照组比较，**P＜0.01。
B.供体年龄72岁
| 组别 | 平均寿命(天)(x±s，n＝8) | 延寿率(％) |
| 对照组2.55μmol·L-1黄芪甲苷组1.28μmol·L-1黄芪甲苷组0.64μmol·L-1黄芪甲苷组 | 25.50±3.0759.38±3.11**48.25±3.50**37.63±3.58** | 132.989.247.6 |
与对照组比较，**P＜0.01。
实施例6.黄芪甲苷对培养的人表皮角朊细胞的增殖作用及其机理
1.材料和方法
1.1.材料
1.1.1.药品：黄芪甲苷(Astragaloside IV，简称AGS-IV)从山东膜荚黄芪(Astragalus membranaceus Bge)根中提取，由我校化学教研室提供，经薄层、红外、质谱鉴定其化学结构符合文献报道。黄芪甲苷为白色粉末状，脂溶性，由含0.05％二甲基亚砜(DMSO)的DMEM培养液配制成溶液，0.22μm滤膜无菌过滤，4℃保存。
1.1.2.培养基：DMEM(GIBCO，U.S.A)，内含20％小牛血清(上海第二医科大学科技实验中心二室)，10ng/ml表皮生长因子(EGF，本校生化教研室提取)，10μg/ml胰岛素(徐州生化制药厂)，0.4μg/ml氢化可的松(扬州制药厂)，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素。
1.1.3.其它试剂：无钙镁Hank液(简称D-Hank液)，每1000ml液体含NaCl8.0g，KCl0.4g，Na2PO4·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g。胰蛋白酶(Difco进口分装)，MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2yl)2，5diphenyltetrazolium bromide，Fluka公司]，碘化丙啶染色剂(Sigma)，RNA酶(进口分装)，其它试剂均为国产分析纯。
1.1.4.仪器和设备：细胞培养室常规设备，96孔细胞培养板，12孔细胞培养板(Corning)，DG-3022A酶标仪(华东电子管厂，南京)，FACScan流式细胞仪(B.D.公司，U.S.A)。
1.1.5.标本：皮肤来源于外科门诊包皮环切术所切除的正常皮肤，供体年龄在24-28岁之间。
1.2..方法
1.2.1.表皮角朊细胞的培养
根据Liu及马圣清所建立的方法并加以少许改动。外科手术切下的包皮立即放入含青霉素400u/ml，链霉素200μg/ml的D-Hank液中，4℃放置1小时，取出皮片在超净工作台上用D-Hank液漂洗2次，洗尽血迹，再用消毒手术器械将皮下组织尽可能剔净。将皮肤剪成长条状平贴于玻璃平皿中，加入0.3％胰蛋白酶消化(加入量一般为10ml/6cm2皮肤组织)，盖上玻盖，4℃消化16-20小时，次日取出皮片用D-Hank液洗两次后置于已加入DMEM培养液的平皿中，无菌镊轻轻揭下表皮，尖吸管轻轻吹打，使表皮角朊细胞游离至培养液中，200目不锈钢网过滤去残渣，再用培养液洗一次，制成细胞悬液以备接种。接种的细胞培养板预先覆以胶原膜以提高细胞贴壁率，胶原由大鼠尾腱制得，胶原膜的覆盖参照Liu的方法。细胞接种后置于含5％CO2的孵箱中37℃条件下培养，每3天换一次培养液。
1.2.2细胞生长曲线的测定：
将制得的KC悬液接种于预先覆有胶原膜的96孔细胞培养板中，接种密度为5×105/ml，每孔接种100μl。于接种后第二天，待原代培养的KC贴壁并形成细胞集落后换去原培养液，随机分为5组，分别换入未加药的DMEM培养液和黄芪甲苷浓度分别为2.55μmol·L-1、1.28μmol·L-1和0.64μmol·L-1的DMEM培养液及含4×10-4mol·L-1的L-丝氨酸(阳性对照)的DMEM培养液，连续培养
15天。分别在培养的第3、5、8、10、12、15天计数各组的细胞数，每组计数3孔，取两次独立实验的结果计算平均值，以各组细胞数的均数绘制细胞生长曲线。
1.2.3.MTT法检测细胞的活性
在原代培养的第3、5、8、10、12、15天对各组进行细胞计数的同时，用MTT法进行细胞活性的检测。检测方法参照Mosmann的方法略加改进。在加入MTT前弃去原培养液，每孔换以100μl不含小牛血清的DMEM培养液，再加入10μl 5mg/ml的MTT(用PBS溶解，无菌过滤，4℃避光保存)，继续培养4小时后，加入含0.04N HCl的异丙醇100μl中止反应，充分混匀，待紫色结晶全部溶解后，在酶标仪上570nm处读取各孔的O.D.值。每实验组测6个复孔，以两次独立实验的结果计算各组的平均值。
1.2.4.细胞腺苷酸环化酶活性的观察：
将制得的表皮角朊细胞悬液以5×105个细胞/ml接种于覆有胶原膜的12孔细胞培养板中，每孔接种1ml细胞悬液进行原代培养。实验分为未加药对照组和黄芪甲苷浓度分别为2.55μmol·L-1、1.28μmol·L-1和0.64μmol·L-1的用药组，每组3个复孔。培养第10天弃去各孔中培养液，用1％戊二醛固定细胞2分钟，继以pH7.4的二甲砷酸缓冲液洗涤细胞2次，共计1小时，然后加入孵育液(含ATP0.5mmol·L-1，硫酸镁4mmol·L-1，茶碱2mmol·L-1，硝酸铅4.8mmol·L-1，葡萄糖8％)37℃作用1小时后，用4℃双蒸水冲洗2次，共5分钟，再滴入5％硫化铵。水洗后，倒置显微镜下观察沉积于细胞膜周围的硫化铅黑色沉淀，即为腺昔酸环化酶的活性部位，比较各组颜色的深浅并摄影。
1.2.5..流式细胞分析法检测细胞DNA的含量
1.2.5.1.样品制备：将制得的KC悬液以5×105个细胞/ml接种于覆有胶原膜的12孔细胞培养板中，每孔接种1ml细胞悬液进行原代培养。实验分为对照组(每组6孔)和2.55μmol·L-1黄芪甲苷组(每组5孔)，置于含5％CO2孵箱中37℃条件下培养。培养至第6天，用1％EDTA-0.3％胰蛋白酶37℃消化7-10分钟，加入培养液吹打得单细胞悬液，1500rpm离心5分钟，倾去上清液，PBS洗一次后用含70％的-20℃乙醇固定，放-20℃保存。临测前，细胞经1％RNAase在37℃下处理10分钟并将细胞数目调整为106/ml，然后在室温下用0.01％碘化乙啶染色20分钟，350目尼龙网过滤后待测。
1.2.5.2.流式细胞术分析：样品经制备和染色后，以FACScan流式细胞仪分析单个细胞DNA含量。该机配有检测波长488nm的氩离子激光器对每个样品检测平均10000个细胞的DNA含量，收集的信息经Cellfit Cell-cycle Analysis专用分析程序处理后得出DNA含量分布的直方图和细胞周期中G0/1期、S期和G2+M期占整个细胞周期的百分比，并由此得出S期组分(SPF)和增殖指数(PI)以判断增殖活性的高低。SPF是S期细胞占整个细胞周期的百分比，PI＝S+G2+M/G0/1+S+G2+M×100％。
2.统计学分析：
定量指标均以x±s表示，各用药组与对照组之间以t检验进行显著性检验，对方差不齐者，采用t’检验。
3.结果
3.1.药物对原代表皮角朊细胞生长的影响
Liu及马圣清等指出，原代表皮角朊细胞在体外培养时，可分为不同阶段，细胞接种后至培养第5天为延缓期(lag phase)，此期贴壁细胞数减少；培养一周前后至第15天为对数生长期(growth phase)，贴壁细胞数迅速增多，至两周左右汇成单层。本实验资料符合上述情况。加药后，延缓期的时间并未缩短，药物产生的细胞增殖作用发生在对数生长期，在0.64μmol·L-1-2.55μmol·L-1范围内，黄芪甲苷均有增殖作用，以2.55μmol·L-1黄芪甲苷的作用最强，呈剂量依赖关系。至培养第15天，对照组细胞密度是接种密度的3.04倍，2.55μmol·L-1、1.28μmol·L-1和0.64μmol·L-1黄芪甲苷则分别是接种密度的4.42倍，3.94倍和3.5倍。阳性对照L-丝氨酸对KC的增殖作用稍强于2.55μmol·L-1黄芪甲苷(培养至第15天，两组细胞数比较，0.01＜P＜0.05)，其最大细胞密度是接种密度的4.84倍(见表3)。
3.2.药物对MTT法检测细胞活性的影响
MTT测定法是依靠线粒体琥珀酸脱氢酶催化MTT形成蓝色甲的多少来检测活细胞数和功能状态。加药组的光密度值比对照组显著增高，反映黄芪甲苷能明显提高细胞活性。各用药组以2.55μmol·L-1黄芪甲苷的作用最强，但其作用略弱于L-Serine(见表4，)。与同时进行的细胞计数比较，药物对细胞活性的影响要早于其增殖作用出现时间。
3.3.药物对细胞腺苷酸环化酶活性的影响
在倒置显微镜下观察，沉积于细胞膜周围的黑色沉淀即为腺苷酸环化酶的活性部位，颜色深浅即代表活性的高低。结果显示，对照组细胞颜色较深，酶活性高。加药组细胞颜色较浅，酶活性相对较低，以2.55μmol·L-1黄芪甲苷组细胞颜色最浅，1.28μmol·L-1黄芪甲苷组次之，0.64μmol·L-1黄芪甲苷组颜色深浅与对照组差别不大。
3.4.药物对细胞DNA含量的影响
通过流式细胞仪对每个样本检测平均1万个细胞，经计算机分析后，得出DNA含量分布的直方图，其横坐标为荧光道数，代表细胞DNA含量，纵坐标为相对细胞数。从图中可见，与对照组相比，加药组的G0/1峰降低，而S峰显著增高。加药组与对照组的细胞周期各时相百分比例分析表明，用药后G0/1期细胞比例由51.23％降至24.94％，S期组分则由36.27％升至64.96％，增殖指数由48.78％升至75.04％，表示用药后细胞的增殖活性明显提高(见表5)。
4.讨论
原代表皮角朊细胞在体外培养至培养第15天，对照组细胞密度是接种密度的3.04倍，2.55μmol·L-1、1.28μmol·L-1和0.64μmol·L-1黄芪甲苷则分别是接种密度的4.42倍，3.94倍和3.5倍。表皮细胞的增殖水平在一定程度上反映了皮肤的衰老程度。衰老的皮肤表皮细胞新陈代谢减慢，新生细胞少而角化细胞多。在体外培养的表皮角朊细胞中，也观察到了细胞增殖能力与供体年龄成反比及晚代细胞增殖水平下降的现象。因此，黄芪甲苷促进表皮角朊细胞的增殖能力也是它延缓表皮细胞衰老的原因之一。
MTT比色检测法表明黄芪甲苷提高人KC的细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)活性能促进表皮细胞的糖代谢和能量产生，改善细胞的营养结构，这些都是其促进细胞增殖，延长细胞寿命的重要因素。我们在实验中还观察到，用药组使细胞SDH活性增加的作用早于其增殖作用，这表明在培养早期，用药后虽然细胞数尚未增加，但细胞内的能量代谢已相当活跃，正为细胞分裂作准备。细胞腺苷酸环化酶活性的强弱可用来估计细胞内cAMP含量的多少。cAMP是调节表皮细胞分裂的一重要物质，目前一般认为，表皮中cAMP的浓度与细胞分裂速度成反比。培养液中加入黄芪甲苷后，表皮角朊细胞腺苷酸环化酶活性的降低，说明黄芪甲苷促进表皮细胞增殖作用的机理一部分与它抑制腺苷酸环化酶的活性，进而降低细胞内cAMP含量有关。有关cAMP参与细胞增殖调控的机理，近年来的实验表明，依赖于cAMP的蛋白激酶II型的调节亚基(R)与催化亚基(C)可移位入核，进一步影响核内遗传物质。这也提示黄芪甲苷对细胞的增殖作用可能最终是通过对核内有关基因的影响而实现的，这还有待进一步研究。
应用流式细胞仪一次可以快速检测上万个细胞的DNA含量，所得信息全部由计算机处理，具有高精度，高灵敏度，自动化的优点。由于增殖细胞在开始有丝分裂前都必需倍增DNA，故检测DNA含量的变化即能明确细胞的增殖特性。一般均把S期组分(SPF)和增殖指数(PI)作为细胞增殖活性的指标。我们用流式细胞仪检测KC的DNA含量的结果表明用药组的细胞SPF和PI均显著高于对照组，说明黄芪甲苷能使表皮角朊细胞的增殖活性明显提高，这进一步证实了黄芪甲苷对皮肤角朊细胞有较强的刺激生长作用。
表3黄芪甲苷对原代培养的人表皮角朊细胞的生长刺激作用
| 组别 | 培养后各天数的细胞数(×104/ml)(*±s，n＝6) | ||||||
| 3 | 5 | 8 | 10 | 12 | 15 | 最大增殖倍数 | |
| 空白对照组2.55μmol·L-1黄芪甲苷组1.28μmol·L-1黄芪甲苷组0.64μmol·L-1黄芪甲苷组4×10-4mol·L-1L-丝氨酸组 | 43±846±845±845±647±6 | 36±438±442±638±646±4** | 61±878±9**68±5*65±690±5** | 85±8103±10**98±9*87±10125±10** | 114±13162±17**145±10**129±9*190±8** | 152±13221±13**197±15**175±11**242±6** | 3.044.423.943.54.84 |
与对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
表4 黄芪甲苷(黄芪甲苷)对MTT法检测的原代培养人表皮角朊细胞活性的影响
| 组别 | 培养后各天数的OD值(x±s，n＝6) | |||||
| 3 | 5 | 8 | 10 | 12 | 15 | |
| 空白对照组0.4133±0.01222.55μmol·L-10.49**黄芪甲苷组±0.01411.28μmol·L-10.4658**黄芪甲苷组±0.01380.64μmol·L-10.4573**黄芪甲苷组±0.01334×10-4mol·L-10.5017**L-丝氨酸组±0.0140 | 0.2667±0.01440.2767±0.01440.2642±0.00100.2633±0.01870.2908**±0.0131 | 0.255±0.01570.2925**±0.01480.275*±0.01620.2592±0.01160.3142**±0.0151 | 0.2933±0.01070.3417**±0.01190.3175**±0.01380.3042*±0.01000.3592**±0.0144 | 0.3317±0.01750.3841**±0.01440.3608**±0.01440.3450*±0.00800.4117**±0.0153 | 0.3858±0.01440.4308**±0.01510.41**±0.01540.4008*±0.01380.4608**±0.0138 | |
与对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
表5 黄芪甲苷(黄芪甲苷)对人表皮角朊细胞周期和增殖指数的影响
| 组别 | 例数 | 细胞周期各时相的百分比PI值 | |||
| G0/1 | S | G2+M | PI | ||
| 对照组48.78±3.522.55μmol·L-175.04±1.75** | 黄芪甲苷组 | 65 | 51.23±3.5224.94±1.76** | 36.27±4.1264.96±1.30** | 12.52±0.9710.46±1.75** |
与对照组比较，**P＜0.01。
实施例7黄芪甲苷抗皮肤生物氧化的作用研究
1.材料和方法
1.1..材料
1.1.1.药品：黄芪甲苷(Astragaloside IV，简称AGS-IV)从山东膜荚黄芪(Astragalus membranaceus Bge)根中提取，由我校化学教研室提供，经薄层、红外、质谱鉴定其化学结构符合文献报道。黄芪甲苷为白色粉末状，脂溶性，细胞培养用黄芪甲苷由含0.05％二甲基亚砜(DMSO)的DMEM培养液配制成溶液，0.22μm滤膜无菌过滤，4℃保存。动物实验用黄芪甲苷临用前1％羧甲基纤维素(CMC)配制成所需浓度。
1.1.2.培养基：DMEM(GIBCO，U.S.A)，内含20％小牛血清(上海第二医科大学科技实验中心二室)，10ng/ml表皮生长因子(EGF，本校生化教研室提取)，10μg/ml胰岛素(徐州生化制药厂)，0.4μg/ml氢化可的松(扬州制药厂)，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素。
1.1.3.其它试剂：无钙镁Hank液(简称D-Hank液)，每1000ml液体含NaCl8.0g，KCl0.4g，Na2PO4·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g。1，1，3，3-四甲氧基丙烷(1，1，3，3-Tetramethoxyprepan)购自Fluka公司，考马斯亮兰G-250(Fluka)，胰蛋白酶(Difco进口分装)，超氧化物歧化酶测定试剂盒(南京铁道医学院建成生物工程研究所)，硫代巴比妥酸(简称TBA，上海第二试剂厂)。其它试剂均为国产分析纯。
1.1.4.仪器和设备：细胞培养室常规设备，细胞培养皿(60mm，corning)，12孔细胞培养板(Corning)，RF-540荧光分光光度计(日本岛津)，国产721分光光度计。
1.1.5.动物：昆明种老年小白鼠(江苏省实验动物中心)，雄性，体重37±5g，8月龄。
1.2..方法：
1.2.1细胞内过氧化脂质产物丙二醛(MDA)的荧光测定
1.2.1.1.皮肤标本的来源：皮肤分别来源于1.门诊包皮环切术所切下的正常皮肤，供体年龄23岁；2.烧伤整形术所切下的同一供体的胸部及面部皮肤，供体年龄74岁，这两个部位的皮肤可认为分别代表皮肤的自然老化及光老化。
1.2.1.2.表皮角朊细胞的制备及培养：表皮角朊细胞的制备及原代培养参照Liu及马圣清的方法。当培养皿中角朊细胞汇聚成单层后，进行传代培养。将培养皿中加入1％EDTA-0.3％胰蛋白酶消化液，37℃消化7-10分钟，待原先贴附的细胞漂起分散后，加入DMEM培养液。吸管反复吹打后，得单细胞悬液，1500rpm离心5分钟，倾去上清液，加入培养液将细胞沉淀振摇成细胞悬液，调整细胞计数成5×105/ml，传代接种于铺有胶原膜的12孔培养板中，每孔接种1ml，置37℃，5％CO2的孵箱中培养。于接种后第二天，待培养的表皮角朊细胞贴壁并形成细胞集落后换去原培养液，随机分为5组，分别换入未加药的DMEM培养液和黄芪甲苷浓度分别为2.55μmol·L-1、1.28μmol·L-1和0.64μmol·L-1的DMEM培养液及含1mmol·L-1 VitC(阳性对照)的DMEM培养液。每组设6个复孔，培养6天后，以1％EDTA-0.3％胰蛋白酶进行消化，得单细胞悬液，调整各样本细胞数均为4×105/ml，每样本取1ml细胞悬液进行MDA的测定。
1.2.1.3.MDA的测定：参照翁玉椿的方法进行。细胞悬液用生理盐水洗涤1-2次，离心后弃上清，在细胞中加入12/N硫酸4ml，10％磷钨酸0.5ml，摇匀后3500rpm离心10分钟，如此反复2次，再在沉淀中加入4ml双蒸水和1mlTBA冰醋酸溶液(0.67％TBA与冰醋酸等体积混合)，充分悬浮后置于95℃中水浴1小时，急冷至室温，加入正丁醇5ml，充分摇匀，3500rpm离心15分钟，取上清液在RF-540荧光分光光计上，采用激发波长515nm，发射波长553nm测定其荧光强度(f)，标准管用2.5μmol·L-1四甲氧基丙烷100μl，加入4ml双蒸水和1mlTBA冰醋酸溶液，与样品管一样保温，提取，测定其荧光强度F。细胞MDA含量按下式计算：
MDA含量＝0.25×f/F×1/样品含百万细胞数，式中f值为样品管荧光强度，F值为标准管荧光强度，标准品为0.25nmol.其单位为nmol/百万细胞。
1.2.2.小鼠皮肤超氧化物歧化酶(SOD)的测定
1.2.2.1.实验分组：本实验设对照组，小剂量给药组和大剂量给药组，每组10只小鼠。分别灌以等体积的1％羧甲基纤维素(CMC)、6mg/kg黄芪甲苷及12mg/kg黄芪甲苷，每天灌胃一次，连续30天。
1.2.2.2.组织匀浆的制备：参照谢忠及季健平方法。末次给药后，将小鼠背部剃毛，取背部皮肤，拭干，称重，剪碎，按1∶10(W/V)比例加入冷的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.7)，用高速匀浆机在冰水浴中以10000转/分匀浆10s，间歇30s，反复3次制成10％皮肤匀浆。4℃，15000转/分离心15分钟，吸取上清液测定SOD及蛋白含量。
1.2.2.3.SOD测定：采用南京建成生物研究所提供的SOD测定试剂盒。试剂盒主要由黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、盐酸羟胺组成。该试剂盒通过黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生稳定浓度的氧自由基，后者氧化羟胺，在显色剂作用下呈紫红色。当被测定样品含SOD时，能歧化氧自由基，从而抑制显色反应。本法尤其适合于SOD的微量测定。测定按照试剂盒所提供步骤进行。蛋白含量测定采用考马斯亮兰法，先以不同浓度的标准蛋白(小牛血清白蛋白)与考马斯亮兰G反应，绘制光吸收值蛋白质浓度标准曲线，算出直线回归方程，再吸取50μl匀浆上清液与考马斯亮兰反应，在721分光光度计上595nm处读取OD值，代入方程中计算各样品蛋白含量。
SOD活性计算公式：对照管OD-样品管OD÷50％×反应液总量×1/蛋白含量样品管OD 所取样品量
1.2.3.小鼠皮肤脂褐素含量的荧光测定
实验分组及给药同SOD测定。未次给药后，取小鼠皮肤，拭干，称取重量200mg，剪碎后，用氯仿-甲醇(2∶1)提取液4ml制备匀浆。而后加入等量蒸馏水剧烈振荡3分钟，3000转/分离心10分钟。吸取下层氯仿层于另一试管中，加氯仿至5ml，紫外灯下照射30秒，在RF-540荧光光度计上以激发波长360nm，发射波长450nm测定样品荧光强度。以0.05mol·L-1硫酸新鲜配制的硫酸奎宁标化，0.1μg/ml硫酸奎宁溶液荧光强度为10u，以每克湿组织含硫酸奎宁量(μg)表示皮肤脂褐素含量。
2..统计学分析：
定量指标均以x±s表示，各用药组与对照组之间以t检验进行显著性检验，对方差不齐者，采用t’检验。
3.结果
3.1.黄芪甲苷对培养的人表皮角朊细胞脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的影响：
黄芪甲苷各剂量组对年青人的表皮角朊细胞及来源于同一老年人不同部位(胸部和面部)的表皮角朊细胞均有显著降低细胞内丙二醛的作用(见表6)。其作用浓度以2.55μmol·L-1黄芪甲苷为最佳浓度，该剂量组降低MDA的程度与1mmol·L-1 VitC相似。不同年龄进行比较，黄芪甲苷对老年人细胞内MDA的降低程度相对要强于来源于年青人的培养细胞。如2.55μmol·L-1黄芪甲苷对来源于老年人胸部及面部的表皮角朊细胞内MDA分别下降57.05％及66.19％，而对年青人的表皮角朊细胞内MDA只下降39.89％。
3.2.黄芪甲苷对老年小鼠皮肤SOD活性及脂褐素含量的影响：
老年小鼠口服黄芪甲苷一个月后，皮肤SOD活性明显升高，而脂褐素的含量明显下降，大剂量组黄芪甲苷(12mg/kg)的作用更强。12mg/kg黄芪甲苷能使小鼠皮肤SOD活性提高59.08％，脂褐素含量下降41.85％；6mg/kg黄芪甲苷能使小鼠皮肤SOD活性提高36.77％，脂褐素含量下降27.69％(见表7)。
4.讨论
我们采用了同一老年供体面部及胸部皮肤，分别代表光老化与自然老化。实验结果表明，未加药时，老年人培养细胞内MDA的水平比年青人高，这符合随增龄，体内的自由基防御系统能力减弱，从而导致自由基引起的脂质过氧化作用增强的理论。文献也曾报道，脂质过氧化产物在20岁后随年龄而增加[19]。除了机体在代谢过程中所产生的自由基，日光特别是其中的紫外线照射皮肤引起的光氧化反应也是皮肤中自由基的一个重要来源，此外长期照射紫外线还引起皮肤SOD活性下降，因而在实验中可观察到来源于面部皮肤的培养细胞其MDA含量要高于来源于胸部皮肤的培养细胞。我们在实验中还发现，黄芪甲苷对老年人表皮角朊细胞的抗脂质过氧化作用比对年青人的细胞作用更为明显。这表明，黄芪甲苷的抗生物氧化作用可能与细胞内的自由基水平有关，年青人的细胞内自由基水平相对较低，黄芪甲苷对脂质过氧化的抑制作用相对较弱；老年人细胞内自由基水平较高，此时黄芪甲苷的抗生物氧化作用就比较明显，这可能也是黄芪甲苷对培养的老年人皮肤组织块延寿作用相对强于对年青人的皮肤组织块延寿作用的原因之一。黄芪甲苷对光老化的皮肤抑制脂质过氧化作用更强，甚至强于阳性对照VitC的作用也说明了它的抗生物氧化作用与细胞内自由基浓度有关，至于其机理还有待进一步探讨。此外，黄芪甲苷对老年小鼠皮肤脂褐素的显著抑制作用，也是其抗皮肤衰老的一个重要原因。
表6 黄芪甲苷(黄芪甲苷)对培养的人表皮角朊细胞内
丙二醛(MDA)含量的影响(x±s，n＝6)
| 组别 | MDA含量(nmol/百万细胞) | ||
| 23岁供体 | 74岁供体胸部皮肤 | 74岁供体面部皮肤 | |
| 空白对照组2.55μmol·L-1黄芪甲苷组1.28μmol·L-1黄芪甲苷组0.64μmol·L-1黄芪甲苷组1mmol·L-1VitC组 | 0.2068±0.00340.1243±0.00430.1415±0.00480.1688±0.00510.1147±0.0050 | 0.3378±0.01780.1451±0.00560.2085±0.00530.2413±0.01210.1335±0.0050 | 0.4002±0.02230.1353±0.01150.2352±0.00510.2630±0.00850.1913±0.0103 |
与对照组比较，P均＜0.01。
表7 黄芪甲苷(黄芪甲苷)对老年小鼠皮肤SOD活性及
脂褐素含量的影响(x±s)
| 组别 | 动物数 | SOD活性(u/mg蛋白) | SOD活性提高率(％) | 脂褐素含量(μg/g湿组织) | 抑制率 |
| 1％CMC对照组6mg/kg黄芪甲苷组12mg/kg黄芪甲苷组 | 101010 | 30.30±1.7441.44±5.10**48.20±4.41** | 36.7759.08 | 3.25±0.112.35±0.13**1.89±0.09** | 27.6941.85 |
与对照组比较，**P＜0.01。
Claims (10)
1.一种黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品，其特征在于该化妆品由下列重量配比的原料药所制成：
黄芪甲苷(或黄芪总苷) 0.0001-0.03％(0.0016-0.05％)
油质原料和乳化剂 10-70％
碱剂 0.2-2％
保湿剂 5-21％
抗氧剂 0.0005％-0.2％
防腐剂 0.1-0.2％
香精 0.5-1.5％
精制水 20-80％
2.根据权利要求1所述的护肤化妆品，其特征在于该化妆品为膏剂或霜剂，包括雪花膏、润肤露、日霜、晚霜、冷霜、保湿霜、柔软霜、护肤霜、营养霜、防晒霜、护手霜、清洁霜、按摩霜。
3.一种制备权利要求1所述的黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品的方法，其制备步骤为：
按处方量比例的油质原料和乳化剂加热至70-90℃时加入黄芪甲苷搅拌均匀，使黄芪甲苷全部溶解，备用；然后将按处方量的碱剂，保湿剂，防腐剂和水混合，不断搅拌加热至70℃-90℃，搅拌均匀至全部溶解，经维持20min灭菌后备用；最后将上述备用的二相成分相混，搅拌乳化，至45-50℃时加入香精和抗氧剂，搅拌均匀，静置过夜再经匀质器(三滚机或胶体磨)均匀后，脱气，检验合格后，即可制成油/水型护肤膏剂或水/油型护肤霜剂。
4.根据权利要求1所述的黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品，其特征在于所述的黄芪甲苷还包括从黄芪中提取的内含黄芪甲苷的黄苷总苷。
5.根据权利要求1所述的黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品，其特征在于所述的油质原料和乳化剂包括：硬脂酸，棕榈酸异丙酯，硬脂酸单甘油脂，十六醇，十八醇，白油，茶油，花油，椰子油，貂油，杏仁油，橄榄油，羊毛酯，凡士林，蜂蜡，液体及固体石蜡，失水山梨醇单油酸酯，失水山梨醇单硬脂酸酯，失水山梨醇单棕榈酸酯，聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物，聚氧乙烯羊毛脂衍生物，聚氧乙烯月桂醚，聚氧乙烯十八醇，聚氧乙烯油醇，聚氧乙烯醚，聚氧乙烯氧丙烯硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯，聚氧乙烯单硬脂酸酯。
6.根据权利要求1所述的抗皮肤衰老护肤化妆品，其特征在于所述的碱剂为：
氢氧化钠，氢氧化钾，三乙醇胺或硼砂。
7.根据权利要求1所述的黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤用化妆品，其特征在于所述的保湿剂包括：甘油，丙二醇，1，3-丁二醇，聚乙二醇，山梨酸，卵磷酯，透明质酸或吡咯烷酮羧酸钠。
8.根据权利要求1所述的黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤用化妆品，其特征在于所述的抗氧剂包括：二羟基酚，愈创木酚，没食子酸及其丙酯与戊酯，2，5-二叔丁基甲酚、2，5-二叔丁基对苯二酚、愈创树脂、去甲二氢愈创酸，抗坏血酸、乙二胺四乙酸或维生素E。
9.根据权利要求1所述的黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品，其特征在于所述的防腐剂包括：对羟基苯甲酸酯类有尼泊金甲酯，尼泊金乙酯，尼泊金丙酯，尼泊金丁酯；凯松，苯扎溴铵或苯扎氯铵。
10.权利要求1所述的黄芪甲苷抗皮肤衰老护肤化妆品，在制备防治皮肤衰老化妆品中的应用。
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