CN116019753B - 含樱花和光甘草定的脂质体溶液、及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种含樱花和光甘草定的脂质体溶液、及其制备和应用。脂质体溶液的制备方法包括如下步骤：（1）酵母菌接种到发酵底物中，经发酵培养，超声，制得樱花发酵溶胞物；发酵底物包括樱花水提液、葡萄糖和硫酸铵；（2）将1份卵磷脂、0.05~0.125份胆固醇、0.3~0.8份聚甘油类乳化剂、1~4.5份多元醇和0.125~0.5份光甘草定的混合物与1~4份步骤（1）制得的樱花发酵溶胞物和15~25份水混合，经剪切均质，高压均质，即可。本申请制得的组合物同时兼具理想的抗氧化和美白功效，制备工艺简单，不仅提高了光甘草定在水相体系中的分散能力，还降低光甘草定的细胞毒性和刺激性，提高光甘草定的生物利用度。

Description

含樱花和光甘草定的脂质体溶液、及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于发酵技术领域，尤其涉及一种含樱花和光甘草定的脂质体溶液、及其制备和应用。

背景技术

光甘草定是一种黄酮类物质，提取自光果甘草，光甘草定因其具有理想的美白作用被人们誉为“美白黄金”，是美白和抗衰老的圣物。但光甘草定的水溶性差，通常需要添加乳化剂或增溶剂等物质提高其在水相中的分散能力和溶解能力，使用方法繁琐，而且通过上述方法对光甘草定的分散性和溶解度的提高程度有限。也有研究表明，光甘草定对细胞具有一定的细胞毒性，而且对眼睛和皮肤也具有一定的刺激性，当化妆品中光甘草定含量较高时，会导致使用者皮肤过敏，或眼球出现红血丝。由于光甘草定的水不溶性、细胞毒性和刺激性限制了其在化妆品中的添加量，进而导致美白功效不显著，限制了光甘草定在化妆品领域的应用。樱花为天然植物，其中含有丰富的天然维生素A、B、E和樱花酵素等活性物质，具有嫩肤、增亮肤色的作用，是护肤品的重要原料之一，有“青春之花”之誉。

因此，本领域亟需研发一种可高效利用樱花和光甘草定的美容功效，制备工艺简单，体系稳定，细胞毒性和刺激性均较小，使用安全性高，且美白效果显著的含光甘草定的化妆品。

发明内容

本申请所要解决的技术问题是克服现有技术中的光甘草定在水中分散能力差，溶解度低，且光甘草定的细胞毒性和刺激性较大，现有乳化剂或增溶剂对光甘草定在水相中分散能力和增溶效果的提升有限等缺陷，而提供一种含樱花和光甘草定的脂质体溶液、及其制备和应用。本申请制得的具有美容功效的组合物同时兼具理想的抗氧化和美白功效，制备工艺简单，不仅提高了光甘草定在水相体系中的分散能力，还降低光甘草定的细胞毒性和刺激性，提高光甘草定的生物利用度，还提高了产品的使用安全性。

本申请采用以下技术方案解决上述技术问题：

本申请提供一种脂质体溶液的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）酵母菌接种到发酵底物中，经发酵培养，超声，制得樱花发酵溶胞物；所述发酵底物包括樱花水提液、葡萄糖和硫酸铵；

（2）将1份卵磷脂、0.05~0.125份胆固醇、0.3~0.8份聚甘油类乳化剂、1~4.5份多元醇和0.125~0.5份光甘草定的混合物与1~4份步骤（1）制得的所述樱花发酵溶胞物和15~25份水混合，经剪切均质，高压均质，制得所述脂质体溶液。

步骤（1）中，所述葡萄糖占所述樱花水提液的质量百分比可为0.1%~0.5%。

步骤（1）中，所述硫酸铵占所述樱花水提液的质量百分比可为0.1%~0.3%。

步骤（1）中，所述樱花水提液的制备方法可包括如下步骤：干燥的樱花和水在85~90℃条件下浸提60~120min，过滤，收集滤液。

所述樱花水提液的制备过程中，所述干燥的樱花与所述水的质量比可为（0.5~1）：100。

所述樱花水提液的制备过程中，所述樱花的目数可为本领域常规，较佳地为50~200目，更佳地为100~200目。

所述樱花水提液的制备过程中，所述浸提的温度较佳地为95~100℃。

所述过滤的方法可为本领域常规，一般可包括常压过滤和/或滤膜过滤。当采用所述滤膜过滤的方法时，所述滤膜的孔径可为本领域常规，一般可为0.45μm。

步骤（1）中，所述发酵底物在使用前还可按照本领域常规包括灭菌的操作。

其中，所述发酵底物的所述灭菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为高温灭菌法。

当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90~100℃，更佳地为90~95℃。

当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为15~45min，更佳地为30~40min。

其中，按照本领域常规，所述发酵底物进行所述灭菌的操作后，还可进一步包括冷却至室温的操作。

步骤（1）中，所述酵母菌可包括酿酒酵母菌，较佳地包括“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1009的酿酒酵母菌”、“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1389的酿酒酵母菌”、“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1001的酿酒酵母菌”和“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1002的酿酒酵母菌”中的至少一种。

步骤（1）中，所述酵母菌可按照本领域常规以酵母菌菌液的形式添加，所述酵母菌菌液中所述酵母菌的浓度可为10⁶~10⁹CFU/mL，较佳地为10⁶~10⁷CFU/mL。

步骤（1）中，单位体积的所述樱花水提液中接种的所述酵母菌的数量可为10⁵~10⁶CFU/mL。

步骤（1）中，所述发酵培养可按照本领域常规在摇床培养箱中进行。其中，所述摇床培养箱的转速可为150~180rpm。

步骤（1）中，所述发酵培养的时间可为24~72h，较佳地为48~72h。

步骤（1）中，所述发酵培养的温度可为25~35℃，较佳地为25~28℃。

步骤（1）中，所述超声的条件和方法可为本领域常规，一般在超声波细胞破碎仪中进行，可使所述酵母菌破碎即可。

步骤（1）中，所述超声的功率可为本领域常规，一般可为65~130W。

步骤（1）中，所述超声的时间可为本领域该类操作常规的时间，一般可为5~20min，较佳地为15~20min。

一较佳实施方案的步骤（1）中，所述超声采用间歇超声的方法，每次超声时间为5~20s，间歇时间为10~20s，所述超声时间和所述间歇时间的和为5~20min。按照本领域常规，所述间歇时间为相邻两次超声之间不进行超声时的间隔时间。

一更佳实施方案的步骤（1）中，所述超声采用间歇超声的方法，每次超声时间为20s，间歇时间为20s，所述超声时间和所述间歇时间的和为15min。

步骤（1）中，所述超声的操作后还可进一步包括灭菌的操作。

其中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高温灭菌法。

当采用所述高温灭菌法对所述超声后制得物料进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90~100℃，更佳地为90~95℃。

当采用所述高温灭菌法对所述超声后制得物料进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为15~45min，更佳地为30~40min。

其中，所述灭菌的操作后还可按照本领域常规进一步包括冷却至室温的操作。

步骤（2）中，所述卵磷脂可包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和磷脂酰胆碱类卵磷脂中至少一种。

其中，所述磷脂酰胆碱类卵磷脂可包括二肉豆蔻酰基卵磷脂和/或二棕榈酰磷脂酰胆碱。

步骤（2）中，所述聚甘油类乳化剂可包括聚甘油-10硬脂酸酯。

步骤（2）中，所述多元醇可包括双丙甘醇、甘油、丙二醇、丁二醇和戊二醇中至少一种，较佳地包括双丙甘醇。

步骤（2）中，所述胆固醇的重量份数较佳地为0.1~0.125份。

步骤（2）中，所述聚甘油类乳化剂的重量份数较佳地为0.5~0.8份。

步骤（2）中，所述多元醇的重量份数较佳地为2.5~3.5份。

步骤（2）中，所述光甘草定的重量份数较佳地为0.125~0.25份，更佳地为0.2~0.25份。

步骤（2）中，所述樱花发酵溶胞物的重量份数较佳地为2~4份。

步骤（2）中，所述水的重量份数较佳地为19~25份。

步骤（2）中，所述混合的过程中还可进一步添加防腐剂。

其中，所述防腐剂的重量份数可为0.25~2份，较佳地为0.5~1份。

其中，所述防腐剂可包括化妆品领域常规使用的醇类防腐剂和/或对羟基苯乙酮。所述醇类防腐剂可包括辛甘醇、1,2-己二醇和苯氧乙醇中至少一种，较佳地包括辛甘醇和1,2-己二醇。当所述防腐剂包括辛甘醇和1,2-己二醇时，辛甘醇和1,2-己二醇的质量比可为1：（0.5~2），较佳地为1：1。

步骤（2）中，所述混合物的制备方法可包括如下步骤：所述卵磷脂、所述胆固醇、所述聚甘油类乳化剂、所述多元醇和所述光甘草定经混合，即可。

其中，所述混合的温度可为70~80℃，较佳地为75~80℃。

其中，所述混合的时间可为本领域常规，一般可使各组分全部溶解即可。

步骤（2）中，所述剪切均质的温度可为70~80℃，较佳地为75~80℃。

步骤（2）中，所述剪切均质的时间可为5~15min。

步骤（2）中，所述剪切均质可按照本领域常规在剪切均质机中进行，所述剪切均质机的转速可为5000~10000rpm，较佳地为7000~8000rpm。

步骤（2）中，所述高压均质的压力可为200~800bar，较佳地为600~800bar。

步骤（2）中，所述高压均质的时间可为5~10min。

步骤（2）中，所述高压均质可按照本领域常规在高压均质机中进行。

本申请还提供一种脂质体溶液，其由如上所述的脂质体溶液的制备方法制得。

本申请还提供一种如上所述的脂质体溶液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。

一些实施例中，所述脂质体溶液可作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分和/或美白活性成分。

本申请还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的脂质体溶液。

一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种。

一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括但不限于面膜、精华或爽肤水。

一些实施例中，所述脂质体溶液占所述皮肤外用剂的质量百分比可为1%~20%，较佳地为1%~5%。

一些实施例中，所述室温一般指18~30℃。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本申请各较佳实例。

本申请所用试剂和原料均市售可得。

本申请的积极进步效果在于：本申请制得的具有美容功效的组合物同时兼具理想的抗氧化和美白功效，充分利用樱花和光甘草定的美容功效，制备工艺简单，不仅提高了光甘草定在水相体系中的分散能力和溶解能力，还降低光甘草定的细胞毒性和刺激性，提高产品使用安全性。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本申请，但并不因此将本申请限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例和对比例中酵母菌菌液的制备方法包括如下步骤：

（1）酿酒酵母菌菌种的活化：配置YPD液体培养基（按2%：2%：1%（w/v）比例准确称量蛋白胨、葡萄糖和酵母浸粉），121℃，30min高温灭菌，灭菌后冷却至室温，紫外灭菌后，从-80℃冰箱中取出待活化的酿酒酵母菌菌种，室温融化后接种于上述配置的YPD液体培养基中，放入摇床，28℃，180rpm的条件进行菌种活化；

（2）酿酒酵母菌菌种的纯化：将活化的酿酒酵母菌按梯度稀释，再进行涂布铺板，以获得单一菌落；

（3）酿酒酵母菌菌种的扩大培养：将纯化后的单一酿酒酵母菌菌种接种到YPD液体培养基中，28℃，180rpm的摇床中培养，测定600nm处的吸光度，当吸光度为1.2时，即菌种已经处于对数生长期，此时菌种可进行接种培养。

实施例1

（1）干燥的樱花进行粉碎，过100目筛，与水混合，按樱花占水的质量百分比为1%的比例配置，于90℃提取2h，提取后慢速过滤纸除杂，然后过0.45μm滤膜，过滤得到的滤液为樱花水提液；向制得的樱花水提液中加入占樱花水提液的质量百分比为0.5%的葡萄糖，加入占樱花水提液的质量百分比为0.1%的硫酸铵，于温度为90℃的条件下灭菌30min，灭菌后降至室温，制得发酵底物；

（2）酿酒酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC1009；按照上述方法制得酿酒酵母菌菌液，将酿酒酵母菌菌液接种到发酵底物中，单位体积发酵底物中接种的酿酒酵母菌的数量为10⁶CFU/mL，在摇床培养箱上，于28℃的条件下发酵培养72h，摇床培养箱的转速为180rpm，发酵培养结束后将制得的物料转移到超声波细胞破碎仪中进行超声，用于破碎酿酒酵母菌，采用间歇超声的方式，每间隔20s超声20s，间隔和超声的总时间为15min，超声的功率为130W，超声后于95℃条件下灭菌30min；灭菌后，降至室温，制得樱花发酵溶胞物；

（3）将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇、1g光甘草定混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入8g步骤（2）制得的樱花发酵溶胞物和72.5g水，在75℃条件下保温剪切均质15min，剪切均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

实施例2

与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中发酵菌种不同，具体为将保藏编号为CICC1009的酿酒酵母菌替换为等量的购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC 1389的酿酒酵母菌，其他条件参数同实施例1。

实施例3

与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中发酵菌种不同，具体为将保藏编号为CICC1009的酿酒酵母菌替换为等量的购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC 1001的酿酒酵母菌，其他条件参数同实施例1。

实施例4

与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中发酵菌种不同，具体为将保藏编号为CICC1009的酿酒酵母菌替换为等量的购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC 1002的酿酒酵母菌，其他条件参数同实施例1。

实施例5

与实施例1相比，区别仅在于区别仅在于步骤（3）中光甘草定和水的添加量不同；本实施例中，光甘草定的添加量为0.5g，水的添加量为73g，其他条件参数同实施例1。

对比例1

与实施例1相比区别主要在于步骤（2）中发酵菌种及发酵条件不同，具体为将保藏编号为CICC1009的酿酒酵母菌替换为等量的乳酸菌，乳酸菌选用购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC 6207的长双歧杆菌，并对发酵培养的条件做相应性调整，具体包括如下步骤：

（1）干燥的樱花进行粉碎，过100目筛，与水混合，按樱花占水的质量百分比为1%的比例配置，于90℃提取2h，提取后过慢速滤纸除杂，然后过0.45μm滤膜，过滤得到的滤液为樱花水提液；向制得的樱花水提液中加入占樱花水提液的质量百分比为0.5%的乳糖，于温度为90℃的条件下灭菌30min，灭菌后降至室温，制得樱花发酵底物；

（2）乳酸菌选用购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC6207的长双歧杆菌；将纯化后的长双歧杆菌接入到MRS培养基，37℃静置培养，得到乳酸菌菌液，将乳酸菌菌液接种到发酵底物中，单位体积发酵底物中接种的乳酸菌的数量为10⁶CFU/mL，于37℃，静置培养72h，发酵培养结束后将制得的物料转移到超声波细胞破碎仪中进行超声，用于破碎乳酸菌，采用间歇超声的方式，每间隔20s超声20s，间隔和超声的总时间为15min，超声的功率为130W，超声后于95℃条件下灭菌30min；灭菌后，降至室温，制得樱花发酵溶胞物；

（3）将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇、1g光甘草定混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入8g步骤（2）制得的樱花发酵溶胞物和72.5g水，在75℃条件下保温剪切均质15min，剪切均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

对比例2

与实施例1相比，区别仅在于不进行步骤（3）的操作，具体为：将8g实施例1中步骤（2）制得的樱花发酵溶胞物与92g水混合，即可。

对比例3

与实施例1相比，区别仅在于不添加步骤（2）制得的樱花发酵溶胞物，将其替换为等量的水，具体包括如下步骤：

将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇、1g光甘草定混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入80.5g水，在75℃条件下保温剪切均质15min，剪切均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

对比例4

与实施例1相比，区别仅在于步骤（3）中不添加光甘草定，即将1g光甘草定替换为1g水，其他条件参数同实施例1，具体包括如下步骤：

（1）干燥的樱花进行粉碎，过100目筛，与水混合，按樱花占水的质量百分比为1%的比例配置，于90℃提取2h，提取后过慢速滤纸，然后过0.45μm滤膜，过滤得到的滤液为樱花水提液；向制得的樱花水提液中加入占樱花水提液的质量百分比为0.5%的葡萄糖，加入占樱花水提液的质量百分比为0.1%的硫酸铵，于温度为90℃的条件下灭菌30min，灭菌后降至室温，制得发酵底物；

（2）酿酒酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC1009；按照上述方法制得酿酒酵母菌菌液，将酿酒酵母菌菌液接种到发酵底物中，单位体积发酵底物中接种的酿酒酵母菌的数量为10⁶CFU/mL，在摇床培养箱上，于28℃的条件下发酵培养72h，摇床培养箱的转速为180rpm，发酵培养结束后将制得的物料转移到超声波细胞破碎仪中进行超声，用于破碎酿酒酵母菌，采用间歇超声的方式，每间隔20s超声20s，间隔和超声的总时间为15min，超声的功率为130W，超声后于95℃条件下灭菌30min；灭菌后，降至室温，制得樱花发酵溶胞物；

（3）将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入8g步骤（2）制得的樱花发酵溶胞产物和73.5g水，在75℃条件下保温剪切均质15min，剪切均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

对比例5

与实施例1相比，区别仅在于步骤（3）中光甘草定和水的添加量不同，光甘草定添加量为3g，水的添加量为70.5g，其他条件参数同实施例1。

对比例6

与实施例1相比，区别仅在于步骤（2）中不进行超声处理，将步骤（3）中添加的樱花发酵溶胞物替换为等量的樱花发酵产物滤液，其他条件参数同实施例1，具体操作方法如下：

（1）干燥的樱花进行粉碎，过100目筛，与水混合，按樱花占水的质量百分比为1%的比例配置，于95℃提取2h，提取后过慢速滤纸，然后过0.45μm滤膜，过滤得到的滤液为樱花水提液；向制得的樱花水提液中加入占樱花水提液的质量百分比为0.5%的葡萄糖，加入占樱花水提液的质量百分比为0.1%的硫酸铵，于温度为90℃的条件下灭菌30min，灭菌后降至室温，制得发酵底物；

（2）酿酒酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC1009；按照上述方法制得酿酒酵母菌菌液，将酿酒酵母菌菌液接种到发酵底物中，单位体积发酵底物中接种的酿酒酵母菌的数量为10⁶CFU/mL，在摇床培养箱上，于28℃的条件下发酵培养72h，摇床培养箱的转速为180rpm，发酵培养结束后于95℃条件下灭菌30min，灭菌后降至室温，4800rpm离心30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，收集滤液，即得樱花发酵产物滤液；

（3）将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇、1g光甘草定混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入8g步骤（2）制得的樱花发酵产物滤液和72.5g水，在75℃条件下保温剪切均质15min，剪切均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

对比例7

与实施例1相比，区别仅在于步骤（1）中不添加葡萄糖和硫酸铵，其他条件参数同实施例1，具体操作方法如下：

（1）干燥的樱花进行粉碎，过100目筛，与水混合，按樱花占水的质量百分比为1%的比例配置，于90℃提取2h，提取后慢速过滤纸除杂，然后过0.45μm滤膜，过滤得到的滤液为樱花水提液；樱花水提液于温度为90℃的条件下灭菌30min，灭菌后降至室温，制得发酵底物；

（2）酿酒酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），保藏编号为CICC1009；按照上述方法制得酿酒酵母菌菌液，将酿酒酵母菌菌液接种到发酵底物中，单位体积发酵底物中接种的酿酒酵母菌的数量为10⁶CFU/mL，在摇床培养箱上，于28℃的条件下发酵培养72h，摇床培养箱的转速为180rpm，发酵培养结束后将制得的物料转移到超声波细胞破碎仪中进行超声，用于破碎酿酒酵母菌，采用间歇超声的方式，每间隔20s超声20s，间隔和超声的总时间为15min，超声的功率为130W，超声后于95℃条件下灭菌30min；灭菌后，降至室温，制得樱花发酵溶胞物；

（3）将4g大豆卵磷脂、0.5g胆固醇、2g聚甘油-10硬脂酸酯、10g双丙甘醇、1g辛甘醇、1g的1,2-己二醇、1g光甘草定混合，加热至75℃，使各组分全部溶解；再向体系中加入8g步骤（2）制得的樱花发酵溶胞物和72.5g水，在75℃条件下保温剪切均质15min，剪切均质机的转速为7000rpm，再将混合液转移到高压均质机中，高压均质10min，高压均质的压力为800bar，得到脂质体溶液。

效果实施例1体系稳定性数据

测试上述实施例1~5、对比例1、对比例3~7制得产品的粒径，结果见表1。对比例2制得产品为溶液，无法测得粒径。

表1粒径测试实验结果

有研究表明，纳米粒子的透膜性随其粒径的增加而减少，当产品中粒子粒径在100nm以内时，具有高透膜性；当粒子粒径在100~200nm范围内时，也具有较高的透膜性，但较粒子粒径在100nm以内的产品相比，透膜性略有降低。被动转运膜的粒径临界值为500nm，大于500nm的粒子很难跨越极性上皮细胞进入循环系统。

本申请实施例1~5制得脂质体的粒径较小，均小于100nm，透膜性好，易被皮肤吸收，且体系稳定性高。对比例5制得产品的粒径为2800nm，可见，当光甘草定的含量高于本申请限定范围时，体系中组装后物料的粒径较大，透膜性差，不易被肌肤吸收。

效果实施例2刺激性实验

1、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：pH=7.2，配制后一周内用完。

2、待测样品配置：用去离子水将上述实施例或对比例制得的产品稀释成体积百分比为40%的待测液。

3、RBC悬液的制备

制备红细胞悬液（RBC）

用一次性吸管将离心管中的血细胞沉淀转移至新的EP管中，取1mL的RBC沉淀于15mL的EP管中，加入9mL的PBS缓冲液进行10倍稀释，然后轻轻摇晃混合均匀，1500rpm 离心5min，倒掉上清液，反复清洗三次直到管内PBS无色为止，再添加10 mL的PBS缓冲液后即得到红细胞悬液。

4、实验组设置

全溶血对照组：0.75mL水+0.25mL的红细胞悬液；

阴性对照组：0.75mL的PBS缓冲液+0.25mL的红细胞悬液；

样品组：0.75mL待测液+0.25mL的红细胞悬液；

样品对照：0.75mL待测液+0.25mL的PBS；

根据比例加样，总体积为1mL，将EP管置于150rpm，37℃摇床中培育1h，然后将各EP管放在离心机中，10000×g速度离心1min以停止培育，离心后取上层清液，在560nm处测定吸光值，记录并保存数据。

根据下述公式计算样品组的溶血率，结果见表2。

样品组红细胞溶血率=（A_样品组-A_样品对照-A_{阴性对照组}）/（A_{全溶血对照组}-A_{阴性对照组}）×100%。

表2红细胞溶血率实验结果

注：“*”同实施例1相比，P<0.05

结果表明：本申请实施例1~5制得产品的红细胞溶血率低，刺激性小。

对比例1制得产品的刺激性高于实施例1~5（P<0.05），推测可能是对比例1使用的长双歧杆菌在发酵过程中分泌出乳酸等物质，对红细胞具有一定的刺激性；另外，对比例1制得产品中光甘草定被包裹和保护的程度差于实施例1。

对比例3与实施例1相比区别仅在于未添加樱花发酵溶胞物，仅使用大豆卵磷脂等物质包裹光甘草定。本申请实施例1~5制得产品在对比例3的基础上添加了樱花发酵溶胞物，红细胞溶血率显著降低，可见添加樱花发酵溶胞物后可提高光甘草定在水中的分散能力，降低体系中未被包裹的光甘草定含量，进而减小体系的刺激性。

对比例5与实施例1~5相比，光甘草定的添加量过高，制得终产品中光甘草定被包裹的数量有限，导致体系中含有很多未被包裹的光甘草定，进而导致其红细胞溶血率较高。

对比例6与实施例1相比区别仅在于将樱花发酵溶胞物替换为等量的樱花发酵产物滤液，对比例6制得产品与对比例3相比，虽然红细胞溶血率显著降低，但对比例6制得产品的红细胞溶血率仍显著高于实施例1~5制得产品，推测可能是樱花发酵产物滤液和樱花发酵溶胞物中均含有利于光甘草定分散的物质，但樱花发酵溶胞物中有助于光甘草定分散的物质更多，进而减少体系中未被包裹的光甘草定的量，减小体系的刺激性。

对比例7与实施例1相比区别仅在于发酵底物中未添加葡萄糖和硫酸铵，未补充碳源和氮源。根据结果可看出，当发酵底物改变时，会影响发酵菌种的代谢能力和代谢途径，进而导致终产品中可提高光甘草定分散能力和溶解能力的物质减少，从而使得终产物刺激性偏大。

效果实施例3 抗氧化实验（DPPH自由基清除率）

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

待测液配置：使用去离子水将上述实施例或对比例制得的产品分别配置成体积百分数为10%的待测液。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

（1）取等体积（1mL）的待测液与0.8mg/mL的DPPH溶液混匀（A1管）；

（2）取等体积（1mL）的无水乙醇与0.8mg/mL的DPPH溶液混匀（A2管）；

（3）取等体积（1mL）的无水乙醇与待测液混匀（A₃管）；

（4）避光反应30min后，在517nm下测A₁管、A₂管、A₃管吸光度值；清除率计算公式为：DPPH自由基清除率=[(A₂+A₃)-A₁]/A₂×100%。

DPPH自由基清除率结果见表3。

表3 DPPH自由基清除率实验结果

注：“*”表明对比例1及对比例6同实施例1相比具有显著性差异，P<0.05。

结果表明：本申请实施例1~5制得产品具有理想的DPPH自由基清除能力，即具有理想的抗氧化能力。

对比例1与实施例1相比，DPPH自由基清除率相对较低，具有显著性差异（P<0.05）。可见，以乳酸菌樱花发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的抗氧化功效低于以酵母菌樱花发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的抗氧化功效。

根据对比例2、对比例3和实施例1的效果数据可看出，本申请中樱花发酵溶胞物的添加量相对较少，其自身的DPPH自由基清除率相对较弱（见对比例2），但当樱花发酵溶胞物与光甘草定和包括大豆卵磷脂等物质在内的脂质体结合使用时，可显著提高体系的DPPH自由基清除率，三种组分组合后对抗氧化能力具有协同促进作用，即实施例1制得产品的DPPH自由基清除率（70.09%）比对比例2（4.22%）和对比例3（54.98%）制得产品的DPPH自由基清除率的加和还要高。

实施例1与对比例6相比，实施例1制得产品的DPPH自由基清除率更高。推测可能是因为发酵后的溶胞物中含有部分具有抗氧化功效的物质；另外，溶胞物中含有更有利于光甘草定在水中分散，提高其在体系中稳定性的双亲性的物质，进而表现出更优异的抗氧化能力。

实施例1与对比例7相比，实施例1制得产品的DPPH自由基清除率更高。推测可能是因为当发酵底物改变时，会影响发酵菌种的代谢能力和代谢途径，进而导致终产品中具有抗氧化功效的活性成分的种类发生变化，活性成分含量减少，而且有利于光甘草定分散和溶解的物质也减少，因此将樱花发酵溶胞物加入到脂质体中也未起到明显增效的作用。

效果实施例4 酪氨酸酶抑制实验

配置pH值为6.8的PBS缓冲液。

酪氨酸酶溶液：用 pH值为6.8的PBS磷酸缓冲液，将酪氨酸酶配制成100u/mL的酶溶液。（酪氨酸酶粉末活力≥1000unit/mg）

0.1M HCl溶液：用HCl含量为36%-38%的HCl溶液0.431mL，蒸馏水定容至50mL。

0.5mg/mL左旋多巴溶液：取0.02g 左旋多巴，先溶于14mL，0.1mol/L的HCl溶液，再加入26mL，pH值为6.8的PBS磷酸缓冲液搅拌混匀，共40mL。

待测样品配置：用去离子水将上述实施例或对比例制得的产品稀释成体积百分比为50%的待测液。

阳性对照组配制：准确称取5g的烟酰胺，溶于PBS缓冲液（pH=6.8)中，混匀，制得质量百分数为5%的烟酰胺溶液；

阴性对照组：水；

空白组：PBS缓冲液（pH=6.8)；

按照表4配置各组反应液。

表4 各组反应液中组分配比和制备方法

注：阳性对照组同待测样品组，将待测样品溶液替换为等量的阳性对照液。

参照表4，使用1.5mL的EP管设立样品管（T）、样品本底（T₀）、酶反应管（C）和溶剂本底（C₀），每一样品的每个受试浓度的样品管（T）需设立3支平行管，同时酶反应管（C）也需设立3支平行管。

在样品管（T）和样品本底（T₀）中各加入 250μL相同浓度的样品溶液，酶反应管（C）和溶剂本底（C₀）则分别加入 250μL 的PBS磷酸缓冲液。

在样品管（T）和酶反应管（C）中各加入 125μL酪氨酸酶溶液，样品本底（T₀）与溶剂本底（C₀）以 125μL的PBS磷酸缓冲液代替，将样品和酪氨酸酶充分混匀，置37℃水浴槽孵育10min。依次在各管中加入 500μL的左旋多巴溶液，控制每管反应时间为5分钟，即刻将各管反应溶液移入比色皿中，在475nm处测定吸光值，并记录。代入酪氨酸酶活性抑制率计算公式中，即可得出上述实施例或对比例制得产品经稀释后制得待测样品的酪氨酸酶活性抑制率，结果见表5。

待测样品酪氨酸酶活性抑制率=[(C-C₀)-(T-T₀)]/(C-C₀)×100%。

表5酪氨酸酶活性抑制率实验结果

结果表明：本申请实施例1~5制得产品具有理想的酪氨酸酶抑制率，可见具有理想的美白功效。

对比例1与实施例1相比，酪氨酸酶抑制率相对较低。可见，以乳酸菌樱花发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的美白功效差于以酵母菌樱花发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的美白功效。

根据对比例2、对比例3和实施例1的效果数据可看出，本申请中樱花发酵溶胞物的添加量相对较少，其自身的美白功效相对较弱（见对比例2），但当樱花发酵溶胞物与光甘草定和包括大豆卵磷脂等物质在内的脂质体结合使用时，可显著提高体系的酪氨酸酶抑制率，三种组分组合后对美白功效具有协同促进作用，即实施例1制得产品的酪氨酸酶抑制率（95.84%）比对比例2（28.89%）和对比例3（52.19%）制得产品的酪氨酸酶抑制率的加和还要高。

对比例5因其体系不稳定，光甘草定在体系中分散性较差，光甘草定会发生自聚现象，降低了其生物利用度，进而导致其酪氨酸酶抑制率极其显著地低于实施例1制得产品。

实施例1与对比例6相比，实施例1制得产品的酪氨酸酶抑制更高。根据结果推测实施例1制得产品与对比例6制得产品相比，多出的溶胞产物的美白功效相对较弱，但溶胞产物与大豆卵磷脂等物质结合更有利于提高光甘草定在体系中的溶解度和分散稳定性，在降低光甘草定刺激性的同时，也在一定程度上提高了光甘草定的生物利用度，进而提高体系的美白功效。

实施例1与对比例7相比，实施例1制得的产品酪氨酸酶抑制率较高。推测可能是因为当发酵底物改变时，会影响发酵菌种的代谢能力和代谢途径，进而导致终产品中活性成分的种类发生变化，活性成分含量减少，有利于光甘草定分散和溶解的物质也减少，因此将樱花发酵溶胞物加入到脂质体中，对酪氨酸酶抑制率的提高能力有限。

效果实施例5 CCK-8细胞存活率实验

将装有生长状态良好的B16细胞的培养瓶从培养箱中取出，使用pH=7.2的PBS缓冲液清洗两遍B16细胞，每一瓶细胞加入0.5mL的胰酶，放入细胞培养箱2min，等待细胞完全消化脱壁悬浮，之后加入1mL有血清的DMEM培养基终止胰酶消化，将细胞悬浮液转移至15mL离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清液后将细胞沉淀与有血清的DMEM培养基吹打均匀，然后转移至T25培养瓶中，在5% CO₂，37℃的培养箱中进行传代培养两到三天，待细胞融合率为80%以上可进行之后的实验。

将8×10³个细胞/100μL接种到96孔板中培养24h，吸弃原培养基；实验组加入100μL待测样品（用无血清DMEM培养基稀释上述实施例或对比例制得的样品，配置成体积百分比为0.03%的待测样品）处理24h，每孔加入10μL的CCK-8试剂，于37℃继续孵育1h，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA_待测样品。对照组的每孔加入10μL有血清的DMEM培养基处理24h，每孔加入10μL CCK-8试剂，于37℃继续孵育1h，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA_对照。

空白组的每孔中不加细胞，只添加100μL有血清的DMEM培养基，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA空白。

细胞存活率=（OA_待测样品-OA_空白）/（OA_对照-OA_空白）×100%，按照该公式计算上述实施例或对比例制得待测样品处理细胞后的细胞存活率，结果见表6。

表6细胞存活率实验结果

注：表中“*”表示同实施例1有显著性差异，P<0.05；表中“**”表示同实施例1有极其显著性差异，P<0.01。

根据表6中结果可看出，同一浓度下的实施例1~5制得产品对细胞几乎无毒性。

效果实施例6 黑色素生成抑制率的测定

取对数生长期状态良好的B16细胞计数并接种于6孔板中，置于37℃，5%CO₂环境培养箱中培养过夜，待细胞融合率达到80%以上，弃掉旧培养基，PBS清洗2次。

实验组：加入2mL实施例待测液或对比例待测液（将上述实施例或对比例制得产品分别用无血清的DMEM稀释成体积百分比为0.06%的待测液）。

空白组：只加2mL无血清培养基。

上述各组加样后均培养24h，培养后吸弃旧培养基，使用PBS洗涤后加入500μL胰酶消化4min，加入1mL含血清培养液终止消化，1500rpm离心3min，吸弃上清液，留细胞沉淀，加入0.5mL含10%DMSO的1M氢氧化钠溶液，超声分散3min，80℃水浴30min，振荡混匀，10000rpm离心2min，吸取上清液200μL至96孔板，于405nm读取吸光度值。

设置空白孔，即指培养板中不进行任何操作，只添加等量10%DMSO的1M氢氧化钠溶液。

黑色素产生抑制率=1-(实验组OD值-空白孔OD值)/(空白组OD值-空白孔OD值)×100%，每一组成分重复5个样本，计算结果取平均值，结果见表7。

表7黑色素产生抑制率实验结果

注：表中“*”表示同实施例1有显著性差异，P<0.05。

根据表7中结果可看出，本申请实施例1~5制得产品具有理想的黑色素产生抑制率，可见具有理想的美白功效。对比例1与实施例1相比，黑色素产生抑制率相对较低。可见，以乳酸菌樱花发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的美白功效差于以酵母菌樱花发酵溶胞物为原料制得脂质体溶液的美白功效。

根据对比例2、对比例3和实施例1的效果数据可看出，本申请中樱花发酵溶胞物的添加量相对较少，其自身的美白功效相对较弱（见对比例2），但当樱花发酵溶胞物与光甘草定和包括大豆卵磷脂等物质在内的脂质体结合使用时，可显著提高体系的黑色素产生抑制率，三种组分组合后对黑色素产生抑制率具有协同促进作用，即实施例1制得产品的黑色素产生抑制率（22.39%）比对比例2（4.98%）和对比例3（10.38%）制得产品的黑色素产生抑制率的加和还要高。

对比例5因其体系不稳定，光甘草定在体系中分散性较差，光甘草定发生自聚现象，虽然自聚后的光甘草定可通过细胞吞噬作用进入细胞发挥一定的美白功效，但结合前述分析可知，对比例5制得产品具有较高的细胞毒性和刺激性，不适合作为化妆品原料。

实施例1与对比例6相比，实施例1制得产品的黑色素产生抑制率显著提高。根据结果推测，实施例1制得产品与对比例6制得产品相比，多出的溶胞产物的美白功效相对较弱，但溶胞产物与大豆卵磷脂等物质结合更有利于提高光甘草定在体系中的溶解度和分散稳定性，在降低光甘草定刺激性的同时，也在一定程度上提高了光甘草定的生物利用度，不影响光甘草定的释放，进而提高体系的美白功效。

实施例1与对比例7相比，实施例1制得产品的黑色素产生抑制率显著提高。推测可能是因为当发酵底物改变时，会影响发酵菌种的代谢能力和代谢途径，进而导致终产品中具有美白功效的活性成分的种类发生变化，活性成分含量减少，而且有利于光甘草定分散和溶解的物质减少，因此终产品的黑色素含量抑制率显著低于实施例1。

效果实施例7 人体皮肤斑贴

空白组：去离子水；

样品组：将上述实施例1~5制得产品配置成体积百分比为1%的待测液。

空白对照的斑试器上不加任何物质，阴性对照组的斑试器上添加50μL去离子水，实验组的斑试器上添加50μL上述制得的待测液；将加有受试物的斑试器敷于受试者的前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。24h后去除斑试器，去除后30min（待压痕消失后）按表8标准观察皮肤反应，并记录观察结果见表9。

表8皮肤不良反应分级标准

表9 人体斑贴实验结果

结果表明：实施例1~5制得产品使用安全性高，使用后肌肤均无过敏现象发生。

最后，还需要说明的是，在本申请中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种脂质体溶液的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）酵母菌接种到发酵底物中，经发酵培养，超声，制得樱花发酵溶胞物；所述发酵底物包括樱花水提液、葡萄糖和硫酸铵；所述酵母菌为酿酒酵母菌；

（2）将1份卵磷脂、0.05~0.125份胆固醇、0.3~0.8份聚甘油类乳化剂、1~4.5份多元醇和0.125~0.5份光甘草定的混合物与1~4份步骤（1）制得的所述樱花发酵溶胞物和15~25份水混合，经剪切均质，高压均质，制得所述脂质体溶液。

2.如权利要求1所述的脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述脂质体溶液的制备方法满足下述条件中至少一种：

步骤（1）中，所述葡萄糖占所述樱花水提液的质量百分比为0.1%~0.5%；

步骤（1）中，所述硫酸铵占所述樱花水提液的质量百分比为0.1%~0.3%；

步骤（1）中，所述樱花水提液的制备方法包括如下步骤：干燥的樱花和水在85~90℃条件下浸提60~120min，过滤，收集滤液；

步骤（1）中，所述发酵底物在使用前还包括灭菌的操作；

步骤（1）中，单位体积的所述樱花水提液中接种的所述酵母菌的数量为10⁵~10⁶CFU/mL；

步骤（1）中，所述发酵培养的时间为24~72h；

步骤（1）中，所述发酵培养的温度为25~35℃；

步骤（1）中，所述超声的功率为65~130W；

步骤（1）中，所述超声的时间为5~20min。

3.如权利要求2所述的脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述脂质体溶液的制备方法满足下述条件中至少一种：

步骤（1）中，所述酿酒酵母菌包括“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1009的酿酒酵母菌”、“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC1389的酿酒酵母菌”、“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1001的酿酒酵母菌”和“购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1002的酿酒酵母菌”中的至少一种；

步骤（1）中，所述发酵培养的时间为48~72h；

步骤（1）中，所述发酵培养的温度为25~28℃；

步骤（1）中，所述超声的时间为15~20min。

4.如权利要求1~3中任意一项所述的脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述脂质体溶液的制备方法满足下述条件中至少一种：

步骤（2）中，所述卵磷脂包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和磷脂酰胆碱类卵磷脂中至少一种；

步骤（2）中，所述聚甘油类乳化剂包括聚甘油-10硬脂酸酯；

步骤（2）中，所述多元醇包括双丙甘醇、甘油、丙二醇、丁二醇和戊二醇中至少一种；

步骤（2）中，所述胆固醇的重量份数为0.1~0.125份；

步骤（2）中，所述聚甘油类乳化剂的重量份数为0.5~0.8份；

步骤（2）中，所述多元醇的重量份数为2.5~3.5份；

步骤（2）中，所述光甘草定的重量份数为0.125~0.25份；

步骤（2）中，所述樱花发酵溶胞物的重量份数为2~4份；

步骤（2）中，所述水的重量份数为19~25份；

步骤（2）中，所述混合的过程中还进一步添加防腐剂；

步骤（2）中，所述剪切均质的温度为70~80℃；

步骤（2）中，所述剪切均质的时间为5~15min；

步骤（2）中，所述剪切均质在剪切均质机中进行，所述剪切均质机的转速为5000~10000rpm；

步骤（2）中，所述高压均质的压力为200~800bar；

步骤（2）中，所述高压均质的时间为5~10min。

5.如权利要求4所述的脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述脂质体溶液的制备方法满足下述条件中至少一种：

步骤（2）中，所述磷脂酰胆碱类卵磷脂包括二肉豆蔻酰基卵磷脂和/或二棕榈酰磷脂酰胆碱；

步骤（2）中，所述光甘草定的重量份数为0.2~0.25份；

步骤（2）中，所述防腐剂的重量份数为0.25~2份；

步骤（2）中，所述防腐剂包括醇类防腐剂和/或对羟基苯乙酮；

步骤（2）中，所述剪切均质的温度为75~80℃；

步骤（2）中，所述剪切均质在剪切均质机中进行，所述剪切均质机的转速为7000~8000rpm；

步骤（2）中，所述高压均质的压力为600~800bar。

6.一种脂质体溶液，其特征在于，由如权利要求1~5中任意一项所述的脂质体溶液的制备方法制得。

7.一种如权利要求6所述的脂质体溶液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脂质体溶液作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分和/或美白活性成分。

9.一种皮肤外用剂，其特征在于，包括如权利要求6所述的脂质体溶液。

10.如权利要求9所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂满足下述条件中至少一种：

所述皮肤外用剂中还进一步包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种；

所述皮肤外用剂包括面膜、精华或爽肤水；

所述脂质体溶液占所述皮肤外用剂的质量百分比为1%~20%。