CN1589889A - 霍山石斛萃取物，其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有生理活性的霍山石斛(Dendrobii Caulis)植物萃取物及其制备方法。该萃取物是通过将该植物体以水溶性有机溶剂萃取或以包含水溶性有机溶剂与水的组合物萃取而获得；所使用的水溶性有机溶剂主要选自含碳数介于1～8的醇类、烷类及酯类，其中该萃取物具有调控视网膜黑色素上皮细胞作用的功效。

Description

霍山石斛萃取物，其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及具有调控视网膜黑色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞作用的萃取物及其制备方法，尤其涉及一种霍山石斛萃取物及其制备方法。本发明还涉及该提取物的应用。
背景技术
目前民间最名贵的眼科用中药是石斛(Dendrobii Caulis)，石斛属于兰科植物，药用部位为茎，属于本经上品，性微寒，味甘微咸，其功能主治生津益胃，清热养阴。治口干烦渴，病后虚热，阴伤目暗。从中医书上常可见石斛之疗效，例：圣济总录中记载石斛散「治眼目昼视精明，暮夜昏暗，视不见物」。原机启微中记载石斛夜光丸「治神水宽大渐散，昏如雾露中行，渐睹空中有黑花，渐睹物成二体，久则光不收，及内障神水淡绿色，淡白色者」。百草镜中指出，石斛系出 六安及 颖川府霍山县，名霍山石斛，最佳。但，为何石斛具有生理活性？其中所含的物质到底为何？此等问题系成为目前探寻的方向。
RPE细胞位于视网膜的最外层，是排列在布鲁赫氏膜(Bruch’smembrance)与光接受器(photoreceptors)之间成一个单层细胞(Monolayercell)(1)。RPE细胞顶端的绒毛突起(villous processes)与光接受器的外段相接触，其底端则有许多透过布鲁赫氏膜而与脉络膜紧密接和的折迭(basalinfoldings)；其可有效地清除或输送脉络膜与视网膜神经层的有毒物质及代谢物，因此RPE细胞亦构成了很重要的视网膜血管屏障(blood-retinal barrier)。
此外，RPE细胞亦具有吸收光线的功能，并与吞噬杆状细胞及锥状细胞受光线刺激而脱落的外节(rod outer segments，ROS)、分解吞噬体(phagosome)、合成细胞外基质(extracellular matrix)与黑色素(melanin)、药物的解毒、提供光接受器的外段再生时所必须的物质、维生素A的储存与运送、视紫(Rodopsin)的合成、形成网膜的接着力.....等作用有关。根据统计，大白鼠的一个RPE细胞一天必须清除25,000个杆状细胞及锥状细胞受光线刺激而脱落的外节，可见如此频繁吞噬机能的重要性(2)。因为RPE细胞正常的吞吃作用对于维持视网膜中光接受器的健康具有相当大的关联性，所以一旦吞吃机能降低，将造成光接受器的退化(degeneration)(3)。因为RPE细胞会随着年龄的增加而死亡或游离至他处，纵使老化的RPE细胞仍具有吞噬能力，但其清除(digestion)的能力却已明显降低(4)；1995年Panda-Jonas等人就指出人的光受器每年会损失0.2-0.4％，且杆状细胞的损失较锥状细胞损失更多(5)，此可能造成老年人视力减退及疾病的发生，故RPE细胞功能的维持对于视觉系统是相当重要的。
另外，一氧化氮(Nitric oxide；NO)是一个不稳定、半衰期仅数秒钟的小分子气体(6)，然而其却具有多种的生理功能。由于一氧化氮属电中性(neutral)，因此可自由穿透进出细胞膜(7)；另一方面一氧化氮具有未配对电子(unpairedelectron)，因此其类似自由基(free radical)而具有高度的反应力，一旦形成便可迅速通过细胞膜而发生作用(8)。在免疫系统中，一氧化氮扮演着防御与控制细胞毒性的角色；在血管系统中，一氧化氮则是所谓的内皮细胞舒张因子(EDRF)；而在中枢神经系统，一氧化氮则是作用为神经传导物质(neurotransmitter)(7)。
一氧化氮系在一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase；NOS)将L-arginine转变成L-citrulline的过程中被释放；截至目前为止，详细的一氧化氮合成机转仍不完全清楚。一氧化氮合成酶有三种异构体(isoforms)，其中neuronal NOS及endothelial NOS为基本型(constitutive form)，简称cNOS，其活性受到钙离子Ca++及携钙素calmodulin的调节，所产生一氧化氮的浓度属于nM(10-9M)等级，第三种为immunologic NOS属可诱导型(inducible form)简称iNOS，但其活性不受到Ca++及calmodulin的调节，所产生一氧化氮的浓度属于mM(10-6M)等级，其中cNOS与iNOS的基因是位在不同染色体上(以人类而言，endothelial on chromosome 7，neuronal onchromosome 12，iNOS on chromosome 17)(8，9)。
现已发现在视网膜中的视网膜神经细胞(retinal neuron)、RPE细胞、无轴突细胞及视神经节细胞(amacrine and ganglion cells)、黏质细胞(Muller cells)等皆有一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase；NOS)的存在，且到目前为止，已有证据显示一氧化氮在生理及病理状态下，皆扮演重要的角色，且与眼睛的机能关系密切(10)。1994年Kurenny等人指出一氧化氮具有调节光接受器(photoreceptors)上的voltage-gated ion channel之功能，因此推测一氧化氮可能与光线讯息的传递有关(11)。1993年Deussen等人发现在基础环境(basalcondition)或缺血环境(ischemia)下，一氧化氮具有控制视网膜血流量的能力(12)。Tilton等人亦指出一氧化氮可能具有调节糖尿病所引起的视网膜内血管受损的程度(13)。而在1994年Goureau等人则报告当视网膜神经胶质细胞(retinalglial cells)及视网膜色素上皮细胞受到LPS，IFN-g，TNF-a刺激会促进一氧化氮合成酶的表现，进而大量产生一氧化氮，由此可知一氧化氮在视网膜处于发炎或受到感染的情况下，可能扮演着防御、保护的角色(14)。然而，截至目前为止，cNOS在视觉接受器的位置及特性仍不甚清楚，有文献指出在视觉接受器本体有cNOS活性，另有文献则指出在视觉接受器外段(photoreceptor outersegments)才有cNOS活性，而产生的一氧化氮可调节光线的传导、神经突触的讯号传递、生理状态下或缺血状态下视网膜的血流量等(10)。iNOS的活性亦表现于视网膜的一些细胞中，例如RPE细胞与黏质细胞(Muller cells)等，有文献指出在培养牛的视网膜色素上皮细胞中，若经过IFN-g，LPS，TNF-a刺激后约12小时可产生大量一氧化氮，且可至少持续96小时(15)。细胞因子(cytokines)在RPE细胞的iNOS活性上的影响是相当复杂的，例如，对bovineRPE细胞而言，需LPS及lFN-γ或TNF-α刺激才能产生大量一氧化氮，bFGF则具有抑制NOS的作用，而TGF-β则具有些微促进作用(16)。对人类RPE细胞而言，必须有Interleukin-1β的刺激才能产生大量NO，LPS则无影响，TGF-β则而却能明显抑制其产生一氧化氮(17)。
当受到细菌感染时，iNOS的表现可能是有益的，其所释放的一氧化氮可以杀死入侵的微生物；相反的，在某些状况下太大量产生一氧化氮反而会导致自体免疫疾病(autoimmune disease)或败血性休克(septic shock)。1994年Tilton等人提出了第一份证据说明一氧化氮与眼底发炎反应有关，本案申请人则发现iNOS inhibitor可以阻断由内毒素(endotoxin)所引起的葡萄膜炎(18)。Goureau等人指出以IFN-γ及LPS处理RPE使之产生大量一氧化氮，而此作用会被aFGF、bFGF所抑制，且指出是抑制在iNOS的表现而非iNOS mRNA的稳定性(stability)，所以，本案申请人推测FGF可保护RPE免于受到内毒素或细胞激素所引起的伤害(19)。此外，1994年Becquet等人的研究中指出培养牛的RPE细胞时加入SIN-1(作为NO供给者)或利用细胞激素来刺激细胞使之产生大量的一氧化氮下，RPE细胞吞吃ROS的活性会受到抑制，这样的作用可被一氧化氮清道夫(scavenger)(如hemoglobulin)或L-arginine analogs所恢复，且与cGMP无关(16)。由此可见iNOS在视网膜中亦扮演着免疫调节的角色。
常见的视网膜病变有糖尿病所引起的视网膜血管新生(proliferativediabetic retinopathy)、增殖性视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy)及老年性黄斑部病变(Aged-macular degeneration)等(20)，而视网膜的病变，是所有眼科疾病中最难治疗的。高血糖(hyperglycemia)加速醣化作用(glycation)的发生，产生高度醣化终产物(advanced glycation end products，AGEs)一直被认为是与糖尿病末期所引发的各种血管、神经并发症息息相关(21-25)。AGE的形成是还原醣(reducing sugar)的醛基(aldehyde group)或酮基(ketone group)与蛋白质的一级胺(primary amino acid)经由非酵素(nonenzymatic)的作用产生不稳定的希夫碱(Schiff base)，再经由阿默得里重组(Amadorirearrangement)产生阿默得里产物(Amardori product)(26)。已知非酵素醣化作用是一不可逆反应且多发生在半衰期长的蛋白质上(27)，因AGE的形成造成蛋白质交联(cross-linking)后会使得蛋白质对于蛋白酶(protease)产生抗性，因此AGE的累积是一老化的标记(28；29)。随着年龄的增加，脑部锥状神经(pyramidal neurons)、布鲁赫氏膜(Bruch’s membrane)、胶原蛋白(collagen)中AGE的含量也都随着上升。非酵素醣化作用速率呈初级反应，反应速率决定于还原糖与蛋白质的浓度，糖尿病患血糖浓度较一般正常人为高，因此更加速了醣化作用的发生。已知糖尿病加速动脉粥状硬化、肾脏损伤(25)、血管受损、神经病变(26)、视网膜病变及糖尿病患较健康者易中风(30)，都与AGE有直接的关系(26；28；29)。糖尿病造成红血球的聚集，主要是白蛋白(albumin)被醣化后造成其三级结构(tertiary structure)改变，以致于丧失抗聚集(anti-aggregation)的功能(22)，另外，研究显示糖尿病引发肾脏丝球体通透性的改变，是因为白蛋白的醣化而非肾小球基膜(glomerular basementmembrane)的醣化(23)。Poduslo等人在1994年也提到醣化的蛋白质会增加其通透血脑屏障(blood brain barrier)的能力(31)。
AGE能够和细胞表面上的一些受体(receptor)、蛋白质结合，目前已知的有清道夫受体(scavenger receptors)第一型及第二型，AGE的受体(RAGE，the receptor for AGE)，OST-48(AGE-R1)，80K-H phosphoprotein(AGE-R2)及galectin-3(AGE-R3)(32)。在单核球、巨噬细胞、内皮细胞、神经胶细胞......等都可发现AGE受体，当细胞被AGE活化时，常使得细胞外基质蛋白质(extracellular matrix protein)、血管附着分子(vascular adhesion molecules)、及生长因子(growth factor)表现量增加，随着不同的细胞种类及讯息传递，而伴随着趋化性(chemotaxis)，血管新生(angiogenesis)，氧化压力，细胞增生或细胞程序死亡(programmed cell death)(34)。已知人类脑部各种细胞表现不同的高度醣化终产物受体，可清除AGE，当此能力丧失时，造成细胞外AGE的累积，而诱发中枢神经系统的炎症反应(33)。而AGE可使RPE细胞的视网膜血管内皮细胞生长因子(retinal vascular endothelial growth factor)(21)，及PDGF-β(34)的表现量增加。AGE在老化过程中扮演重要角色，因此我们希望以醣化白蛋白作为一个病理模型(model)以期进行新的研究与探讨。
HGF/SF(Hepatocyte growth factor)为肝脏最重要之生长因子，是由60KDa的重链(heavy chain)(αchain)及30KDa的轻链(light chain)(βchain)以二硫键相接所构成(35)。体内刚合成的HGF/SF为prepro HGF/SF须经酵素修剪之后成为异双形式(heterodimeric form)才具有生物活性。HGF为一种多功能的生长因子，对多种细胞皆有调节生长的能力，在组织修复(tissue repair)及器官再生(organ regeneration)中扮演重要角色。HGF在体内分布十分广泛，以肝脏产量最大，其余尚有胰脏、胸腺、血液、小肠、胎盘......等(35)。1996年发现眼睛的组织如泪液、泪腺、角膜中有HGF/SF或HGF/SF受体存在，可见HGF/SF在眼睛内可能有其调控的角色(36)。1998年He等人更发现视网膜色素上皮细胞不但同时具有HGF及HGF受体(c-Met)，而且c-Met的酪胺酸磷酸化反应(tyrosine phosphorylation)是一直持续不断的在表现，所以HGF对视网膜色素上皮细胞而言可能是一个自体作用的生长因子，而且可能与视网膜发育(37)，伤口愈合及视网膜血管新生有关(38)。由以上内容可知，不论是促进或是抑制RPE细胞活性的影响因子都是目前急需了解与突破的领域。
纵上所述，因为RPE细胞在视网膜发育及其相关的调控机制上扮演了非常重要的角色，故如何调控RPE细胞的活性以便间接掌控与RPE细胞有关的机制已成为今日相关研究的重要课题。
发明内容
本发明提供了一种具有生理活性的霍山石斛(Dendrobii Caulis)植物萃取物，其是通过用水溶性有机溶剂或是包含有该水溶性有机溶剂与水的混合物萃取所述植物而得到的。
根据本发明，该水溶性有机溶剂为含碳数介于1～8的醇类、烷类或是酯类中的一种。
根据本发明，该醇类为甲醇或乙醇。
根据本发明，该萃取物具有促进视网膜黑色素上皮细胞(RPE，retinalpigment epithelium cell)的作用。
根据本发明，该萃取物具有减少生物体中高度醣化终产物(advancedglycation end product，AGE)含量的作用。
另外，本发明还提供了一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体(physiologically acceptable carrier)以及前述任一项所述的萃取物或是该萃取物的同分异构物。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为一种具有药理活性的组合物。
根据本发明，该具有生理可接受性的载体为一具有药理活性的载体。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为对心血管疾病具有药理活性的组合物。
根据本发明，该心血管疾病系选自，但不限于：动脉硬化、血管受损与中风。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为对神经病变具有药理活性的组合物。
根据本发明，其中该神经病变系选自，但不限于：视网膜神经细胞病变、RPE细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变与脑部锥状神经病变。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为对肾脏疾病具有药理活性的组合物。
根据本发明，该肾脏疾病系选自，但不限于肾脏丝球体病变与肾小球基膜病变。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为对眼睛疾病具有药理活性的组合物。
根据本发明，该眼睛疾病系选自，但不限于：葡萄膜炎、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎与布鲁赫氏膜病变。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为对胰脏疾病具有药理活性的组合物。
根据本发明，该胰脏疾病系选自，但不限于糖尿病及其并发症。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为对自体免疫疾病(autoimmunedisease)或是败血性休克(septic shock)具有药理活性的组合物。
本发明也提供了一种制备霍山石斛(Dendrobii Caulis)植物萃取物的方法，该方法包含至少一个以水、水溶性有机溶剂或是水与该水溶性有机溶剂的混合物来萃取该植物的步骤。
根据本发明，该水溶性有机溶剂系为含碳数介于1～8的醇类、烷类或是酯类中的一种。
根据本发明，该醇类为甲醇或乙醇。
此外，本发明也提供了一种制备一植物萃取物的方法，其步骤包含：a)以第一醇类萃取该植物以产生第一醇类萃取物；b)以水与烷类同时萃取该第一醇类萃取物以产生第一水层萃取物与烷类萃取物；c)以酯类萃取该水层以产生酯类萃取物与第二水层萃取物；以及d)以第二醇类萃取该第二水层萃取物以产生第二醇类萃取物与第三水层萃取物。
根据本发明，该植物为兰科植物。
根据本发明，该兰科植物属于石斛属(Genus Dendrobium)。
根据本发明，其中步骤a)还包含下列步骤：a1)提供该植物的干物质；a2)以粉磨机磨碎该干物质；a3)以该第一醇类萃取被磨碎的该物质以获得该第一醇类萃取物。
根据本发明，该第一醇类的含碳数为1-8。
根据本发明，该第一醇类为甲醇或是乙醇。
根据本发明，该第二醇类为含碳数1-8的醇类。
根据本发明，该第二醇类为丁醇或是正丁醇。
根据本发明，其中步骤b)还包含下列步骤：b1)以减压、浓缩、抽气等步骤来干燥该第一醇类萃取物。
根据本发明，该烷类萃取物为正己烷萃取物。
根据本发明，其中步骤c)更包含下列步骤：c1)干燥该酯类萃取物；以及c2)以己烷与甲醇萃取干燥后的该酯类萃取物以产生己烷萃取物与甲醇萃取物。
根据本发明，该己烷萃取物系经减压、浓缩抽气等步骤而被干燥。
根据本发明，该酯类为乙酸乙酯。
根据本发明，其中该方法还包含步骤：e)以层析法层析该第二醇类萃取物以获得一个命名为DCMPbL6，7的第一冲提物；以及f)以第一冲提剂冲提该DCMPbL6，7以获得第二冲提物。
根据本发明，其中该步骤e)是通过第二冲提剂而实施。
根据本发明，其中该第二冲提剂的组成为体积比为1∶1的甲醇与水的混合物。
根据本发明，其中该第一冲提剂为一异丙醇与水以体积比为20∶80而组成的混合物，且该第二冲提物被命名为DCMPbL6，7D2。
根据本发明，其中该DCMPbL6，7D2还以一个甲醇/水/乙酸以体积比为35∶65∶1而组成的混合物进行层析并产生第三冲提物DCMPbL6，7D2H2。
根据本发明，其中该第一冲提物为异丙醇与水以体积比为30∶70而组成的混合物，且该第二冲提物被命名为DCMPbL6，7D3。
根据本发明，其中该DCMPbL6，7D3还以一个甲醇/水/乙酸以体积比为40∶60∶1而组成的混合物进行层析并产生第四冲提物DCMPbL6，7D3H3。
根据本发明，其中该第一冲提剂为异丙醇与水以体积比为40∶60而组成的混合物，且该第二冲提物被命名为DCMPbL6，7D4。
根据本发明，其中该DCMPbL6，7D4还以一个甲醇/水/乙酸以体积比为45∶55∶1而组成的混合物进行层析并产生第五冲提物DCMPbL6，7D4H3。
另外，本发明还提供了另一种霍山石斛(Dendrobii Caulis)植物萃取物，其为前述方法所产生的各萃取物中的一个。
根据本发明，该植物萃取物具有促进视网膜黑色素上皮细胞(retinalpigment epithelium cell，RPE)的作用。
根据本发明，该萃取物具有减少生物体中高度醣化终产物(advancedglycation end product，AGE)含量的作用。
另外，本发明还提供了一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及前述的植物萃取物或是该植物萃取物的同分异构物。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为一种具有药理活性的组合物。
根据本发明，该具有生理可接受性的载体为具有药理活性的载体。
根据本发明， 该组合物为对选自于下列疾病群组的任一疾病具有药理反应 的药物组合物，该疾病群组包含：心血管疾病、神经疾病、肾脏疾病、肝脏疾 病、眼睛疾病与自体免疫疾病。
根据本发明，该疾病选自下列疾病：动脉硬化、血管受损、中风、视网膜神经细胞病变、RPE细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变、脑部锥状神经病变、肾脏丝球体病变与肾小球基膜病变、葡萄膜炎、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎、布鲁赫氏膜病变、糖尿病及其并发症以及败血性休克。
本发明另外还提供了另一种组成物，其为如前所述获得的该第二冲提物。
根据本发明，该组成物具有促进视网膜黑色素上皮细胞(retinal pigmentepithelium cell，RPE)的作用。
根据本发明，该组成物具有减少生物体中高度醣化终产物(advancedglycation end product，AGE)含量的作用。
本发明还提供了另一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及前述组成物或是该组成物的同分异构物。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为一种具有药理活性的组合物。
根据本发明，该具有生理可接受性的载体为具有药理活性的载体。
根据本发明，该组成物为对选自于下列疾病群组之任一疾病具有药理反应的药用组合物，该疾病群组包含：心血管疾病、神经疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、眼睛疾病与自体免疫疾病。
根据本发明，该疾病选自下列疾病：动脉硬化、血管受损、中风、视网膜神经细胞病变、RPE细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变、脑部锥状神经病变、肾脏丝球体病变与肾小球基膜病变、葡萄膜炎、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎、布鲁赫氏膜病变、糖尿病及其并发症以及败血性休克。
本发明还提供了一种化合物，其为如前所述获得的第三冲提物。
根据本发明，该化合物具有促进视网膜黑色素上皮细胞(retinal pigmentepithelium cell，RPE)的作用。
根据本发明，该化合物具有减少生物体中高度醣化终产物(advancedglycation end product，AGE)含量的作用。
此外，本发明还提供了另一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及前述之任一项所述的化合物或是该化合物的同分异构物。
根据本发明，该具有生理活性的组合物为一种具有药理活性的组合物。
根据本发明，该具有生理可接受性的载体为具有药理活性的载体。
根据本发明，该组合物为对选自于下列疾病群组之任一疾病具有药理反应的药物组合物，该疾病群组包含：心血管疾病、神经疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、眼睛疾病与自体免疫疾病。
根据本发明，该疾病系选自下列疾病：动脉硬化、血管受损、中风、视网膜神经细胞病变、RPE细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变、脑部锥状神经病变、肾脏丝球体病变与肾小球基膜病变、葡萄膜炎、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎、布鲁赫氏膜病变、糖尿病及其并发症以及败血性休克。
本发明还提供了一种组成分，其为如前所述获得的第四冲提物。
根据本发明，该组成物具有促进视网膜黑色素上皮细胞(retinal pigmentepithelium cell，RPE)的作用。
根据本发明，该组成物具有减少生物体中高度醣化终产物(advancedglycation end product，AGE)含量的作用。
另外，本发明还提供了另一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及前述之组成分或是该组成分的同分异构物。
根据本发明，其中该具有生理活性的组合物系为一种具有药理活性的组合物。
根据本发明，其中该具有生理可接受性的载体为具有药理活性的载体。
根据本发明，其中该组合物为对选自于下列疾病群组之任一疾病具有药理反应的药用组合物，该疾病群组包含：心血管疾病、神经疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、眼睛疾病与自体免疫疾病。
根据本发明，其中该疾病系选自下列疾病：动脉硬化、血管受损、中风、视网膜神经细胞病变、RPE细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变、脑部锥状神经病变、肾脏丝球体病变与肾小球基膜病变、葡萄膜炎、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎、布鲁赫氏膜病变、糖尿病及其并发症以及败血性休克。
再者，本发明还提供了另一种组成分，其为如前所述获得的第五冲提物。
根据本发明，其中该组成分具有促进视网膜黑色素上皮细胞(retinalpigment epithelium cell，RPE)的作用。
根据本发明，其中该组成分具有减少生物体中高度醣化终产物(advancedglycation end product，AGE)含量的作用。
再一次地，本发明提供了另一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及前述的组成分或是该组成分的同分异构物。
根据本发明，其中该具有生理活性的组合物为一种具有药理活性的组合物。
根据本发明，其中该具有生理可接受性的载体为具有药理活性的载体。
根据本发明，其中该组成物为对选自于下列疾病群组之任一疾病具有药理反应的药物组合物，该疾病群组包含：心血管疾病、神经疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、眼睛疾病与自体免疫疾病。
根据本发明，该疾病系选自下列疾病：动脉硬化、血管受损、中风、视网膜神经细胞病变、RPE细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变、脑部锥状神经病变、肾脏丝球体病变与肾小球基膜病变、葡萄膜炎、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎、布鲁赫氏膜病变、糖尿病及其并发症以及败血性休克。
附图说明
图1为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物的分离流程图；
图2为本发明较佳实施例的霍山石斛甲醇萃取物对RPE细胞吞吃作用的影响柱形图；
图3为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPe/h、DCMPe/m、DCMPb对RPE细胞吞吃作用影响的柱形图；
图4为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2对RPE细胞吞吃作用影响的柱形图；
图5为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以600-MHz进行分析所得到的1H-NMR图谱；
图6为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以600-MHz进行分析所得到的13C-NMR图谱；
图7为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以600-MHz进行分析所得到的DEPT图谱；
图8为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以600-MHz进行分析所得到的HMQC图谱；
图9为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以600-MHz进行分析所得到的HMBC图谱；
图10为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的1H-1H COSY图谱；
图11为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2的UV光谱图；
图12为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3对RPE细胞吞吃作用影响的柱形图；
图13为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的1H-NMR图谱；
图14为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的13C-NMR图谱；
图15为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的DEPT图谱；
图16为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的1H-1H COSY图谱；
图17为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的HMBC图谱；
图18为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3对RPE细胞吞吃作用影响的柱形图；
图19为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的1H-NMR图谱；
图20为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的13C-NMR图谱；
图21为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的DEPT图谱；
图22为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的HMQC图谱；
图23为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的1H-1H COSY图谱；
图24为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3在利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂而以500-MHz进行分析所得到的HMBC图谱；
图25为本发明较佳实施例的霍山石斛萃取物DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb对RPE细胞的一氧化氮生成作用的影响柱形图；
图26(A)-(B)为本发明较佳实施例的霍山石斛甲醇萃取物处理RPE细胞所得到的β-actin(A)与HGF(B)基因表达电泳图；
图27为本发明较佳实施例的不同霍山石斛萃取物对RPE细胞的HGF的mRNA表达的影响结果电泳图；
图28(A)-(B)为本发明较佳实施例的霍山石斛粗萃取物DeCaM对正常情况下的RPE细胞的β-actin(A)与bFGF(B)基因表达作用结果电泳图；
图29(A)-(B)为本发明较佳实施例的霍山石斛粗萃取物DeCaM对正常情况下的RPE细胞的VEGF(A)及TGF-β(B)基因表达作用结果电泳图；
图30(A)-(B)为本发明较佳实施例的霍山石斛粗萃取物DeCaM对缺氧情况下的RPE细胞的β-actin(A)与bFGF(B)基因表达作用结果电泳图；
图31(A)-(B)为本发明较佳实施例的霍山石斛粗萃取物DeCaM对缺氧情况下的RPE细胞的VEGF(A)及TGF-β(B)基因表达作用结果电泳图；
图32为本发明较佳实施例的霍山石斛甲醇萃取物与肝生长因子HGF对RPE细胞的蛋白质水解活性影响电泳图；
图33为根据图32所绘制出的霍山石斛甲醇萃取物与肝生长因子HGF对RPE细胞的蛋白质水解活性影响的折线图；以及
图34为本发明较佳实施例的霍山石斛甲醇萃取物对具有糖尿病的老鼠体内的AGE含量的影响柱形图。
具体实施方式
本发明的霍山石斛萃取物及其制备方法可通过以下的实施例说明而得到充分了解，并使本领域技术人员据此完成本发明，但本发明的下述实施例并非对本发明作出限制。
(一)视网膜色素上皮细胞培养
自屠宰场取得新鲜牛眼，先以碘酒消毒外表再以磷酸缓冲液(phosphatebuffer saline，PBS)冲洗二次，解剖去除水晶体、玻璃体、视网膜等后，以0.01％EDTA处理40分钟，再以5％Trypsin处理15分钟，经圆形镊轻压及吸管轻吸数次即可获单一RPE细胞。吸出溶液置于含10％胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的培养液Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)中，培养在37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中。每隔5-6天换新培养液，待长满后以0.05％胰蛋白脢(trypsin)及0.02％乙二胺四醋酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)处理继代之。本实验主要以第五代、第六代进行生物活性测试。
(二)ROS的制备
自屠宰场取得新鲜牛眼，置于冰上照光30分钟，先以碘酒消毒外表再以汉克氏缓冲液(Hank’s buffer)冲洗二次，解剖去除水晶体、玻璃体、取出视网膜剪成小碎片置于含有20％蔗糖(sucrose)的20mM Tris-HCl溶液中，于4℃冰箱中搅拌三个小时，细胞液分别以No.300、220、110、74、53、10mesh的过滤膜过滤。计算滤液中的细胞数，分装为每管1×108 ROS细胞，置于-20℃冰箱保存。
(三)FITC-ROS的制备
取出ROS解冻后去除上清液，加入700μl含10％蔗糖的硼酸缓冲液(Borate buffer)(pH8.0)混和之后，再加入ROS之1/1000重量的荧光物质fluorescein sothiocyanate(FITC)粉末，置于4℃旋转1.5小时，利用含20％蔗糖的20mM Tris-acetate(pH7.2)冲洗以去除未与ROS结和的FITC，10000rpm离心10分钟，重复数次，最后再溶于含2.5％蔗糖之DMEM中。
(四)视网膜色素上皮细胞吞吃机能的测定
将RPE细胞调配为5×104cells/ml，吸取200μl到96 well plate中，待长满后换新培养液，再加入不同浓度的测试药物20μl到每个well中并使胎牛血清含量居2％～5％之间，经48小时的培养，加入50μl之2×107FITC-ROS/ml到各well中，培养4小时，清除上清液并以2.5％sucrose/PBS冲洗数次，最后加入100μl PBS利用细胞荧光测定机Cyto-Fluorometer(Ex filter：485/20nm，Em filter 530/25nm)测定之，所测得读值是粘于RPE表面及被吞吃的FITC-ROS量。每个well加入5μlFluoroQuench于培养箱中反应1小时后测其荧光读值，视为被吞吃的FITC-ROS量。
(五)视网膜色素上皮细胞一氧化氮Nitric Oxide生成的测定(DANassay)(39)
取100μl的细胞培养上清液加入50μl的2，3-二氨基萘(2，3-diaminonaphthalene，DAN)，在室温中作用十分钟后，加入25μl的2.8N氢氧化钠(NaOH)中止反应，再以Cyto-Fluorometer 2300(基态360±40nm，激态460±40nm)进行测定。所得的值通过已知浓度的亚硝酸钠(NaNO2)作出的标准曲线换算出一氧化氮浓度。
(六)视网膜色素上皮细胞核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)制备
将视网膜色素上皮细胞培养于100mm培养盘(1×106cells in DMEM+10％FCS)，待长满后，更换新的培养液(含2.5％FCS之DMEM)，加入霍山石斛化学溶媒分层法之区分物0.1μg/ml，培养48小时。首先去除培养液并以冰的PBS缓冲液冲洗二次，加入1ml/105～106cells之RNAzolTMB静置5分钟，利用刮勺将细胞由组织培养盘上刮下，移至1.5ml的离心管内，加入1/10倍体积量的氯仿(chloroform)，快速振摇混和均匀后静置冰上5分钟，于4℃下，经12000rpm高速离心15分钟，之后小心吸取上层透明水层移至另一1.5ml的离心管内并加入等体积的异丙醇(isopropanol)混和均匀，再于冰上静置5分钟，经4℃，12000rpm高速离心10分钟，去除上清液，沉淀部份以70％酒精漂洗，再经4℃，7500rpm离心8分钟，去除酒精并干燥，以含0.1％焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)处理过的四次水溶解，取部份以OD260定量，并以OD260/OD280判定纯度。剩余部份以70％酒精保存，置于-20℃。
(七)RPE细胞之生长因子之逆转录及多链聚合反应(reverse transcriptionand polymerase chain reaction，RT-PCR)
分别取加药组与对照组的RPE细胞萃取的total RNA 5μg加入2.5μg寡聚脱氧胸苷(oligodT)，70℃10分钟后经室温10分钟，再加入10mM脱氧核甘酸(dNTP)2μl、rRNasin 1μl、鸟类骨髓母细胞症病毒(AvianMyeloblastosis virus，AMV)逆转录脢(reverse transcriptase)1μl(10unit)、及其缓冲液，使反应体积为20μl，于42℃反应50分钟，再经90℃加热5分钟后置冰上10分钟，最后加入rRNAase H 1μl，于37℃反应30分钟。取逆转录反应的cDNA及其不同倍数稀释的cDNA加入2mM dNTP 5μl及各管加入欲侦测的引子(primer)：β-actin及各种标的基因的正股(sense)及反股(antisense)引子0.1μg/μl各1μl，聚合脢(polymerase)1μl(2单位)及其缓冲液，作用体积为20μl，条件为：变性处理(denaturing)：94℃、1.5分钟，黏合处理(annealing)：57℃、1.5分钟，延长(extension)：72℃、2分钟，于DNA thermal cycler(Perkin-Elmer-Cetus)进行PCR反应。β-actin反应25cycle；HGF反应35个循环(cycle)。
1.HGF primers购自Gibco(Gaithersburg，MD，USA)
Sense，21mer：5’-GGG ATT CTC AGT ATC CTC ACA-3’
Antisense，21mer：5’-CCT ACA TTT GTT CGT GTT GGA-3’
2.VEGF primer：
Sense，24mer：5’-AGA AAC CCC ACG AAG TGG TGA AGT-3’
Antisense，24mer：5’-CGT TTA ACT CAA GCT GCC TCG CCT-3’
3.bFGF primer：
Sense，19mer：5’-CCA AGC GGC TGT ACT GCA A-3’
Antisense，24mer：5’-GAT CAG ATG CTG CCA TTA AGA TCA-3’
4.TGF-βprimer：
Sense，24mer：5’-CCT GGA CAC CAA CTA CTG CTT CAG-3’
Antisense，24mer：5’-ACG ATC ATG TTG GAC AAC TGC TCC-3’
(八)醣化白蛋白(glycated albumin)之制备
(a)牛醣化白蛋白制作
以一倍PBS将白蛋白(fraction V)配成1mM，以0.22μm无菌过滤膜过滤后，加入以0.22μm无菌过滤膜过滤之250mM葡萄糖(glucose)置于37℃培养箱中进行醣化作用，三个星期后将反应液透析去除多余之葡萄糖后，以ConA-Sepharose凝胶进行纯化后，透析后冷冻干燥保存。
(b)小鼠醣化白蛋白制作
以一倍PBS(pH7.4)将白蛋白(fraction V)配成100mg/ml(1.51mM)，以0.22μm无菌过滤膜过滤后，加入等体积溶于一倍PBS(pH7.4)以0.22μm无菌过滤膜过滤后的1.8g/ml(1M)的葡萄糖(D-glucose)于玻璃管内，置于37℃培养箱黑暗中进行糖化反应，60天后将反应液置于透析袋中透析去除多余的葡萄糖后，再以0.22μm无菌过滤膜过滤，测定蛋白质浓度后分装，冷冻干燥后置于-20℃保存备用。
(九).FITC标定AGE-BSA(40)
取白蛋白100mg，FITC 1.8mg溶于15ml 0.1M碳酸钠缓冲液(Sodiumcarbonate buffer，pH9.5)，在25℃避光搅拌五小时，以HW-55F(1.6×100cm)分子筛管柱进行分离，全程避光，以5％(v/v)的正丁醇(n-butanol)作为冲提缓冲液(elution buffer)，以自然流速进行分离，将分离之样品以三次水进行透析三次，蛋白质定量后无菌过滤，分装冷冻干燥，测荧光并计算标定上荧光的当量比。
(十)RPE细胞降解FITC-labeled AGE-BSA的观察
事先将灭过菌清洁之盖玻片置于24槽培养盘(24 well culture plate)中，以300μl 0.5％凝胶(gelatin)涂附(coating)30分钟，再以培养液(medium)洗去涂附的凝胶，RPE细胞以每槽5×104个细胞(5×104cell/well)的细胞数目用10％FCS/DMEM培养于覆有盖玻片24 well plate中，每盘内含0.7ml培养液，待48小时后，细胞长满，吸除培养液，以0.5ml培养液洗三次，加30-300μg/ml不同浓度的FITC-BSA DMEM培养液0.5ml中，将细胞以PBS冲洗四次，洗除未被吞吃或结合的荧光，取出盖玻片，以含1％FQEB的PBS润湿，封片后立即以荧光显微镜观察。
(十一)霍山石斛淬取物的制作及纯化活性成分的分离
(1).霍山石斛醇类萃取物的制备
将两公斤霍山石斛以粉碎机打碎后，加入甲醇(methanol)或乙醇(ethanol)浸泡隔夜后，以滤网去除残渣并用抽气过滤方式过滤后进行减压浓缩，共重复浸泡三次。甲醇或乙醇液完全抽干后，将石斛由醇类萃取所得的醇类粗萃取物命名为DeCaM。
(2)霍山石斛化学溶媒分层萃取物的制备
以400ml三次水溶出后，以等量之正己烷(n-hexane)进行分层三次，得正己烷层命名为DCMPh，水层次以乙酸乙酯(ethyl-acetate)分层四次，得EtOAc层，命名为DCMPe，水层再以及正丁醇(n-butanol)分层三次，得正丁醇层及水层，分别称为DCMPb及DCMPw。
(3).霍山石斛纯化成份的萃取及分离
分离霍山石斛活性成分，其分离方法如下：霍山石斛1.9kg经甲醇三次约16公升萃取，经减压浓缩后抽干得到标品，称作DCM，先以乙酸乙酯(EtOAc)2公升溶解后，再与等体积水进行分配萃取，水层再用等体积乙酸乙酯萃取二次，得一乙酸乙酯(EtOAc)层与第二水层，将EtOAc萃取层混合收集后，经减压浓缩抽干，再以己烷(hexane)4公升及甲醇(methanol)2公升分配萃取三次得到两层，经减压浓缩后得到己皖层(命名为DCMPe/h)及甲醇层(命名为DCMPe/m)标品；将第二水层调整为2公升，再以丁醇(buantol)2公升进行分配萃取，减压浓缩后得到丁醇层(命名为DCMPb)及第三水层(命名为DCMPw)标品。PCMPb标品以LH20胶进行分子管柱层析(2.5×107cm，移动相为：甲醇∶水＝50∶50)，进行活性的筛选后，将得到八个层析峰，收集其中之第六层析峰与第七层析峰之萃取物，系命名为PCMPbL6，7标品。接着再以Diaion SP-20 SS进行吸附管柱层析(1×30cm)，其中，以异丙醇(isorpopanol)∶水＝20∶80(体积比)之冲提液冲提出第二层析峰，命名为DCMPbL6，7D2；以异丙醇(isorpopanol)∶水＝30∶70(体积比)之冲提液冲提出第三层析峰，命名为DCMPbL6，7D3，以异丙醇(isorpopanol)∶水＝40∶60(体积比)之冲提液冲提出第四层析峰，命名为DCMPbL6，7D4。
其中，DCMPbL6，7D2再经HPLC反相(reverse phase)C18管柱在冲提液为甲醇∶水∶乙酸＝35∶65∶1(体积比)时冲提，收集其中之第二层析峰，命名为DCMPbL6，7D2H2。
DCMPbL6，7D3再经HPLC反相(reverse phase)C18管柱在冲提液为甲醇∶水∶乙酸＝40∶60∶1(体积比)时冲提，收集其中之第三层析峰，命名为DCMPbL6，7D3H3。
而，DCMPbL6，7D4则经HPLC反相(reverse phase)C18管柱则在冲提液为甲醇∶水∶乙酸＝45∶55∶1(体积比)时进行冲提，收集其中之第三层析峰，系命名为DCMPbL6，7D4H3。其分离流程如图1所示。
(十二)霍山石斛醇萃取物对RPE吞吃作用的影响：
请参考图2，其为霍山石斛甲醇萃取物对RPE细胞吞吃作用影响的柱形图。如第二图所示，不同浓度的霍山石斛甲醇萃取物(0.1、1、10、100μg/ml)对于RPE细胞的吞吃作用皆具有显著的促进效果；而浓度为10％的FCS亦可显著促进RPE细胞的吞吃作用，相关的操作流程分述于后：将104个RPE细胞置入96槽培养盘(96 well culture plate)中，以含有10％FCS的DMEM培养48小时，接着改以含有2％FCS的DMEM作为培养液，之后分别加入不同浓度的霍山石斛甲醇萃取物，48小时后，每槽内加入浓度为2×107FITC-ROS细胞/ml的溶液50μl。4小时之后，以PBS洗去多余的FITC-ROS细胞，最后则以多重标定冷光侦测技术仪(1420 Multilabel counter(PE)measure system)进行荧光强度的测试。其中以利用2％FCS处理RPE细胞所得之吞吃作用促进效果作为基础，符号『#』代表与该基础作比较所得之差异度达到显著水平0.05，符号『*』则表示差异度达显著水平0.01。由上述内容可知，凡是具有霍山石斛甲醇萃取物的组成物、组成分或是其它具生理活性的组成，纵使其具有其它具有生理可接受性的载体(physiologically acceptablecarrier)，该组成将可因包含有霍山石斛甲醇萃取物而对RPE细胞的吞吃作用具有促进作用；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
请参考图3，其为霍山石斛萃取物对RPE细胞吞吃作用影响的柱形图。如图3所示，不同霍山石斛萃取物(1μg/ml之DCMPe/h与1、10μg/ml之DCMPe/m以及0.1、1、10μg/ml之DCMPb)对于RPE细胞的吞吃作用皆具有显著的促进效果。相关的操作流程分述于后：将104个RPE细胞置入96槽培养盘(96 well culture plate)中，以含有10％FCS的DMEM培养48小时，接着改以含有2％FCS的DMEM作为培养液，之后分别加入不同浓度的霍山石斛萃取物(DCMPe/h、DCMPe/m、DCMPb)，48小时后，每槽内加入浓度为2×107 FITC-ROS细胞/ml的溶液50μl。4小时之后，以PBS洗去多余的FITC-ROS细胞，最后则以多重标定冷光侦测技术仪(1420Multilabel counter(PE)measure system)进行荧光强度的测试。其中以利用2％FCS处理RPE细胞所得之吞吃作用促进效果作为基础，符号『#』代表与该基础作比较所得之差异度达到显著水平0.05，符号『*』则表示差异度达显著水平0.01。由上述内容可知，具有霍山石斛萃取物(DCMPe/h、DCMPe/m、DCMPb)的组成物、组成分或是其它具生理活性的组成，即使其包含有其它具有生理可接受性的载体，该组成将可因包含霍山石斛萃取物(DCMPe/h、DCMPe/m、DCMPb)而对RPE细胞的吞吃作用具有促进作用；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
另外，上述纯化后的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2、DCMPbL6，7D3H3、DCMPbL6，7D4H3亦可显著促进RPE细胞的吞吃作用。举DCMPbL6，7D2H2为例，不同浓度的DCMPbL6，7D2H2(0.1、1、10、100μg/ml)对于RPE细胞的吞吃作用皆具有显著的促进作用，相关结果请参考图4；其相关操作程序简述于后：将104个RPE细胞置入96槽培养盘(96 wellculture plate)中，以含有10％FCS的DMEM培养48小时，接着改以含有2％FCS的DMEM作为培养液，之后分别加入不同浓度的霍山石斛萃取物(DCMPbL6，7D2H2)，48小时后，每槽内加入浓度为2×107 FITC-ROS细胞/ml的溶液50μl。4小时之后，以PBS洗去多余的FITC-ROS细胞，最后则以多重标定冷光侦测技术仪(1420 Multilabel counter(PE)measuresystem)进行荧光强度的测试。其中以利用2％FCS处理RPE细胞所得之吞吃作用促进效果作为基础，符号『#』代表与该基础作比较所得之差异度达到显著水平0.05，符号『*』则表示差异度达显著水平0.01。其中，霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2的化学结构至今尚无法确定，但是其之存在已确实可由图5至图11所示的结果(600-MHz的NMR、DEPT、HMQC、HMBC、COSY图谱以及UV光谱)所证明；其中图5至图10为利用二甲基枫(dimethylsulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂以600-MHz或是500-MHz对霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2进行分析而得到的NMR、DEPT、HMQC、HMBC、COSY(500-MHz)图谱；图11则为霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2的UV光谱图。进一步来看，任何具有霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2而具有生理活性的组成，虽然可能包含其它具有生理可接受性载体，但是该组成都将因包含霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D2H2而对RPE细胞的吞吃作用具有促进作用；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
另外，就霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3而言，不同浓度的DCMPbL6，7D3H3(0.1、1μg/ml)对于RPE细胞的吞吃作用皆具有显著的促进作用，相关结果请参考图12；其相关操作程序简述于后：将104个RPE细胞置入96槽培养盘(96 well culture plate)中，以含有10％FCS的DMEM培养48小时，接着改以含有2％FCS的DMEM作为培养液，之后分别加入不同浓度的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3，48小时后，每槽内加入浓度为2×107 FITC-ROS细胞/ml的溶液50μl。4小时之后，以PBS洗去多余的FITC-ROS细胞，最后则以多重标定冷光侦测技术仪(1420 Multilabel counter(PE)measure system)进行荧光强度的测试。其中以利用2％FCS处理RPE细胞所得的吞吃作用促进效果作为基础，符号『#』代表与该基础作比较所得之差异度达到显著水平0.05，符号『*』则表示差异度达显著水平0.01。其中，霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3的化学结构至今尚无法确定，但是其之存在已确实可由图13至图17所示的结果所证明，其为利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂以500-MHz对霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3进行分析而得到的NMR、DEPT、HMBC、COSY图谱。进一步来看，因为DCMPbL6，7D3H3对于RPE细胞的吞吃作用具有显著的促进作用，因而，任何具有霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3且具生理活性的组成，虽然可能包含其它具生理可接受性的载体，但是该组成都将因包含霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D3H3而对RPE细胞的吞吃作用具有促进作用；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
另外，就霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3而言，不同浓度的DCMPbL6，7D4H3(0.1、1、10μg/ml)对于RPE细胞的吞吃作用皆具有显著的促进作用，相关结果请参考图18；其相关操作程序简述于后：将104个RPE细胞置入96槽培养盘(96 well culture plate)中，以含有10％FCS的DMEM培养48小时，接着改以含有2％FCS的DMEM作为培养液，之后分别加入不同浓度的霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3，48小时后，每槽内加入浓度为2×107 FITC-ROS细胞/ml的溶液50μl。4小时之后，以PBS洗去多余的FITC-ROS细胞，最后则以多重标定冷光侦测技术仪(1420 Multilabelcounter(PE)measure system)进行荧光强度的测试。其中以利用2％FCS处理RPE细胞所得之吞吃作用促进效果作为基础，符号『#』代表与该基础作比较所得之差异度达到显著水平0.05，符号『*』则表示差异度达显著水平0.01。其中，霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3的化学结构至今尚无法确定，但是其之存在已确实可由图19至图24所示的结果所证明，为利用二甲基枫(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)作为溶剂以500-MHz对霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3进行分析而得到的NMR、DEPT、HMQC、HMBC、COSY图谱。进一步来看，因为DCMPbL6，7D4H3对于RPE细胞的吞吃作用具有显著的促进作用，故，任何具有霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3且具生理活性的组成，虽然可能包含其它具有生理可接受性的载体，但是该组成都将因包含霍山石斛萃取物DCMPbL6，7D4H3而对RPE细胞的吞吃作用具有促进作用；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
(十三)霍山石斛萃取物对于RPE细胞对一氧化氮生成作用的影响
请参考图25，为霍山石斛萃取物对于RPE细胞对一氧化氮生成作用的影响柱形图。由图25可知：不同的霍山石斛萃取物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)对于RPE细胞对一氧化氮生成作用的影响并不同；其中符号『#』与『*』分别代表所得结果与利用2％FCS处理RPE细胞所得之一氧化氮生成作用的促进效果相比较时所获得的差异度达到显著水平0.05与0.01。由图25可知：浓度为100、1000μg/ml的霍山石斛甲醇萃取物DCM，浓度为10、100、1000μg/ml的霍山石斛乙酸乙酯萃取物DCMPe，以及浓度为10或1000μg/ml的霍山石斛正丁醇萃取物DCMPb，以及浓度为100与1000μg/ml的霍山石斛正己烷萃取物DCMPh皆可显著促进RPE细胞对一氧化氮生成作用的影响。相关操作程序简述于后：将104个RPE细胞置入96槽培养盘(96 wellculture plate)中，以含有10％FCS的DMEM培养48小时，接着改以含有2％FCS的DMEM作为培养液，之后分别加入不同浓度的霍山石斛萃取物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)，48小时后，每槽内加入浓度为2×107 FITC-ROS细胞/ml的溶液50μl。4小时之后，以PBS洗去多余的FITC-ROS细胞，最后则以多重标定冷光侦测技术仪(1420 Multilabel counter(PE)measure system)进行荧光强度的测试。进一步来看，因为不同浓度的霍山石斛萃取物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)对于RPE细胞的一氧化氮生成作用具有显著的促进作用，因此，任何包含霍山石斛萃取物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)且具生理活性的组成，虽然其可能具有其它具生理可接受性的载体，但是该组成都将因包含霍山石斛萃取物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)而对RPE细胞的一氧化氮生成作用具有促进作用；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
(十四)霍山石斛萃取物对RPE细胞的肝生长因子β-actin与HGF表达的促进作用
请参考图26(A)-(B)，其为以霍山石斛甲醇萃取物处理RPE细胞所得到的β-actin(A)与HGF(B)表达电泳图；其中所述生长因子的表达是通过RT-PCR的方法而呈现。由图26可知，霍山石斛甲醇萃取物明显具有促进RPE细胞对于肝功能因子β-actin与HGF表达的作用；其相关操作程序简述于后：将RPE细胞移入含有2％FCS与1000μg/ml之霍山石斛甲醇萃取物的DMEM中培养24小时后进行电泳，其中以由1μg全RNA所产生的cDNA量当作β-actin(A)的模板(template)(1×)；以由0.5μg全RNA所产生的cDNA量当作HGF(B)的模板(template)(1×)。第一泳道(lane)为以×174/Hae III作为标记(marker)所得的结果；第二泳道为一倍模板的电泳结果；第三泳道为模板稀释两倍后所得的电泳结果；第四泳道为模板稀释四倍后所得的电泳结果；第五泳道为模板稀释八倍后所得的电泳结果；第六泳道则为模板稀释十六倍后所得的电泳结果。
请参阅图27，其为不同霍山石斛萃取物对RPE细胞的HGF的mRNA表达的电泳图。由图27可知，霍山石斛正己烷萃取物DCMPh明显具有促进RPE细胞对于肝功能因子β-actin与HGF表达的作用；其相关操作程序简述于后：将RPE细胞移入含有2％FCS与0.1μg/ml不同霍山石斛萃取物(正己烷萃取物DCMPh、乙酸乙酯萃取物DCMPe以及正丁醇萃取物DCMPb)的DMEM中培养48小时后进行电泳，其中以由1μg全RNA所产生的cDNA量当作模板(template)(1×)。第一泳道(lane)为以×174/Hae III作为标记(marker)所得的结果；第二泳道为HGF控制组的电泳结果；第三泳道为β-actin控制组的电泳结果；第四泳道为以霍山石斛正己烷萃取物DCMPh处理RPE细胞所得到的HGF表达的电泳结果；第五泳道为以霍山石斛正己烷萃取物DCMPh处理RPE细胞所得到的β-actin表达的电泳结果；第六泳道为以霍山石斛乙酸乙酯萃取物DCMPe处理RPE细胞所得到的HGF表达的电泳结果；第七泳道为以霍山石斛乙酸乙酯萃取物DCMPe处理RPE细胞所得到的β-actin表达的电泳结果；第八泳道为以霍山石斛正丁醇萃取物DCMPb处理RPE细胞所得到的HGF表达的电泳结果；第九泳道为以霍山石斛正丁醇萃取物DCMPb处理RPE细胞所得到的β-actin表达的电泳结果。
进一步来看，因为不同浓度的霍山石斛萃取物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)对于RPE细胞的肝生长因子β-actin与HGF的表达具有显著的促进作用，因此，任何具有霍山石斛萃取物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)且具生理活性的组成，虽然其可能具有其它具生理可接受性的载体，但是，该组成都将因包含霍山石斛萃取物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)而对RPE细胞的肝生长因子β-actin与HGF的表达具有促进作用；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
(十五)霍山石斛萃取物对RPE细胞在正常及缺氧情况下对bFGF，VEGF及TGF-β基因表达的抑制作用。
请参考图28(A)至图29(B)， 其为将石斛粗萃取物DeCaM对RPE 细胞在正常情况下对β-actin，bFGF，VEGF及TGF-β基因表达 的作用，其中以β-actin的mRNA表达作为对照组。由图28(A)至图29(B)的结果可知：对正常的RPE细胞而言，其bFGF mRNA的表达量被霍山石斛甲醇萃取物抑制了4倍；VEGF mRNA的表达量则被抑制2倍；TGF-βmRNA的表达量则无特殊变化。相关的操作程序系简述于后：将RPE细胞移入含有2％FCS与1000μg/ml的霍山石斛粗萃取物DeCaM的DMEM中培养48小时后抽取RNA，利用RT-PCR方法进行分析，其中以由1μg全RNA所产生的cDNA量当作模板(template)(1×)。第一泳道(lane)为以×174作为标记(marker)所得的结果；第二泳道为以100bp梯状物(ladder)作标记所得的结果；第三泳道为一倍模板的电泳结果；第四泳道为模板稀释两倍后所得的电泳结果；第五泳道为模板稀释四倍后所得的电泳结果；第六泳道为模板稀释八倍后所得的电泳结果；第七泳道为模板稀释十六倍后所得的电泳结果；第八泳道为模板稀释三十二倍后所得的电泳结果。
进一步来看，因为霍山石斛粗萃取物DeCaM在正常情况下对RPE细胞之bFGF，VEGF具有显著的抑制作用，因此，任何具有霍山石斛粗萃取物DeCaM且具生理活性的组成，虽然其可能具有其它具生理可接受性的载体，但是，该组成都将因包含霍山石斛粗萃取物DeCaM而对RPE细胞的bFGF，VEGF的表达具有抑制作用；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
请参考图30(A)至图31(B)，其为将石斛粗萃取物DeCaM对RPE细胞在缺氧情况(hypoxia)下对β-actin，bFGF，VEGF及TGF-β基因表达的作用，其中以β-actin的mRNA表达作为对照组。由图30(A)至图31(B)的结果可知：对缺氧的RPE细胞而言，其bFGF mRNA的表达量被霍山石斛粗萃取物抑制了2倍；VEGF mRNA的表达量则被抑制2倍；TGF-βmRNA的表达量则被抑制了4倍。相关的操作程序系简述于后：将RPE细胞移入含有2％FCS与1000μg/ml的霍山石斛粗萃取物DeCaM的DMEM中培养48小时后抽取RNA，利用RT-PCR方法进行分析，其中以由1μg全RNA所产生的cDNA量当作模板(template)(1×)。第一泳道(lane)为以×174作为标记(marker)所得的结果；第二泳道为以100bp梯状物(ladder)作标记所得的结果；第三泳道为一倍模板的电泳结果；第四泳道为模板稀释两倍后所得的电泳结果；第五泳道为模板稀释四倍后所得的电泳结果；第六泳道为模板稀释八倍后所得的电泳结果；第七泳道为模板稀释十六倍后所得的电泳结果；第八泳道为模板稀释三十二倍后所得的电泳结果。
进一步来看，因为霍山石斛粗萃取物DeCaM在缺氧情况下对RPE细胞之bFGF，VEGF及TGF-β的表达都具有显著的抑制作用，因此，任何具有霍山石斛粗萃取物DeCaM且具有生理活性的组成，虽然其可能具有其它具生理可接受性的载体，但是，该组成都将因包含霍山石斛粗萃取物DeCaM而对RPE细胞的bFGF，VEGF及TGF-β之表达具有抑制作用；其中，该载体为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。由以上内容可知，霍山石斛萃取物可选择性调节在眼底疾病中扮演重要角色的基因，如bFGF、VEGF、TGF-β等mRNA的表达。
(十六)试管内醣化白蛋白(AGE-BSA)制作
配置含有0.1g/ml牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)第五划分(fraction V)以及180mg/ml的葡萄糖(glucose)的PBS，以孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，各取5ml加于15ml试管中(反应浓度为760mM BSA和0.5M葡萄糖)，另外也作不含葡萄糖的对照组，密封后置于黑暗37℃培养箱中。放置2、4、8、12、16周后取出，在4℃以100倍体积的三次水进行透析四次，以完全去除葡萄糖，无菌过滤冷冻干燥，秤重定量回溶分装后再冷冻干燥，置-20℃保存。
(十七)霍山石斛萃取物与HGF对RPE细胞降解AGE-BSA能力的影响
相关操作流程简述为：在96槽的培养盘(96 well culture plate)中移入1×106个RPE细胞I，以含10％FCS的DMEM作培养液，在37℃、大气中含有5％CO2的条件下培养48小时。共有五组实验处理，每组两盘，实验处理36、48小时后以0.01％EDTA处理打下细胞，置于DMEM中，计算细胞数目。五组处理条件分别为：
组别 DCM(μg/ml) HGF(ng/ml)
1     100     0
2     10     0
3     1     0
4     0     50
5     0     0
溶液以1200rpm离心5分钟，细胞再回悬于10ml DMEM中两次，再次离心以0.7ml均质缓冲液(Homogenization buffer)(50mM醋酸钠缓冲液，pH4.5；1mM双硫苏醣醇(dithiothreitol，DTT)；0.15M氯化钠；3mM氮化钠NaN3)含0.1％TritonX-100回悬浮后以超音波振荡器震荡四次，每次15秒，以彻底打破细胞，以13000rpm离15分钟，再以15秒×4次做超音波震荡，离心11000rpm 15分钟，收集上清液；无菌过滤，计算蛋白质浓度，取AGE-BSA 1000μg/ml，无菌过滤。反应，0、6、12、24、48、72小时后，电泳观察BSA与AGE-BSA降解的形式与程度。
(十八)霍山石斛甲醇萃取物与肝生长因子HGF对RPE细胞的蛋白质水解活性的影响
请参考图32，其为霍山石斛甲醇萃取物与肝生长因子HGF对RPE细胞的蛋白质水解活性影响电泳图。由图32可知，水解活性在各处理组之间差异不大，但是以10μg/ml DCM及50ng/ml HGF处理RPE细胞所得的水解作用与未接受处理的控制组作比较，则可清楚看见RPE细胞的水解作用有所增加；相关操作步骤为： 将10 6 个RPE细胞移入直径10公分的培养皿之中，先以含有10％FCS的DMEM中培养RPE细胞48小时，再以含有2％FCS与不同浓度之霍山石斛甲醇萃取物DCM或是HGF：(a)100μg/ml DCM；(b)10μg/ml DCM；(c)1μg/ml DCM；(d)50ng/ml HGF以及(e)控制组的DMEM进行培养，48小时后，萃取出细胞的蛋白质(cellular_extracts)不分划分(fraction)，先将蛋白质定量再与AGE-BSA共同反应，终反应浓度为细胞萃取物(萃出的蛋白质)和AGE-BSA皆为500μg/ml，亦即酵素(细胞萃取物)与反应基质(AGE-BSA)比为1∶1，培养82小时；其中第一泳道(lane)为以×174作为标记(marker)所得的结果；第二泳道细胞萃取物所得的结果；第三至第八泳道则为0-82小时的电泳结果；第九至十则是仅以AGE进行电泳所得到的结果。
另外，请参考图33，其为根据图32所绘制出的霍山石斛甲醇萃取物与肝生长因子HGF对RPE细胞的蛋白质水解活性影响的折线图。由图33可知：水解作用的速率在12到48小时的作用时间中速度较快，而在培养48与82小时之时间点之间的降解形式在不同处理间仅有些微差异；而在培养48小时之时，10μg/ml DCM对RPE细胞水解活性的影响最强，而100μg/ml DCM与50ng/ml HGF的效果则是次之。
由此可知，霍山石斛甲醇萃取物与肝生长因子HGF对于RPE细胞的蛋白质水解活性具有促进作用，故，任何具有霍山石斛甲醇萃取物DCM或是HGF且具有生理活性的组成，虽然其可能具有其它具生理可接受性的载体，但是该组成都将因包含霍山石斛甲醇萃取物DCM或是HGF而对RPE细胞的蛋白质水解活性具有促进作用；其中，该载体为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
(二十)以低剂量的链脲菌素(streptozotocin，STZ)诱导建立自体免疫糖尿病并发症的动物模型
请参考图34，其为霍山石斛甲醇萃取物对具有糖尿病的老鼠体内的AGE含量的影响柱形图。由图34可知，以霍山石斛甲醇萃取物DCM处理具有糖尿病的老鼠后，该老鼠体内的AGE含量明显的下降，亦即，通过此动物试验可知：霍山石斛甲醇萃取物确实具有减少AGE含量的功效。其相关操作程序为：取6周大的C57BL/6J公鼠，藉由pH 4.5，浓度为0.15M的柠檬酸缓冲液(citric acid buffer)将STZ以每日每公斤体重50mg的剂量注入公鼠体内，连续注射5天，待12-14天之后以眼窝采血测得血糖浓度要大于250mg/dl才达到要求。将符合要求的公鼠分成四组，分别依体重差异而饲以含有不同剂量霍山石斛甲醇萃取物的饲料(0mg/kg/day、1g/kg/day、200mg/kg/day以及40mg/kg/day)，每周采血一次观察，若血糖下降则就再以200mg/kg/day的剂量注射STZ，让老鼠维持在高血糖的环境中，约4～8周后，取眼窝血测血糖及AGE AB。另外亦取眼睛、肝、肾作石蜡包埋切片先以HEstain观看病理变化。在实验中记录体重、饮水、饲料的消耗量。并且留意老鼠外观皮毛的变化及四肢和尾巴血液循还状况并拍照纪录；其中以符号『*』代表与该控制组作比较所得之差异度达到显著水平0.05，符号『**』则表示差异度达显著水平0.01。
进一步来看，霍山石斛甲醇萃取物确实具有减少AGE量的功效，因此，任何具有霍山石斛甲醇萃取物DCM且具有生理活性的组成，虽然其可能具有其它具生理可接受性的载体，但是该组成都将因包含霍山石斛甲醇萃取物DCM而对降低体内AGE含量具有功效；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
由以上内容可知，透过悉心试验与研究，本案申请人亦已发现并证明霍山石斛(Dendrobii Caulis)植物萃取物确实可调控视网膜黑色素上皮(retinalpigment epithelium，RPE)细胞的作用并间接影响其相关机制。本发明所提出的霍山石斛萃取物除了对RPE细胞的吞吃作用、一氧化氮生成作用、肝生长因子表现等作用具有促进功效之外，其亦可减少体内AGE含量。另外，不管是在正常或是缺氧情况下，霍山石斛萃取物对RPE细胞内的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和纤维母细胞生长素(basicfibroblast growth factor，bFGF)以及转化生长因子(transforming growthfactor-beta，TGF-β)的基因表现都具有显著的抑制作用。故，任何含有霍山石斛萃取物的组合物，例如一包含霍山石斛萃取物及其生理可接受性载体的具有生理活性的组合物，该组合物都将因具有本发明所提出的各霍山石斛萃取物而具有上述的功效；其中，该载体系为任何可携带该萃取物或是该萃取物的同分异构物而移动的物质，例如，可为一胶囊(内部则可盛有该萃取物或是该萃取物的同分异构物)。
进一步来看，因为视网膜黑色素上皮细胞、体内的一氧化氮生成作用、肝生长因子、体内的AGE含量、RPE细胞内的血管内皮生长因子(VEGF)和纤维母细胞生长素(bFGF)以及转化生长因子(TGF-β)的基因表达与心血管疾病、神经疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、眼睛疾病以及自体免疫等疾病有关(请参考本申请文件的背景技术)；而本发明的霍山石斛萃取物又与视网膜黑色素上皮细胞量、一氧化氮生成作用、肝生长因子作用、体内AGE量、RPE细胞内的血管内皮生长因子(VEGF)和纤维母细胞生长素(bFGF)的作用以及转化生长因子(TGF-β)的基因表达有关，因此，本发明的霍山石斛萃取物亦将对动脉硬化、血管受损、中风、视网膜神经细胞病变、RPE细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变、脑部锥状神经病变、肾脏丝球体病变与肾小球基膜病变、葡萄膜炎、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎、布鲁赫氏膜病变、糖尿病及其并发症以及败血性休克等疾病具有影响。另外，因为本发明的实际应用范围非常大，并不局限于对视网膜上皮细胞与体内AGE含量的作用，而且是相关萃取物应用的首例，因此本发明具有显著的新颖性与创造性。即使本领域技术人员运用相关知识对本发明可进行各种修饰，但这些修饰仍在本发明申请所要保护的范围之内。
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Claims (26)

1.一种具有生理活性的霍山石斛植物的萃取物，其是利用水溶性有机溶剂或该水溶性有机溶剂与水的混合物来萃取所述植物而得到的。
2.如权利要求1所述的萃取物，其中：
该水溶性有机溶剂系为含碳数介于1～8的醇类、烷类或酯类中的一种；及/或
该醇类系为甲醇或乙醇。
3.如权利要求1所述的萃取物，其中该萃取物具有促进视网膜黑色素上皮细胞的作用；及/或
该萃取物具有减少生物体中高度醣化终产物含量的作用。
4.一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及前述权利要求1-3任意一项所述的萃取物或是该萃取物的同分异构物。
5.如权利要求4所述的组合物，其中：
所述具有生理活性的组合物为一种具有药理活性的组成物；
所述具有生理可接受性的载体为一具有药理活性的载体；
所述具有生理活性的组合物为对眼底疾病具有药理活性的组成物；
所述具有生理活性的组合物为对视网膜神经病变具有药理活性的组合物；
所述视网膜神经病变选自，但不限于：视网膜神经细胞病变、视网膜黑色素上皮细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变；
所述眼睛疾病选自，但不限于：葡萄膜炎、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎与布鲁赫氏膜病变、糖尿病视网膜病变及糖尿病诱发血管病变及AGE所导致肾脏并发症。
6.一种制备霍山石斛植物萃取物的方法，其包含至少一个以水、水溶性有机溶剂或是水与该水溶性有机溶剂的混合物来萃取该植物的步骤。
7.一种制备植物萃取物的方法，其包含下述步骤：
a)以第一醇类萃取该植物以产生第一醇类萃取物；
b)以水与烷类同时萃取该第一醇类萃取物以产生第一水层萃取物与烷类萃取物；
c)以酯类萃取该水层以产生酯类萃取物与第二水层萃取物；以及
d)以第二醇类萃取该第二水层萃取物以产生第二醇类萃取物与第三水层萃取物。
8.如权利要求7所述的方法，其中：
所述植物为兰科植物；及/或
所述兰科植物属于石斛属。
9.如权利要求7所述的方法，其中步骤a)还包含下列步骤：
a1)提供该植物的干物质；
a2)以粉磨机磨碎该干物质；
a3)以所述第一醇类萃取被磨碎的该物质以获得所述第一醇类萃取物。
10.如权利要求7所述的方法，其中：
所述第一醇类的含碳数为1-8；
所述第一醇类为甲醇或乙醇；
所述第二醇类为含碳数1-8的醇类；
所述第二醇类为丁醇或正丁醇；
所述步骤b)还包含下列步骤：
b1)以减压、浓缩、抽气等步骤来干燥该第一醇类萃取物；
所述烷类萃取物为正己烷萃取物；
所述步骤c)还包含下列步骤：
c1)干燥该酯类萃取物；以及
c2)以己烷与甲醇萃取干燥后的该酯类萃取物以产生己烷萃取物与甲醇萃取物；
该己烷萃取物经减压、浓缩抽气等步骤而被干燥；及/或
该酯类为乙酸乙酯。
11.如权利要求7所述的方法，还包含步骤：
e)以层析法层析所述第二醇类萃取物以获得一个命名为DCMPbL6，7的第一冲提物；以及
f)以第一冲提剂冲提该DCMPbL6，7以获得第二冲提物。
12.如权利要求11所述的方法，其中：
所述步骤e)通过第二冲提剂而实施；及/或
所述第二冲提剂的组成为体积比为1∶1的甲醇与水的混合物。
13.如权利要求11所述的方法，其中：
所述第一冲提剂为异丙醇与水以体积比为20∶80而组成的混合物，且该第二冲提物被命名为DCMPbL6，7D2；及/或
所述DCMPbL6，7D2通过甲醇/水/乙酸以体积比为35∶65∶1而组成的混合物进行层析并产生第三冲提物DCMPbL6，7D2H2。
14.如权利要求11所述的方法，其中：
所述第一冲提物为异内醇与水以体积比为30∶70而组成的混合物，且该第二冲提物被命名为DCMPbL6，7D3；及/或
所述DCMPbL6，7D3通过甲醇/水/乙酸以体积比为40∶60∶1而组成的混合物进行层析并产生第四冲提物DCMPbL6，7D3H3。
15.如权利要求11所述的方法，其中：
所述第一冲提剂为异丙醇与水以体积比为40∶60而组成的混合物，且该第二冲提物被命名为DCMPbL6，7D4；
所述DCMPbL6，7D4通过甲醇/水/乙酸以体积比为45∶55∶1而组成的混合物进行层析并产生第五冲提物DCMPbL6，7D4H3。
16.一种霍山石斛植物萃取物，其为权利要求7的方法所生成的萃取物重的一种，其中：
所述植物萃取物具有促进视网膜黑色素上皮细胞的作用，及/或
所述萃取物具有减少生物体中高度醣化终产物含量的作用。
17.一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及权利要求16所述的植物萃取物或是该植物萃取物的同分异构物。
18.如权利要求17所述的组合物，其中：
所述具有生理活性的组合物为一种具有药理活性的组合物；
所述具有生理可接受性的载体为具有药理活性的载体；
所述组合物为一药物组合物，其对选自下列疾病群组的任一疾病具有药理作用：心血管疾病、肾脏疾病、眼睛疾病；
所述疾病系选自下列疾病：动脉硬化、血管受损、中风、视网膜神经细胞病变、视网膜黑色素上皮细胞病变、无轴突细胞病变、视神经节细胞病变、黏质细胞病变、视网膜神经胶质细胞病变、肾脏丝球体病变与肾小球基膜病变、视网膜血管新生、增殖性视网膜病变、老年性黄斑病变、光接受器退化、视网膜发炎、布鲁赫氏膜病变、糖尿病及其并发症。
19.一种组成物，系为申请专利范围第11项中所获致的该第二冲提物，其中：
该组成物具有促进视网膜黑色素上皮细胞的作用；及/或
该组成物具有减少生物体中高度醣化终产物含量的作用。
20.一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及权利要求19所述的任意组成物或是该组成物的同分异构物。
21.一种化合物，其为权利要求13中所获得的第三冲提物，其中：
该化合物具有促进视网膜黑色素上皮细胞的作用；及/或
该化合物具有减少生物体中高度醣化终产物含量的作用。
22.一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及权利要求21所述的任意化合物或该化合物的同分异构物。
23.一种组成分，其为权利要求14所获得的第四冲提物，其中：
该组成物具有促进视网膜黑色素上皮细胞的作用；及/或
该组成物具有减少生物体中高度醣化终产物含量的作用。
24.一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及权利要求23所述的组成分或是该组成分的同分异构物。
25.一种组成分，其为权利要求16中所获得的第五冲提物，其中：
该组成分具有促进视网膜黑色素上皮细胞的作用；及/或
该组成分具有减少生物体中高度醣化终产物含量的作用。
26.一种具有生理活性的组合物，其包含一个具有生理可接受性的载体以及权利要求25所述的组成分或是该组成分的同分异构物。
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