TWI723344B - 使用印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物用於製備護眼的醫藥組合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種具有護眼功效的石斛萃取物，該石斛萃取物之活性成分包含有印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物。本發明還提供了一種具有護眼功效的醫藥組合物，以及一種使用石斛萃取物用於製備護眼的醫藥組合物的用途。

Description

使用印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物用於製備護眼的醫藥組合物的用途
本發明是關於一種護眼的醫藥組合物、一種護眼的石斛萃取物以及一種使用石斛萃取物用於製備護眼的醫藥組合物的用途，特別是關於一種活性成分包含有印防己毒烷型(picrotoxane)結構之倍半萜類化合物之護眼的醫藥組合物、一種護眼的石斛萃取物以及一種使用石斛萃取物用於製備護眼的醫藥組合物的用途。
根據台灣中藥典記載石斛生藥的基原植物包括(金釵)石斛(Dendrobium nobile Lindl.)，粉花石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe.)，黃草石斛(Dendrobium.chrysanthum Wall.ex Lindl.)、馬鞭石斛(Dendrobium fimbriatum Hook.)、鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)、鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxtum Lindl.)或黃花石斛(Dendrobium tosaense Makino)。前人有關石斛的研究報導有各式活性化合物被分離出來，其中石斛鹼被認為是主要活性成分；菲類(Phenanthrene)成分具有之生物活性包括抗氧化、抗發炎、抗腫瘤等作用；倍半萜類化合物具有免疫調節作用，石斛 多醣類具有護肝、免疫調節、抗腫瘤、降血壓等功效；聯苄化合物(bibenzyl compounds)具有抗氧化和抗腫瘤等作用。雖然石斛被指明具有清肝明目之功效，而於眼睛疾病的應用雖然近期有報導指出石斛的聯苄化合物moscatilin在缺氧情況下能保護視網膜損傷。然而，moscatilin是極性較低的化合物，先前有文獻報導該化合物具有細胞毒性及抗腫瘤作用，本研究也發現對視神經細胞株有毒性並不適合作為治療眼睛疾病的醫學藥物。臨床上目前尚未有白內障、青光眼、乾眼症等疾病的有效且副作用少的藥物，而石斛在傳統中醫如何發揮其護眼作用，其活性成分為何，尚未見有相關之明確研究方向。
本發明係提供一種護眼的醫藥組合物、一種護眼的石斛萃取物以及一種使用石斛萃取物用於製備護眼的醫藥組合物的用途，其中一個特徵在於使用印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物作為其活性成分。
根據本發明之一實施例，本發明係提供了一種具有護眼功效的石斛萃取物，該石斛萃取物之活性成分包含有印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物。
根據本發明另一實施例，本發明係提供一種使用石斛萃取物用於製備護眼的醫藥組合物的用途，其中該石斛萃取物之活性成分包含有印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物。
根據本發明又一實施例，本發明係提供了一種用於護眼 的醫藥組合物，其活性成分包含有印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物。
本發明所獲得之石斛萃取物具有護眼之功效，且本發明更進一步提供此萃取物的主要活性成分，具醫學上之價值。
第1圖與第2圖：石斛之酒精/水粗萃物A，及萃取物A-2，分別對人類視網膜神經細胞(ARPE-19)和大鼠視神經節細胞(RGC-5)在過氧化氫，缺氧及紫外光照射損傷下對兩種細胞之保護作用。
第3圖：石斛活性成分化合物1、化合物2、化合物3與葉黃素對過氧化氫，缺氧或紫外光照射導致之ARPE-19和RGC-5細胞損傷下對細胞之保護作用。
第4圖：石斛活性成分化合物1在不同濃度下，對過氧化氫，缺氧或紫外光照射導致之ARPE-19和RGC-5細胞損傷下對細胞之保護作用。
第5圖：石斛萃取物A-2與化合物1對斑馬魚經紫外光照射引起白內障之保護作用的量化圖。
第6圖：石斛萃取物A-2之液相層析串聯質譜(LC/MS)分析之化學剖面圖。
為使本發明所屬技術領域中具有普通知識者可以進一步了解本發明，在以下的描述中會列出本發明的較佳實施例，並配合圖式，詳細 說明本發明內容及所欲實現之效果。
本發明是關於一種石斛萃取物，其製備方法如下。首先，提供一石斛科生藥材，以60-80%乙醇/水萃取得到粗萃物A。於一實施例中，石斛科植物係指蘭科石斛屬(Dendrobium)植物中之(金釵)石斛(Dendrobium nobile Lindl.)，但並不以此為限，於其他實施例中亦可能是鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)、黃草石斛(Dendrobium.chrysanthum Wall.Ex Lindl.)、馬鞭石斛(Dendrobium fimbriatum Hook.)、鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)、黃花石斛(Dendrobium tosaense Makino)或粉花石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe.)。於一實施例中，該生藥材係指此石斛科植物的莖部。於一實施例中，粗萃物A佔生藥材的重量百分比為10~16%。
接著，利用大孔樹脂進行層析，以水沖提後得到水萃取物A-1，再用40-60%乙醇/水沖提後得到一萃取物A-2。於一實施例中，大孔樹脂例如：日本三菱化工公司所開發之Diaion HP樹脂系列。其中，萃取物A-2佔生藥材的重量百分比為3-6%。
接著，萃取物A-2先用Sephadex LH-20管柱，用甲醇溶離得富含倍半萜類成分之分劃層，該部分再用製備型逆相層析管柱RP-18，以30%-45%甲醇/水做移動相，反覆分離得到一系列倍半萜成分，該等活性成分為具有印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物。於一實施例中，此倍半萜類化合物可以以結構式I來表示：
Figure 108105682-A0305-02-0007-2
，其中R1可以是H或葡萄糖基(Glc)、R2可以是H或OH、R3可以是CH3或CH2OH，R4可以是H或OH。
於本發明之一實施例中，此種具有結構式I之化合物為dendromoniliside D(以下稱化合物1)，其化學式為2β,3β,11,12-tetrahydroxypicrotoxan-3(15)-olide 11-O-β-D-glucopyran-oside(IUPAC命名：1S,4S,5S,5αR,6R,9S)-5-hydroxy-9--(2-hydroxypropan-2-yl)-5α-methyl-6-((((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)-methyl)octahydro-2H-1,4-methanocyclopenta[d]oxepin-2-one)，其可由下方結構式II來表示：
Figure 108105682-A0305-02-0007-3
於本發明另一實施例中，此種具有結構式I之化合 物為dendrodensiflorol(以下稱化合物2)，其化學式為2β,3β,11,12-tetrahydroxypicrotoxan-3(15)-olide(IUPAC命名：(1S,4S,5S,5αR,6R,9S)-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-9-(2-hydroxypropan-2-yl)-5α-methyloctahydro-2H-1,4-methanocyclopenta[d]oxepin--2-one)，其可由下方結構式III來表示：
Figure 108105682-A0305-02-0008-4
於本發明另一實施例中，此種具有結構式I之化合物 為dendronobiloliside A(以下稱化合物4)，其化學式為2β,3β,11,13-tetrahydroxypicrotoxan-3(15)-olide 11-O-β-D-glucopyranoside(IUPAC命名(1S,4S,5S,5αR,6R,9S)-5-hydroxyl-9-((S)-1-hydroxypropan-2-yl)-5-methyl-6-((((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-tetrahydro-2H-pyran-2-yl)-oxy)methyl)octahydro-2H-1,4-methanocyclopenta[d]oxepin-2-one)，其可由下方結構式IV來表示：
Figure 108105682-A0305-02-0009-5
於本發明另一實施例中，此種具有結構式I之化合物為dendroside G(以下稱化合物7)，其化學式為2β,3β,4,1i-tetrahydroxypicrotoxan-3(15)-olide 11-O-β-D-glucopyranoside(IUPAC命名：(1S,4R,5S,5αR,6R,9R)-5,9-dihydroxy-9-isopropyl-5α-methyl-6-((((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxy-methyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)methyl)octahydro-2H-1,4-methanocyclopenta[d]oxepin-2-one)，其可由下方結構式V來表示：
Figure 108105682-A0305-02-0009-6
於本發明之一實施例中，具有結構式I之活性成分可以包含上述化合物1、化合物2、化合物4或化合物7，其中之一者，其中之兩者，其中之三者或全部。於本發明較佳實施例中，活性成分是包含化合物1與化合物2，且化合物1的含量大於化合 物2的含量，例如化合物1與化合物2在萃取物中的含量比例為3：1~10：1。於一實施例中，具有結構式I之活性成分佔萃取物A-2的重量百分比為12~20%。
於本發明之一實施例中，萃取物A-2還進一步包含有一生物鹼。於一實施例中，生物鹼可以以結構式VI來表示：
Figure 108105682-A0305-02-0010-8
於一實施例中，此生物鹼例如是石斛鹼(dendrobine)(R=H)(以下稱化合物3)、N-甲基石斛鹼(N-methyldendrobinium)(R=CH3)(以下稱化合物5)或N-異戊烯基石斛鹼(N-isopentenyl dendrobinium)(R=isopentenyl)(以下稱化合物6)。於一實施例中，生物鹼佔萃取物A-2的重量百分比為20~35%。
後續，將萃取物A、萃取物A-1、萃取物A-2以及活性成分(具有印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物)分別進行人類視網膜神經細胞(ARPE-19)和大鼠視神經節細胞(RGC-5)經過氧化氫或缺氧或紫外光照射引起的視神經細胞損傷之生物活性評估，其中粗萃物A、萃取物A-2及活性成分具護眼功效，活性成分中的化合物1(dendromoniliside D)與化合物2(dendrodensiflorol)具有顯著的護眼功效。本發明所稱之護眼功效，係指具有 保護視神經細胞、活化視神經細胞或延遲視神經細胞老化或死亡之功效。更具體而言，石斛植物萃取物中的活性成分，係減少自由基、缺氧(hypoxia)或紫外線(UV)損傷導致之眼睛疾病如白內障、視網膜及黃斑部病變和青光眼的發生。以下針對前述石斛萃取物以及其中的活性成分製備方法，以及所得之萃取物具有護眼功效之實驗，描述如下。
實驗方法
(一)成分萃取與分析
一年生(金釵)石斛(Dendrobium nobile Lindl.)地上莖切碎後，用60%酒精/水於50℃萃取過夜，萃取液經減壓濃縮後得粗萃物A，之後將粗萃物A置於大孔樹脂Diaion HP-20管柱，用水沖提後之沖提液濃縮得萃取物A-1，之後管柱再用30-70%酒精/水沖提，該沖提液經減壓濃縮後得萃取物A-2。萃取物A-2再利用製備型逆相層析管柱Sephadex LH-20和RP-18管柱分離其中成分得純化合物。
上述石斛萃取物A-2利用液相層析串聯質譜儀(LC/MS)分析其化學剖面，請參考第6圖，第6圖所示為石斛萃取物A-2之液相層析串聯質譜(LC/MS)分析之化學剖面圖，可確認其中含倍半萜類成分2β,3β,11,12-tetrahydroxypicrotoxan-3(15)-olide 11-O-β-D-glucopyranoside(化合物1；dendromoniliside D)(滯留時間，16.459分)；2β,3β,11,12-tetrahydroxy-picrotoxan-3(15)-olide(化合物2；dendrodensiflorol)(滯留時間，20.410分)；2β,3β,11,13-tetrahydroxypicrotoxan-3(15)-olide 11-O-β-D-glucopyranoside(化合物4；dendronobiloliside A)(滯留時間，18.375分)；2β,3β,4,11-tetrahydroxypicrotoxanpicrotoxan-3(15)-olide 11-O-β-D-glucopyranoside(化合 物7；dendroside G)(滯留時間，20.767分)等，以及含有生物鹼類化合物包括N-甲基石斛鹼(N-methyldendrobinium)(化合物5)(滯留時間，18.633分)，石斛鹼(dendrobine)(化合物3)(滯留時間，19.894分)和N-異戊烯基石斛鹼(N-isopentenyl dendrobinium)(化合物6)(滯留時間，33.024分)等化合物。LC/MS分析條件-儀器：Shimadzu LC-2040 C，LC/MS2020；分析管柱：Purospher ® STAR,RP-18 endcapped(2μm)；移動相溶劑A：乙腈；溶劑B：0.1%甲酸；分析流程：0-2分，1-5% A；2-8分，5-10% A；8-18分，10-15% A；18-20分，15% A；20-25分，15-20%A；25-30分，20-30% A；30-35分，30% A；35-40分，30-70% A；40-45分，70% A；注射量1μl；流速：0.2ml/min。
(二)視神經細胞活性試驗
1.細胞株及其培養
本實驗採用人類視網膜神經細胞株(ARPE-19)和大鼠視神經節細胞株(RGC-5)。ARPE-19細胞培養在DMEM-F12培養液中，內含10%胎牛血清(FBS)、0.2%碳酸氫鈉及抗生素(青黴素100units/ml、鏈黴素100μg/ml)；大鼠視神經節細胞(RGC-5)，培養在DMEM培養液中，內含10%胎牛血清(FBS)及抗生素(青黴素100units/ml、鏈黴素100μg/ml)。
2.過氧化氫，缺氧和紫外光誘發細胞損傷之實驗
ARPE-19和RGC-5細胞在過氧化氫(H2O2)或缺氧(hypoxia)或紫外光(UV)照射處理下會導致細胞死亡，細胞存活 率測定：將細胞置於96-孔盤培養皿中，經過1天，再以不同濃度石斛萃取物或化合物1~4預處理24小時後，再加入過氧化氫(H2O2；500μM)或放置於缺氧環境中培養24小時或紫外光(UV；30μJ/cm2)光照，連續照三次，每次照60秒，兩次中間間隔60秒後，在細胞培養箱內培養24小時，然後再用Sulforhodamine B(SRB)呈色法分析其中存活細胞：分析時，每孔加入50μl的50% TCA(即每孔含有10% TCA)用以固定細胞，置放於4℃ 1小時後，用二次水清洗5次，待完全乾燥後，每孔加入100μl的0.4% SRB(w/v，溶於1%醋酸)染色60分鐘，以1%醋酸清洗數次，待完全乾燥後以10mM Tris-base溶液將SRB萃取出來，在ELISA reader測量540nm的吸光值，以未處理的控制組的吸光值當作100%細胞存活率，計算各處理之存活百分比。
3. UVC誘發斑馬魚白內障試驗
斑馬魚隨機分組(每組12隻)，分別為空白對照組、UVC(300μJ/cm2)照射組和UVC照射+給藥實驗組(萃取物A-2分別給予0.495，0.99和4.95mg/ml三組；化合物1分別給予0.1和1.0mM兩組)。斑馬魚預先投餵石斛萃取物A-2或化合物1一個星期，再進行UVC照射，每天觀察斑馬魚的水晶體變化。於UVC照射前，先將斑馬魚進行麻醉，僅讓斑馬魚的眼睛露出，使其暴露於UVC(325μJ/cm2)中約3分鐘，連續進行七天UV實驗之後，每天觀察斑馬魚眼睛的變化，斑馬魚白內障嚴重度依水晶體澄清的程度計分為1至等級3的白內障量化，等級越高水晶體越混濁， 再以量化數值作圖。
實驗結果
1.石斛萃取物對過氧化氫，缺氧和紫外光照射誘發細胞損傷對ARPE-19和RGC-5細胞的保護活性
氧氣經由一連串氧化作用才能提供活動所需能量，能量產生過程會製造自由基，自由基會使脂肪產生過氧化作用，甚至造成DNA、蛋白質與細胞膜的氧化傷害，所以氧氣愈多的組織、能量愈高的組織，就會有所謂的「氧化壓力」，而黃斑部正是人體中有高度氧化壓力的組織之一。因此，氧化壓力是造成許多眼睛疾病與失明的重要原因。此外，造成眼睛病變的另一個主要原因為網膜缺血，網膜缺血容易導致網膜周邊細胞缺氧，因而產生細胞壞死。因此，我們建立氧化壓力(H2O2)誘導及缺氧及UV光損傷之細胞模型，作為篩選護眼活性之細胞篩選。如第1圖與第2圖所示，為石斛酒精/水粗萃物A及萃取物A-2分別對RGC-5和ARPE-19細胞的過氧化氫，缺氧及紫外光照之保護作用下細胞存活率之量化圖。在第1圖，符號表示如下，**：與不加H2O2或Hypoxia或UV和不加粗萃物A之空白對照組比較，p<0.01；#：粗萃物A處理組與加H2O2或Hypoxia或UV和不加粗萃物A之空白對照組比較，p<0.05；##：粗萃物A處理組與加H2O2或Hypoxia或UV和不加粗萃物A之空白對照組比較，p<0.01。在第2圖中，符號表示如下，**：與不加H2O2或Hypoxia或UV和不 加萃取物A-2之空白對照組比較，p<0.01；#：萃取物A-2處理組與加H2O2或Hypoxia或UV和不加萃取物A-2之空白對照組比較，p<0.05；##：萃取物A-2處理組與加H2O2或Hypoxia或UV和不加萃取物A-2之空白對照組比較，p<0.01。試驗結果顯示金釵石斛之粗萃物A及萃取物A-2，無論對ARPC-19和RGC-5經500μM過氧化氫或在缺氧情況下或UV照射後之損傷都具有保護作用。粗萃物A在10-100μg/ml濃度下雖然三種模式都呈濃度效應，只有在100μg/ml濃度下有顯著活性；而萃取物A-2不但呈濃度效應並且在50μg/ml濃度下就有顯著活性，而且其保護活性高於粗萃物A。
2.石斛之成分具有細胞保護活性
如第3圖所示，為金釵石斛活性成分化合物1(圖中顯示為compound 1)、化合物2(圖中顯示為compound 2)、化合物3(圖中顯示為compound 3)與葉黃素(lutein)(圖中顯示為compound 4)對過氧化氫，缺氧或UV光導致之ARPE-19和RGC-5細胞損傷下細胞存活率圖。在第3圖，符號表示如下，**：與不加H2O2或Hypoxia或UV和不加compound之空白對照組比較，p<0.01；#：compound處理組與加H2O2或Hypoxia或UV和不加compound之空白對照組比較，p<0.05；##：compound處理組與加H2O2或Hypoxia或UV和不加compound之空白對照組比較，p<0.01。如第3圖所示，石斛分離之主要倍半萜純化物化合物1在過氧化氫(H2O2)，缺氧(hypoxia)和紫外光(UV)處理下，對ARPE-19和 RGC-5細胞引起的損傷有保護活性，其保護活性優於葉黃素(圖中顯示為compound 4)；另一倍半萜成分化合物2對過氧化氫(H2O2)和紫外光(UV)也具有保護作用，其保護活性與葉黃素(圖中顯示為compound 4)相當；反之，石斛的指標成分石斛鹼(化合物3)(dendrobine，圖中顯示為compound 3)則不具有保護活性。如第4圖所示，為石斛活性成分化合物1在不同濃度下，對過氧化氫，缺氧或UV光導致之ARPE-19和RGC-5細胞損傷下細胞存活率圖。在第4圖，符號表示如下，**：與不加H2O2或Hypoxia或UV和不加化合物1(compound 1)之空白對照組比較，p<0.01；#：化合物1處理組與加H2O2或Hypoxia或UV和不加化合物1之空白對照組比較，p<0.05；##：化合物1處理組與加H2O2或Hypoxia或UV和不加化合物1之空白對照組比較，p<0.01。 如第4圖所示，活性成分化合物1進一步做濃度依賴性試驗，於1-10mM濃度下對過氧化氫(H2O2)，缺氧(hypoxia)和紫外光(UV)對ARPE-19和RGC-5細胞引起的損傷均呈濃度依賴性保護反應，於10mM濃度下可以達到80%以上的保護活性並且未呈現毒性反應。
3.金釵石斛萃取物A-2和化合物1對UVC誘發斑馬魚白內障之保護活性
如第5圖所示，為金釵石斛萃取物A-2對斑馬魚經UV光照射引起的白內障程度示意圖。在第5圖中，符號表示如下，*：同一組試驗與加UVC不加萃取物A-2或化合物1(compound 1)之 對照組比較，p<0.05；**：同一組試驗與加UVC加萃取物A-2或化合物1之藥物處理組比較，p<0.01。如第5圖所示，經UV光照沒給藥組於第四天就都有白內障，給與石斛萃取物A-2無論是在第四天或第七天，在0.495-4.95mg/ml濃度下，都可以明顯的降低斑馬魚白內障的發生，活性成分化合物1在0.1和1.0mM濃度下也都可以顯著的降低斑馬魚白內障的發生，尤其在1mM濃度下第四天幾乎沒有白內障的發生。
Figure 108105682-A0305-02-0002-9

Claims (3)

  1. 一種使用印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物用於製備護眼的醫藥組合物的用途，其中該印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物為2β,3β,11,12-tetrahydroxypicrotoxan-3(15)-olide 11-O-β-D-glucopyranoside或2β,3β,11,12-tetrahydroxypicrotoxan-3(15)-olide。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物係由一石斛萃取液而來。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該印防己毒烷型結構之倍半萜類化合物在該石斛萃取物的重量百分比為12~20%。
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