CN116059119B

CN116059119B - 含甘草和光甘草定的脂质体溶液、及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116059119B
Application number: CN202310197517.3A
Authority: CN
Inventors: 卢永杰; 张冬盈; 孙静; 张兵; 张炽坚; 艾勇; 何廷刚
Original assignee: Hua An Tang Biotech Group Co ltd
Current assignee: Hua An Tang Biotech Group Co ltd
Priority date: 2023-03-03
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2043-03-03
Also published as: CN116059119A

Abstract

本申请公开了一种含甘草和光甘草定的脂质体溶液、及其制备方法和应用。脂质体溶液的制备方法包括如下步骤：（1）酵母菌接种到甘草水提液中，经发酵培养，超声，制得甘草发酵溶胞物；（2）将1份卵磷脂、0.05~0.125份胆固醇、0.3~0.8份聚甘油类乳化剂、1~4.5份多元醇和0.075~0.5份光甘草定的混合物与1~4份步骤（1）制得的甘草发酵溶胞物和15~25份水混合，经均质，高压均质，即可。本申请制得的具有美容功效的组合物同时兼具理想的抗氧化和美白功效，制备工艺简单，不仅提高了光甘草定在水相体系中的分散性，还降低光甘草定的细胞毒性和刺激性，提高产品使用安全性。

Description

含甘草和光甘草定的脂质体溶液、及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于发酵技术领域，尤其涉及一种含甘草和光甘草定的脂质体溶液、及其制备方法和应用。

背景技术

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhizainflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效。常用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。因其具有理想的美白功效，使其在化妆品领域也有广泛的应用。目前，已从甘草中分离出光甘草定、甘草甜素、异甘草醇和甘草西定等多种化合物；其中，光甘草定是公认的美白活性成分，但其水溶性差，通常需要添加乳化剂提高其在水相中的分散能力，或者添加增溶剂使其在水相中增溶，使用方法繁琐，而且对分散性和溶解度的提高程度有限。也有研究表明，光甘草定对黑色素细胞和人皮肤成纤维细胞具有一定的毒性，而且对肌肤和眼睛的刺激性较大，当化妆品中光甘草定含量增加时，容易导致眼睛出现红血丝。由于光甘草定的水不溶性、细胞毒性和刺激性限制了其在化妆品中的添加量，进而导致美白功效不显著。

因此，本领域亟需研发一种使用安全性高，制备工艺简单，光甘草定在体系中分散性佳，体系稳定性理想，毒性和刺激性均较小，且美白功效显著的含光甘草定的化妆品。

发明内容

本申请所要解决的技术问题是克服现有技术中光甘草定在水中分散能力差，溶解度低，且光甘草定的细胞毒性和刺激性较大，现有乳化剂或增溶剂对光甘草定在水相中分散能力和增溶效果的提升有限等缺陷，而提供一种含甘草和光甘草定的脂质体溶液、及其制备方法和应用。本申请制得的具有美容功效的组合物同时兼具理想的抗氧化和美白功效，制备工艺简单，不仅提高了光甘草定在水相体系中的分散性，还降低光甘草定的细胞毒性和刺激性，提高产品使用安全性。

本申请采用以下技术方案解决上述技术问题：

本申请提供一种脂质体溶液的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）酵母菌接种到甘草水提液中，经发酵培养，超声，制得甘草发酵溶胞物；

（2）将1份卵磷脂、0.05~0.125份胆固醇、0.3~0.8份聚甘油类乳化剂、1~4.5份多元醇和0.075~0.5份光甘草定的混合物与1~4份步骤（1）制得的所述甘草发酵溶胞物和15~25份水混合，经均质，高压均质，制得所述脂质体溶液。

步骤（1）中，所述甘草水提液的制备方法可包括如下步骤：干燥的甘草和水在85~100℃条件下浸提60~120min，离心，收集上清液。

所述甘草水提液的制备过程中，所述干燥的甘草与所述水的质量比可为（1~5）：100。

所述甘草水提液的制备过程中，所述甘草的目数可为本领域常规，较佳地为50~200目，更佳地为100~200目。

所述甘草水提液的制备过程中，所述浸提的温度较佳地为95~100℃。

所述甘草水提液的制备过程中，所述离心的转速可为4000~5000rpm，较佳地为4000~4800rpm。

所述甘草水提液的制备过程中，所述离心的时间可为25~40min，较佳地为30~35min。

所述甘草水提液的制备过程中，所述离心的操作后还可按照本领域常规包括对所述上清液进行过滤的操作。其中，所述过滤使用的滤膜孔径可为本领域常规，一般可为0.22μm。

步骤（1）中，所述甘草水提液在使用前还可按照本领域常规包括灭菌的操作。

其中，所述甘草水提液的所述灭菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为高温灭菌法。

当采用所述高温灭菌法对所述甘草水提液进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90~121℃，更佳地为95~100℃。

当采用所述高温灭菌法对所述甘草水提液进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为15~45min，更佳地为30~40min。

其中，按照本领域常规，所述甘草水提液进行所述灭菌的操作后，还可进一步包括冷却至室温的操作。

步骤（1）中，所述酵母菌可包括酿酒酵母菌，较佳地包括“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌”、“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1346的酿酒酵母菌”、“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌”和“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1305的酿酒酵母菌”中的至少一种。

步骤（1）中，所述酵母菌可按照本领域常规以酵母菌菌液的形式添加，所述酵母菌菌液中所述酵母菌的浓度可为10⁶~10⁹CFU/mL，较佳地为10⁶~10⁷CFU/mL。

步骤（1）中，单位体积的所述甘草水提液中接种的所述酵母菌的数量可为10⁵~10⁶CFU/mL。

步骤（1）中，所述发酵培养可按照本领域常规在摇床培养箱中进行。其中，所述摇床培养箱的转速可为150~180rpm。

步骤（1）中，所述发酵培养的时间可为24~72h，较佳地为48~72h。

步骤（1）中，所述发酵培养的温度可为25~35℃，较佳地为25~28℃。

步骤（1）中，所述超声的条件和方法可为本领域常规，一般可使所述酵母菌破碎即可。

步骤（1）中，所述超声可按照本领域常规在超声波细胞破碎仪中进行。

步骤（1）中，所述超声的功率可为本领域常规，一般可为65~130W。

步骤（1）中，所述超声的时间可为本领域该类操作常规的时间，一般可为5~20min，较佳地为15~20min。

一较佳实施方案的步骤（1）中，所述超声采用间歇超声的方法，每次超声的时间为5~20s，间歇时间为10~20s，所述超声时间和所述间歇时间的和为5~20min。按照本领域常规，所述间歇时间为相邻两次超声之间不进行超声时的间隔时间。

一更佳实施方案的步骤（1）中，所述超声采用间歇超声的方法，每次超声时间为20s，间歇时间为20s，所述超声时间和所述间歇时间的和为15min。

步骤（1）中，所述超声的操作后还可进一步包括灭菌的操作。

其中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高温灭菌法。

当采用所述高温灭菌法对所述超声后制得物料进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90~121℃，更佳地为95~100℃。

当采用所述高温灭菌法对所述超声后制得物料进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为15~45min，更佳地为30~40min。

其中，所述灭菌的操作后还可按照本领域常规进一步包括冷却至室温的操作。

步骤（2）中，所述卵磷脂可包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和磷脂酰胆碱类卵磷脂中至少一种。

其中，所述磷脂酰胆碱类卵磷脂可包括二肉豆蔻酰基卵磷脂和/或二棕榈酰磷脂酰胆碱。

步骤（2）中，所述聚甘油类乳化剂可包括聚甘油-10硬脂酸酯。

步骤（2）中，所述多元醇可包括双丙甘醇、甘油、丙二醇、丁二醇和戊二醇中至少一种，较佳地包括双丙甘醇。

步骤（2）中，所述胆固醇的重量份数较佳地为0.1~0.125份。

步骤（2）中，所述聚甘油类乳化剂的重量份数较佳地为0.5~0.8份。

步骤（2）中，所述多元醇的重量份数较佳地为2.5~3.5份。

步骤（2）中，所述光甘草定的重量份数较佳地为0.075~0.25份，更佳地为0.125~0.25份。

步骤（2）中，所述甘草发酵溶胞物的重量份数较佳地为2~4份。

步骤（2）中，所述水的重量份数较佳地为19~25份。

步骤（2）中，所述混合的过程中还可进一步添加防腐剂。

其中，所述防腐剂的重量份数可为0.25~2份，较佳地为0.5~1份。

其中，所述防腐剂可包括化妆品领域常规使用的醇类防腐剂和/或对羟基苯乙酮。所述醇类防腐剂可包括辛甘醇、1,2-己二醇和苯氧乙醇中至少一种，较佳地包括辛甘醇和1,2-己二醇。当所述防腐剂包括辛甘醇和1,2-己二醇时，辛甘醇和1,2-己二醇的质量比可为1：（0.5~2），较佳地为1：1。

步骤（2）中，所述混合物的制备方法可包括如下步骤：所述卵磷脂、所述胆固醇、所述聚甘油类乳化剂、所述多元醇和所述光甘草定经混合，即可。

其中，所述混合的温度可为70~80℃，较佳地为75~80℃。

其中，所述混合的时间可为本领域常规，一般使各组分全部溶解即可。

步骤（2）中，所述均质的温度可为70~80℃，较佳地为75~80℃。

步骤（2）中，所述均质的时间可为5~15min。

步骤（2）中，所述均质可按照本领域常规在均质机中进行，所述均质机的转速可为5000~10000rpm，较佳地为7000~8000rpm。

步骤（2）中，所述高压均质的压力可为200~800bar，较佳地为600~800bar。

步骤（2）中，所述高压均质的时间可为5~10min。

步骤（2）中，所述高压均质可按照本领域常规在高压均质机中进行。

本申请还提供一种脂质体溶液，其由如上所述的脂质体溶液的制备方法制得。

本申请还提供一种如上所述的脂质体溶液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。

一些实施例中，所述脂质体溶液可作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分和/或美白活性成分。

本申请还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的脂质体溶液。

一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的任意一种或多种。

一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括但不限于面膜、精华或爽肤水。

一些实施例中，所述脂质体溶液占所述皮肤外用剂的质量百分比可为1%~20%，较佳地为1%~5%。

一些实施例中，所述室温一般指18~30℃。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本申请各较佳实例。

本申请所用试剂和原料均市售可得。

本申请的积极进步效果在于：本申请制得的具有美容功效的组合物同时兼具理想的抗氧化和美白功效，制备工艺简单，不仅提高了光甘草定在水相体系中的分散性，还降低光甘草定的细胞毒性和刺激性，提高产品使用安全性。

附图说明

本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：

图1为实施例1和对比例6制得产品在室温条件下储存7天时产品的状态对比图；

图2为实施例1和对比例6制得产品在60℃条件下储存7天时产品的状态对比图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例和对比例中酵母菌菌液的制备方法包括如下步骤：

（1）酿酒酵母菌菌种的活化：配置YPD液体培养基（按2%：2%：1%（w/v）比例准确称量蛋白胨、葡萄糖和酵母浸粉），121℃，30min高温灭菌，灭菌后冷却至室温，紫外灭菌后，从-80℃冰箱中取出待活化的酿酒酵母菌菌种，室温融化后接种于上述配置的YPD液体培养基中，放入摇床，28℃，180rpm的条件进行菌种活化；

（2）酿酒酵母菌菌种的纯化：将活化的酿酒酵母菌按梯度稀释，再进行涂布铺板，以获得单一菌落；

（3）酿酒酵母菌菌种的扩大培养：将纯化后的单一酿酒酵母菌菌种接种到YPD液体培养基中，28℃，180rpm的摇床中培养，测定600nm处的吸光度，当吸光度为1.2时，即菌种已经处于对数生长期，此时菌种可进行接种培养。

实施例1

（1）干燥的甘草进行粉碎，过100目筛，与水混合，按甘草占水的质量百分比为5%的比例配置，于95℃提取2h，提取后于4800rpm条件下离心30min，收集上清液，上清液过0.22μm滤膜，过滤得到的滤液于温度为95℃的条件下灭菌30min，灭菌后降至室温，制得甘草水提液；

（2）酿酒酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC1747；按照上述方法制得酿酒酵母菌菌液，将酿酒酵母菌菌液接种到发酵底物中，发酵底物为步骤（1）制得的甘草水提液，单位体积发酵底物中接种的酿酒酵母菌的数量为10⁶CFU/mL，于28℃，180rpm的条件下发酵培养72h，发酵培养结束后将制得的物料转移到超声波细胞破碎仪中进行超声，用于破碎酿酒酵母菌，采用间歇超声的方式，每间隔20s超声20s，间隔和超声的总时间为15min，超声的功率为130W，超声后于95℃条件下灭菌30min；灭菌后，降至室温，制得甘草发酵溶胞物；

（3）将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇、1g光甘草定混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入8g步骤（2）制得的甘草发酵溶胞物和72.5g水，在75℃条件下保温均质15min，均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

实施例2

与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中发酵菌种不同，具体为将保藏编号为CICC1747的酿酒酵母菌替换为等量的购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC 1346的酿酒酵母菌，其他条件参数同实施例1。

实施例3

与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中发酵菌种不同，具体为将保藏编号为CICC1747的酿酒酵母菌替换为等量的购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌，其他条件参数同实施例1。

实施例4

与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中发酵菌种不同，具体为将保藏编号为CICC1747的酿酒酵母菌替换为等量的购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC 1305的酿酒酵母菌，其他条件参数同实施例1。

实施例5

与实施例1相比，区别仅在于区别仅在于步骤（3）中光甘草定和水的添加量不同；本实施例中，光甘草定的添加量为0.5g，水的添加量为73g，其他条件参数同实施例1。

实施例6

与实施例1相比，区别仅在于区别仅在于步骤（3）中光甘草定和水的添加量不同；本实施例中，光甘草定的添加量为0.3g，水的添加量为73.2g，其他条件参数同实施例1。

对比例1

与实施例1相比区别主要在于将保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌替换为等量的乳酸菌，乳酸菌选用购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC6207的长双歧杆菌，并对发酵培养的条件做相应调整，具体包括如下步骤：

（2）乳酸菌选用购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC6207的长双歧杆菌；将纯化后的长双歧杆菌接入到MRS培养基，37℃静置培养，得到乳酸菌菌液，将乳酸菌菌液接种到发酵底物中，发酵底物为步骤（1）制得的甘草水提液，单位体积发酵底物中接种的乳酸菌的数量为10⁶CFU/mL，于35℃，静置培养72h，发酵培养结束后将制得的物料转移到超声波细胞破碎仪中进行超声，用于破碎乳酸菌，采用间歇超声的方式，每间隔20s超声20s，间隔和超声的总时间为15min，超声的功率为130W，超声后于95℃条件下灭菌30min；灭菌后，降至室温，制得甘草发酵溶胞物；

对比例2

与实施例1相比，区别仅在于不进行步骤（3）的操作，具体为：将8g实施例1中步骤（2）制得的甘草发酵溶胞物与92g水混合，即可。

对比例3

与实施例1相比，区别仅在于不添加步骤（2）制得的甘草发酵溶胞物，将其替换为等量的水，具体包括如下步骤：

将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇、1g光甘草定混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入80.5g水，在75℃条件下保温均质15min，均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

对比例4

制备光甘草定水溶液：称取1g光甘草定分散在10g的1,3-丙二醇中，25℃超声1h，然后加入89g的去离子水制备质量百分含量为1%光甘草定水溶液。

对比例5

与实施例1相比，区别仅在于步骤（3）中不添加光甘草定，即将1g光甘草定替换为1g水，其他条件参数同实施例1，具体包括如下步骤：

（3）将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入8g步骤（2）制得的甘草发酵溶胞产物和73.5g水，在75℃条件下保温均质15min，均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

对比例6

与实施例1相比，区别仅在于步骤（3）中光甘草定和水的添加量不同，光甘草定添加量为3g，水的添加量为70.5g，其他条件参数同实施例1。

对比例7

与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中不进行超声处理，将步骤（3）中添加的甘草发酵溶胞物替换为等量的甘草发酵产物滤液，其他条件参数同实施例1，具体操作方法如下：

（2）酿酒酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC1747；按照上述方法制得酿酒酵母菌菌液，将酿酒酵母菌菌液接种到发酵底物中，发酵底物为步骤（1）制得的甘草水提液，单位体积发酵底物中接种的酿酒酵母菌的数量为10⁶CFU/mL，于28℃，180rpm的条件下发酵培养72h，发酵培养结束后于95℃条件下灭菌30min，灭菌后降至室温，4800rpm离心30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，收集滤液，即得甘草发酵产物滤液；

（3）将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇、1g光甘草定混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入8g步骤（2）制得的甘草发酵产物滤液和72.5g水，在75℃条件下保温均质15min，均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

效果实施例1体系稳定性数据

测试上述实施例1~6和对比例1、对比例3、对比例5~7制得产品的粒径，结果见表1。对比例2和对比例4制得产品为溶液，无法测得粒径。

表1 粒径测试实验结果

结果表明：本申请实施例1~6制得脂质体的粒径较小，体系稳定性高。

根据表1可知，对比例6制得产品的粒径为2880nm；可见，当光甘草定含量高于本申请限定范围时，体系中组装后物料的粒径较大。

观察上述实施例和对比例制得产品在室温和高温（60℃）条件下储存7天时产品的状态，结果见下文。

实施例1和对比例6制得产品在室温条件下储存7天时产品的状态对比图见图1，60℃条件下储存7天时产品的状态对比图见图2。对比例6制得产品与实施例1制得产品相比，室温条件下溶液浑浊，伴随着少量沉淀生成，随着温度的升高和时间的延长，体系中沉淀变多。这说明，脂质体包裹光甘草定的量是有限度的，若光甘草定的含量太高，光甘草定会因无法被脂质体包裹而溢出，自身聚集成大颗粒物质，进而影响体系的稳定性。

大豆卵磷脂溶于水后，导致体系呈淡黄色。本申请使用的光甘草定的纯度为90%，光甘草定和杂质在高温条件下也会变质而发黄。

上述对比例2制得的甘草发酵溶胞物在室温和高温条件下储存一段时间后，颜色几乎无差异，说明甘草发酵溶胞物具有较理想的高温稳定性。

上述对比例5（与实施例1相比，区别仅在于不含光甘草定）制得产品在室温和高温条件下储存一段时间后，颜色也几乎无差异，说明大豆卵磷脂、胆固醇、聚甘油-10硬脂酸酯、双丙甘醇、辛甘醇和1,2-己二醇的高温稳定性也比较理想。

本申请实施例1~6制得产品在室温和高温条件下储存一段时间后，颜色差异非常小，推测可能是光甘草定被体系中脂质体包裹，并起到保护的作用，提高了光甘草定的稳定性，在高温条件下变质程度显著减小。

本申请对比例3（与实施例1相比不添加甘草发酵溶胞物）和对比例7（与实施例1相比，将甘草发酵溶胞物替换为甘草发酵产物滤液）制得产品在高温条件下储存一段时间后，其颜色与室温条件下储存的产品相比明显加深，而本申请实施例1制得产品颜色随温度变化非常小，推测可能是实施例1制得产品中添加了甘草发酵溶胞物，其与大豆卵磷脂等物质结合可更有利于光甘草定的包裹，提高产品稳定性，导致光甘草定在高温条件下稳定存在。

效果实施例2 刺激性实验

1、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：pH=7.2，配制后一周内用完。

2、待测样品配置：用去离子水将上述实施例或对比例制得的产品稀释成体积百分比为25%的待测液。

3、RBC悬液的制备

制备红细胞悬液（RBC）

用一次性吸管将离心管中的血细胞沉淀转移至新的EP管中，取1mL的RBC沉淀于15mL的EP管中，加入9mL的PBS缓冲液进行10倍稀释，然后轻轻摇晃混合均匀，1500rpm 离心5min，倒掉上清液，反复清洗三次直到管内PBS无色为止，再添加10 mL的PBS缓冲液后即得到红细胞悬液。

4、实验组设置

全溶血对照组：0.75mL水+0.25mL的红细胞悬液；

阴性对照组：0.75mL的PBS缓冲液+0.25mL的红细胞悬液；

样品组：0.75mL待测液+0.25mL的红细胞悬液；

样品对照：0.75mL待测液+0.25mL的PBS；

根据比例加样，总体积为1mL，将EP管置于150rpm，37℃摇床中培育1h，然后将各EP管放在离心机中，10000×g速度离心1min以停止培育，离心后取上层清液，在560nm处测定吸光值，记录并保存数据。

根据下述公式计算样品组的溶血率，结果见表2。

样品组红细胞溶血率=（A_样品组-A_样品对照-A_{阴性对照组}）/（A_{全溶血对照组}-A_{阴性对照组}）×100%。

表2 红细胞溶血率实验结果

结果表明：本申请实施例1~5制得产品的红细胞溶血率低，刺激性小。

对比例1制得产品的刺激性较强，推测可能是对比例1使用的长双歧杆菌在发酵过程中分泌出乳酸等物质，对红细胞具有一定的刺激性；另外，对比例1制得产品中光甘草定被包裹和保护的程度差于实施例1。

对比例4制得光甘草定水溶液的溶血率非常高；可见，虽然有机溶剂助溶后可提高光甘草定在水中的分散能力，但其仍具有极其显著的刺激性。

对比例3与实施例1相比区别仅在于未添加甘草发酵溶胞物，仅使用大豆卵磷脂等物质包裹光甘草定；对比例3与对比例4相比，红细胞溶血率虽然有所降低，但降低程度有限。本申请实施例1~6制得产品在对比例3的基础上添加了甘草发酵溶胞物，红细胞溶血率显著降低，可见添加光草发酵溶胞物后可提高光甘草定在水中的分散能力和体系的稳定性，降低体系中未被包裹的光甘草定含量，进而减小刺激性。

对比例6与实施例1~6相比，光甘草定的添加量过高，结合前述稳定性分析可知，制得终产品中光甘草定被包裹的数量有限，导致体系中含有很多未被包裹的光甘草定，进而导致其红细胞溶血率较高。

对比例7与实施例1相比区别仅在于将甘草发酵溶胞物替换为等量的甘草发酵产物滤液，对比例7制得产品与对比例3相比，虽然红细胞溶血率有所降低，但降低程度有限，推测可能是实施例1中使用的甘草发酵溶胞物中含有更多有利于光甘草定分散，提高体系稳定性的物质，进而减少体系中未被包裹光甘草定的分散量，减小刺激性。

效果实施例3 抗氧化实验（DPPH自由基清除率）

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

待测液配置：使用去离子水将上述实施例或对比例制得的产品分别配置成体积百分数为10%的待测液。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

（1）取等体积（1mL）的待测液与0.8mg/mL的DPPH溶液混匀（A₁管）；

（2）取等体积（1mL）的无水乙醇与0.8mg/mL的DPPH溶液混匀（A₂管）；

（3）取等体积（1mL）的无水乙醇与待测液混匀（A₃管）；

（4）避光反应30min后，在517nm下测A₁管、A₂管、A₃管吸光度值；清除率计算公式为：DPPH自由基清除率=[(A₂+A₃)-A₁]/A₂×100%。

DPPH自由基清除率结果见表3。

表3 DPPH自由基清除率实验结果

结果表明：本申请实施例1~6制得产品具有理想的DPPH自由基清除能力，即具有理想的抗氧化能力。

对比例1与实施例1相比，DPPH自由基清除率相对较低。可见，以乳酸菌甘草发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的抗氧化功效低于以酵母菌甘草发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的抗氧化功效。

根据对比例2、对比例3和实施例1的效果数据可看出，本申请中甘草发酵溶胞物的添加量相对较少，其自身的DPPH自由基清除率相对较弱（见对比例2），但当甘草发酵溶胞物与光甘草定和包括大豆卵磷脂等物质在内的脂质体结合使用时，可显著提高体系的DPPH自由基清除率，三种组分组合后对抗氧化能力具有协同促进作用，即实施例1制得产品的DPPH自由基清除率（71.74%）比对比例2（7.37%）和对比例3（54.98%）制得产品的DPPH自由基清除率的加和还要高。

实施例1与对比例7相比，实施例1制得产品的DPPH自由基清除率更高。推测可能是因为发酵后的溶胞物中含有部分具有抗氧化功效的物质；另外，溶胞物中含有更有利于光甘草定在水中分散，提高其在体系中稳定性的双亲性的物质，进而表现出更优异的抗氧化能力。

效果实施例4 酪氨酸酶抑制实验

配置pH值为6.8的PBS缓冲液。

酪氨酸酶溶液：用 pH值为6.8的 PBS磷酸缓冲液，将酪氨酸酶配制为100u/ml的酶液。（酪氨酸酶粉末活力≥1000unit/mg ）

0.1M HCl溶液：量取36%~38%的HCl溶液0.431mL，用离子水定容至50mL。

0.5mg/mL左旋多巴溶液：取0.02g 左旋多巴，先溶于14mL，0.1mol/L的HCl溶液，再加入26mL pH值为6.8的PBS磷酸缓冲液搅拌混匀。

待测样品配置：用去离子水将上述实施例或对比例制得的产品稀释成体积百分比为50%的待测液。

阳性对照液配制：准确称取5g的烟酰胺，溶于PBS缓冲液（pH=6.8)中，混匀，制得质量百分数为5%的烟酰胺溶液；

阴性对照组：水；

空白组：PBS缓冲液（pH=6.8)；

按照表4配置各组反应液。

表4 各组反应液中组分配比和制备方法

注：阳性对照组同待测样品组，将待测样品溶液替换为等量的阳性对照液。

参照表4，设立样品管（T）、样品本底（T₀）、酶反应管（C）和溶剂本底（C₀），每一样品的每个受试浓度的样品管（T）需设立3支平行管，同时酶反应管（C）也需设立3支平行管。

在样品管（T）和样品本底（T₀）中各加入 250μL相同浓度的样品溶液，酶反应管（C）和溶剂本底（C₀）则分别加入 250μL的PBS磷酸缓冲液。

在样品管（T）和酶反应管（C）中各加入 125μL酪氨酸酶溶液，样品本底（T₀）与溶剂本底（C₀）以 125μL的PBS磷酸缓冲液代替，将样品和酪氨酸酶充分混匀，置37℃水浴槽孵育10 min。依次在各管中加入 500μL的左旋多巴溶液，控制每管反应时间为5分钟，即刻将各管反应溶液移入比色皿中，在475nm处测定吸光值，并记录。代入酪氨酸酶活性抑制率计算公式中，即可得出上述实施例或对比例制得产品经稀释后制得待测样品的酪氨酸酶活性抑制率，结果见表5。

待测样品酪氨酸酶活性抑制率=[(C-C₀)-(T-T₀)]/(C-C₀)×100%。

表5 酪氨酸酶活性抑制率实验结果

注：表5中“*”表示实施例1与对比例7相比，具有显著性差异， P<0.05。

结果表明：本申请实施例1~6制得产品具有理想的酪氨酸酶抑制率，可见具有理想的美白功效。

对比例1与实施例1相比，酪氨酸酶抑制率相对较低。可见，以乳酸菌甘草发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的美白功效差于以酵母菌甘草发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的美白功效。

根据对比例2、对比例3和实施例1的效果数据可看出，本申请中甘草发酵溶胞物的添加量相对较少，其自身的美白功效相对较弱（见对比例2），但当甘草发酵溶胞物与光甘草定和包括大豆卵磷脂等物质在内的脂质体结合使用时，可显著提高体系的酪氨酸酶抑制率，三种组分组合后对美白功效具有协同促进作用，即实施例1制得产品的酪氨酸酶抑制率（88.48%）比对比例2（23.76%）和对比例3（52.19%）制得产品的酪氨酸酶抑制率的加和还要高。

根据对比例4的效果数据可知，有机溶剂助溶后的光甘草定水溶液具有非常理想的酪氨酸酶抑制活性，表明光甘草定确实具有优异的体外美白效果。对比例3中未添加甘草发酵溶胞物，只使用包括大豆卵磷脂等物质在内的脂质体包裹光甘草定，虽然可提高光甘草定在水相中的溶解性及分散能力，但是一定程度上减弱了光甘草定的美白活性，推测可能是被脂质体包裹的光甘草定不易被释放，进而导致光甘草定在体系中无法发挥作用，而本申请在体系中添加甘草发酵溶胞物后，有效地解决了该问题，而且还有助于脂质体的形成，提高光甘草定的生物利用度，还为体系提供了具有美容功效的活性成分。

对比例6因其体系不稳定，光甘草定在体系中分散性较差，光甘草定会发生自聚现象，降低了其生物利用度，进而导致其酪氨酸酶抑制率极其显著地低于实施例1制得产品。

实施例1与对比例7相比，实施例1制得产品的酪氨酸酶抑制率略有增高。根据结果推测实施例1制得产品与对比例7制得产品相比，多出的溶胞产物的美白功效相对较弱，但溶胞产物与大豆卵磷脂等物质结合更有利于提高光甘草定在体系中的溶解度和分散稳定性，在降低光甘草定刺激性的同时，也在一定程度上提高了光甘草定的生物利用度，进而提高体系的美白功效。

效果实施例5 CCKB

将装有生长状态良好的B16细胞的培养瓶从培养箱中取出，使用pH=7.2的PBS缓冲液清洗两遍B16细胞，每一瓶细胞加入0.5mL的胰酶，放入细胞培养箱2min，等待细胞完全消化脱壁悬浮，之后加入1mL有血清的DMEM培养基终止胰酶消化，将细胞悬浮液转移至15mL离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清液后将细胞沉淀与有血清的DMEM培养基吹打均匀，然后转移至T25培养瓶中，在5% CO₂，37℃的培养箱中进行传代培养两到三天，待细胞融合率为80%以上可进行之后的实验。

将8×10³个细胞/100 μL接种到96孔板中培养24h，吸弃原培养基；实验组加入100μL待测样品（用无血清DMEM培养基稀释上述实施例或对比例制得的样品，配置成体积百分比为0.06%的待测样品）处理24h，每孔加入10μL的 CCK-8试剂，于37℃继续孵育1h，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA_待测样品。对照组的每孔加入10μL有血清的DMEM培养基处理24h，每孔加入10μL CCK-8试剂，于37℃继续孵育1h，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA_对照。

空白组的每孔中不加细胞，只添加100μL有血清的DMEM培养基，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA_空白。

细胞存活率=（OA_待测样品-OA_空白）/（OA_对照-OA_空白）×100%，按照该公式计算上述实施例或对比例制得待测样品处理细胞后的细胞存活率，结果见表6。

表6 细胞存活率实验结果

根据表6中结果可看出，同一浓度下的实施例1~6制得产品对细胞几乎无毒性；而采用对比例4制得产品处理细胞后，细胞存活率相对较低，这表明光甘草定对细胞具有一定的毒性，而经过脂质体包裹后，毒性会明显减弱。

效果实施例6 黑色素生成抑制率的测定

取对数生长期状态良好的B16细胞计数并接种于6孔板中，置于37℃，5%CO₂环境培养箱中培养过夜，待细胞融合率达到80%以上，弃掉旧培养基，PBS清洗2次。

实验组：加入2mL实施例待测液或对比例待测液（将上述实施例或对比例制得产品分别用无血清的DMEM稀释成体积百分比为0.06%的待测液）。

空白组：只加2mL无血清培养基。

阳性对照组：加入2mL浓度为50μg/ml α-熊果苷的DMEM培养基。

上述各组加样后均培养24h，培养后吸弃旧培养基，使用PBS洗涤后加入500μL胰酶消化4min，加入1mL含血清培养液终止消化，1500rmp离心3min，吸弃上清液，留细胞沉淀，加入0.5mL含10%DMSO的1M氢氧化钠溶液，超声分散3min，80℃水浴30min，振荡混匀，10000rmp离心2min，吸取上清液200μL至96孔板，于405nm读取吸光度值。

设置空白孔，即指培养板中不进行任何操作，只添加等量10%DMSO的1M氢氧化钠溶液。

实验组黑色素产生抑制率=1- (实验组OD值-空白孔OD值)/（空白组OD值-空白孔OD值）×100%，每一组成分重复5个样本，计算结果取平均值，结果见表7。

阳性对照组黑色素产生抑制率=1- (阳性对照OD值-空白孔OD值)/（空白组OD值-空白孔OD值）×100%，每一组成分重复5个样本，计算结果取平均值，结果见表7。

表7 黑色素产生抑制率实验结果

根据表7中结果可看出，本申请实施例1~6制得产品具有理想的黑色素产生抑制率，可见具有理想的美白功效。对比例1与实施例1相比，黑色素产生抑制率相对较低。可见，以乳酸菌甘草发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的美白功效差于以酵母菌甘草发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的美白功效。

根据对比例2、对比例3和实施例1的效果数据可看出，本申请中甘草发酵溶胞物的添加量相对较少，其自身的美白功效相对较弱（见对比例2），但当甘草发酵溶胞物与光甘草定和包括大豆卵磷脂等物质在内的脂质体结合使用时，可显著提高体系的黑色素产生抑制率，三种组分组合后对黑色素产生抑制率具有协同促进作用，即实施例1制得产品的黑色素产生抑制率（38.70%）比对比例2（3.32%）和对比例3（10.38%）制得产品的黑色素产生抑制率的加和还要高。

根据对比例4的效果数据可知，有机溶剂助溶后的光甘草定水溶液具有理想的黑色素产生抑制活性，表明光甘草定确实具有优异的体外美白效果，而对比例3中未添加甘草发酵溶胞物，只使用包括大豆卵磷脂等物质在内的脂质体包裹光甘草定，虽然可提高光甘草定在水相中的溶解性及分散性，但是一定程度上减弱了光甘草定的美白活性，推测可能是被包裹的光甘草定不易被释放，进而导致光甘草定在体系中无法发挥作用，而本申请在体系中添加甘草发酵溶胞物后，有效地解决了该问题，而且还有助于脂质体的形成，提高光甘草定的生物利用度，还为体系提供了具有美容功效的活性成分。

对比例6因其体系不稳定，光甘草定在体系中分散性较差，光甘草定发生自聚现象，虽然自聚后的光甘草定可通过细胞吞噬作用进入细胞发挥一定的美白功效，但结合前述分析可知，对比例6制得产品具有较高的细胞毒性和刺激性，不适合作为化妆品原料。

实施例1与对比例7相比，实施例1制得产品的黑色素产生抑制率显著提高。根据结果推测，实施例1制得产品与对比例7制得产品相比，多出的溶胞产物的美白功效相对较弱，但溶胞产物与大豆卵磷脂等物质结合更有利于提高光甘草定在体系中的溶解度和分散稳定性，在降低光甘草定刺激性的同时，也在一定程度上提高了光甘草定的生物利用度，不影响光甘草定的释放，进而提高体系的美白功效。

效果实施例7 人体皮肤斑贴

空白组：去离子水；

样品组：将上述实施例1~6制得产品配置成体积百分比为1%的待测液。

空白对照的斑试器上添加50μL去离子水，实验组的斑试器上添加50μL上述制得的待测液；将加有受试物的斑试器敷于受试者的前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。 24h后去除斑试器，去除后30min（待压痕消失后）按表8标准观察皮肤反应，并记录观察结果见表9。

表8 皮肤不良反应分级标准

表9 人体斑贴实验结果

结果表明：实施例1~6制得产品使用安全性高，使用后肌肤均无过敏现象发生。

最后，还需要说明的是，在本申请中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims

1.一种脂质体溶液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）将1份卵磷脂、0.05~0.125份胆固醇、0.3~0.8份聚甘油类乳化剂、1~4.5份多元醇和0.075~0.25份光甘草定的混合物与1~4份步骤（1）制得的所述甘草发酵溶胞物和15~25份水混合，经均质，高压均质，制得所述脂质体溶液；

步骤（1）中，所述甘草水提液的制备方法包括如下步骤：干燥的甘草和水在85~100℃条件下浸提60~120min，离心，收集上清液；所述甘草水提液在使用前还包括灭菌的操作；

步骤（1）中，所述酵母菌为酿酒酵母菌；所述发酵培养的时间为24~72h；所述发酵培养的温度为25~35℃；

步骤（2）中，所述聚甘油类乳化剂包括聚甘油-10硬脂酸酯。

2.如权利要求1所述的脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述脂质体溶液的制备方法包括下述条件中至少一种：

步骤（1）中，所述酵母菌以酵母菌菌液的形式添加，所述酵母菌菌液中所述酵母菌的浓度为10⁶~10⁹CFU/mL；

步骤（1）中，单位体积的所述甘草水提液中接种的所述酵母菌的数量为10⁵~10⁶CFU/mL；

步骤（1）中，所述发酵培养在摇床培养箱中进行，所述摇床培养箱的转速为150~180rpm；

步骤（1）中，所述超声在超声波细胞破碎仪中进行；

步骤（1）中，所述超声的功率为65~130W；

步骤（1）中，所述超声的时间为5~20min；

步骤（1）中，所述超声的操作后还包括灭菌的操作。

3.如权利要求2所述的脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述脂质体溶液的制备方法包括下述条件中至少一种：

步骤（1）中，所述甘草水提液的制备过程中，所述干燥的甘草与所述水的质量比为（1~5）：100；

步骤（1）中，所述甘草水提液的制备过程中，所述甘草的目数为50~200目；

步骤（1）中，所述甘草水提液的制备过程中，所述浸提的温度为95~100℃；

步骤（1）中，所述甘草水提液的制备过程中，所述离心的转速为4000~5000rpm；

步骤（1）中，所述甘草水提液的制备过程中，所述离心的时间为25~40min；

步骤（1）中，所述甘草水提液的制备过程中，所述离心的操作后还包括对所述上清液进行过滤的操作；

步骤（1）中，所述酿酒酵母菌包括“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌”、“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC1346的酿酒酵母菌”、“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母菌”和“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1305的酿酒酵母菌”中的至少一种；

步骤（1）中，所述发酵培养的时间为48~72h；

步骤（1）中，所述发酵培养的温度为25~28℃；

步骤（1）中，所述超声采用间歇超声的方法，每次超声时间为5~20s，间歇时间为10~20s，所述超声时间和所述间歇时间的和为5~20min。

4.如权利要求1~3中任意一项所述的脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述脂质体溶液的制备方法包括下述条件中至少一种：

步骤（2）中，所述卵磷脂包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和磷脂酰胆碱类卵磷脂中至少一种；

步骤（2）中，所述多元醇包括双丙甘醇、甘油、丙二醇、丁二醇和戊二醇中至少一种；

步骤（2）中，所述胆固醇的重量份数为0.1~0.125份；

步骤（2）中，所述聚甘油类乳化剂的重量份数为0.5~0.8份；

步骤（2）中，所述多元醇的重量份数为2.5~3.5份；

步骤（2）中，所述甘草发酵溶胞物的重量份数为2~4份；

步骤（2）中，所述水的重量份数为19~25份；

步骤（2）中，所述混合的过程中还进一步添加防腐剂；

步骤（2）中，所述均质的温度为70~80℃；

步骤（2）中，所述均质的时间为5~15min；

步骤（2）中，所述均质在均质机中进行，所述均质机的转速为5000~10000rpm；

步骤（2）中，所述高压均质的压力为200~800bar；

步骤（2）中，所述高压均质的时间为5~10min；

步骤（2）中，所述高压均质在高压均质机中进行。

5.如权利要求4所述的脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述脂质体溶液的制备方法包括下述条件中至少一种：

步骤（2）中，所述磷脂酰胆碱类卵磷脂包括二肉豆蔻酰基卵磷脂和/或二棕榈酰磷脂酰胆碱；

步骤（2）中，所述光甘草定的重量份数为0.125~0.25份；

步骤（2）中，所述防腐剂的重量份数为0.25~2份；

步骤（2）中，所述防腐剂包括醇类防腐剂和/或对羟基苯乙酮；

步骤（2）中，所述均质的温度为75~80℃；

步骤（2）中，所述均质在均质机中进行，所述均质机的转速为7000~8000rpm；

步骤（2）中，所述高压均质的压力为600~800bar。

6.一种脂质体溶液，其特征在于，由如权利要求1~5中任意一项所述的脂质体溶液的制备方法制得。

7.一种如权利要求6所述的脂质体溶液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脂质体溶液作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分和/或美白活性成分。

9.一种皮肤外用剂，其特征在于，包括如权利要求6所述的脂质体溶液。

10.如权利要求9所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂满足下述条件中至少一种：

所述皮肤外用剂中还包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种；

所述皮肤外用剂包括面膜、精华或爽肤水；

所述脂质体溶液占所述皮肤外用剂的质量百分比为1%~20%。