CN107028823A

CN107028823A - 一种制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法及其产品

Info

Publication number: CN107028823A
Application number: CN201610080687.3A
Authority: CN
Inventors: 董银卯; 李丽; 张小慧; 刘有停
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2017-08-11
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: CN107028823B

Abstract

本发明公开了一种制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法及其产品，包括向未发酵甘草溶液中接种活化的酵母菌种，在温度为25‑35℃，pH为6.5‑9.0，转速为80‑160r/min条件下，发酵35‑45h，得到所述的甘草发酵液。研究发现，通过该方法可以显著降低甘草发酵液中光甘草定以及甘草查尔酮A的含量，同时使具有MMPs抑制及胶原蛋白刺激作用的活性成分—异甘草素以及异甘草苷显著升高。因此，由该方法制备得到的甘草发酵液在制备化妆品，特别是具有高安全性，且具有美白以及抗衰老的效果的化妆品中将具有良好的应用前景。

Description

一种制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法及其产品

技术领域

本发明涉及一种甘草的发酵方法及其产品，特别涉及一种用于制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法及其产品，属于化妆品技术领域。

背景技术

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)素有“美白皇后”之称，在化妆品中的应用广泛，市场需求巨大，其不仅可以抑制酪氨酸酶、清除自由基，抑制组胺释放，从而达到美白、抗衰老、抗炎的功效，同时可以改善皮肤粗糙、缺水等问题。甘草美白在国外很多美白类化妆品专利中报道较多，多直接应用甘草提取物添加。众多宣称美白功效的化妆品中含有甘草提取物。由于甘草提取物一般颜色较深，在化妆品中用量受到限制。所以，其粗提物应用于化妆品存在很大的局限。甘草主要成分为：多糖类、三萜类、黄酮类化合物、少量生物碱、木质素、香豆素。其中报道黄酮类化合物106个，苷元73个。目前为止从甘草中分离出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、光甘草定、异甘草甙、新甘草甙、新异甘草甙、甘草素、异甘草素以及甘草西定、甘草醇、异甘草醇、7-甲基香豆精、伞形花内酯等数十种化合物，光甘草定(Glabridin)为国际公认甘草美白活性成分，但本发明在研究过程中发现光甘草定对黑素细胞及成纤维细胞具有毒性，且能够刺激mmps的表达，提示光甘草定作为美白成分对人体存在一定的安全隐患，因此降低甘草提取液中光甘草定的含量，同时提高甘草中具有高安全性的其他美白活性成分成为一种迫切的需要。

随着对中草药制剂的深入研究，微生物发酵中草药成为一种新的中草药研究方法，通过微生物的降解作用，中草药的有效成分和活性物质被最大限度的释放出来。另外，微生物发酵中草药的过程中，中草药的一些成分可能诱导微生物的某些代谢途径发生变化，从而产生新的活性物质。

本发明通过对甘草活性成分进行分析，研究甘草活性成分对细胞的作用机制，通过微生物发酵法，建立了一种可用于制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过对甘草发酵液中主要甘草单体(包括甘草素、异甘草素、异甘草苷、光甘草定、甘草酸以及甘草查尔酮A)在抑制酪氨酸酶、促进胶原蛋白合成、抑制MMP1mRNA表达以及对细胞的毒性方面进行研究，结果发现虽然光甘草定(Glabridin)为国际公认甘草美白活性成分，但其对成纤维细胞具有毒性，并且能够刺激mmps的表达，因此作为美白成分添加到化妆品中会对人体存在一定的安全隐患。另外两种物质，即异甘草素(Isoliquiritigenin)以及异甘草苷(Isoliquiritoside)，经研究证实，其对Col1A1具有显著促进作用，且可以抑制MMP1的表达，是有助于皮肤真皮层改善的物质，而且二者的细胞毒性低，安全性高，因此，异甘草素(Isoliquiritigenin)以及异甘草苷(Isoliquiritoside)在促进胶原蛋白合成、抗衰老化妆品中具有重要的应用价值。

本发明在上述研究的基础上，建立了一种制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法，通过该方法可以显著降低光甘草定以及甘草查尔酮A(Licochalcone A)的含量，同时使具有MMPs抑制及胶原蛋白刺激作用的活性成分异甘草素(Isoliquiritigenin)以及异甘草苷(Isoliquiritoside)显著升高。因此，由该方法得到的甘草发酵液可能会成为高安全性美白活性物质的重要选择。

本发明的一种制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法，包括以下步骤：

(1)甘草溶液制备：

甘草粉碎后过80-120目筛，称取30-60g于烧杯中，加入500-1000mL75％的乙醇，30-50℃超声提取40-90min，真空抽滤至装置的真空度为0.9MPa，取上清液；将得到的上清液旋转蒸发掉乙醇，用蒸馏水补足至原体积，制得未发酵甘草溶液；

(2)甘草发酵液的制备：取未发酵甘草溶液于锥形瓶，加入酵母培养基后灭菌；冷却后接入活化的酵母菌种，在温度为25-35℃，pH为6.5-9.0，转速为80-160r/min条件下，发酵35-45h，得到所述的甘草发酵液。

在本发明中，优选的，步骤(1)包括以下步骤：甘草粉碎后过100目筛，称取60g于烧杯中，加入1000mL75％的乙醇，50℃超声提取60min，真空抽滤至装置的真空度为0.9MPa，取上清液，将得到的上清液旋转蒸发掉乙醇，用蒸馏水补足至原体积，制得未发酵甘草溶液。

在本发明中，优选的，步骤(2)包括以下步骤：取未发酵甘草溶液于锥形瓶，加入酵母培养基后灭菌；冷却后接入活化的酵母菌种，使其浓度达到1.5-2.5×10³CFU/ml，在温度为30℃，pH为9，转速为120r/min条件下，发酵45h，得到所述的甘草发酵液。

在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的酵母培养基由葡萄糖、蛋白胨以及酵母膏组成。

在本发明中，优选的，葡萄糖、蛋白胨以及酵母膏在发酵液中的终浓度分别为0.01g/ml、0.01g/ml以及0.005g/ml。

按照以上所述的发酵方法制备得到的高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液，相较于发酵前的甘草溶液，发酵后的溶液中光甘草定以及甘草查尔酮A的含量下降，异甘草素以及异甘草苷的含量升高(表9)。

在本发明中，优选的，所述发酵液中异甘草素的含量为150-200μg.mL^-1，异甘草苷的含量为150-200μg.mL^-1，光甘草定以及甘草查尔酮A的含量在同等条件下检测不到。

在本发明的一个具体实施例中，采用以上所述的发酵方法所述发酵液中异甘草素的含量为175.00μg.mL^-1，异甘草苷的含量为174.35μg.mL^-1，光甘草定以及甘草查尔酮A的含量在同等条件下检测不到。

更进一步的，本发明还提出了所述的甘草发酵液在制备化妆品、特别是制备具有高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的化妆品中的用途。

附图说明

图1为甘草发酵液中各甘草单体对酪氨酸酶抑制率；

图2不同温度下酵母菌发酵甘草的OD值；

图3不同PH下酵母菌发酵甘草的OD值；

图4不同转速下酵母菌发酵甘草的OD值；

图5不同时间酵母菌发酵甘草的OD值；

图6为发酵前后对酪氨酸酶抑制效果的变化；

图7为发酵前后DPPH清除能力的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1甘草单体对酪氨酸酶抑制效果的研究

为了确定甘草发酵液中各甘草单体对酪氨酸酶抑制效果，本发明选用了以下6种主要甘草单体进行了酪氨酸酶抑制试验，同时测定了6种主要甘草单体的IC50值，6种主要单体为：甘草素、异甘草素、异甘草苷、光甘草定、甘草酸以及甘草查尔酮A。

结果如图1所示，从图1结果可以看出，6种主要单体对酪氨酸酶抑制率为：光甘草定＞甘草酸＞异甘草素＞异甘草苷＞甘草查尔酮A＞甘草素。

实施例2甘草单体的细胞毒性

为了确定甘草发酵液中各甘草单体的细胞毒性，本发明通过WST-1法测试了6种甘草单体对成纤维细胞的细胞毒性，测试结果如表1所示。

表1不同浓度的甘草活性单体(μM)对成纤维细胞的毒性

从表1结果可以看出：异甘草素、异甘草苷在毒性评价试验中表现低毒性；光甘草定以及甘草查尔酮A在毒性评价试验中表现较高毒性，对人体存在一定的安全隐患。

实施例3甘草单体对COLLA1、MMP1mRNA的表达的影响

1、试验方法

利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析法测定1型胶原蛋白和分解1型胶原的胶原蛋白酶代表基因的mRNA数量的变化从而确定1型胶原蛋白和胶原蛋白酶的变化。在60mm培养板中把人皮肤成纤维细胞(nHDF)细胞分株为3x10⁵个/孔后，进行24小时的培养。然后，添加一定浓度样品溶液再进行24小时的培养。收获培养好的细胞后，添加1ml TRIzol试剂(Life Technology)对细胞进行溶解并提取其总mRNA。利用超微量分光光度计检验了总mRNA的浓度和纯度，(其中只选用纯度在2.0以上的总mRNA)。利用反转录酶(M-MLV反转录酶)，把总mRNA反转录为cDNA，用于qRT-PCR。利用HOT FIREPol EvaGreen PCR Mix Plus进行了qRT-PCR，利用StepOnePlusRT-PCR系统分析了该基因的表达。PCR的反应条件是在94℃进行5分钟的变性(denaturation)后，94℃变性30秒，60℃退火30秒,72℃延伸30秒，共进行40个循环。基因表达的变化通过比较β-ACTIN对照组基因表达量来测定。

2、试验结果

评价甘草单体对nHDF细胞Col1A1和MMP1的影响是通过测定Col1A1和MMP1的mRNA的表达量来实现的，结果如表2。

表2 12h后甘草各单体对COL1A1和MMP1的mRNA的影响

综合实验结果来看，可以判断从甘草中提取的异甘草素、异甘草苷、甘草查尔酮具有增加Col1A1的功效；异甘草素、异甘草苷可降低MMP1的含量。所以，异甘草素和异甘草苷可以使Col1A1增加，减少MMP1的表达，是有助于皮肤真皮层改善的物质。光甘草定在降低COL1A1含量的同时增加MMP-1的表达。又因细胞毒性大，存在安全隐患。光甘草素、光甘草苷对Col1A1具有显著促进作用，且可以抑制MMP1的表达，且其细胞毒性低、安全性高，在促进胶原蛋白合成、抗衰老化妆品中具有重要的应用价值。

实施例4制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法的建立

本实施例结合单因素及正交实验对甘草酵母发酵液活性成分进行分析，确定最佳的制备方案，并研究甘草活性成分对成纤维细胞作用机制。

1、原料

甘草选自道地产地的甘草原料，微生物菌种为酿酒酵母，购于中国普通微生物菌种保藏中心。

2、方法

2.1甘草发酵液的制备

甘草溶液制备：甘草粉碎后过100目筛，称取60g于烧杯中，加入1000mL75％的乙醇，50℃超声提取60min，真空抽滤至装置的真空度为0.9MPa，取上清液。将上述样品旋转蒸发掉乙醇，用蒸馏水补足至原体积，制得未发酵甘草溶液。

甘草发酵液的制备：取50mL甘草溶液于锥形瓶，加入葡萄糖0.5g、蛋白胨0.5g，以及酵母膏0.25g，灭菌。冷却后接入1×10⁵CFU活化的酵母菌种，使其终浓度为2×10³CFU/ml。

2.2甘草最佳发酵工艺的选择

2.2.1最佳发酵温度的选择

将培养箱转速设定为120r/min，将其温度分别设置为25℃、28℃、30℃、35℃，培养20h后测定其在600nm下的吸光值。

2.2.2最佳PH值的选择

将培养箱转速设定为120r/min，将其温度分别设置上述所选最佳温度30℃，分别将其PH值用稀碱/稀酸调节至6.5、7.0、8.0、9.0，培养20h后测定其在600nm下的吸光值。

2.2.3最佳转速的选择

用稀碱/稀酸调节至上述最佳pH 8.0，将其温度分别设置上述所选最佳温度30℃，将培养箱转速设定为80r/min、120r/min、140r/min、160r/min，培养20h后测定其在600nm下的吸光值。

2.2.4最佳时间的选择

用稀碱/稀酸调节至上述最佳pH 8.0，将其温度分别设置上述所选最佳温度30℃，将培养箱转速设定为140r/min，分别培养35h、40h、45h后，取培养液，测定其在600nm下的吸光值。

2.3正交试验选择甘草最佳发酵工艺

在上述单一因素试验的基础上，设定正交试验。试验分组如下表3所示所示：

表3正交试验选择甘草最佳发酵工艺

3、实验结果

3.1最佳发酵温度的选择

不同发酵温度下，发酵液的OD值如图2所示。不同温度下甘草发酵前后活性单体含量变化如表4所示。

表4不同温度下甘草发酵前后活性单体含量(μg.mL^-1)的变化

由图2及表4可知，酵母菌发酵甘草时，温度对发酵的差异性显著，在30℃下发酵效果最好。且在30℃下，光甘草定、甘草查尔酮A显著下降，异甘草素、异甘草苷等成分明显升高。

3.2最佳pH值的选择

不同发酵pH下，发酵液的OD值如图3所示。发酵前后甘草活性成分的变化如表5所示。

表5不同发酵pH下甘草发酵前后活性单体含量(μg.mL^-1)的变化

由图3及表5可知，酵母菌发酵甘草时，pH对发酵的影响差异性显著，pH在8和9下发酵效果较好。pH为8时，光甘草定、甘草查尔酮A显著下降，异甘草素、异甘草苷等成分明显升高。

3.3最佳转速的选择

不同转速下，发酵液的OD值如图4所示。不同转速下甘草发酵前后活性成分的变化如表6所示。

表6不同转速下甘草发酵前后活性单体含量(μg.mL^-1)的变化

由图4及表6可知，酵母菌发酵甘草时，培养箱的转速对发酵具有一定的影响，在120r/min时发酵效果最好，且发酵液中光甘草定、甘草查尔酮A显著下降，异甘草素、异甘草苷等成分明显升高。

3.4最佳发酵时间的选择

不同发酵时间下，发酵液的OD值如图5所示。不同发酵时间下甘草发酵前后活性成分的变化如表7所示。

表7不同发酵时间下甘草发酵前后活性单体含量(μg.mL^-1)的变化

由图5及表7可知，酵母菌发酵甘草时，发酵时间对发酵具有明显作用，发酵40h时酵母菌生长趋于稳定。且发酵液中光甘草定、甘草查尔酮A显著下降，异甘草素、异甘草苷等成分明显升高。

单因素试验所得最佳的发酵工艺为发酵温度为30℃、pH＝8、转速为120r/min，发酵时间为40h。

3.5正交试验选择最佳发酵工艺

在上述单因素试验的基础上，设计四因素三水平正交试验，结果如表8。

表8正交试验结果

由正交试验结果计算可知：酵母菌在发酵甘草时的最佳条件为下，温度30℃，pH为9，转速在120r/min时酵母发酵45h时酵母菌的生长最好，且发酵液中光甘草定、甘草查尔酮A显著下降，异甘草素、异甘草苷等成分明显升高。

实施例5高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的制备及效果验证

1、发酵液的制备

1.1原料

1.2方法

甘草溶液制备：甘草粉碎后过100目筛，称取60g于烧杯中，加入1000mL75％的乙醇，50℃超声提取60min，真空抽滤至装置的真空度为0.9MPa，取上清液。将上清液旋转蒸发掉乙醇，用蒸馏水补足至原体积，制得未发酵甘草溶液。

甘草发酵液的制备：取50mL甘草溶液于锥形瓶，加入葡萄糖0.5g、蛋白胨0.5g，以及酵母膏0.25g，灭菌。冷却后接入1×10⁵CFU活化的酵母菌种，使其终浓度为2×10³CFU/ml。在温度为30℃，pH为9，转速为120r/min条件下，发酵45h，得到甘草发酵液。

2、发酵液的HPLC分析

2.1供试品制备

分别取上述发酵液与未发酵液1mL，过滤膜，制得样品。

2.2实验结果

对供试品进行HPLC检测，结果如表9所示。

表9最佳发酵条件下发酵前后6种活性单体含量测定结果

由表9可知：甘草发酵前后活性单体发生了很大变化。光甘草定、甘草查尔酮A含量降低(＜LOD，表示检测不到)，甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、甘草酸含量明显增加。

3、细胞毒性测试

3.1仪器与试剂

电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140)，上海一恒科学仪器有限公司；离心机(Thermo)；CO₂恒温细胞培养箱(HH.CP-01W型)，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；无菌操作台，北京世安科林净化技术有限公司；倒置显微镜，OLYMPUS；细胞培养瓶，NUNC；酶标仪，Multiskan GO，Thermo；分析天平(CP224S)，Sartorius；振荡器(CL-901)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；96孔板；移液抢

DMEM培养基，Corning Cellgro；胎牛血清，Hyclone；双抗，gibco；

PBS，gibco；WST-1，Sigma；胰蛋白酶，GIBCO

3.2试验方法

WST-1(4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝苯基)-2H-5-四氮唑]-1,3-苯磺酸钠))，其测定原理为通过测量细胞内线粒体NADH^-脱氢酶活性的方法说明细胞存活率。四氮唑作用在活细胞，根据线粒体中的脱氢酶会形成有色的甲瓒。通过测定450nm波长的吸光度确定甲瓒的含量，以此确定活细胞的浓度。

3.2.1人皮肤成纤维细胞的传代培养

细胞以1×10⁵/ml接种到事先放置已消毒的96孔板中。在细胞培养箱中进行孵育，待细胞有近80％～100％融合时，将培养液弃去，取1mL胰酶消化，待细胞消化完全后加入1mL培养基离心后去除上清液，加入1mL含血清培养液吹打均匀，后取0.333mL细胞加入到含5mL含血清的培养基中传代培养。

3.2.2细胞接种

待培养板中细胞长至80％左右，将培养液弃之，加入1ml胰蛋白酶并在显微镜下观察至大部分细胞消化下来，再加入1ml含血清培养基终止消化并反复吹打，转移至离心管800r/min离心6min。离心后弃上清，加培养基适量(可以以传代密度接种至96孔板)，铺板，分装到小EP管里反复吹至混合均匀，确保细胞均匀一致铺板。每孔加入100μL的含细胞培养基。将96孔板于培养箱培养24h，待细胞贴壁并长至80％时用于加样继续培养24h。用含10％WST-1的培养基进行处理，在37℃条件下培养，0.5-1h，测定其在450nm处的吸光度，同时测定650nm处的吸光度作为参考。样品配制浓度如下表10所示：

表10样品配制浓度

3.3WST-1法测试细胞毒性结果

通过测定上述6种甘草单体的细胞毒性，决定试样液浓度，其测试结果如表11所示。

表11甘草发酵前后对成纤维细胞毒性

由上表可知：发酵液与未发酵液在浓度为2.5％以上存在明显差异性，在浓度为2.5％时发酵液细胞毒性较未发酵液下降38.2％，存在显著性差异。所以可判断，经发酵后甘草溶液的毒性降低。

4、发酵液对酪氨酸酶抑制效果的研究

按照实施例1的方法，对不同浓度的发酵液以及未发酵液对酪氨酸酶抑制效果进行了研究，结果如图6所示，从该结果可以看出，相较于未发酵液，发酵液在低浓度至高浓度范围内均表现出较高的抑制酪氨酸酶活性。

5、发酵液对COLLA1、MMP1mRNA的表达的影响

按照实施例3的方法，对不同浓度的发酵液以及未发酵液对COLLA1、MMP1mRNA的表达进行了研究，结果如下表12所示，从该结果可以看出，相较于未发酵液，发酵液能够促进Col1A1的表达，抑制MMP1的表达。

表12发酵液以及未发酵液对COLLA1、MMP1mRNA的表达的影响

6、发酵液清除自由基能力研究

发酵前后样品清除DPPH如图7所示。从图7结果可以看出：甘草液发酵后对DPPH的清除能力显著增强，2.5％的甘草溶液其清除DPPH能力由发酵前的42％提高至发酵后的90％，发酵液浓度升高至5％时，DPPH清除能力趋于平稳。

综上所述，在最佳发酵工艺条件下，甘草发酵后，甘草发酵液的细胞毒性显著降低，且DPPH的清除能力显著增强，本发明的提出对高安全性的甘草护肤产品的开发具有重要意义。

Claims

1.一种制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)甘草溶液制备：

2.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：甘草粉碎后过100目筛，称取60g于烧杯中，加入1000mL75％的乙醇，50℃超声提取60min，真空抽滤至装置的真空度为0.9MPa，取上清液，将得到的上清液旋转蒸发掉乙醇，用蒸馏水补足至原体积，制得未发酵甘草溶液。

3.按照权利要求1或2所述的微生物发酵方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：取未发酵甘草溶液于锥形瓶，加入酵母培养基后灭菌；冷却后接入活化的酵母菌种，使其浓度达到1.5-2.5×10³CFU/ml，在温度为30℃，pH为9，转速为120r/min条件下，发酵45h，得到所述的甘草发酵液。

4.按照权利要求1-3任一项所述的微生物发酵方法，其特征在于，步骤(2)中所述的酵母培养基由葡萄糖、蛋白胨以及酵母膏组成。

5.按照权利要求4所述的微生物发酵方法，其特征在于，葡萄糖、蛋白胨以及酵母膏在发酵液中的终浓度分别为0.01g/ml、0.01g/ml以及0.005g/ml。

6.按照权利要求1-5任一项所述的发酵方法制备得到的高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液。

7.按照权利要求6所述的甘草发酵液，其特征在于相较于发酵前的甘草溶液，发酵后的溶液中光甘草定以及甘草查尔酮A的含量下降，异甘草素以及异甘草苷的含量升高。

8.按照权利要求6或7所述的甘草发酵液，其特征在于，所述发酵液中异甘草素的含量为150-200μg.mL^-1，异甘草苷的含量为150-200μg.mL^-1，光甘草定以及甘草查尔酮A的含量在同等条件下检测不到。

9.权利要求6-8任一项所述的甘草发酵液在制备化妆品中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于所述化妆品具有高安全性，且具有美白以及的抗衰老的效果。