KR20050022276A

KR20050022276A - 곽산 석곡 추출물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20050022276A
Application number: KR1020040055902A
Authority: KR
Inventors: 롱-쭌 우
Original assignee: 내셔널 양밍 유니버시티
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2004-07-19
Publication date: 2005-03-07
Also published as: US20050048137A1; CN1589889A; EP1510218B1; US7101577B2; CN100377734C; US8067039B2; KR100759154B1; US20090208595A1; US20080044495A1; TWI294285B; EP1510218A1; ATE521360T1; TW200507867A

Abstract

본 발명은 생리활성을 갖는 곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 추출물 및 그 관련 제조 공정을을 제공한다. 그 중 상기 추출물은 식물체를 수용성 유기용제로 추출 또는 수용성 유기용제가 함유되어 있는 유기용제 및 물의 조성물을 추출함으로써 얻어진다. 또한, 사용된 수용성 유기용제는 주로 탄소수가 1 내지 8에 개재하는 알콜류 및 알킬류와 에스테르류이며, 상기 추출물은 망막 흑색소 상피세포를 조절제어하는 작용의 효과를 갖는다.

Description

곽산 석곡 추출물 및 그 제조 방법{EXTRACT OF PLANT DENDROBII CAULIS AND PREPARING PROCESS THEREOF}

본 발명은 망막흑색소 상피(網膜黑色素上皮;retinal pigment epithelium; RPE)의 조제를 제어하는 세포작용을 갖는 추출물 및 그 제조 프로세스에 관한 것이며, 특히, 곽산 석곡(石斛;Dendrobii Caulis) 추출물 및 그 제조 프로세스에 관한 것이다.

현재 민간에서 가장 중요한 안과용 중국약초는 석곡이며, 이 석곡은 난초과에 속하며 그 약용부위는 줄기이다. 감미로운 맛이 있으면서도 소금기가 있다. 어느 일부 중국의 약물사본에는 석곡 종류가 예를 들면 타액분비장애(salivary defects), 위통 및 안과장해(眼科障害)와 같은 병의 치료에 효과가 있는 것이 개시되고 있다. 우리의 이전의 연구조사의 경험에 의하면 석곡은 가장 약효가 있는 것이다.

RPE 세포는 망막(網膜)의 최외층(最外層)에 위치하고, 브르크막(Bruch's membrane)과 광수용체(photoreceptors) 사이에 배열되어 하나의 단층세포(1)를 형성하고 있다. RPE 세포의 상단부의 길고 부드러운 모(毛) 형상의 돌기(villous process)는 광수용체의 바깥쪽 단과 서로 접촉하고, 그 하단에는 많은 브르크막을 통과하여 맥락막(脈絡膜;choroid)과 긴밀하게 연접된 베이설 인플로이딩(basal inflodings)이 있다. 이것은 효과적으로 맥락막 및 망막 신경층의 유독물질 및 대사물(代謝物)을 청소 또는 수송하므로, RPE 세포도 매우 중요한 망막혈관 배리어(blood-retinal barrier)를 구성한다.

그 외에, RPE도 광선을 흡수하는 기능을 갖는 것 외에, 탐식포(貪食胞; phagosome) 형상의 세포 및 추상세포(錐狀細胞;cone cell)가 광선의 자극을 받아 몰락한 외절(rod outer segments;ROS), 탐식포의 분해, 세포외기질(extracellular matrix)과 멜라닌의 합성, 광수용체의 외단의 재생시에 필요한 물질의 제공, 비타민A의 저장 및 운송, 로드프신의 합성(rhodopsin), 망막의 접착력 등의 작용과 연관된다. 통계에 따르면, 쥐(rat)의 하나의 RPE 세포는 하루에 25,000개의 간상세포(rod cell) 및 추상세포가 광선의 자극을 받아서 몰락한 외절을 청소하지 않으면 안된다. 이것은 이와 같이 빈번한 탐식기능의 중요성을 말하는 것이다(2). RPE 세포의 정상적인 탐식작용은 망막 중의 광수용체의 건강유지에 대하여 큰 관련성을 가지므로, 일단 탐식기능이 저하하면 광수용체의 퇴화(degeneration)를 초래한다(3). 그것은 RPE 세포는 연령의 증가에 따라서 사망 또는 다른 곳으로 유리되므로로, 예를 들어 노화된 RPE 세포가 탐식능력을 갖는다고 하여도 그 소화흡수(digestion) 능력은 벌써 명확하게 저하하고 있다(4). 1995년 Panda-Jonas 등의 사람들은 이미 사람의 광수용체는 매년 0.2-0.4% 손실되는 동시에, 간상세포의 손실은 추상세포의 손실보다도 많다고 지적하고 있다(5). 이것은 노인들의 시력감퇴 및 병의 발생을 초래하므로, RPE 세포의 기능유지는 시각계통에 대하여 매우 중요하다.

또한, 산화질소(NO)는 성질이 불안정하고 반감기가 수초밖에 되지 않는 불안정한 가스분자(6)이지만, 여러 종류의 생리기능을 갖고 있다. 이 산화질소(NO)는 전기중성이므로 자유롭게 세포막을 투과하여 진출할 수 있다(7). 한편 산화질소는 홀전자(unpaired electron)를 갖고 있으므로, 자유 라디칼과 유사하여 고도의 반응력을 가지며, 일단 형성하면 신속하게 세포막을 통과하여 작용을 발생시킨다(8). 면역계통에 있어서 산화질소는 세포독성을 방어 및 제어하는 역할을 한다. 그리고 혈관계통에 있어서 산화질소는 소위 내피세포 이완인자(EDRF)이고, 중추신경계통에 있어서 신경전도물질(Neurotransmitter)(7)로서 작용한다.

산화질소는 산화질소 신타아제(nitric oxide synthase;NOS)에 있어서, L-알기닌(L-arginine)을 L-시트룰린(L-citrulline)으로 전환하는 과정 중에서 석방되지만, 눈앞에 도달하기까지 상세한 산화질소 합성기제는 또한 완전하고 명백하게 알려져 있지 않다. 산화질소 신타아제에는 3종류의 이구체(異構體i;soforms)가 있으며, 그 중 neuronal NOS 및 endothelial NOS는 기본형이고 cNOS로 약칭한다. 그 활성으로서 칼슘이온 Ca++ 및 칼모듈린(calmodulin)의 조절을 받아서 발생하는 산화질소는 nM(10^-9M) 레벨에 속한다. 어떤 종류는 immunologic NOS로서 유발가능형(inducible form)에 속하고 iNOS로 약칭한다. 그러나 그 활성은 Ca++ 및 칼모듈린의 조절을 받지 않고, 발생한 산화질소는 mM(10^-6M) 레벨에 속한다. 그 중, cNOS 및 iNOS의 유전자(gene)는 다른 염색체 상에 위치한다(인류라면, endothelial on chromosome 7, Neuronal on chrosome 12, iNOS on chromosome17)(8,9).

현재 이미 망막 속의 망막신경세포(retinal neuron), RPE 세포, 무축삭세포 및 신경절세포(amacrine and ganglion cells), 뮐러세포(Muller cells) 등, 모두 산화질소 신타아제(NOS)의 존재가 있는 것을 발견하였다. 또한, 현재에 이르기까지, 이미 산화질소가 생리 및 병리상태에 있어서 모두 중요한 역할을 하는 동시에, 눈의 기능관계와 밀접한 것이 뒷받침되었다(10). 1994년, Kurenny 등의 사람들은 산화질소는 광수용체 상의 전압-게이트 이온 채널의 기능을 갖고 있음을 지적하였다. 따라서, 산화질소는 광선정보의 전달과 관련될 가능성이 있는 것으로 추측되었다(11). 1993년 Deussen 등의 사람들은 기초환경(basal condition) 또는 국소빈혈(局所貧血;ischmia) 하에서 산화질소는 망막혈류량의 제어능력을 갖는 것을 발견하였다(12). Tilton 등의 사람들도 산화질소는 당뇨병에 의해 기인된 망막내혈관이 받는 손실의 정도를 조절하는 것이 가능하다는 것을 지적하였다(13). 그리고, 1994년 Goureau 등의 사람들은 망막신경 아교세포(retinal glial cells) 및 망막색소 상피세포가 LPS, IFN-g, TNF-a의 자극을 받으면 NOS(nitric oxide synthase)의 표현을 촉진시키게 되고, 마침내 산화질소(NO)를 대량생산한다고 지적하고 있다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 산화질소는 망막이 염증을 입거나 또는 감염된 경우에는 방어역할을 할 수 있다(14). 그러나, 현재에 이르기까지, cNOS의 광수용체에서의 위치 및 특성은 아직 명확하지 않은 점이 있고, 어떤 문헌에서는 광수용체 본체에는 cNOS 활성이 있다고 지적하고 있지만, 또 어떤 문헌에서는 광수용체 외단에야말로 cNOS 활성이 있으며, 산화질소를 발생시킴으로써 광선의 전도(傳導), 신경시냅스(neuron synapse)의 신호전달, 생리상태하 또는 허혈상태하에서의 망막의 혈류량 등을 조절할 수 있다고 지적하고 있다(10). iNOS의 활성도 망막의 어떤 세포 중에 표현되고 있고, 예를 들면, RPE 세포 및 뮐러세포 등에서는 문헌에 보빈 RPE(bovine RPE) 배양에서, 만일 IFN-τ, LPS, TNF-α의 자극 후 약 12시간 경과하면 대량의 산화질소를 발생시킴과 함께 적어도 96시간 동안 지속된다고 지적하고 있다(15). 사이토킨(cytokines)의 RPE 세포의 iNOS 활성시의 영향은 상당히 복잡하다. 예를 들면, 보빈 RPE에 있어서는, LPS 및 IFN-τ 또는 IFN-α의 자극을 받게 되고, 이 자극이 있고 나서 대량의 산화질소가 발생할 수 있다. 그리고, bFGF는 NOS를 억제하는 작용을 가지며, TGF-β는 얼마의 촉진작용을 갖고 있다(18). 또한, 인간의 RPE 세포에 있어서는 반드시 Interleukin-1β의 자극이 있고 나서 비로소 대량의 NO를 발생시킬 수 있으며, LPS는 영향이 없고, TGF-β는 명백하게 산화질소를 발생시키는 것을 억제할 수 있다.

세균에 감염된 경우, iNOS의 표현(expressions)은 릴리스된 산화질소가 침입한 미생물을 살균하기 때문에 유리한 점이 있지만, 그 반면에 어떤 상황하에서는 릴리스된 산화질소가 과도하게 다량으로 생길 경우에는, 자가면역병 또는 패혈성(敗血性) 쇼크를 초래하게 된다. 1994년 Tilton 등의 사람들은 산화질소가 안저(眼底)의 염증반응과 관계가 있음을 설명하기 위해 제1 증거를 제출하였지만, 본 출원인은 iNOS 억제제(inhibitor)가 내독소(endotoxin)에 의해 초래된 포도막염(葡萄膜炎)을 차단할 수 있음을 발견하였다(18). 한편, Goureau 등의 사람들은 IFN-τ 및 LPS로 처리하여 대량의 산화질소를 발생시키지만, 이 작용은 aFGF, bFGF에 의해 억제된다고 지적하면서, iNOS에서의 표현에 있어 iNOS mRNA의 안정성을 제어하지는 않는 것으로 지적하였으므로, 본 출원인은 FGF는 내독소 또는 사이토킨에 의해 초래된 상해를 면하도록 보호할 수 있다고 추측하였다(19). 그밖에 1994년 Becquet 등의 사람들의 연구에 있어서, 소의 RPE 세포 배양시 SIN-1(NO의 공급자로 함)을 첨가 또는 사이토킨을 이용하여 세포를 자극하여 대량의 산화질소를 발생시키면 RPE 세포의 탐식활성이 억제되고, 이러한 작용은 산화질소 스캔벤져(예를 들면, 헤모그로브린) 또는 L-알기닌 유사물에 의해 회복되며, 또한, cGMP와 관련되지 않는다고 지적하였다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, iNOS는 망막에서도 면역조절의 역할을 하고 있다.

잘 알려져 있는 망막변성은 당뇨병에 의해 초래된 증식당뇨망막병증(proliferative diabetic retinopathy), 증식유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy) 및 노인성황반변성(aged-macular degeneration) 등이 있고(20), 그리고 망막변성은 모든 안과질환에 있어서 가장 치료하기 어려운 것이다. 고혈당(hyperglycemia)이 당화작용(glycation)의 발생을 가속화하여 AGE(advanced glycation end products)를 발생시키는 것은, 계속 당뇨병 후기에 초래된 각종 혈관, 신경 합병증(neuronal complication)과 밀접하게 관련되어 있는 것으로 인정되고 있다(21-25). AGE는 환원당(reducing sugar)의 알데히드기 또는 케톤기와 단백질의 프라이머리 아민산이 비효소의 작용을 경유하여 불안정한 시프당기(schiff base)를 발생시키고, 다시 아마드리 전위(Amadori rearrangement)에 의해 아마드리 생성물을 발생시키도록 형성되어 있다(26). 공지의 비효소 작용은 비가소반응이고 대체로 반감기가 긴 단백질 상에 발생하고 있으므로(27) AGE의 형성에 의해 단백질 교차결합(cross-linking)을 초래한 후, 단백질을 단백효소(protease)에 대하여 저항성을 발생시키므로 AGE의 누적은 노화의 표기이다(28,29). 연령의 증가에 따라서 뇌부의 추상신경, 브루크막(Bruch's membrane), 콜라겐 중의 AGE의 함유량도 상승한다. 비효소당화작용의 속률은 초급반응을 나타내고, 반응속율은 환원당 및 단백질의 농도에 의해 결정된다. 당뇨병 환자의 혈당농도는 일반 건강인에 비해 높으므로 더욱 당화작용의 발생을 가속시킨다. 당뇨병이 동맥죽상경화(動脈粥狀硬化)를 가속시키고, 신장을 파손시키고(25), 혈관을 손상시키고, 신경이 변질(26)되고, 망막변성 및 당뇨병환자가 건강인보다도 중풍에 걸리기 쉬운 것은(30) 모두 AGE와 직접적으로 관련된다(26,28,29). 당뇨병이 적혈구의 응집을 초래하는 것은, 주로 알부민이 당화된 후 제3 구조 변경을 초래하는 것에 의해 응집억제(anti-aggregation) 기능이 상실되는 데 있다(22). 또한 연구에 의하면, 당뇨병이 신장계사구체 투과성의 변경을 유발하는 것은 알부민이 당화되었기 때문이고, 신장계사구체기저막(glomerular basement membrane)의 당화는 아니다(23). Poduslo 등의 사람들도 1994년에 당화된 단백질은 그 투과 혈뇌 장벽(blood brain barrier)의 능력을 증가시킨다고 지적하였다.

AGE로 망막 표면상의 얼마의 수용체, 단백질과 결합가능한 것으로서, 이미 청소 수용체(scavenger receptors)나 제1 형 및 제2 형, AGE의 수용체(RAGE, the receptor for AGE), OST-48(AGE-R1), 80K-H phosphoprotein(AGE-R2) 및 galectin-3(AGE-R3)이 알려져 있다(32). 또한, 모노사이트, 대식세포, 내피세포, 신경아교세포 등에는 모두 AGE 수용체가 발견되고 있다. 그리고 세포가 AGE에 활성화되면, 항상 세포외기질단백질(extracellular matrix protein), 혈관접착분자(Vascular adhesion molecules) 및 성장인자(growth factor) 표현량을 증가시키고, 다른 세포종류 및 정보전달에 의해서 화학주성(chemotaxis), 혈관형성(angiogenesis), 산화압력, 세포증가성, 세포 프로그램 사망(programmed cell death)을 동반한다(34). 이미, 인류뇌부의 각종 세포 표현이, 다른 RAGE는 AGE를 청소할 수 있지만, 이 능력이 상실하면 세포외 AGE의 누적을 초래하고, 중추신경계통의 염증반응을 유발하는 것이 알려져 있다. AGE는 RPE 세포의 망막혈관 내피세포 성장인자(retinal vascular endothelial growth factor)(21) 및 PDGF-β(34)의 표현량을 증가시킬 수 있다. 이 AGE는 노화과정에 있어서 중요한 역할을 하므로, 우리들은 당화 알부민으로 1개의 병리모델로서 새로운 연구와 탐색을 행할 수 있기를 희망하고 있다.

HGF/SF(Hepatocyte growth factor)는 간장에서 가장 중요한 성장인자이고, 60 KDa의 알파체인(αChain) 및 30 KDa의 베타체인(βChain)을 디설피드결합으로 연접함으로써 구성되어 있다. 체내에서 바로 합성된 HGF/SF는 prepro HGF/SF이고, 효소를 통해 변형된 후 다른 형식(heterodimeric form)으로 형성되고 나서야 비로소 생물활성을 갖는다. HGF는 다기능 성장인자이고, 조직수리 및 기관재생에 있어서 중요한 역할을 한다. HGF는 체내에서의 분포가 충분히 넓고, 그 중 간장이 최대이다. 다음에, 췌장, 가슴샘, 혈액, 소장, 태반 등에 보여진다(35). 1996년 눈의 조직, 예를 들면 눈물, 눈물샘 및 각막 중에 HGF/SF 또는 HGF/SF 수용체의 존재가 발견되고, 이것에 의해 HGF/SF에는 눈 안에 조절제어의 역할을 하는 특징이 있는 것으로 인정되었다(36). 1998년 He 등의 사람들은 다시 망막색소 상피세포에는 동시에 HGF 및 HGF 수용체(c-Met)를 갖고 있을 뿐만 아니라, c-Met의 티로신 인산화반응(tyrosine phosphorylation)도 계속 유지되어 표현되고 있으므로, HGF의 망막색소 상피세포에 대하여 말하면, 1개 자체작용의 성장인자이고, 또한, 망막발육(37), 상처치유 및 증식당뇨망막병증과 관련된다(38). 상기한 내용으로 알 수 있는 바와 같이, RPE의 촉진 또는 억제를 물문하고 세포활성의 영향인자는 모두 바로 돌파하지 않으면 안되는 분야이다.

요약하면, RPE 세포는 망막발육 및 그와 관련된 조절제어상 매우 중요한 역할을 하므로, 간접적으로 RPE 세포와 관련된 메카니즘을 파악제어하기 위해서 어떻게 RPE 세포의 활성을 조절제어할지는 이미 요즘의 관련연구의 중요과제로 되고 있다.

따라서, 본 출원인은 상기 선행기술의 결점을 감안하여, 예의 시험과 연구를 거듭한 결과, 마침내 본 발명의 「곽산 석곡 추출물 및 그 제조방법」을 안출하였다.

본 발명의 목적은, 수용성 유기용제 또는 상기 수용성 유기용제와 물의 혼합물에 의해 석곡을 추출한, 생리활성을 갖는 곽산 석곡 추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 수용성 유기용제는 탄소 함유수가 1~8에 개재하는 알콜류, 알킬류 또는 에스테르류이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 그 중의 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 추출물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retinal pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 갖는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 추출물은 생물체 속의 AGE(advanced glycation end product) 함유량을 감소하는 작용을 갖는다.

또한, 본 발명도 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였지만, 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어(Physilogically acceptable carrier) 및 상기 어느 한 항에 기재된 추출물 또는 상기 추출물의 이성질체(isomer)를 포함하고 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 심혈관질환에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 심혈관질환은 동맥경화, 혈관손상 및 중풍으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 신경변성에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 신경변성은 망막신경세포 변성, RPE세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경야교세포 변성 및 뇌부 추상신경변성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만, 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 신장병에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 신장병은 신장계사구체 변성 및 신장계사구체기저막 변성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만, 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 생리활성을 갖는 조성물은 눈병에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 눈병은 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막병증, 광수용체의 퇴화, 망막염증 및 브르크막 변성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만, 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 췌장병에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 췌장병은, 당뇨병 및 그 합병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만, 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 자가면역병(autoimmune disease) 또는 패혈성 쇼크에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.

본 발명은 또한 물, 수용성 유기용제, 또는 물과 상기 수용성 유기용제의 혼합물에 의해 식물을 추출하는 단계를 구비한 곽산 석곡 추출물의 방법을 제공하였다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 수용성 유기용제는 탄소 함유수가 1~8에 개재하는 알콜류, 알킬류 또는 에스테르류 중 하나이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이다.

본 발명에는 또한 식물 추출물을 조제하는 방법이 제공되고, (a) 제1 알콜류로 상기 식물을 추출하여 제1 알콜류 추출물을 생성하는 단계와, (b) 물과 알킬류로 동시에 상기 제1 알콜류 추출물을 추출하여 제1 수층(水層) 추출물 및 알킬류 추출물을 생성하는 단계와, (c) 에스테르류로 상기 수층을 추출하여 에스테르 추출물 및 제2 수층 추출물을 생성하는 단계와, (d) 제2 알콜류로 상기 제2 수층 추출물을 추출하여 제2 알콜류 추출물 및 제3 수층 추출물을 생성하는 단계를 구비하고 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 식물은 난초과 식물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 난초과 식물은 덴드로븀과(Genus Dendrobium)에 속한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 단계(a)는 다시 a1) 상기 식물의 건조물을 제공하는 단계와, a2) 분쇄기로 건조물을 분쇄하는 단계와, a3) 상기 제1 알콜류로 분쇄된 상기 물질을 추출하여 제1 알콜류 추출물을 얻는 단계를 구비하여 이루어진다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 알콜류의 탄소 함유수는 1~8이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제2 알콜류는 탄소 함유수 1~8의 알콜류이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제2 알콜류는 부탄올 또는 n-부탄올이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 단계(b)는 다시 b1) 감압, 농축, 흡기 등으로 제1 알콜류 추출물을 건조하는 단계를 구비하고 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 알킬류 추출물은 n-헥산 추출물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 단계(c)는 다시 c1) 상기 에스테르류 추출물을 건조하는 단계와, c2) 헥산과 메탄올로 건조한 후의 상기 에스테르류 추출물을 추출하여 헥산 추출물과 에탄올 추출물을 생성하는 단계를 구비하여 이루어진다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 헥산 추출물은 감압, 농축, 흡기 등의 단계를 통해 건조된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 에스테르류는 에틸아세테이트이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 방법은 다시 (e) 색층분석법으로 상기 제2 알콜류 추출물을 색층분석하여 명칭을 DCMPbL6,7로 칭한 제1 용출물을 얻는 단계와, (f) 제1 용출제로 상기 DCMPbL6,7을 용출하여 제2 용출물을 얻는 단계를 구비하여 이루어진다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 단계(e)는 제2 용출제에 의해 실시된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제2 용출제는 체적비가 1:1인 메탄올과 물의 혼합물에 의해 조성된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 용출제는 이소프로판올과 물을 체적비 20:80으로 조성한 혼합물이고, 상기 제2 용출물은 DCMPbL6,7D2로 칭한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 DCMPbL6,7D2는 다시 메탄올/물/아세트산을 체적비 30:65:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제2 용출물 DCMPbL6,7D2H2를 생성한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 용출물은 이소프로판올과 물을 제척비 30:70으로 조성한 혼합물이고, 그리고 상기 제2 용출물의 명칭은 DCMPbL6,7D3으로 칭한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 DCMPbL6,7D3은 다시 1개의 메탄올/물/아세트산을 체적비 40:60:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제4 용출물 DCMPbL6,7D3H3을 생성한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 용출제는 이소프로판올과 물을 체적비 40:60으로 조성한 혼합물이고, 그리고, 상기 제2 용출제의 명칭은 DCMPbL6,7D4로 칭한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 DCMPbL6,7D4은 다시 1개의 메탄올/물/아세트산을 체적비 45:55:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제5 용출물 DCMPbL6,7D4H3을 생성한다.

나아가서는, 본 발명도 상기 방법에 의해 생성된 각 추출물 중 어느 하나의 다른 종류의 석곡 추출물을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 식물 추출물은 망막흑색소 상피세포를 촉진하는 작용을 갖는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 추출물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소하는 작용을 갖는다.

또한, 본 발명도 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였다. 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 식물 추출물 또는 상기 추출물의 이성질체(isomer)를 구비하고 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 하기의 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병 등의 병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느하나의, 약리반응을 갖는 의약조성물이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절 세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성, 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨병막병증, 증식유리체망막병증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병이다.

본 발명은 그외에 다른 종류의 조성물인, 얻어진 상기 제2 용출물을 제공하였다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retianl pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 갖는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는다.

또한, 본 발명도 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였다. 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 조성물 또는 상기 조성물의 이성질체(isomer)이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 하기 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 병의 약리반응을 갖는 의약조성물이고, 그 질환은 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병을 포함하고 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성, 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막병증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다.

본 발명도 상기 얻어진 제3 용출물인 화합물을 제공하였다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 화합물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retianl pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 갖는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 화합물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는다.

또한, 본 발명도 별도의 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였지만, 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 상기 화합물의 이성질체를 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경야교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성 및 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막변증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다.

본 발명은 또한 상기 얻어진 제4 용출물인 조성물을 제공하였다.

또한, 본 발명도 다른 종류의 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였지만, 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 조성분 또는 조성분의 이성질체를 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성 및 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막변증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다.

또한, 본 발명은 상기 얻어진 제5 용출물인 조성물을 제공하였다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 생물체 중의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는다.

또한, 본 발명도 다른 종류의 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였지만 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 조성물 또는 조성물의 이성질체를 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성 및 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 유증식유리체망막변증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다.

<실시예>

본 발명의 곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 추출물 및 그 제조 프로세스는 이하의 실시예의 설명에 의해 충분히 이해할 수 있는 동시에, 본 기술에 숙련된 당업자라면 이것에 기초하여 실시할 수 있다. 그러나, 본 발명의 실시예는 하기의 실시예에 국한되는 것은 아니다.

(1) 망막색소 상피세포의 배양

도살장에서 소의 눈을 취득하고, 요오드용액으로 표면을 소독하고나서 다시 인산완충액(PBS)으로 2회 세정하고, 해부하여 수정체, 유리체, 망막 등을 제거한 후 0.1% EDTA(ethylene diamine tetra-acetic acid)로 40분간 처리하고, 다시 5% 트리프신으로 15분간 처리하여 원형핀셋으로 가볍게 누르고, 흡입관으로 가볍게 수회 흡입한 후 단일의 RPE 세포를 얻었다. 용액을 흡출하여 10%의F FCS(fetal calf serum)의 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 속에 두고, 37℃에서 5% CO₂포화습도의 배양 상자 속에서 배양한다. 5~6일마다 새로운 배양액으로 바꾸고, 충분히 성장시키려면 0.05% 트립신 및 0.02%의 EDTA로 계속 처리한다. 본 실험은 주로 제5 세대, 제6 세대로 생리활성 테스트를 진행한다.

(2) ROS의 조제

도살장에서 신선한 소의 눈을 취득하고, 얼음 위에서 30분간 광을 조사한 후 우선 요오드로 표면을 소독하고 다음에 행크버퍼(Hank's buffer)로 2회 세정하였다. 다음에 해부하여 수정체, 유리체를 제거하고, 망막을 조각으로 잘라서 20%의 설탕을 함유한 20mM Tris-Hcl용액 속에 두고, 4℃의 얼음상자에서 3시간 교반하여 각각 No.300,220,110,74,53,10그물의 여과막으로 여과한다. 여과 중의 세포수를 계산하여, 관마다 1×10⁸ROS 세포의 수로 나눠서 -20℃의 얼음상자에 두고 보존시킨다.

(3) FITC-ROS의 조제

ROS 해동 후 제거한 부유액을 취출하고, 700㎖(설탕 10% 함유)의 붕산염완충액(pH8.0)을 첨가하여 혼합한 후, 다시 ROS의 1/1000중량의 FITC(fluorescein isothiocyanate) 분말을 첨가하여 4℃ 온도에서 1.5시간 회전시켰다. 설탕 20% 함유의 20mM 트랜스-아세테이트(pH7.2)를 이용하여 ROS와 혼합되어 있지 않은 FITC를 세정하여 제거하고, 10000rpm으로 10분간 원심분리하여 수회 중복하여 다시 설탕의 DMEM 속에 용해하였다.

(4) 망막색소 상피세포 탐식기능의 측정

RPE 세포를 5×10⁴cells/ml로 조제하여 200㎖를 96웰플레이트(96 well plate) 속에 흡착시키고, 충분히 성장시킨 후 새로운 배양액으로 바꾸고, 다시 다른 농도의 테스트용 약물 20㎖를 각 웰에 첨가하는 동시에 FCS(fetal calf serum)의 함량을 2%~5% 사이에 두고, 4시간 배양한 후, 50㎖의 2×10⁷FITC-ROS/ml를 각 웰 속에 첨가하여 4시간 배양하였다.

그런 후, 부유액을 청소하는 동시에 2.5% 설탕/PBS로 수회 세정하고, 마지막으로 100㎕ PBS를 첨가하여, 세포형광측정기Cyto-Fluorometer (Exfilter:485/20nm, Fm filter 530/25nm)를 이용하여, RPE 표면에 점착되고 또한 탐식된 FITC-ROS량을 측정하였다. 각 웰에 5ml의 FluroQuench를 첨가하여, 배양상자 속에서 1시간 반응 후 그 형광독치를 측정하여 탐식된 FITC-ROS량으로 하였다.

(5) 망막색소 상피세포 산화질소 생성의 측정(DAN assay)(39)

100ml 세포 배양 부유액에 50ml의 2,3-디아미노나프탈린(DAN)를 첨가하여 실온 속에서 10분간 작용한 후, 25ml의 2.8N의 NaOH를 첨가하여 반응을 중지시키고, 다시 세포형광측정기(cyto-Fluorometer 2300(기능 360±400nm, 격태 400±40nm)로 측정하였다. 얻어진 값은 공지의 농도, 아초산나트륨(NaNO₂)에 의해 만들어진 표준곡선으로부터 산화질소 농도를 환산하여 산출한 것이다.

(6) 망막색소 상피세포 리보핵산(RNA)의 조제

망막색소 상피세포를 100mm 배양판(1×10⁶cells in DMEM+10%FCS)에서 배양하고, 충분히 성장시킨 후 새로운 배양액(2.5% 함유 PCS의 DMEM)으로 바꾸고, 곽산 석곡 화학 용매 분층법의 구분물을 0.1㎍/ml 첨가하여 48시간 배양하였다. 우선 배양액을 제거하고, 얼어 붙은 PBS 완충액으로 2회 세정한 후, 1ml/10⁵-10⁶ cells의 RNAzol^TMB 첨가하여 5분간 정치하였다. 다음에 스크레이퍼(scraper)로 세포를 조직 배양판의 위에서 아래로 긁고, 1.5ml의 원신분리관 내로 옮겨서 1/10배의 체적량의 클로로포름을 첨가하였다. 그리고 쾌속으로 바로 혼합되어 균일하게 한 후, 얼음 위에 5분간 정치하여 4℃의 온도하에서 12000rpm의 고속 원심분리를 15분간 행하였다. 그런 후 주의깊게 상층의 투명 수층을 흡착하고, 다른 1.5ml의 원심분리관 내로 옮겨서 동일한 체적의 이소프로판올을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 다시 얼음 위에서 5분간 정치하였다. 그리고, 4℃의 온도에서 12000rmp의 고속도로 10분간 원심분리하여 부유액을 제거하고, 70%의 에탄올로 침전부분을 세정하였다. 나아가서는 4℃의 온도 및 7500rpm을 통해 8분간 원심분리를 행하고, 에탄올을 제거건조하였다. 그런 후, 0.1% 함유 DEPC의 이미 4회처리한 물을 용해하고 그 일부를 취하여, 0D₂₆₀로 양을 평가하는 동시에 OD₂₆₀/OD₂₈₀로 순도를 판정하였다. 잉여의 부분은 70%의 에탄올로 보존하고, -20℃의 온도하에 두었다.

(7) RPE 세포의 성장인자의 역전사 및 중합연쇄반응(Reverse Transcription and polymerase chain reaction;RT-PCR)

각각 실험군과 대조군의 RPE 세포로부터 추출된 모든 RNA 5㎎을 취하고, 2.5㎎의 Obligo dT를 첨가하여 70℃의 온도에서 10분간 후 실온에서 10분간 두었다. 그리고 다시 10mM시약(dNTP) 2㎖, rRNasin 1㎖, AMV(AVian Myeloblastosis Virus), reverse trascriptase 1㎖(10unit) 및 그 완충액을 첨가하여 반응체적을 20㎖로 하였다. 그런 후 42℃의 온도에서 50분간 반응시키고, 다시 90℃의 온도에서 5분간 가열시킨 후 얼음 위에 10분간 두었다. 마지막으로, rRNAaseH 1㎖ 첨가하여 37℃의 온도에서 30분간 반응시켰다. 역전사반응의 cDNA 및 부동배수(不同倍數;various diluted concentrations) 희석한 cDNA를 취하고, 2 mM dNTP 5㎖ 첨가하며, 각 관에 검출하고자 하는 인자(primer):β-actin 및 각종 타켓의 sense 및 antisense Primer 0.1㎎/㎖ 각 1㎖, 폴리머레이스 1㎖(2unit) 및 그 완충액을 첨가하였다. 작용체적은 20㎖이고, 조건은 변성처리(denaturing)가 94℃에서 1.5분간 행해지고, 어닐링(annealing)이 57℃에서 1.5분간 행해지고, 연장(extension)이 72℃에서 2분간 행해지고, DNA 증폭기(Perkin-Elmer-Cetus)로 PCR반응을 행한다. β-actin반응은 25 사이클, HGF반응은 35 사이클이다.

1. HGF는 Gibco(Gaithersburg,MD,USA)로부터 인도된 것이다.

sense, 21 mer:5'-GGG ATT CTC AGT ATC CTC ACA-3'

Antisense, 21 mer:5'-CCT ACA TTT GTT CGT GTT GGA-3'

2. VEGF primer:

Sense, 24 mer:5'-AGA AAC CCC ACG AAG TGG TGA AGT-3'

Antisense, 24 mer:5'-CGT TTA ACT CAA GCT GCC TCG CCT-3'

3. bFGF primer:

Sense, 19 mer:5'-CCA AGC GGC TGT ACT GCA A-3'

Antisense, 24 mer:5'-GAT CAG ATG CTG CCA TTA AGA TCA-3'

4. TFG-βprimer:

Sense, 24 mer:5'-CCT GGA CAC CAA CTA CTG CTT CAG-3'

Antisense, 24 mer:5'-ACG ATC ATG TTG GAC AAC TGC TCC-3'

(8) 당화알부민(glycated albumin)의 제조

(a) 소 당화알부민의 제작

1배의 PBS로 알부민(프랙션V)을 1mM로 희석하고, 0.22㎛의 무균여과막으로 여과한 후, 0.22㎛ 무균여과막으로 여과한 250mM 글루코스를 37℃의 배양기 속에 두고 당화작용을 진행하였다. 3주후 반응액을 투석하여 남은 글루코스를 제거한 후, Cona-Sepharose 겔로 순화(純化)를 행하고 투석 후 냉동건조로 보존하였다.

(b) 쥐 당화알부민의 제작

1배의 PBS(pH7.4)로 알부민(프랙션V)을 100mg/m1(1.51mM)으로 희석하고, 0.22㎛의 무균여과막으로 여과한 후, 등체적의 1배의 PBS(pH7.4)를 0.22㎛ 무균여과막으로 여과한 후의 1.8g/m1(1M)의 D-글루코스를 유리관 내에 용해시키고, 37℃배양기에 두고 어둠속에서 당화반응을 행하고, 60일 후 반응액을 투석자루 속에 두고 남은 글루코스를 제거한다. 그런 후, 다시 0.22㎛ 무균여과막으로 여과하여 단백질농도를 측정한 후 분장(分裝)하고, 냉동건조 후 -20℃의 온도로 보존하여 사용한다.

(9) FITC 테스트에 의한 AGE-BSA(40)의 정량

알부민 100mg, FITC 1.8mg을 취하고, 15ml 0.1M 탄산나트륨 완충액(Sodium carbonate buffer, pH9.5)에 용해하여, 25℃의 온도에 있어서 광을 피하면서 5시간 교반하였다. 그리고 HW-55F(1.6×100cm) 분자 낡은 기둥으로 분리를 진행하고, 전 공정적으로 광을 피하면서 5%(V/V)의 n-부탄올 용출완충액으로 하고, 자연유속으로 분리를 행한다. 분리한 샘플을 3회 물로 투석하고, 단백질 정량 후 무균여과하고 냉동건조로 분장하여 형광을 측정하는 동시에 형광의 당량비를 계산 정량하였다.

(10) RPE 세포 감성(減成) FITC-labeled AGE-BSA의 관찰

사전에 멸균청소한 유리편을 24조 배양판(24 well culture plate) 속에 두고 300㎕ 0.5% 겔로 30분간 도포하고, 다시 배양액으로 도포한 겔을 세정하였다. RPE 세포는 매 조 5×10⁴개 세포(5×10⁴cell/well)의 세포수로 10% PCS/DMEM을 이용하여 유리편을 덮어씌운 24조 판 속에 배양하였다. 각 판내에는 0.7㎖의 배양액이 있고, 48 시간 후에 세포가 충분히 성장한 후 배양액을 흡입하여 제거하고, 0.5㎖ 배양액으로 3회 세정하여, 30~300㎍/㎖ 여러 농도의 FITC-BSA DMEM을 배양액 0.5㎖ 속에 두었다. PBS에서 이 세포를 4회 세정하여 아직 탐식되어 있지 않거나 또는 결합된 형광을 세정하여 제거한다. 유리편을 취출하여 1% 함유 FQEB의 PBS로 습윤하고, 밀봉 후 바로 형광현미경으로 관찰하였다.

(11) 곽산 석곡 추출물 및 순화 활성 성분의 분리

1) 곽산 석곡 추출물의 조제

분쇄기로 2kg의 석곡을 분쇄한 후 메탄올 또는 에탄올을 첨가하여 밤새 침윤한 후 필터로 잔사를 제거하는 동시에 흡기여과방식으로 여과한 후 감압농축을 행하고, 반복하여 3회 침윤하였다. 메탄올 또는 에탄올이 완전하게 흡기건조된 후, 석곡이 알콜류로부터 추출하여 얻은 것으로부터, 알콜류 추출물을 DeCaM으로 칭한다.

2) 곽산 석곡 화학용매 추출물의 조제

400ml의 물로 3회 용해한 후 등량의 n-핵산으로 3회 분할하여 DCMph로 칭하였다. 수층은 에틸아세테이트로 4회 분할하여 EtOAc층을 얻어 DCMPe로 칭하였다. 수층은 다시 n-부탄올로 3회 분할하여 n-부탄올층 및 수층을 얻고, 각각 DCMPb 및 DCMPw로 칭하였다.

3) 곽산 석곡 순화성분의 추출 및 분리

다음의 분리방법으로 곽산 석곡 활성성분을 분리하였다. 우선 에탄올로 곽산 석곡 1.9kg을 메탄올로 3회 약 16리터 추출하였다. 감압농축후 건조하여 DCM으로 칭하는 샘플을 얻었다. 우선 에틸아세테이트(EtOAc)로 2리터 용해한 후, 다시 등체적의 물로 분배추출을 행하고, 그리고 수층은 다시 등체적의 에틸아세테이트로 2회 추출하여 에틸아세테이트(EtOAc)층과 제2 수층을 얻었다. 이 EtOAc 추출층을 혼합수집한 후 감압농축건조하고, 다시 핵산 4리터 및 메탄올 2리터로 3회 분배추출하여 2층을 얻고, 감압농축후 핵산층(DCMPe/h으로 칭함) 및 메탄올층(DCMPe/m)샘플을 얻었다. 제2 수층을 2리터로 조정하고, 다시 부탄올 2리터로 분배추출하고, 감압농축후 부탄올층(DCMPb라 칭함) 및 제3 수층(DCMPw) 샘플을 얻었다 PCMPb 샘플은 LH20 아교로 분자관 기둥 색층분석(2.5x10⁷cm, 이동층은 메탄올:물=50:50)을 행하고, 액티브한 절분을 행한 후, 얻어진 8개 크로마토그래픽 속의 제6 크로마토그래픽과 제7 크로마토그래픽의 추출물을 수집하여 PCMPbL6,7 샘플로 칭하였다. 다음에, 다시 Diaion SP-20 SS로 흡착관 기둥 색층분석(1x30cm)을 행하고, 이소프로판올:물=20:80(체적비)의 용출액으로 제2 크로마토그래픽을 용출하고, DCMPbL6, 7D2로 칭하였다. 그리고 이소프로판올:물=30:70(체적비)의 용출액으로 제3 크로마토그래픽의 용출을 DCMPbL6,7D3라 칭하였다. 또한, 이소프로판올:물=40:60(체적비)의 용출액으로 제4 크로마토그래픽의 용출을 DCMPbL6, 7D4로 칭하였다.

그 중, DCMPbL6,7D2는 다시 HPLC 역상 C18 관기둥을 통해 용출액이 메탄올:물:아세트산=35:65:1(체적비)일 때에 용출하고, 그 중의 제2 크로마토그래픽을 수집하여 DCMPbL6, 7D2H2로 칭하였다.

DCMPbL6,7D3은 다시 HPLC 역상 C18 관기둥을 통해 용출액이 메탄올:물:아세트산=40:60:1(체적비)일 때에 용출하고, 그 중의 제3 크로마토그래픽을 수집하여 DCMPbL6,7D3H3이라 칭하였다. 그리고 DCMPbL6,7D4는 HPLC 역상 C18 관기둥을 통해 용출액이 메탄올:물:아세트산=45:55:1(체적비) 일 때 용출을 행하고, 그 중의 제3 크로마토그래픽을 수집하여 DCMPbL6,7D4H3으로 칭하였다. 그 분리의 흐름도는 도1에 도시한 바와 같다.

(12) 곽산 석곡 알콜 추출물의 RPE 탐식작용에 대한 영향

도 2는 곽산 석곡 추출물의 RPE 세포 탐식작용에 대한 영향을 보여주는 그래프(주형도)이다. 이 도2에 도시한 바와 같이, 여러 농도의 곽산 석곡의 메탄올 추출물(0.1,1,10,100㎍/ml)의 RPE 세포에 대한 탐식작용은 모두 현저한 촉진효과를 갖는다. 그리고, 농도가 10%의 FCS도 현저하게 RPE 세포의 탐식작용을 촉진할 수 있다. 이들에 관련한 조작의 흐름도를 이하에 나타낸다.

10⁴개 RPE 세포를 96조 배양판(96 well culture plate) 속에 두고, 10% FCS를 포함하는 DMEM으로 48시간 배향하였다. 다음에 2% FCS를 포함하는 DMEM을 배향액으로 하여 각각 여러 농도의 곽산 석곡 메탄올 추출물을 첨가하였다. 48시간 후, 각 조 내에 농도가 2x10⁷FITC-ROS/ml인 용액 50㎕를 첨가하였다. 4시간 경과 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하여 제거하고, 마지막으로 다기능 측정 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter (PE) measure system)으로 형광강도의 테스트를 진행하였다. 그 중, 2% PCS 처리 RPE 세포를 이용하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 현저수준 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 상기한 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 메탄올 추출물을 갖는 조성물, 조성분 또는 그 외 생리활성을 갖는 조성은, 예를 들어, 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어가 있어도, 해당 조성은 곽산 석곡 메탄올 추출물을 포함하고 있는 것에 의해 RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들어, 타블렛(tablet)(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다.)이어도 좋다.

도 3은 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포 탐식작용을 예시한 그래프이다.

도 3에 도시한 바와 같이, 여러 곽산 석곡 추출물(1.10㎍/ml의 DCMPe/h 및 1.10㎍/ml의 DCMPe/m 및 0.1,1,10㎍/ml의 DCMPb)이 RPE 세포에 대한 탐식작용은 모두 현저한 촉진효과를 갖는다. 관련 조작 흐름도를 이하에 설명한다. 우선 10⁴개 RPE 세포를 96조 배향판(96 well culture plate) 속에 두고 10% FCS를 포함한 DMEM으로 48시간 배양하였다. 다음에 2% FCS의 DMEM을 배향액으로 하였다. 그런 후, 각각 여러 농도의 곽산 석곡 추출물을 첨가하여 48시간 경과 후, 각 조 내에 각각 농도가 2x10⁷FITC-ROS/ml의 용액 50㎕을 첨가하였다. 48시간 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하고, 마지막으로 다기능 중량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter (PE) measure system)으로 형광강도의 테스트를 행하였다. 그 중, 2% FCS로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 상기한 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 추출물(DCMPe/h, DCMPe/m, DCMPb)을 갖는 조성물, 조성분 또는 그 외 생리활성을 갖는 조성은 예를 들어, 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어가 있어도 상기 조성은 곽산 석곡 추출물(DCMPe/h, DCMPe/m, DCMPb)을 포함하고 있는 것에 의해, RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들어 이어도 좋다(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 장입하고 있다).

상기한 순화 후의 곽산 석곡 추출물

DCMPbL6,7D2H2, DCMPbL6,7D3H3, DCMPbL6,7D4H3도 현저하게 RPE 세포의 탐식작용을 촉진할 수 있다. DCMPbL6,7D2H2를 예를 들면, 여러 농도의 DCMPbL6,7D2H2(0.1,1,10,100㎍/ml)의 RPE 세포의 탐식작용에 대한 작용은 모두 현저한 촉진작용을 가지며, 도 4에 관련 결과가 도시되어 있다. 조작 프로그램은 우선, 10⁴개 RPE 세포를 96조 배양기판(96 well culture plate) 속에 두고, 10% FCS를 포함한 DMEM으로 48시간 배양하였다. 다음에 2% FCS를 포함한 DMEM을 배향액으로 하여 각각 여러 농도의 석곡 추출물(DCMPbL6,7D2H2)을 첨가하여 48시간 후, 각 조 내에 농도가 2x10⁷FITC-ROS/ml인 용액 50㎕를 첨가하였다. 48시간 경과 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하고, 마지막으로 다기능 정량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter(PE) measure system)으로 형광강도 테스트를 행하였다. 그 중, 2% FCS 처리 RPE 세포를 이용하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 그 중 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2의 화학구조는 오늘에 이르러서도 아직 확정할 수 없지만 그 존재는 이미 확실하게 도 5 내지 도 10에 나타낸 결과(600-MHZ의 NMP,DEPT,HMQC,HMBC,COSY 스펙트럼 도표 및 UV 분광도)로부터 입증되고 있다. 그 중, 도 5 내지 도 10은 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide-d₆, DMS0-d₆)를 용제로 하여 600-MHz 또는 500-MHz로 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2에 대하여 분석을 행하여 얻어진 NMR,DEPT,HMQC,HMBC,COSY(500-MHz) 스펙트럼 도표이고, 그리고 도 11은 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2의 UV 분광도이다. 요약하면, 곽산 석곡 조성물 DCMPbL6,7D2H2를 갖는 것에 의해 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 다른 생리수용성을 갖는 캐리어를 포함하지만, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 포함하므로 RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떠한 물질이다. 예를 들면 곽산이어도 좋다.(내부에는 상기 추출물질 또는 상기 추출물의 이성체가 장입되어 있다)

또한 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3에 있어서는, 여러 농도의 DCMPbL6,7D3H3(0.1·1㎍/ml)는 RPE 세포의 탐식작용에 대하여 모두 현저한 촉진작용을 갖는다. 도 12에 그 관련 결과를 나타내고 있다. 이 관련 조작 프로그램을 간단하게 설명하면, 우선 10⁴개 RPE 세포를 96조 배양액판(96 well culture plate) 속에 넣고, 10% FCS를 포함한 DMEM으로 48시간 배양하였다. 다음에 2% FCS를 포함한 DMEM을 배양액으로 하여 각각 여러 농도의 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 첨가하여 48시간 경과 후, 각 조 내에 각각 농도가 2x10⁷FITC-ROS/ml의 용액 50㎕을 첨가하였다. 4시간 경과 후, PBS로 여분의 FITC-ROS세포를 세정하고, 마지막으로 다기능 중량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter(PE)measure system)으로 형광강도 테스트를 행하였다. 그 중 2% FCS 처리 RPE 세포를 이용하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 그 중 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3의 화학구조는 오늘에 이르러도 아직 확정할 수 없지만 그 존재는 이미 확실하게 도 13 내지 도 17에 나타낸 결과로부터 증명되고 있다. 그것은 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide-d₆, DM-d₆)를 용제로하여 500-MHz로 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3에 대하여 분석을 행하여 얻어진 NMR,DEPT,NMBC,COSY 스펙트럼 도표이다. 요약하면, 이것은 DCMPbL6,7DH3가 RPE 세포의 탐식작용에 대하여 현저한 촉진작용을 가지고 있으므로, 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 가지며 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 다른 생리수용성의 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 포함함으로써, RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.

또한, 그외에, 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3에 있어서는, 여러 농도의 DCMPbL6,7D4H3(0.1·1.10㎍/ml)이 RPE 세포에 대한 탐식작용은 모두 현저한 촉진작용을 갖는다. 관련 결과는 도 18을 참조하면서 관련된 흐름도를 이하에 설명한다. 우선 10⁴개 RPE 세포를 96조 배양판(96 well culture plate) 속에 두고, 10% FCS를 포함하는 DMEM으로 48시간 배향하였다. 다음에 2% FCS를 포함한 DMEM을 배양액으로 하였다. 그런 후, 각각 여러 농도의 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3를 첨가하고 48시간 경과후, 각 조 내에 각각 농도가 2x10⁷FITC-ROS/ml인 용액 50㎕를 첨가하였다. 4시간 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하여 제거하고, 마지막으로 다기능 정량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter (PE) measure system)으로 형광강도 테스트를 진행하였다. 그 중, 2% FCS로 RPE세포를 처리하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 그 중, 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3의 화학구조는 오늘에 이르러도 아직 확정할 수 없지만 그 존재는 확실하게 도19 내지 도24에 나타낸 결과로부터 증명되고 있다. 그 중, 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide-d₆, DM s0-d₆)를 용제로하여 500-MHz로 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3에 대하여 분석을 행하고, NMR,DEPT,HMQC,HBMC,COSY 스펙트럼 도표가 얻어졌다. 요약하면, DCMPbL6,7D4H3은 RPE 세포에 대한 탐식작용에 현저한 촉진작용을 가지므로, 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 가지고 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 다른 생리수용성을 갖는 캐리어를 포함하지만, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 포함함으로써, RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 물질이다. 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.

(13) 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포 대 산화질소 생성작용에 대한 영향

도 25는 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포 대 산화질소 생성작용에 대한 영향을 나타내는 그래프이다. 이 도 25로부터 알 수 있는 바와 같이, 여러개의 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)이 RPE 세포 대 산화질소 생성작용에 대한 영향은 동일하지 않다. 그 중 부호 「#」 및 「*」은 각각 얻어진 결과와 2% FCS로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 산화질소 생성작용의 촉진효과를 비교했을 때 얻어진 차이도가 현저수준 0.05와 0.01에 달하는 것을 나타내고 있다. 이 도 25에 도시한 바와 같이, 농도가 100,1000㎍/ml의 곽산 석곡 메탄올 추출물 DCM, 농도가 10,100,1000㎍/ml의 곽산 석곡 에틸아세테이트 추출물 DCMPe, 농도가 10 또는 1000㎍/ml의 곽산 석곡 추출물 n-부탄올 추출물 PCMPb 및 농도가 100,1000㎍/ml의 곽산 석곡 n-핵산 추출물 DCMPh는 모두 현저하게 RPE 세포의 산화질소 생성작용에 대한 영향을 촉진한다. 관련된 조작 프로그램은 이하에 나타낸다. 우선, 10⁴개 RPE 세포를 96조 배항판(96 well culture plate) 중에 두고, 10% FCS를 포함한 DMEM으로 48시간 배양하였다. 다음에 2% FCS를 포함한 DMEM을 배향액으로 하였다. 그런 후, 각각 여러 농도의 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMpb)을 첨가하여 48시간 경과 후, 각 조 내에 각각 농도가 2x10⁷FITC-ROS/ml의 용액 50㎕를 첨가하였다. 48시간 경과 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하고, 마지막으로 다기능 정량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter(PE) measure system)으로 형광강도 테스트를 행하였다. 여기서 여러 농도의 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)이 RPE 세포의 산화질소 생성작용에 대하여 현저한 촉진작용을 갖는 것에 의해, 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)을 포함하고, 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 그 외 생리수용성의 캐리어를 가질 가능성이 있지만, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)을 포함하고 있으므로, RPE 세포의 산화질소 생성작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.

(14) 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포의 간 성장인자 β-actin과 HGF 표현에 대한 촉진작용

도 26(A)-(B)는 곽산 석곡 메탄올 추출물로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 β-actin(A) 및 (B)를 표현하는 전기영동도이다. 그 중, 이들 성장인자의 표현은 RT-PCR의 방법에 의해 표현된다. 도 26으로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 추출물은 명백하게, RPE 세포의 간 기능인자 β-actin 및 HCF 표현에 대한 작용을 촉진한다. 그 관련된 조작 프로그램을 간단하게 설명하면, 우선 2% FCS 및 1000㎍/㎖을 포함한 곽산 석곡 추출물의 DMEM에 있어서 24시간 배양 후 전기영동을 행하였다. 그 중, 1㎍ 모든 RNA에 의해 발생된 CDNA를 β-actin(A)의 형판(template)(1X)로 하고, 0.5㎍ 모든 RNA에 의해 발생된 CDNA량을 HGF(B)의 형판으로 하였다(1X). 제1 레인(lane)은 X174/Hae111을 표기(marker)하여 얻은 결과이다. 제2 레인은 1배 형판의 전기영동 결과이다. 제3 레인은 형판을 2배로 희석하여 얻어진 전기영동 결과이다. 제4 레인형판을 4배 희석한 후 얻어진 전기영동 결과이다. 제5 레인은 형판을 8배 희석한 후에 얻어진 전기영동 결과이다. 제6 레인은 형판을 16배로 희석한 후에 얻어진 전기영동 결과이다.

다음에 도 27은 여러개의 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포의 HGF에 대한 mRNA 표현의 전기영동도이다. 이 도 27로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 n-핵산 추출물 DCMPh는 명백하게 RPE 세포가 간 기능인자 β-actin 및 HGF 표현에 대하여 촉진하는 작용을 갖는다. 그 관련 조작 프로그램을 간단히 설명하면, 우선 RPE 세포를 2% FCS와 0.1㎍/ml를 포함한 여러개의 곽산 석곡 추출물(n-핵산 추출물 DCMPh, 에틸아세테이트 추출물 DCMPe 및 n-부탄올 추출물 DCMPb)의 DMEM 중으로 옮겨진다. 48시간 경과 후 전기영동을 행하고, 그 중, 1㎍ 모든 RNA에 의해 발생된 cDNA량을 형판으로 하였다(1X). 제1 레인(lane)은 X174/Hae111을 표기(marker)로서 얻어진 결과이다. 제2 레인은 HGF 제어그룹의 전기영동 결과이다. 제3 레인은 β-actin 제어그룹의 전기영동 결과이다. 제4 레인은 곽산 석곡 n-핵산 추출물 DCMPh로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 HGF 표현의 전기영동 결과이다. 제5 레인은 곽산 석곡 n-핵산 추출물 DCMPh로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 β-actin 표현의 전기영동 결과이다. 제6 레인은 곽산 석곡 에틸아세테이트 추출물 DCMPe로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 HGF 표현의 전기영동 결과이다. 제7 레인은 곽산 석곡 에틸아세테이트 추출물 DCMPe로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 β-actin 표현의 전기영동결과이다. 제8 레인은 곽산 석곡 n-부탄올 추출물 DCMPb로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 HGF 표현의 전기영동 결과이다. 제9 레인은 곽산 석곡 n-부틸 추출물 DCMPb로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 β-actin 표현의 전기영동 결과이다.

또한, 여러 농도의 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)은 RPE 세포의 간 성장인자 β-actin 및 HGF의 표현에 대하여 현저한 촉진작용을 갖고 있는 것에 의해, 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)을 가지며 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있지만, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)을 포함하고 있으므로 RPE 세포의 간 성장인자 β-actin 및 HGF의 표현에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들면 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.

(15) 곽산 석곡 추출물의 RPE 세포에 대하여, 정상 및 산소결핍의 상황하에서 bFGF,VEGF 및 TGF-β 표현에 대한 억제작용

도 28(A) 내지 도 29(B)는 곽산 석곡 추출물 DeCaM이 RPE 세포에 대하여, 정상상황하에서 β-actin, bFGF, VEGF 및 TFG-β 표현에 대한 작용을 나타내고, 그 중 β-actin의 mRNA표현을 대조군으로 한다. 도 28(A) 내지 도 29(B)의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 정상의 RPE 세포의 경우, 그 bFGF, mRNA의 표현량은 곽산 석곡 추출물에 4배 억제되어 있다. 그리고 VFGF,mRNA의 표현량은 2배로 억제되어 있다. TGF-β mRNA의 표현량이 되면 특수적인 변화가 없다. 이 관련된 조작 프로그램을 다음에 간단하게 설명하면, 우선, RPE 세포를 2% FCS 및 1000㎍/ml를 포함한 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 DMEM 중에 옮겨서 배양하였다. 48시간 경과 후 RNA를 추출하고, RT-PCR 방법에 의해 분석을 촉진하고, 그 중의 1㎍ 모든 RNA에 의해 발생한 CDNA량을 형판(template)(1X)으로 하였다. 제1 레인은 4X174를 표기로 하여 얻은 결과이고, 제2 레인은 100bp 사닥다리형(ladder)을 표기로 하여 얻은 결과이고, 제3 레인은 1배형판의 전기영동 결과이고, 제4 레인은 형판을 2배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제5 레인은 형판을 4배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제6 레인은 형판을 8배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제7 레인은 형판을 16배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제8 레인은 형판을 32배 희석한 후 얻은 전기영동 결과이다.

여기서, 곽산 석곡 추출물 DeCaM은 정상상황하에서는 RPE 세포의 bFGF, VEFG에 대하여 현저한 억제작용을 갖고 있는 것에 의해, 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 가지며 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성이 모두 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 포함하고 있으므로 RPE 세포의 bFGF,VEGF의 표현에 대하여 억제작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이고, 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.

도 30(A) 내지 도 31(B)는 석곡 추출물 DeCaM을 RPE 세포에 대하여 산소결핍상태(hypoxia)하에서 β-actin, bFGF, VEGF 및 TGF-β 표현에 대한 작용이고, 그 중 β-actin의 mRNA 표현을 대조군으로 한다. 도 30(A) 내지 도 31(B)의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 산소결핍 RPE 세포의 경우, 그 bFGF mRNA의 표현량은 곽산 석곡 추출물에 2배 억제되어 있고, VEGF, mRNA의 표현량을 2배 억제되어 있으며, TGF-β, mRNA의 표현량은 4배 억제되어 있다. 그 관련된 조작 프로그램을 다음에 나타내면, 우선 RPE 세포를 2% FCS 및 1000㎍/ml의 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 포함한 DMEM 중에 옮겨져서 48시간 배양 후 RNA을 추출하였다. RT-PCR 방법에 의해 분석을 행하고, 그 중의 1㎍ 모든 RNAL에 의해 발생한 cDNA량을 형판(template)(1X)로 하였다. 제1 레인은 4X174를 표기로 하여 얻은 결과이고, 제2 레인은 100bp 사닥다리형(ladder)을 표기로 하여 얻은 결과이고, 제3 레인은 1배 판의 전기영동 결과이고, 제4 레인은 형판을 2배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제5 레인은 형판을 4배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제6 레인은 형판을 8배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제7 레인은 형판을 16배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제8 레인은 형판을 32배 희석한 후 얻은 전기영동 결과이다.

여기서, 곽산 석곡 추출물 DeCaM은 산소결핍상황하에서 RPE 세포의 bFGF, VEFG 및 TGF-β의 표현에 대하여 현저한 억제작용을 갖고 있는 것에 의해, 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 가지며 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성이 모두 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 포함하고 있으므로 RPE 세포의 bFGF,VEGF 및 TGF-β의 표현에 대하여 억제작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이고, 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다. 이상의 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 추출물은 선택적으로 눈병 중에서 중요한 역할을 하는 유전자, 예를 들면 bFGF,VEGF, TFG-β 등 mRNA의 표현을 조절할 수 있다.

(16) 테스트 파이프 내 당화알부민(AGE-BSA)의 제작

0.1g/ml 보빈 세럼 알부민(bovin serum albmin;BSA)의 플랙션V 및 180mg/ml 글루코스를 함유한 PBS를 배치하고, 구경이 0.22㎛의 무균여과막으로 여과하여, 각각 5ml 취하여 15ml 테스트 파이브 속에 첨가하였다(반응농도는 760mM BSA 및 0.5M 글루코스). 또한 그외에 글루코스를 포함하지 않는 대조군을 제작하고, 밀봉후 암흑 37℃ 배양기 속에 두었다. 2,4,8,12,16주 방치 후 취출하였다. 4℃에 있어서 100배 체적의 3차 물로 4회 투석하고, 완전하게 글루코스를 제거하여 무균여과로 냉동건조한 후, 정량으로 평량하여 회용 분리후 다시 냉동건조하고, -20℃ 온도에 두고 보존하였다.

(17) 곽산 석곡 추출물과 HGF이 RPE 세포에 대하여 AGE-BSA 능력을 감성하는 영향 관련된 조작 흐름도를 다음에 설명한다.

96조의 배양판(96 well culture plate) 중에 1x10⁶개 RPE 세포를 옮기고, 10% PCS를 포함한 DMEM을 배양액으로 하여 37℃의 온도에서, 대기 중 5% CO₂를 포함하는 조건하에서 48시간 배양하였다. 아울러 5군의 실험처리로 각 군 2판 처리하고, 36,48시간 실험처리 후 0.01% EDTA 처리로 세포를 DMEM 속에 던져두고, 세포수를 계산하였다. 5군의 처리조건은 각각 다음의 표에 나타낸다.

군별	DCM(㎍/ml)	HGF(ng/ml)
1	100	0
2	10	0
3	1	0
4	0	50
5	0	0

용액은 1200rpm 원심분리 5분간 후, 세포를 다시 10ml DMEM 속에 2회 현탁시키고, 다시 0.7ml 균질완충액(50mM 아세트산나트륨 완충액〔50mM 아세트산나트륨 완충액, pH4.5, 1mM DTT, 0.15M 염화나트륨, 3mM 질화나트륨NaN₃〕로 원심분리되어, 0.1%를 포함한 TritonX-100로 현탁한 후 초음파진동기로 4회, 매회 15초로 철저하게 세포를 타파하였다. 그것으로부터 13000rpm으로 15분간 원심분리하고, 다시 15초X4회로 초음파진동을 행하고, 11000rpm으로 15분간 원심분리 부유액을 수집하였다. 무균여과하여 단백질 농도를 계산하여 AGE 및 AGE-BSA 감성의 형식 및 정도를 전기 영동 관찰하였다.

(18) 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자 HGF가 RPE 세포의 단백질분해활성에 대한 영향

도 32는 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자 HGF의 RPE 세포에 대한 단백질분해활성 영향의 전기영동도이다. 이 도 32에서는 분해활성은 각 처리조 사이에서 차이가 크지 않지만, 10㎍/㎖ DCM 및 50ng/㎖ HGF로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 분해작용과 처리를 받지 않은 제어군과를 비교한 바, RPE 세포의 분해작용이 어느정도 증가하고 있는 것이 확실히 보였다. 다음에 관련된 조작단계를 설명한다. 106개 RPE 세포를 직경 10cm의 배양접시 속에 옮겨넣고, 우선 10%를 포함한 FCS의 DMEM 속에서 RPE 세포를 48시간 배양한 후, 다시 2%를 포함한 FCS 및 여러 농도의 곽산 석곡 메탄올 추출물 또는 HGF〔(a)100㎍/ml, (b)10㎍/ml DCM, (c)1㎍/ml DCM, (d)50ng/ml HGF 및 (e)제어군의 DMEM〕로 48시간 배양하였다. 그런 후, 세포의 단백질(cellular extracts)를 추출하여 세분하지 않고, 우선 단백질을 정량하여 다시 AGE-BSA와 공동반응시킨 바, 반응농도는 세포추출물(추출된 단백질) 및 AGE-BSA가 모두 500mg/ml이고, 즉 효소(세포추출물)와 반응기질(AGE-BSA) 비는 1:1로 82시간 배양하였다. 그 중, 제1 레인은 4X174를 표기로 하여 얻은 결과이고, 제2 레인은 세포추출물로부터 얻어진 결과이고, 제3 내지 제 8레인은 0~82시간의 전기영동 결과이고, 제9 내지 제10 레인은 전기영동을 행하여 얻어진 결과이다.

또한, 도 33은 도면에 기초하여 묘사되었다. 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자의 RPE 세포에 대한 단백질분해활성 영향의 절선도(折線圖)이다. 도 33에 도시한 바와 같이, 분해작용의 속율(速率)은 12에서 48시간의 작용시간 중 속도가 비교적 빠르고, 그리고 48과 82시간 사이에 배양한 감성형식은 부동처리 사이에서 약간의 차이를 봤다. 그리고 48시간 배양했을 때, 10㎍/ml DCM이 RPE 세포분해활성에 대한 영향이 가장 강하고, 그리고 100㎎/ml DCM 및 50ng/ml HGF의 효과는 그다음에 이어진다.

이와 같이, 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자가 RPE 세포의 단백질분해활성에 대하여 촉진작용을 갖고 있는 것으므로, 곽산 석곡 추출물 또는 HGF를 가지며 또한 생리활성을 갖는 조성은, 그외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성이 곽산 석곡 추출물 DCM 또는 HGF를 포함하고 있으므로, RPE 세포의 단백질분해활성에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.

(19) 낮은 조제량의 STZ(streptozotocin)로 자가면역 당뇨병 합병증을 유도연립하는 동물 모델

도 34는 곽산 석곡 메탄올 추출물이 당뇨병을 갖는 쥐의 체내의 AGE 함량에 대한 영향을 나타내는 도면이다. 도 34에 도시한 바와 같이, 곽산 석곡 추출물 DCM으로 당뇨병을 가진 쥐를 처리한 후, 상기 쥐 체내의 AGE 함량은 명확하게 저하되고, 즉 이 동물실험에 의해 곽산 석곡 메탄올 추출물은 확실하게 AGE 함량을 감소시키는 효과를 갖는다. 그 관련된 조작 프로그램을 설명하면, 우선 6주 크기의 C57BL/6J 쥐를 취하고, pH4.5, 농도가 0.15M의 레몬산 완충액(Citric acid buffer)에 의해 STZ를 매일 1kg 체중마다 50mg의 조제량으로 쥐 체내에 유입하여 연속 5일 주사하였다. 이와 같이 12~14일 주사한 후 안와혈액(orbital blood;眠寮探血)으로 측정한 바, 혈당농도가 250mg/d1보다도 커지고 나서야 비로서 수요에 달하였다. 이 수용에 부합하는 쥐를 4군으로 나눠서, 각각 체중의 차이에 따라서 여러 조제량을 포함한 석곡 메탄올 추출물의 사료(0mg/kg/day,1g/kg/day, 200mg/kg/day 및 40mg/㎏/day)로 키우고, 매주 1회 혈당을 관찰하고, 만약 혈당이 내려가면 다시 200mg²/kg²/day의 조제량으로 STZ를 주사형 쥐를 고혈당의 환경 속에 두고, 약 4~8주 후, 안와혈을 취하여 혈당 및 AGB AB를 측정하였다. 또한 안청, 간, 신장을 취하고, He staining 하여, 파라핀으로 처리한 후, 절편화하여 병리변화를 관찰하였다. 실험 중에 있어서는 체중, 음료수, 사료의 소모량을 기록하였다. 동시에 쥐의 외관, 표면 털의 변화, 네 다리 및 모혈액순환상황에 주의하여 사진을 찍어서 기록하였다. 그 부호 「*」에서 상기 제어군과 비교하여 얻은 차이가 현저수준 0.05에 달하는 것을 나타내고, 「**」에서 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다.

또한 곽산 석곡 메탄올 추출물은 확실하게 AGE량을 효과를 갖고 있으므로, 곽산 석곡 메탄올 DCM을 가지며 또한 생리활성을 갖고 있는 어떤 조성은, 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성이 모두 곽산 석곡 메탄올 추출물 DCM을 포함하고 있으므로, 체내의 AGE 함량을 저하시키는 것에 효과를 갖는다. 그 중 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이고, 예를 들어 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.

이상의 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 출원인은 예의 시험과 연구를 거듭한 결과, 마침내 곽산 석국 추출물은 확실하게 망막흑색소 상피세포의 작용을 조절제어할 수 있는 동시에, 간접적으로 그 관련 메카니즘에 영항을 준다. 본 발명에 의해 제출된 곽산 석곡 추출물은 RPE 세포의 탐식작용, 산화질소 생성작용, 간 성장인자 표현 등 작용에 대하여 촉진효과를 갖는 것 외에, 체내의 AGE 함량을 감소시킬 수 있다. 또한 그 외에, 정상 또는 산소결핍을 물문하고, 곽산 석곡 추출물은 RPE 세포내의 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth faction;VEGF), 성정인자를 변환(transforming growth faction-beta;TEG-β) 및 섬유 모세포 성장소(basic fibroblast growth faction;bFGF)의 유전자 표현에 대하여 모두 현저한 억제작용을 갖는다. 따라서, 곽산 석곡 추출물을 포함하는 어떤 조성물, 예를 들면 곽산 석곡 추출물 및 그 생리수용성 캐리어의 생리활성을 갖는 조성물은 모두 본 발명에 의해 제출된 각 곽산 석곡 추출물을 갖고 있으므로 상기의 효과를 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이고, 예를 들면 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.

또한, 망막흑색소 상피세포, 체내의 산화질소 생성작용, 간 성장인자, 체내의 AGE 함량, RPE 세포 내의 혈관내피 성장인자(VEGF)와 섬유 모세포 생성소(bFGF)의 작용 및 변환 성장인자(TGF-β)의 유전자 표현은 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병 등의 병과 관련된다(본 출원의 선행기술 내용을 참조하기 바란다).

그리고, 본 발명의 곽산 석곡 추출물은 또한 망막흑색소 상피세포량, 산화질소 생성작용, 간 성장인자 작용, 체내 AGE량, RPE 세포 내의 혈관내피 생산인자(VEGF)와 유모세포생장소(bFGF)의 작용 및 변환 성장인자(TGF-β)의 유전자 표현과 관련하므로, 본 발명의 곽산 석곡 추출물도, 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성과 신장계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식성세포 변성, 노화성황반 변셩, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르트막 변성, 당뇨병 및 그 합병증 및 패혈성 쇼크 등의 병에 대하여 영향을 갖는다. 또한, 본 발명의 실제 응용 범위도 매우 넓고, 망막상피세포와 체내 AGE함량의 작용에 한정되지 않는다. 그리고 본 발명은 관련 추출물 응용의 최초의 예이므로, 본 발명이 현저한 신규성 및 진보성을 가지고 있는 것은 말할 필요도 없다.

상기한 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이므로, 당연히 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않고, 첨부 청구범위을 벗어나지 않는 한 당업자에 의한 단순한 설계변경, 부가, 수식, 치환은 모두 본 발명의 기술적 범위에 속한다.

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도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물의 분리흐름도.

도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 추출물인 곽산 석곡 메탄올 추출물의 RPE 세포 탐식작용을 예시하는 그래프.

도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPe/h, DCMPe/m, DCMPb의 RPE 세포 탐식작용을 예시한 그래프.

도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 DCMPbL6,7D2H2의 RPE세포 탐식작용을 예시한 그래프.

도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 ¹H-NMR 스펙트럼 도표.

도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 ¹³C-NMR 스펙트럼 도표.

도 7은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 DEPT 스펙트럼 도표.

도 8은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 HMQC 스펙트럼 도표.

도 9는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 HMBC 스펙트럼 도표.

도 10은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 도표.

도 11은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2의 UV 분광도.

도 12는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3의 RPE 세포 탐식작용에 대한 영향을 나타내는 그래프.

도 13은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 ¹H-NMR 스펙트럼 도표.

도 14는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 ¹³C-NMR 스펙트럼 도표.

도 15는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 DEPT 스펙트럼 도표.

도 16은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 도표.

도 17은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 HMBC 스펙트럼 도표.

도 18은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3의 RPE 세포 탐식작용 대한 영향을 나타내는 그래프.

도 19는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 ¹H-NMR 스펙트럼 도표.

도 20은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 ¹³C-NMR 스펙트럼 도표.

도 21은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 DEPT 스펙트럼 도표.

도 22는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 HMQC 스펙트럼 도표.

도 23은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 도표.

도 24는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d₆, DMSO-d₆을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 HMBC 스펙트럼 도표.

도 25는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb가 RPE 세포의 산화질소 생성작용에 대한 영향을 나타내는 그래프.

도 26(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 메탄올 RPE 세포를 처리하여 얻은 β-actin(A) 및 HGF(B)의 유전자 표현 전기영동도.

도 27은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물의 RPE 세포의 HGF에 대한 mRNA 표현의 영향 결과 전기영동도.

도 28(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 정상상황하의 RPE 세포에 대한 VEGF(A) 및 TGF-β(B) 유전자 표현 작용 결과 전기영동도.

도 29(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 정상상황하의 RPE 세포에 대한 β-actin(A) 및 bFGF(β) 유전자 표현 작용 결과전기영동도.

도 30(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 산소 결핍 상황하의 RPE 세포에 대한 β-actin(A) 및 bFGF(B) 유전자 표현 작용결과 전기영동도.

도 31(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 산소 결핍상황하의 RPE 세포에 대한 VEGF(A) 및 TGF-β(B) 유전자 표현 작용 결과 전기영동도.

도 32는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자의 RPE 세포에 대한 단백질 분해 활성 영향 전기영동도.

도 33은 도 32에 기초하여 도시한 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자의 RPE 세포에 대한 단백질 분해 활성 영향을 나타내는 그래프.

도 34는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 메탄올 추출물의 당뇨병을 가진 쥐의 체내 AGE 함량에 대한 영향을 나타내는 그래프.

Claims

수용성 유기용제 또는 상기 수용성 유기 용제와 물의 혼합물에 의해, 생리 활성을 갖는 곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 식물을 추출한 석곡(Dendrobii Caulis) 추출물.
제1항에 있어서,

상기 수용성 유기 용제는 탄소 함유 갯수가 1 내지 8로 개재되는 알콜류, 알킬류 또는 에스테르류이고,

상기 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이며,

상기 추출물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retinal pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 가지며, 그리고

상기 추출물은 생물체 중의 AGE(advanced glycation end product) 함유량을 감소하는 작용을 갖는 석곡 추출물.
제1항 또는 제2항에 있어서,

생리 수용성을 갖는 캐리어(physilogically acceptable carrier) 및 상기 어느 한 항에 기재된 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 포함하여 이루어지는 석곡 추출물.
제3항에 있어서,

상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이고,

상기 생리 수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이며,

상기 생리활성을 갖는 조성물은 심혈관질환에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,

상기 심혈관질환은 동맥경화, 혈관손상 및 중풍으로 이루어지는 군에서 선택된 것이며,

상기 생리활성을 갖는 조성물은 신경병에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,

상기 신경병은 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 세포신경아교세포 변성 및 뇌부추상신경세포 변성으로 이루어지는 군에서 선택된 것이며,

상기 생리활성을 갖는 조성물은 신장병에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,

상기 신장병은 신장사구체 변질 및 신장사구체기저막 변질로 이루어지는 군에서 선택된 것이고, 다만, 이들 군에 한정되지 않으며,

상기 생리활성을 갖는 조성물은 상기 눈병에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,

상기 눈병은 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막병증, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 노인성황반 변성 및 브르크막 변성으로 이루어지는 군에서 선택된 것이며, 다만, 이들 군에 한정되지 않으며,

상기 생리활성을 갖는 조성물은 췌장병에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,

상기 췌장병은 당뇨병 및 그 합병증으로 이루어지는 군에서 선택된 것이며, 다만, 이들에 한정되지 않으며, 및

상기 생리활성을 갖는 조성물은 자가면역병(autoimmune disease) 또는 패혈성 쇼크에 대해 약리활성을 갖는 조성물인 석곡 추출물.
곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 추출물을 제조하는 방법으로서, 적어도 물, 수용성 유기용제 또는 물과 상기 수용성 유기용제와의 혼합물에 의해 식물을 추출하는 단계를 구비하여 이루어진 식물추출물의 제조방법.
식물 추출물을 제조하는 방법으로서,

(a) 제1 알콜류로 상기 식물을 추출하여 제1 알콜류 추출물을 발생시키는 단계와;

(b) 물과 알킬류로 동시에 상기 제1 알콜류 추출물을 추출하여 제1 수층 추출물 및 알킬류 추출물을 발생시키는 단계와;

(c) 에스테르류로 상기 수층을 추출하여 에스테르 추출물 및 제2 수층 추출물을 발생시키는 단계와;

(d) 제2 알콜류로 상기 제2 수층 추출물을 추출하여 제2 알콜류 추출물 및 제3 수층 추출물을 발생시키는 단계를 구비하여 이루어진 식물 추출물의 제조 방법.
제6항에 있어서,

상기 식물은 난초과 식물이며,

상기 난초과 식물은 덴드로븀과(Dendrobium)에 속하며,

상기 단계 a)는 다시 a1) 상기 식물의 건조물을 제공하는 단계와, a2) 분쇄기로 상기 건조물을 분쇄하는 단계와, a3) 상기 제1 알콜류로 분쇄된 상기 물질을 추출하여 상기 제1 알콜류 추출물을 얻는 단계를 구비하여 이루어지며,

상기 제1 알콜류의 탄소 함유갯수는 1 내지 8이고,

상기 제1 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이며,

상기 제2 알콜류는 탄소 함유갯수 1 내지 8의 알콜류이고,

상기 제2 알콜류는 부탄올 또는 n부탄올이며,

상기 단계 b)는 다시 b1) 감압, 농축, 흡기 등으로 상기 제1 알콜류 추출물을 건조하는 단계를 포함하며,

상기 알킬류 추출물은 n-핵산 추출물이며,

상기 단계 c)는 다시 c1) 상기 에스테르류 추출물을 건조하는 단계와, c2) 핵산과 메탄올로 건조한 후의 상기 에스테르류 추출물을 추출하여 핵산 추출물과 메탄올 추출물을 발생시키는 단계를 포함하고,

상기 핵산 추출물은 감압, 농축, 흡기 등의 단계를 통해 건조되며, 및

상기 에스테르류는 에틸아세테이트인 식물 추출물의 제조 방법.
식물 추출물의 제조 방법은 (e) 색층분쇄법으로 상기 제2 알콜류 추출물을 색층분석하여 명칭을 DCMPbL6,7으로 칭한 제1 용출물을 얻는 단계와,

(f) 제1 용출제로 상기 DCMPbL6,7을 용출하여 제2 용출물을 얻는 단계를 구비하여 이루어지는 식물 추출물의 제조 방법.
제8항에 있어서,

상기 식물 추출물의 제조방법에 있어서,

단계 (e)는 제2 용출제에 의해 실시되고,

상기 제2 용출제는 체적비가 1:1인 메탄올과 물의 혼합물에 의해 생성되고,

상기 제1 용출제는 이소프로판올과 물을 체적비 20:80으로 조성한 혼합물이며, 또한, 상기 제2 용출제는 DCMPbL6,7D2라 칭하고,

상기 DCMPbL6,7D2는 다시 메탄올/물/아세트산을 체적비 30:65:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제3 용출물 DCMPbL6,7D2H2를 발생시키고,

상기 제1 용출물은 이소프로판올과 물을 체적비 30:70으로 조성한 혼합물이며, 그리고 상기 제2 혼합물은 DCMPbL6,7D3라 칭하고,

상기 DCMPbL6,7D3은 하나의 메탄올/물/아세트산을 체적비 40:60:1로 하여 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제4 용출물 DCPPbL6,7D3H3을 발생시키며,

상기 제1 용출제는 이소프로판올과 이소프로판올과 물을 체적비 40:60으로 조성한 혼합물이며, 그리고, 상기 제2 용출물의 명칭은 DCMPbL6,7D4라 칭하며,

상기 DCMPbL6,7D4는 다시 1개의 메탄올/물/아세트산을 체적비 45:55:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제5 용출물 DCMPbL6,7D4H3을 발생시키는 식물 추출물의 제조방법.
제6항에 의해 발생된 각 추출물 중 어느 하나의 곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 식물 추출물로서,

상기 식물 추출물은 망막흑색소 상피세포(retinal pigment epithelium cell;RPE)를 촉진하는 작용을 가지며, 및

상기 추출물은 생물체 중의 고도당화 종산물(AGE: Advanced Glycation End product) 함유량을 감소시키는 곽산 석곡 식물 추출물.
제10항에 있어서,

생리 수용성의 캐리어 및 제10항에 기재된 식물 추출물은 상기 식물 추출물의 이성체를 포함하고,

상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이며,

상기 생리수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이며,

상기 조성물은 하기의 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병 등의 병으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의, 약리반응을 갖는 의약 조성물이며,

상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부 추상신경세포 변성, 신장사구체 변성, 신장사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막병증, 노인성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병 및 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹에서 선택된 병인 식물 추출물.
제8항에서 얻어진 제2 용출물로서,

상기 조성물은 망막흑색소 상피세포(retinal pigment epithelium cell;RPE)를 촉진하는 작용을 가지며,

상기 조성물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는 조성물.
제12항에 있어서,

생리활성을 갖는 조성물로서, 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 조성물 또는 상기 조성물의 이성체를 구비한 생리활성을 갖는 조성물.
제9항으로 얻어진 제3 용출물인 조성물로서,

상기 화합물은 망막흑색소 상피세포를 촉진하는 작용을 가지며, 및

상기 화합물은 생물체 중의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는 조성물.
제14항에 있어서,

생리활성을 갖는 조성물로서, 1개의 생리수용성을 갖는 캐리어와, 제14항 기재의 화합물 또는 상기 화합물의 이성체를 구비한 조성물.
제9항에 의해 얻어진 제4 용출물인 조성물로서,

상기 조성물은 망막흑색 상피세포를 촉진하는 작용을 가지며, 및

상기 조성물은 생물체 중 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는 조성물.
생리활성을 갖는 조성물로서, 생리수용성을 갖는 캐리어 및 제16항 기재의 조성물 또는 상기 조성물의 이성체를 함유하여 이루어지는 조성물.
제9항에 의해 얻어진 제5 용출물인 조성물로서,

상기 조성물은 망막흑색 상피세포를 촉진하는 작용을 가지며, 및

상기 조성물은 생물체 중 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는 조성물.
제18항에 있어서,

생리활성을 갖는 조성물로서, 1개의 생리수용성을 갖는 캐리어와, 제18항 기재의 조성분 또는 상기 조성분의 이성체를 포함하여 이루어지는 조성물.