TWI294285B - Extract of plant herba dendrobii and preparing process thereof - Google Patents

Description

1294285 (blood-retinal barrier)。 此外，RPE細胞亦具有吸收光線的功能，並與吞噬桿狀細 胞及錐狀細胞受光線刺激而脫落的外節（rodoutersegments， R〇S )、分解吞噬體(phagosome)、合成細胞外基質（extracellular matrix)與黑色素(melanin)、藥物的解毒、提供光接受器的外段 再生時所必須的物質、維生素A的儲存與運送、視紫 (Rodopsin)的合成、形成網膜的接著力··…等作用有關。根據 統計，大白鼠之一個RPE細胞一天必須清除25,〇〇〇個桿狀細胞 及錐狀細胞受光線刺激而脫落的外節，可見如此頻繁吞噬機能 的重要性。因為处E細胞正常的吞吃作用對於維持視網膜 中光接受裔之健康具有相當大之關聯性，故，一旦吞吃機能降 低’將造成光接受器之退化(degenerati〇n)(3)。因為細胞會 隨著年齡的增加而死亡或游離至他處，縱使老化的細胞仍 具有吞噬能力，但其清除(digesti〇n)的能力卻已明顯降低(4); 1995年Panda-Jonas等人就指出人的光受器每年會損失 0.2-0.4%，且桿狀細胞的損失較錐狀細胞損失更多⑸，此可能 造成老年人視力減退及疾病的發生，故j^PE細胞功能的維持對 於視覺系統是相當重要的。 另外，一氧化氮(Nitric oxide; NO)是一個不穩定、半衰期 僅數秒鐘的小分子氣體(6) ’然而其卻具有多_生理功能。由 =氧化氮屬tt性（neutral) ’因此可自由穿透進出細胞膜 ，另方面一氧化氮具有未配對電子(unpaire(j eiectron)，因 此其類似自由基(free radieal)而具有高度的反應力，一旦形成 便可，速通過細胞麻發生_(8)。在免疫系統巾，—氧化氮 扮次著防禦與控制細胞毒性的角色；在血管系統中，—氧化氮 1294285 無現iNOS inhibitor可以阻斷由内毒素（end〇toxin)所弓 葡萄膜炎（）。GGureau等人指出以IFN_T及Lps處理咖使 之產生大量-氧化氮，而此作用會被aFGF、bFGF所抑制，且 指出是抑制在iNOS的表現而非iN〇s mRNA的穩定性 (stability) ’所以，本案申請人推測FGF可保護免於受到 内毒素或細胞激素所引起的傷害〇9)。此外，1994年职杖 等人的研究中指出培養牛的赃細胞時加入8职（作為恥 供給者）或利用細胞激素來刺激細胞使之產生大量的一氧化 氮下’ RPE細胞吞吃R〇s的活性會受到抑制，這樣的作用可 被一氧化氮清道夫（scavenger)(如 hemoglobulin)或 L_arginine analogs所恢復，且與cGMP無關〇6)。由此可見iN〇s在視網 膜中亦扮演著免疫調節的角色。 常見的視網膜病變有糖尿病所引起的視網膜血管新生 (proliferative diabetic retinopathy)、增殖性視網膜病變 (proliferative vitreoretinopathy)及老年性黃斑部病變 (Aged_macular degeneration)等(2G)，而視網膜的病變，是所有眼 科疾病中最難治療的。高血糖(hyperglyCemia)加速醣化作用 (glycation)的發生’產生高度醣化終產物(advanced glycati〇n end products，AGEs)—直被認為是與糖尿病末期所引發的各種 血管、神經併發症息息相關(21_25)。AGE的形成是還原醣 (reducing sugar)的醛基(aldehyde group)或酮基(ketone group)與 蛋白質的一級胺(primary amino acid)經由非酵素(n〇nenzymatic) 的作用產生不穩定的許夫氏驗（Schiff base )，再經由阿默得里 重組（Amadori rearrangement)產生阿默得里產物（Amard〇ri product)(26)。已知非酵素聽化作用是一不可逆反應且多發生在 1294285

半衰期長的蛋白質上(27)，目A (s-nnking)後會使得蛋白質對於2造成蛋白質交聯 性，因此age的累積是一老化的標吃(28;29)產生抗 ^ ^ ^ # ^ neur〇ns) ^ ^ membrane)、膠原蛋白(c〇llagen)中a 2氏，(細奶 白=:Γ呈初級反應’反應速率決定於還原糖與蛋 患血糖濃度較-般正常人為高，因此更加 严、血… 已知糖尿病加速動脈粥狀硬化、腎臟損 ί者易、神經病變、視網膜病變及糖尿病患較健 康者易中風，都與AGE有直接的關係(26;28;29)。糖尿病造成 紅血球的聚f ’主要是自蛋白(albumin)祕化後造成其三級社 構(==struc㈣改變，以致於喪失抗聚集㈣墻eg^ 1功，’另外，研究顯示糖尿病引發腎臟絲球體通透性的改 變，是因為白蛋白的畴化而非腎小球基膜(glomerularbasement membrane)的醣化(23)。P〇dusl〇等人在1994年也提到醣化的蛋 白貝會增加其通透血腦屏障(bi〇〇d brain barrier)的能力(31)。 AGE能夠和細胞表面上的一些接受器(recept〇r)、蛋白質 結合’目剷已知的有清道夫接受器（scavengerrecept〇rs)第一 型及弟一型 ’ AGE 的接受器(rage，the receptor for AGE )， OST-48 (AGE-Rl)，80K-H phosphoprotein (AGE_R2)及 galectin-3 (AGE-R3)(32)。在單核球、巨嗤細胞、内皮細胞、神 經膠細胞……等都可發現AGE接受器，當細胞被AGE活化 時，常使得細胞外基質蛋白質（extracellular matrix protein)、血 管附著分子(vascular adhesion molecules)、及生長因子(growth factor)表現量增加，隨著不同的細胞種類及訊息傳遞，而伴隨 10 1294285 著趨化性(chemotaxis)，血管新生(angiogenesis)，氧化壓力，細 胞增生或細胞程式死亡(pr〇grammecl cell death)(34)。已知人類腦 部各種細胞表現不同的高度醣化終產物接受器，可清除 AGE，當此能力喪失時，造成細胞外age的累積，而誘發中 樞神經系統之發炎反應(33)。而AGE可使RPE細胞的視網膜血 官内皮細胞生長因子（retinai vascuiar end〇theiiai glOwth fact〇r)(21)，及PDGFj(34)之表現量增加。AGE在老化過程中 扮演重要角色，因此我們希望以醣化白蛋白作為一個病理模型 (model)以期進行新的研究與探討。 HGF/SF (Hepatocyte growth factor)為肝臟最重要之生長 因子’是由 60 KDa 的重鏈(heavy chain)(a chain)及 30 KDa 的 輕鏈(light chain)( /5 chain)以雙硫鍵相接所構成(35)。體内剛 合成的HGF/SF為prepro HGF/SF須經酵素修剪之後成為異雙 形式（heterodimericform)才具有生物活性。HGF為一種多功 能的生長因子，對多種細胞皆有調節生長的能力，在組織修復 (tissue repair)及器官再生（organ regenerati〇n)中扮演重要角 色。HGF在體内分布十分廣泛，以肝臟產量最大，其餘尚有 胰臟、胸腺、血液、小腸、胎盤……等(35)。1996年發現眼睛 的組織如淚液、淚腺、角膜中有HGF/SF或HGF/SF接受器存 在，可見HGF/SF在眼睛内可能有其調控的角色⑽。1998年版 等人更發現視網膜色素上皮細胞不但同時具有及 接文器（c-Met)，而且〇Met的酪胺酸磷酸化反應（讲〇_ phosphorylation)是一直持續不斷的在表現，所以HGF對視網 膜色素上皮細胞而言可能是一個自體作用的生長因子，而且可 能與視網膜發育(37)，傷口癒合及視網膜血管新生有關(38)。由 1294285 根據上述構想’其中該具有生理活性的組成物係為一種具 有藥理活性的組成物。 根據上述構想’其中該具有生理可接受性的載體係為一具 有藥理活性的載體。 根據上述構想，其中該具有生理活性的組成物係為對心血 管疾病具有藥理活性的組成物。 根據上述構想，其中該心血管疾病係選自，但不限於以下 群組：動脈硬化、血管受損與中風。

根據上述構想，其中該具有生理活性的組成物係為對神經 病變具有藥理活性的組成物。 根據上述構想，其中該神經病變係選自，但不限於以下群 組··視，膜神經細胞病變、RPE細胞㉟變、無軸突細胞病變、 視神經節細胞病變、黏質細胞病變、視網膜神轉質細胞病線 與腦部錐狀神經病變。 又 根據上述構想，其中該具有生理活性的組成物係為對腎觸 疾病具有藥理活性的組成物。

根據上述構想，其中該腎臟疾病係選自，但不限於以下君 組··腎臟絲球體病變與腎小球基膜病變。 、 - 根據上述構想’其中該具有生理活性的組成物係為對眼轉 疾病具有藥理活性的組成物。 έ根據上述構想，其中該眼睛疾病係選自，但不限於以下, ，.葡萄膜炎、視網膜血管新生、增殖性視網膜病變、老年^ 頁斑病變、光接受器退化、視網膜發炎與布魯赫氏膜病變。 、根據上述構想’其中該具有生理活性的組成物係為 疾病具有藥理活性的組成物。 13 1294285 想’其中該第一醇類為甲醇或是乙醇。 / (心，其中該第二醇類為含碳數1-8的醇類。 =，想，其中該第二醇類為丁醇或是正丁醇。 壓 =讀想’其中步驟b)更包含下列步驟：叫以減 濃縮、抽氣等步驟來乾燥該第—醇類萃取物。

根據上述構想’其中魏類萃取物為—正己鮮取物。 ί艮據上述構心’其中步驟c)更包含下列步驟：cl)乾燥該 ^員十取物，以及e2)以己垸與曱醇萃取乾雜的細旨類萃取 物以產生-己辟取物與—帽萃取物。 根據上述構想’其巾該己鮮取物係經誠、濃縮抽氣等 步驟而被乾燥。 根據上述構想，其中該酯類為乙酸乙酯。 /艮據上述構想’其中該方法更包含步驟：e)以層析法層 析違第一醇類卒取物以獲得一個命名為DC··，？的第一沖 提物，以及f)以一第一沖提劑沖提^CMpbL6,7以獲得一第 二沖提物。 根據上述構想，其巾雜驟e)係藉—第二沖提劑而實施。

根據上述構想，其中該第二沖提劑之組成為體積比為】：工 的甲醇與水之混合物。 根據上述構想’其中該第一沖提劑為一異丙醇與水以體積 比為20 : 80而組成之混合物，且該第二沖提物被命名為 DCMPbL6?7D2 〇 根據上述構想，其中該DCMPbL6,7D2更以一個甲醇/水/ 乙酸以體積比為35:65:1而組成之混合物進行層析並產生一第 三沖提物DCMPbL6,7D2H2。 15 1294285 根據上述構想’其中該組成物係為對選自於下列疾病群組 之任一疾病具有藥理反應的醫藥組成物，該疾病群組係包含： 心血管疾病、神經疾病、腎臟疾病、肝臟疾病、眼睛疾病與自 體免疫疾病。 根據上述構想，其中該疾病係選自下列疾病：動脈硬化、 血管受損、中風、視網膜神經細胞病變、細胞病變、無軸 突細胞病變、視神經節細胞病變、黏質細胞病變、視網膜神經 膠質細胞病變、腦部錐狀神經病變、腎臟絲球體病變與腎小球 基膜病、交、葡萄膜炎、視網膜血管新生、增殖性視網膜病變、 老年性黃斑病變、光接受器退化、視網膜發炎、布魯赫氏膜病 受、糖尿病及其併發症以及敗血性休克）。 本發明另外也提供了另一種組成物，係為前述獲致的該第 二沖提物。 根據上述構想，其中該組成物具有促進視網膜黑色素上皮 細胞（retinal pigment epithelium ceU，RPE)的作用。 根據上述構想，其中該組成物具有減少生物體中高度醣化 終產物(advanced glycation end product，AGE)含量的作用。 本發明還提供了另一種具有生理活性的組成物，係包含一 個具有生理可接受性的載體以及前述之組成物或是該組成物 的同分異構物。 根據上述構想，其中該具有生理活性的組成物係為_種具 有藥理活性的組成物。 根據上述構想，其中該具有生理可接受性的載體係為一具 有藥理活性的載體。 〃 根據上述構想，其中該組成物係為對選自於下列疾病群組 17 1294285 ft，上^構心’其中該疾病係選自下列疾病：動脈硬化、 血官―、中風、視網膜神經細胞病變、腿細胞病變 =胞病變、/見神經節細胞病變、黏質細胞病變、視咖中經 Μ細胞病變、腦部錐狀神經病變、腎臟絲球體病變盘腎小球 基膜病變、賴駭、視_血管新±、增錄 老年性黃斑病變、光接受器退化、視網膜發炎、布,t、赫ΐ膜病 變、糖尿病及其併發症以及敗血性休克。 、/ 提物本發明還提供了—種組成分，係、為前述所獲致之該第四沖 根據上述構想’其中該組成物具有促進視網膜黑色素上皮 細胞（retinal Pigment epithelium _，)的作用。’、 根據上述構想，其中該組成物具有減少生物體中高度酶化 終產物(advanced glycation end product，AGE)含量的作用。 另外，本發明也提供了另-種具有生理活性的組成物，係 包含-個具有生理可接受性的_以及前述之組成分或是該 組成分的同分異構物。 以 “根據上述構想，其中該具有生理活性的組成物係為一種具 有藥理活性的組成物。 一具 根據上述構想，其巾該具有生理可接受性的载體 有藥理活性的載體。 根據上述構想，其中該組成物係為對選自於下列疾病群組 之任=疾病具有_反應的醫成物，該疾病群組係包含·· 心血管疾病、神經疾病、腎臟疾病、肝臟疾病、眼睛疾病與自 19 1294285 體免疫疾病。 根據上述構想，其中該疾病係選自下列疾病：動脈硬化、 血管受損、中風、視網膜神經細胞病變、RPE細胞病變、無軸 突細胞病變、視神經節細胞病變、黏質細胞病變、視網膜神經 膠質細胞病變、腦部錐狀神經病變、腎臟絲球體病變與腎小球 基膜病變、葡萄膜炎、視網膜血管新生、增殖性視網膜病變、 老年性黃斑病變、光接受器退化、視網膜發炎、布魯赫氏膜病 變、糖尿病及其併發症以及敗血性休克。 再者，本發明還提供了另一種組成分，係為前述所獲致之 該第五沖提物。 很龈上迷構想，其中該組成分具有促進視網,W、 細胞（retinal pigment epithelium cell，RPE)的作用。 根據上述構想，其中該組成分具有減少生物體中高度醣化 終產物(advanced glycation end product，AGE)含量的作用。 另外，本發明也提供了另一種具有生理活性的組成物，係 包含一個具有生理可接受性的載體以及前述之組成分或是該 組成分的同分異構物。 ^ 」艮據上述構想，其中該具有生理活性陳成物係為—種具 有藥理活性的組成物。 、 t據上觸想’其找具有生理可接纽賴 有樂理活性的載體。 n ^ 根據上述構想，其中該組成物係為對選自於下列疾 之tr疾病具有藥理反應的醫藥組成物，該疾病群組係包含. :免神經疾病'腎臟疾病、肝臟疾病、眼睛疾病與自 20 1294285 ㈡ROS之製備 自屠宰場取得新鮮牛眼，置於冰上照光30分鐘，先以碘 酒消毒外表再以漢克氏緩衝液（Hank’s buffer)沖洗二次，解 剖去除水晶體、玻璃體、取出視網膜剪成小碎片置於含有20% 蔗糖（sucrose)的20 mM Tris-HCl溶液中，於4°C冰箱中攪 拌三個小時，細胞液分別以No· 300、220、110、74、53、10 mesh的過濾膜過濾。計算濾液中的細胞數，分裝為每管ιχ108 ROS細胞，置於-20°C冰箱保存。 (三）FITC-ROS之製備 取出ROS解束後去除上清液，加入700 ml含10%嚴糖 的硼酸緩衝液（Borate buffer) (ρΗ8·0)混和之後，再加入R〇s 之 1/1000 重量的螢光物質fluorescein sothiocyanate (FITC) 粉末，置於4°C旋轉1.5小時，利用含20%蔗糖的20mM Tris_acetate (ρΗ7·2)沖洗以去除未與R〇s結和的FITC， 10000 rpm離心10分鐘，重覆數次，最後再溶於含2.5%蔗 糖之DMEM中。 (四)視網膜色素上皮細胞吞吃機能之測定

將RPE細胞調配為5xl〇4cells/mi，吸取200 ml到96 well plate中，待長滿後換新培養液，再加入不同濃度的測試 藥物20 ml到每個well中並使胎牛血清含量居2 %〜5 %之 間，經48小時的培養，加入50ml之2x 107FITC_ROS/ml 到各well中，培養4小時，清除上清液並以2.5%sucrose/PBS 22 1294285 thermal cycler (Perkin-Elmer-Cetus)進行PCR反應。β-actin 反 應 25 cycle ; HGF 反應 35個循環（cycle)。 1. HGF primers構自 Gibco (Gaithersburg，MD，USA)

Sense，21 mer.5，_ GGG ATT CTC AGT ATC CTC ACA - 3’ Antisense, 21 mer:5?- CCT ACA TTT GTT CGT GTT GGA -3f 2. VEGF primer:

Sense，24 mer: 5’_ AGA AAC CCC ACG AAG TGG TGA AGT - 3，

Antisense，24mer: 5，- CGT TTA ACT CAA GCT GCC TCG CCT - 3’ 3. bFGF primer:

Sense，19 mer: 5，- CCA AGC GGC TGT ACT GCA A- 3， Antisense, 24 mer: 5，_ GAT CAG ATG CTG CCA TTA AGA TCA-3丨 4. TGF-/S primer:

Sense，24 mer: 5，- CCT GGA CAC CAA CTA CTG CTT CAG - 3’

Antisense，24 men 5，_ACG ATC ATG TTG GAC AAC TGC TCC-3， (八）謝匕白蛋白（glycated albumin)之製備 (a)牛醣化白蛋白製作 以一倍PBS將白蛋白（fracti〇n v)配成1 mM，以0·22 μιη 25 1294285 ，菌過濾膜過濾、後’加人以0.22μιη無菌過濾膜過4之25〇應 葡萄糖（glucose)置於37t培養箱中進行醣化作用，三個星期 後將反應液透析去除多餘之賴糖後，以C()nA_SephaiOse凝 膠進行純化後’透析後冷;東乾燥保存。 (b)小鼠醣化白蛋白製作。 以一倍PBS (pH 7.4)將白蛋白（fracti〇n v)配成川〇 mg/ml (1.51 mM)，以0.22 ,無菌過濾膜過濾後，加入等體積 /谷於倍PBS (pH 7.4)以0.22 μπι無菌過濾膜過濾後的1 $ g/mi (1 Μ)的葡萄糖（D-glucose)於玻璃管内，置於37。〇培養箱累 暗中進行糖化反應，60天後將反應液置於透析袋中透析去除多 餘的葡萄糖後，再以0·22 μιη無菌過濾膜過濾，測定蛋白質濃 度後分裝，冷凍乾燥後置於-20°C保存備用。 (九).FITC 標定 AGE_BSA(40) 取白蛋白lOOmg，FITC 1.8mg溶於15ml 0·1Μ碳酸鈉緩 衝液（Sodium carbonate buffer ’ ρΗ9·5)，在25°C避光擾掉五 小時，以HW-55F (1.6 x 100cm)分子篩管柱進行分離，全程 避光，以5 % ( v/v )的正丁醇（n_butanol)作為沖提緩衝液(eluti〇n buffer)，以自然流速進行分離，將分離之樣品以三次水進行透 析三次，蛋白質定量後無菌過濾，分裝冷凍乾燥，測螢光並計 算標定上螢光的當量比。 (十）RPE細胞降解FITC-labeledAGE-BSA的觀察 事先將滅過菌清潔之蓋玻片置於24槽培養盤（24 well culture plate)中，以300 μ10_5% 凝膠（gelatin)塗附（coating) 26 1294285 (9) Goldstein IM. Ostwald P. 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Claims (1)

12942駱 0. 2 2 τΡ 公告本^ _、申請專利範圍·· 1. (Herba Dendr〇bii) 植物萃取物，該 =取物是藉由使贿鋪鱗取練萃取石斛植物而 石斛植物萃取物具有促進視網膜黑色素上皮細胞及/ 或減f生物體中高度醣化終產物的作用。 」二^1利細第1項所述之石斛植物萃取物，其中該醇類為含 石反數介於1〜8的醇類。 3H月專利耗圍第2項所述之石斛植物萃取物，其中該醇類為曱 醇或乙醇。 4. ^具有生理活性的組成物，係包含—個具有生理可接受性的 4 phyS1〇logieaily aeeeptable)以及申請專利範圍第 w 項之任-項所述之石斛植物萃取物。 U明專利範圍第4項所述之組成物’其中該具有生理活性的組 成物係為-種具有藥理活性的組成物。 申明相範圍第5項所述之組成物，其巾該具有生理活性的組 成㈣為對心血管疾病具有藥理活性的組成物。 7. ^申請專利範圍第6項所述之組成物，其中該心血管疾病係選 自·動脈硬化、血管受損與中風。 8·=申請專利範圍第4項所述之組成物，其中該具有生理活性的組 9 _:為對神經病變具有藥理活性的組成物。 、申明專利範圍第8項所述之組成物，其中該神經病變係選自： 神經細胞病變、咖細胞病變、無軸突細胞病變 、視神 、、、< >、、、田也病憂、黏質細胞病變、視網膜神經勝質細胞病變與腦 1294285 部錐狀神經病變。 女申Μ專利範圍第4項所述之組成物，其中該具有生理活性的 組成物係為對腎臟疾病具有藥理活性的組成物。 自如申 =專利範圍_項所述之組成物，其中該腎臟疾病係選 •月臟絲球體病變與腎小球基膜病變。 專利範圍第4項所述之組成物，其中該具有生理活性的 ’、成物係為對轉疾病具有藥理活性的組成物。 13.白如t請專利範圍帛12項所述之組成物，其中該眼睛疾病係選 至’、=膜炎、視網膜血管新生、增殖性視網膜病變、老年性 14 ^病·^光接受器退化、視網膜發炎與布魯赫氏膜病變。 租成lit第4項所述之組成物，其中該具有生理活性的 、，，成物係鱗顧_具絲理活性的組成物。 自===物（_，綱顧疾病係選 16組她（嘯，她_理活性的 性的組成物。(aUtolm_e disease )具有藥裡活 I7.如申請專利範圍第4 組成物係麵糖B脉摘其以具有生理活性的 種使用f ㈣變具有藥理活性的組成物。 以製備促===斛（He—ϋ)植物萃取物 化終產物之藥物的用途。皮細地及/或減少生物體令高度酿 18 1294285 ‘V 二 年月日 修正 Dendrobii Caulis 1.9kg DCM 40g 補充 DCMPe/h 2g DCMPe/m 12g DCMPb 2.5g DCMPw 20g LH20 gel (2.5x107 cm)分子管柱層析 移動相：甲醇：水=50:50 1 1 1 1 1 LI L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 65 mg 23.89mg Diaion SP20SS (1x30 cm)吸附管柱層析 移動相：異丙醇：水（ΙΡΑ:Η20) IPA: H20 [D2J [D3J D4 20:80 30:70 40:60 35mg 12m； 16 mg D6 D7 HPLC RP Cis (10x300mm) HPLC RP C18 (10x300mm) HPLC RP C18 (10x300mm) 甲醇：水：乙酸=35:65:1 甲醇：水：乙酸=40:60:1甲醇··水：乙酸=45:55:1 H1 ____- ___〆 H2 H3 HI H2 H3 HI H2 H3 3.8 mg 3.4 mg 12.8 mg 第一圖 1294285

t i control Wm 0.1 ug/ml b^^sl 1 ug/ml 10 ug/ml 卜 i 100 ug/ml fmrmi 10% fos xa)puj _—

Control DCM DCM DCM DCM 10%FCS 第. 回 2 Ί I 1 I control , γ/////λ Χ^Λ ug/ml 1 ug/ml 10 ug/ml I - I 100 ug/ml Bimn io % fgs #0 # control DCMPe/h DCMPe/m DCMPb 10 % FCS 第三圖 1294285

第四圖

1294285

第五匱

1294285

第六圖 1294285

2 2 0 2 00 18 0 160 14 0 12 0 100 80 60 2 0 ppm

PPm

ppm 第七圖

1294285 第八圖

1294285

回

a ΟΟΐ) ABS 0.500 rm

1294285

χωρυι 工

DCMPbL6,7D3H3 第十二圖 1294285

•i.O 4.5 ί ,0 3Λ J:G 2.5 2.0 i.S 3t .0 U ：：.；:：：：； · ； i : '曹 Ψ k 巷丨 W f h 5 第十三匱 *·： c». ir «» tf· <*» vi -t .·< 〇 «> r· ：*· f* r，r. 5Ί RHHIBBMNRiMRKIMRRMRR 蜃 KfflnRWMMHRRHIRHBiMHBi! νέο i?o xeo iva llMiiiifeiMl ΐΙϋΙϋΙϊιΙϋιΐιιΑιϋΐ Μ^·ιΐΐΜϋ ppm 第十四圖 1294285 ife婦 j ί ; ij ^ι^ιιΐΜΐΐΐΐιΙιΙϋ^ιΐϋ^ι liiiiil^si I ： jj j I I ί, !! ; i j;;：|i I 3：：. ;> i〇 ppm 第十五匱 -1^ - LdT— a φ a φ e Ϋ t ^ m t·〆 % I 第 J、 1/ 1294285

A、:..^LSLL· ^ 1-: -J.al-napppf-lJ'lTr^J-a'l-t! 二二 |_! ppm 第十七圖 XI t I control Ζ^77Ά 0.1 ug/ml 1 ug/nil 10 ug/ml iOO ug/ml ΓΠΤΓΠί 10 % FCS

DCMPbL6,7D4H3 第十八圖 1294285

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1294285 儺SMI曰 :正 補充 I j i 削 WH 賺 ΐϊ:ΜΙ 娜棚明 RWWPSWSHWWfflSi 鋪一^ 第. 圖 PPm

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ppm 第二十四圖 1294285 倐

χωρυι DCMPe-1 DCMPb-1 control DCM DCMPh 第二十五圖