KR101319984B1 - 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 추출 방법은 산수유를 증기로 찌고, 이를 락토바실러스 브레비스로 발효시킨 다음 열수 추출함으로써, 로가닌 함량이 높고, 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물을 효율적으로 얻을 수 있다.

Description

항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법{Method for producing Cormus officinalis fermentation extract with increased antioxidative activity}

본 발명은 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

생약재에 함유되어 있는 생리활성 성분을 얻기 위하여 공지된 추출방법을 사용하여 왔다. 공지된 추출 방법으로는 전통적인 방법인 수 추출 방법, 알콜 추출 방법, 열수 추출 방법, 증기압 추출 방법 등이 있으며, 최근 들어서는 초임계 유체 추출 방법, 감마선 조사 추출 방법, 고압 추출 방법, 고전압 펄스 전기장(high woltage pulsed electric fields, PEF) 추출 방법, 마이크로웨이브 추출 방법, 초음파 추출 방법 등이 이용되고 있다.

상기 열수 추출 방법은 추출 효율이 낮고, 에너지 소비가 많으며, 높은 열로 인하여 생약재 내의 많은 생리활성 성분의 파괴, 단백질의 변이, 가용성분 위주의 추출, 열에 대한 불안정성 등의 많은 단점을 드러내고 있다.

상기 초음파 추출 방법은 열을 직접 가열하는 방식이 아닌 초음파 에너지가 내부에서 열에너지로 바뀌는 형태로, 저온의 상태에서 초음파를 이용하여 추출함으로써 비열처리의 한 방법으로 분류되어 사용되고 있지만, 엄밀히 말하면 내부 열의 증가를 나타내기에 비열처리라고 할 수 없다.

상기 고압 추출 방법은 일반적으로 600~800 MPa의 압력으로 추출하는 방법으로 널리 이용되고 있으나, 초고압 상태이기 때문에 장치의 가격이 매우 비싸고, 기계를 다루는데 위험요소가 따른다는 문제점을 가지고 있다. 그리고, 다른 고압 추출 방법으로는 초임계 유체 추출 방법이 있는데, 이는 특정 정유 성분을 분리하기 위한 방법이고, 추출하는 시간이 많이 걸리는 단점이 있다.

상기한 바와 같이, 초임계 유체 추출 방법, 감마선 조사 추출 방법, 고압 추출 방법, 고전압 펄스 전기장(high woltage pulsed electric fields, PEF) 추출 방법, 마이크로웨이브 추출 방법, 초음파 추출 방법 등은 많은 투자비용으로 인하여 그 이용에 많은 제한 요인을 가지고 있으며, 전통적인 추출 방법보다 월등히 많은 투자비용에 반해 좋은 장점들을 보여주지 못하고 있다.

따라서, 상기의 추출 방법들을 병행하여 추출하는 방법이 이용되어 왔다. 일 예로, 열수 추출 방법과 초음파 추출 방법을 병행 처리하면 비열처리에 의해 열에 의한 생리활성 성분의 파괴를 막아주고, 추출 수율의 증진을 가져온다. 하지만, 상기의 병행 추출 방법은 생약재가 포함하고 있는 다른 독성 물질을 많이 포함하여 추출되는 단점이 발생한다.

따라서, 생약재 내에서 생리활성 성분을 효과적으로 추출해낼 수 있는 생약재의 추출 방법에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

한편, 산수유(Cornus officinalis)는 층층나무과(Cornaceae)에 속하는 낙엽활엽 소교목으로, 산수유 열매의 육질을 건조한 것으로, 성질은 약간 따뜻하고 맛은 시고 떫으며 독이 없다. 과육(열매)에는 코르닌(cornin), 모로니사이드 (morroniside), 로가닌(loganin), 탄닌(tannin), 사포닌(Saponin) 등의 배당체와 포도주산, 사과산, 주석산 등의 유기산이 함유되어 있으며, 그 밖에 비타민 A와 다량의 당(糖)도 포함되어 있다. 종자(씨)에는 팔미틴산, 올레인산, 리놀산 등이 함유되어 있다. 산수유는 음(陰)을 왕성하게 하며, 신정(精)과 신기(腎氣)를 보하고 성기능을 높이며, 음경을 딴딴하고 크게 한다. 또한, 정수(精髓)를 보(補)해 주고 허리와 무릎을 덥혀 준다. 빈뇨를 낫게 하며, 두풍과 코가 메는 것, 귀먹는 것을 낫게 한다. 또한, 사포닌의 함량이 15% 이상 함유되어 있어 수렴효과가 우수하며, 유해산소 제거 효과도 우수하여 피부를 개선해 주는 효과를 갖는다. 동물실험에서는 이뇨작용과 혈압강하작용을 보이며, 산수유 달인 물은 포도상구균, 이질균의 억제 작용과 복수암 세포의 억제작용이 있고, 혈당강하작용도 있으며, 심근의 수축력을 높이고, 혈압을 올리며, 면역 계통에 림프세포 증식작용을 보이고, 혈소판 응집억제 작용도 보인다.

상기한 바와 같이, 산수유 열매에는 다양한 생리활성 물질이 많이 포함되어 있으나, 종래의 추출 방법을 이용하여 산수유로부터 생리활성 물질을 추출할 경우 유효성분인 생리활성 물질이 매우 적게 얻어져 추출 효율이 떨어지는 단점이 있다. 따라서, 산수유로부터 생리활성 물질을 효과적으로 얻을 수 있는 개량된 추출 방법의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 산수유로부터 생리활성 물질을 효과적으로 얻을 수 있는 개량된 추출 방법에 대해 연구하던 중, 산수유를 증기로 찌고 이를 락토바실러스 브레비스로 발효시킨 다음 열수 추출하여 산수유 발효 추출물을 얻었으며, 얻어진 산수유 발효 추출물에 함유되어 있는 로가닌 함량이 기존의 추출방법으로 얻은 산수유 추출물에서 보다 더 높고, 항산화 활성이 더 우수하게 나타남을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은

1) 산수유를 수세하고 씨를 제거한 다음 과실을 건조하고 분쇄하는 단계,

2) 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis, KCTC 13094)를 MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe) 액체배지에 접종하고 전 배양하는 단계,

3) 상기 분쇄한 산수유를 증기로 찌고 밀봉 상태에서 자연 냉각시키는 단계,

4) 전 배양된 락토바실러스 브레비스를 증기로 찐 분쇄 산수유에 접종하고 발효시키는 단계,

5) 상기 발효된 산수유에 정제수를 가하고 열수 추출하는 단계, 및

6) 상기 추출액을 감압 여과 및 농축하고 건조하는 단계를 포함하는, 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법은, 산수유를 증기로 찌고, 이를 락토바실러스 브레비스로 발효시킨 다음 열수 추출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 산수유 발효 추출물의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 1)단계는 산수유를 건조하고 분쇄하는 단계로, 산수유를 수세하고 씨를 제거한 다음 과실을 건조하고 0.2~0.5㎝의 크기로 분쇄한다.

상기 2)단계는 유산균을 전 배양하는 단계로, 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis, KCTC 13094)를 MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe) 액체배지에 접종하고 30~40℃에서 1~5일 동안 전 배양한다.

상기 3)단계는 분쇄한 산수유를 증기로 찌는 단계로, 건조된 분쇄 산수유를 110~130℃, 바람직하게는 121℃에서 10~30분 동안, 바람직하게는 15분 동안 증기로 찌고 밀봉 상태에서 자연 냉각시킨다.

상기 4)단계는 전 배양된 락토바실러스 브레비스를 증기로 찐 분쇄 산수유에 접종하고 발효시키는 단계로, 락토바실러스 브레비스를 증기로 찐 분쇄 산수유 중량 대비 3~10%(v/v), 바람직하게는 5%(v/v)로 접종하고, 30~40℃에서 1~5일 동안 발효시킨다.

상기 5)단계는 발효된 산수유를 열수 추출하는 단계로, 발효 종료 후 발효된 산수유에 산수유 중량 대비 5~10배량의 정제수를 가하고 100℃에서 1~3시간 동안 추출한다.

상기 6)단계는 분말 형태의 산수유 발효 추출물을 얻는 단계로, 상기 5)단계에서 얻은 산수유 추출액을 감압 여과 및 농축하고 동결건조하여 분말 형태의 산수유 발효 추출물을 얻는다.

상기 방법으로 얻어진 산수유 발효 추출물을 HPLC로 분석하여 로가닌 함량을 측정한 결과, 산수유 발효 추출물에서의 로가닌 함량은 17.92±0.07㎎/g로, 산수유 알콜 추출물(13.14±0.15㎎/g), 산수유 효소 추출물(14.58±0.08㎎/g), 산수유 효소 열수 추출물(11.79±0.11㎎/g)에 비해 높게 나타난다.

또한, 상기 방법으로 얻어진 산수유 발효 추출물에서 DPPH 라디칼 소거 활성, 환원력 활성 및 과산화수소 소거 활성이 산수유 알콜 추출물, 산수유 효소 추출물, 산수유 효소 열수 추출물에 비해 우수하다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 추출 방법은 산수유를 증기로 찌고, 이를 락토바실러스 브레비스로 발효시킨 다음 열수 추출함으로써, 로가닌 함량이 높고, 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물을 효율적으로 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 산수유 발효 추출물은 피부노화방지용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출 방법으로 얻어진 산수유 발효 추출물은, 기존의 추출 방법으로 얻은 산수유 추출물에 비해 로가닌 함량이 높고, 항산화 활성이 우수하다.

도 1은 농도별(0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ㎎/㎖)로 희석한 로가닌 표준용액을 HPLC로 분석하여 얻은 로가닌의 검량선을 나타낸 도이다.
도 2는 각 산수유 추출물의 HPLC 분석에 의한 로가닌 정량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 각 산수유 추출물의 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 각 산수유 추출물의 농도에 따른 환원력 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 각 산수유 추출물의 농도에 따른 과산화수소 소거 활성을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 산수유 발효 추출물의 제조

전남 구례군 산동면에서 수확한 산수유를 수세하고 씨를 제거한 다음 과실을 건조하고 0.2~0.5㎝의 크기로 분쇄하였다. 유산균인 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis, KCTC 13094)를 MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe) 액체배지가 함유된 500㎖ 삼각플라스크에 접종하고 37℃에서 72시간 동안 배양기(HB-101M)에서 전 배양하였다. 건조된 분쇄 산수유를 121℃에서 15분 동안 증기로 찌고 밀봉 상태에서 자연 냉각시켰다. 이후 전 배양된 유산균(락토바실러스 브레비스)을 멸균된 스프레이 용기에 넣고, 찐 분쇄 산수유에 찐 분쇄 산수유 중량 대비 5%(v/v)로 고르게 분사하여 접종한 다음, 배양기(HB-101M)에서 37℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 발효 종료 후, 산수유 중량 대비 6배량의 정제수를 가하고 추출기(KSNP B1130)로 100℃에서 1시간 동안 추출하였다. 상기 추출액을 5㎛의 막공 크기를 갖는 종이 필터(ADVANTEC, 110 mm)를 여과부에 깔고 그 위에 셀라이트를 약 3㎝ 첨가한 후 추출액을 감압 여과하였다. 이 여과액은 최종 고형분 함량이 50%가 될 때까지 회전 진공 증발기(EYELA, N-1000)를 이용하여 진공도 700mmHg, 50~60℃의 온도에서 감압 농축하였다. 이후 농축액을 -70℃의 초저온냉동고에서 동결한 후, 동결건조기(EYELA, FDU-2100)로 건조하여 분말 형태의 산수유 발효 추출물을 제조하였다.

비교예 1 : 산수유 알콜 추출물의 제조

건조한 산수유 300g에 70% 에탄올 500㎖를 첨가하고 환류 냉각 추출 장치로 70℃에서 1시간씩 3회 반복추출 하였다. 추출액을 감압 여과하고, 여과액의 최종 고형분 함량이 50%가 될 때까지 감압 농축한 다음, 동결건조하여 분말 형태의 산수유 에탄올 추출물을 제조하였다.

비교예 2 : 산수유 효소 추출물의 제조

건조한 산수유 400g에 정제수 2,400㎖를 가하고, 펙틴분해효소(Pectinex 5XL, NOVOZYMES 사)와 복합효소(Viscozyme L, 바이오시스 사)를 각각 건조 산수유 중량 대비 0.65%(v/v)씩 첨가하였다. 이후 교반기를 이용하여 200rpm, 50℃, pH 5.0에서 4시간 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 효소의 활성을 멈춰주기 위해 100℃에서 15분 동안 실활시켰다. 추출액을 감압 여과하고, 여과액의 최종 고형분 함량이 50%가 될 때까지 감압 농축한 다음, 동결건조하여 분말 형태의 산수유 효소 추출물을 제조하였다.

비교예 3 : 산수유 효소 열수 추출물의 제조

건조한 산수유 400g에 정제수 2,400㎖를 가하고, 펙틴분해효소(Pectinex 5XL, NOVOZYMES 사)와 복합효소(Viscozyme L, 바이오시스 사)를 각각 건조 산수유 중량 대비 0.65%(v/v)씩 첨가하였다. 이후 교반기를 이용하여 200rpm, 50℃, pH 5.0에서 4시간 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 반응액을 자연 냉각시키고, 추출기 (KSNP B1130)로 100℃에서 1시간 동안 추출하였다. 추출액을 감압 여과하고, 여과액의 최종 고형분 함량이 50%가 될 때까지 감압 농축한 다음, 동결건조하여 분말 형태의 산수유 효소 열수 추출물을 제조하였다.

실험예 1 : HPLC 분석에 의한 각 산수유 추출물의 로가닌 정량 분석

산수유 추출물의 검액에 대한 정량 분석을 위하여 HPLC를 이용하여 로가닌 함량을 분석하였다. 표준용액은 로가닌(loganin)을 메탄올에 완전히 녹여 0.45㎛ 주사기 필터(ADVENTEC)로 여과하여 사용하였고, 각각의 산수유 추출물은 에탄올에 녹여 0.45㎛ 주사기 필터로 여과하여 정량 분석하였다. HPLC 분석조건은 표 1에 나타내었다. 로가닌을 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ㎎/㎖의 농도로 희석하여 얻은 각각의 로가닌에 대한 피크면적비와 표준용액의 농도에 대한 검량선을 작성하여 정량 분석을 실시하였다.

농도별(0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ㎎/㎖)로 희석한 로가닌 표준용액을 HPLC로 분석하여 얻은 로가닌의 검량선은 도 1에 나타내었고, HPLC 분석에 의한 각 산수유 추출물의 로가닌 정량 분석 결과는 도 2 및 표 2에 나타내었다.

HPLC 분석조건

기기( Agilent Technologies )
펌프	Quat Pump(G1311A)
검출기	VWD(G1314B)
자동샘플러	ALS(G1329A)
컬럼	Gemini 5u C18 (110A 4.6×250 ㎜)
작동 조건
UV 파장	203㎚
컬럼 온도	35℃
주입량	10㎕
유속	1.0㎖/min
이동상 A	증류수
이동상 B	아세토니트릴
구배( Gradient profile )	시간(min)	%A	%B	유속(㎖/min)
	0	95	5	1.0
	20	70	30
	30	70	30
	35	20	80

HPLC 분석에 의한 산수유 추출물의 로가닌 함량

산수유 추출물	로가닌 함량(㎎/g)
산수유 발효 추출물(실시예 1)	17.92±0.07
산수유 알콜 추출물(비교예 1)	13.14±0.15
산수유 효소 추출물(비교예 2)	14.58±0.08
산수유 효소 열수 추출물(비교예 3)	11.79±0.11

도 1, 도 2 및 표 2에 나타난 바와 같이, 로가닌의 검량선의 상관계수(R²)는 0.999로 높은 직선성을 나타내었고, 각 산수유 추출물에 대한 로가닌 함량은 산수유 발효 추출물에서 17.92±0.07㎎/g으로 가장 높게 나타났다.

실험예 2 : 산수유 추출물의 항산화 활성 측정

각 산수유 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위하여, DPPH 라디칼 소거 활성, 환원력 활성, 과산화수소 소거 활성을 측정하였다.

1. DPPH 라디칼 소거 활성 측정

Brand-Williams(1995)의 시험방법을 변형하여 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼에 대한 산수유 추출물의 소거 능력을 측정하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 1 및 비교예 1~3에서 제조한 산수유 추출물을 농도별(10, 50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖)로 DPPH 용액에 가하고 10초 동안 잘 혼합하였다. 그 다음, 혼합액을 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 측정은 시료(산수유 추출물) 첨가군와 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다. 양성대조군으로는 항산화 활성이 잘 알려져 있는 비타민 C를 사용하였다.

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 모든 산수유 추출물에서 농도가 높아질수록 DPPH 라디칼이 소거 활성이 우수하게 나타남을 확인하였다. 산수유 효소 추출물과 산수유 발효 추출물에서는 50㎍/㎖ 이상의 농도에서 유사한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었으나, 100㎍/㎖의 농도에서는 산수유 발효 추출물에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 높게 나타났다.

2. 환원력 활성 측정

상기 실시예 1 및 비교예 1~3에서 제조한 산수유 추출물 각 1㎖에 pH 6.6의 200mM 인산완충용액 및 1%의 칼륨 철시안화물(potassium ferricyanide)을 각각 1㎖씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA(trichloroacetic acid) 용액을 각 1㎖씩 가하고 13,500xg에서 15분 동안 원심분리하였다. 각각의 상등액 1㎖에 증류수 및 염화 제 1철(ferrous chloride)을 각 1㎖씩 혼합한 후 700㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 산수유 추출물의 환원력은 시료(산수유 추출물) 첨가군과 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 각 산수유 추출물은 10~100㎍/㎖의 농도에서는 비슷한 환원력 활성을 나타내었으나, 500㎍/㎖ 이상의 농도에서는 산수유 발효 추출물 > 산수유 효소 추출물 > 산수유 효소 열수 추출물 > 산수유 알콜 추출물 순으로 환원력 활성을 나타내었다. 특히, 산수유 발효 추출물의 환원력 활성은 양성대조군인 비타민 C보다도 높은 활성을 나타내었다.

3. 과산화수소 소거 활성 측정

상기 실시예 1 및 비교예 1~3에서 제조한 산수유 추출물 각 80㎕, 10mM 과산화수소 20㎕ 및 0.01M 인산완충용액(pH 5.0) 100㎕를 37℃에서 5분 동안 반응시켰다. 그 후, 15㎕의 1.25mM ABTS(2,2'-aziono-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) 및 30㎕의 퍼옥시다제를 37℃에서 10분 동안 반응시켜 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 과산화수소 소거 활성은 시료(산수유 추출물) 첨가 전후의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 각 산수유 추출물의 과산화수소 소거 활성은 10㎍/㎖의 농도에서는 음성대조군과 크게 차이는 없었지만, 그 이상의 농도에서는 활성을 나타내었으며, 산수유 발효 추출물에서 가장 높은 과산화수소 소거 활성을 나타내었다.

Claims (6)

1) 산수유를 수세하고 씨를 제거한 다음 과실을 건조하고 분쇄하는 단계,
2) 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis, KCTC 13094)를 MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe) 액체배지에 접종하고 전 배양하는 단계,
3) 상기 분쇄한 산수유를 110~130℃에서 10~30분 동안 증기로 찌고 밀봉 상태에서 자연 냉각시키는 단계,
4) 전 배양된 락토바실러스 브레비스를 증기로 찐 산수유에 증기로 찐 산수유 중량 대비 3~10%(v/v)로 접종하고 30~40℃에서 1~5일 동안 발효시키는 단계,
5) 상기 발효된 산수유에 정제수를 가하고 열수 추출하는 단계, 및
6) 상기 추출액을 감압 여과 및 농축하고 건조하는 단계를 포함하는, 로가닌 함량 및 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 2)단계에서 전 배양은 30~40℃에서 1~5일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 로가닌 함량 및 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법.

삭제

삭제

삭제

제 1항에 있어서, 상기 5)단계에서 열수 추출은 발효된 산수유에 산수유 중량 대비 5~10배량의 정제수를 가하고 100℃에서 1~3시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는, 로가닌 함량 및 항산화 활성을 증가시킨 산수유 발효 추출물의 제조방법.

Images