CN111759953A - 石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属制药技术领域，涉及石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用。具体涉及石斛水提取物和石斛醇提取物在高脂的状态下对脂肪酸合成的调节。体外实验证明本发明制备的石斛提取物能够明显抑制乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶以及硬脂酰辅酶A去饱和酶的表达水平，故能够得到石斛提取物具有有效抑制脂肪酸的合成的功效；同时油红O染色试验结果表明，本发明制备的石斛提取物能够抑制脂滴的合成。因此，本发明提供的石斛提取物能够制备抑制脂肪酸合成的药物，这为脂肪酸抑制剂的制备提供新的思路和路径。

Description

石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用。

背景技术

在脂肪酸合成过程中乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase1，ACC1）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）、以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl-CoAdesaturase， SCD1）等酶起着重要作用。乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）是存在于胞浆中含有生物素的变构羧化酶,是脂肪酸代谢过程中的限速酶,其使乙酰辅酶A羧化成丙二酰辅酶A。在人类和其它哺乳动物中该酶属于组织特异性酶，存在两种基因形式ACC1和ACC2，近年来发现肿瘤代谢在肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药过程中起着重要的作用,而腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）和ACC在肿瘤代谢中发挥着核心作用。

近年来研究表明，存在于许多天然植物中的酚类、萜类、类黄酮及甾体等化合物对脂肪酸合成发挥了重要的调节作用。例如从银杏科（Ginkgoaceae）中分离出的银杏酸衍生物能够抑制FASN的表达；类萜化合物通过靶向脂质代谢而在缓解代谢性疾病中发挥重要作用；柑橘类黄酮化合物与降低人体的血液胆固醇和甘油三酸酯有关，并且能够减轻肝脂肪变性等。这些广泛分布于植物中的天然提取物，已表现出对脂肪酸合成存在一定的影响，并且毒性较小。可见，多种天然提取物对脂肪酸合成有调控作用，在开发脂肪酸合成抑制剂方面前景广阔。

石斛是常用名贵中药材，性味甘淡微咸，寒，归胃、肾，肺经。始载《神农本草经》，品种众多，其中霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛和马鞭石斛是石斛中的上品。又名林兰(《神农本草经》)、千年润(《本草纲目》)等，其具有较高的观赏价值和药用功能，在李时珍《本草纲目》中记载，石斛有“补五脏、劳贏瘦、滋阴益精、久服厚肠胃、平胃气、长肌肉、定志除惊、轻身延年”等功效。

根据我们的文献调研，尚未发现石斛或者石斛提取物在制备脂肪酸合成抑制剂中的应用和报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用，是石斛提取物的一种新用途。目前没有任何报道表明石斛提取物能够用于制备抑制脂肪酸合成的药物。

本发明提供了石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用，所述石斛提取物由石斛药材经提取得到。

进一步的，所述石斛提取物为石斛水提取物或石斛醇提取物。

进一步的，所述石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。

进一步的，所述石斛水提取物的制备步骤为：将新鲜石斛，去根、叶后保留茎部，粉碎后，加入5-8倍重量份的蒸馏水浸没，于75-85℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取,合并提取液，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

进一步的，所述石斛醇提取物的制备步骤为：将石斛干粉，用18-20倍重量份的75%乙醇于55-60℃下进行提取，重复提取，合并提取液，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

进一步的，所述石斛提取物可制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式，例如可以为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂、口服液剂中的一种。

本发明的有益效果是：

本发明制备的石斛提取物不论是从对脂肪酸合成相关的酶即乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶(FASN)以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的表达水平结果，还是从油红O染色结果，均能够得到其具有有效抑制脂肪酸的合成的功效的结论。因此，本发明提供的石斛提取物能够制备抑制脂肪酸合成的药物。

附图说明

图1为石斛水提取物抑制HUH7细胞中乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶以及硬脂酰辅酶A去饱和酶的基因表达；

其中，数据以means±SD表示，ACC1：乙酰辅酶A羧化酶，^**P＜0.01；FASN：脂肪酸合成酶，^**P＜0.01，^***P<0.05；SCD1：硬脂酰辅酶A去饱和酶，^**P＜0.01，^***P<0.05；给药组vs空白对照组；FWE：Fresh Dendrobium Water Extraction石斛水提取物；fold：倍数；

图2为石斛醇提取物抑制HUH7细胞中乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶以及硬脂酰辅酶A去饱和酶的基因表达；

其中，数据以means±SD表示，ACC1：乙酰辅酶A羧化酶；FASN：脂肪酸合成酶，^***P<0.05；SCD1：硬脂酰辅酶A去饱和酶，^**P＜0.01，^***P<0.05；给药组vs空白对照组；DEE：DryDendrobium Ethanol Extraction石斛醇提取物；fold：倍数；

图3为石斛水提取物给药处理HUH7细胞的油红O染色图，其中，FWE：石斛水提取物；

图4为石斛醇提取物给药处理HUH7细胞的油红O染色图，其中，DEE：石斛醇提取物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

由于现有药用石斛的种类很多，这里本发明实施例以霍山石斛为例，研究石斛醇提取物作为抑制脂肪酸合成的药物的应用效果。但本发明中的石斛并不仅限于霍山石斛，也可以是其他同属的药用石斛，例如铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛或者鼓槌石斛等。

霍山石斛，原产于我国安徽霍山等地，是国家现代中药重大专项200多个濒危稀缺品种中首位保护品种，是药用石斛中的极品，也是霍山县独有的、拥有原产地地理标志的名贵中药材，历史上被誉为“中华九大仙草之首”、“健康软黄金”，《神农本草》、《本草纲目》均有记载。霍山石斛所含有的多糖能大幅度提高人体内SOD(延缓衰老的主要物质)，在增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老和促进癌细胞凋亡等方面有明显作用，从而达到保健益寿的功效。

实施例1

分别制备石斛水提取物以及石斛醇提取物，具体如下：

（1）石斛水提取物的制备：称取100g新鲜采摘的霍山石斛，去根、叶后保留茎部，粉碎后，加入500ml蒸馏水浸没霍山石斛药材，在80 ℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取3 次,每次1h， 合并3次提取液。将合并后的提取液在55 ℃下减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，进行冷冻干燥至恒重，得到质量体积浓度为100 mg/ml的石斛水提取物。

（2） 石斛醇提取物的制备：称取20g霍山石斛干粉，用400ml的 75% 乙醇于55-60℃下进行提取，提取 2 次，每次提取24h，合并2次提取液，将合并后的提取液减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，进行冷冻干燥至恒重，得到质量体积浓度为100 mg/ml的石斛醇提取物。

将上述实施例1中制备质量浓度为100mg/ml的石斛水提取物以及石斛醇提取物，在试验前均用0.22μm的滤膜过滤除菌，然后稀释，制备成一系列质量浓度依次为10μg/mL,100μg/mL,1000μg /ml的石斛水提取物以及一系列质量浓度依次为10μg/mL,100μg/mL，500μg/mL的石斛醇提取物的工作液，作为药物，备用。

（Ⅰ）检测石斛提取物对体外HUH7细胞中脂肪酸合成相关的酶的mRNA的表达

分组：HUH7细胞复苏后，采用DMEM完全培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下培养，细胞同步化12h，随机分成2大组，即：①空白对照组：不给药（0μg/ml）；②给药组：（1）石斛水提取物高剂量组(FWE：1000μg/mL) 、石斛水提取物中剂量组(FWE：100μg/mL)、石斛水提取物低剂量组(FWE：10μg/mL)；（2）石斛醇提取物中剂量组(DEE：100μg/mL)、石斛醇提取物低剂量组(DEE：10μg/mL)，给药作用12h，荧光定量 PCR：使用 RNAiso Plus 提取HUH7细胞的总RNA，通过 Oligo dT18 将 1μg总RNA 逆转录为 cDNA，通过定量PCR 技术，使用 Toyobo 公司ThunderBirdSYBR qPCR Mix 试剂按照说明书对引物进行 PCR 扩增。每组样品 3 个复孔，以保证实验数据的有效性。使用 GAPDH为内参，检测目的基因乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶(FASN)以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA相对于内参基因（GAPDH）的表达变化来定量。采用Graphpad7分析数据 (即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数 )。所用引物为：ACC1（h-ACC1-F：GCCATTGGGATTGGGGCTTAC；h-ACC1-R：CCCGCCCGAGGACTTTGTTG）、FASN（hFASN-f：AACTCCAAGGACACAGTCACCAT；hFASN-r：CAGCTGCTCCACGAACTCAAA）以及SCD1（hSCD1-f：TGGGTTGGCTGCTTGTG；hSCD1-r：GCGTGGGCAGGATGAAG）。

结合附图1和图2的实验结果可知，由本发明制备的石斛水提取物相对空白对照组（给药浓度为0μg/mL），高剂量石斛水提取物的给药均能够明显抑制乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶（FASN）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA表达水平，中剂量石斛水提取物的给药能够明显抑制脂肪酸合成酶（FASN）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA表达水平，低剂量石斛水提取物的给药能够明显抑制脂肪酸合成酶（FASN）的mRNA表达水平；而由本发明制备的石斛醇提取物相对空白对照组（给药浓度为0μg/mL），中剂量石斛醇提取物的给药能够明显抑制脂肪酸合成酶（FASN）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA表达水平，低剂量石斛醇提取物的给药能够明显抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA表达水平。由此可知，石斛提取物具有明显抑制脂肪酸合成相关的酶的基因表达的作用。

（Ⅱ）油红O染色

具体过程：将体外HUH7细胞悬液1000 rpm 离心5 min，沉淀用D+完全培养基（包含设置不同血清浓度0，15%、20%、30%）重悬后铺在1块48孔细胞培养板（每孔1*104个细胞，培养板中预先铺上圆形盖玻片），培养 2 小时后吸除未贴壁的悬浮细胞，待其稳定后更换培养基并进行加药处理，油红O染色检测巨噬细胞泡沫化。

（1）铺片，将圆形盖玻片置于烧杯中，加入适量 75%酒精消毒过夜，铺片前换成100%酒精进行铺片，用镊子夹起单个盖玻片，在酒精灯火焰上燃烧，以去除多余的酒精，小心地将盖破片放入 24 孔板内；

（2）细胞爬片，按照上述实验方法将HUH7细胞均匀分到48孔板内（每孔1*104个细胞），在不同血清浓度的D+培养基中培养，处以不同石斛提取物及其质量浓度梯度（即，石斛水提取物：空白对照组(FWE：0μg/mL)、低剂量组(FWE：10μg/mL)、中剂量组(FWE：100μg/mL)、高剂量组(FWE：1000μg/mL) ；石斛醇提取物：空白对照组(DEE：0μg/mL)、低剂量组（DEE：10μg/mL）、中剂量组(DEE：100μg/mL)、高剂量组(DEE：500μg/mL)给药处理,20%FBS培养48h；

（3）培养结束后，用PBS洗两次,每次5min，加入4%多聚甲醛室温固定30min，PBS洗5min；

（4）油红O染色，加入已经过滤好的油红O色液室温染色50min, 60%异丙醇脱色，蒸馏水冲洗3次，苏木素染色1min, 蒸馏水洗涤返蓝，封片晾干后进行观察并拍照，片子置于-20℃冰箱中保存。

结合附图3和图4，油红O可将细胞中脂滴染成红色，脂肪酸合成越多，红色越重。从图中染色情况看出，石斛水提取物处理能够抑制脂滴的合成，且呈浓度依赖性。石斛醇提取物处理同样对脂肪酸合成有明显抑制作用，并呈浓度依赖性。

综上所述，不论是从对脂肪酸合成相关的酶即乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶(FASN)以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的表达水平结果，还是从油红O染色结果来看，均能够得到本发明提供的石斛提取物具有有效抑制脂肪酸的合成的功效作用的结论，因此，本发明提供的石斛提取物能够制备抑制脂肪酸合成的药物。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用，其特征在于，所述石斛提取物由石斛药材经提取得到。

2.根据权利要求1所述的石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用，其特征在于，所述石斛提取物为石斛水提取物或石斛醇提取物。

3.根据权利要求1所述的石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用，其特征在于，所述石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。

4.根据权利要求2所述的石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用，其特征在于，所述石斛水提取物的制备步骤为：将新鲜石斛，去根、叶后保留茎部，粉碎后，加入5-8倍重量份的蒸馏水浸没，于75-85℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取,合并提取液，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

5.根据权利要求2所述的石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用，其特征在于，所述石斛醇提取物的制备步骤为：将石斛干粉，用18-20倍重量份的75% 乙醇于55-60℃下进行提取，重复提取，合并提取物，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

6.根据权利要求1-5任一项所述的石斛提取物在制备抑制脂肪酸合成的药物中的应用，其特征在于，所述石斛提取物可制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式。

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