KR102575312B1 - 망막 색소 상피 세포를 보호하기 위한 노르빅신 함유 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유동물에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 광보호하기 위한, 빅사 오렐라나(Bixa orellana) 종자의 추출물로부터 정제함으로써 생성된 노르빅신을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium) (RPE) 세포의 치료 분야에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 보호하기 위한, 특히 포유동물에서 연령-관련 황반 변성(Age-related macular degeneration) (ARMD) 또는 스타가르트병(Stargardt's disease) 및 색소성 망막염을 치료하기 위한 조성물의 용도를 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이들 질환을 앓는 개체의 시력을 개선하는 것 또는 적어도 질환의 진행을 안정화하는 것이다.
연령-관련 황반 변성 (ARMD)은 특히 유럽 및 북아메리카에서의 노인 인구에서 비가역적 실명의 원인이다. ARMD는 황반이라고 불리는 망막의 중앙 부분에 영향을 미쳐, 심각한 시각 결핍 및 중심시의 비가역적 손실을 일으킨다.
황반 기능은 중심시 및 시력에 책임이 있으며, 이것의 고해상도는 이것의 원추 광수용체의 고농도와 관련된다. ARMD의 초기 단계는 드루센(Druesen)이라고 불리는 침착물로 표시되며, 이것은 시력에 약간만 영향을 미친다. 후속 단계는 2 개의 형태의 ARMD, 지도모양 위축(geographical atrophy) (건성 형태) 또는 삼출성 위축(exudative atrophy) (습성 또는 신생혈관 형태)를 포함하며, 첫 번째 것이 두 번째 것보다 훨씬 더 흔하다. 이들 2 개의 형태의 마지막 단계는 황반 감각신경 망막을 파괴시키지만, 건성 ARMD의 진행은 일반적으로 느린 반면, 습성 ARMD는 몇 주만에 완전한 실명을 일으킬 수 있다.
노화는 질환에 대한 감수성이 증가하는 것과 관련된 (또는 이에 책임이 있는) 시간의 변화에 따른 점진적인 축적이다. 망막에서, 녹내장, 색소성 망막염 및 ARMD를 포함하는 특정한 수의 퇴행성 질환이 노화에 따라 발생할 수 있다. 색소성 망막염은 불균일 세트의 유전 망막 변성과 함께 무리를 이루며, 광수용체 및 RPE에 관련되고, 야간 시각의 손실을 일으킨 다음, 이후 중심시를 손실시킨다. 망막 노화에 관련된 다양한 유형의 질환의 개시에 관한 구체적인 메커니즘들은 상이하지만, 그로부터 생성된 산화 스트레스 및 염증이 발병에 기여하는 중요한 요소인 것으로 여겨진다.
ARMD의 병인에 대한 이론은 RPE의 노화 및 지질을 함유하는 세포외 물질의 점진적인 축적에 의해 유발된 브루크막(Bruch's membrane)에서의 유체역학적 변형을 포함하며, 이것의 활성이 광수용체의 생존에 필수적이다. RPE 세포는 눈에서 여러 상이한 기능을 갖는다: 그들은 그들의 밀착 접합을 통해 혈액-망막 장벽을 확립하고, 따라서 안구의 내부 부분의 면역특권적(immunoprivileged) 상태에 책임이 있다; 그들은 광수용체에게 영양분을 제공함으로써 그들을 살아있게 유지하고 시각 주기에 참여한다. 현재, RPE 세포의 기능에서의 결핍이 ARMD의 발달에 책임이 있다고 이해된다. 노화는 RPE 세포의 기능장애를 유발하고 그들의 대사 및 또한 그들의 포식 활성을 불충분하게 만든다. 광수용체의 외부 절편의 불완전 소화는 브루크막을 가로지르는 확산을 감소시킴으로써 드루센을 형성시킬 수 있으며, 이것은 먼저 망막 및 인식된 이미지의 변형을 유발한다.
RPE는 노화되면서 증가된 양의 지질갈색소를 저장한다. 이들은 지질 및 단백질로 구성되며, 이는 포식리소좀, 리소좀 및 광수용체로부터 유래된다. 또한 지질갈색소는 에탄올아민과 2 개의 레틴알데히드 분자의 축합에 의해 형성된 N-레티닐-N-레티닐리덴 에탄올아민 (A2E)을 함유한다.
노화는 망막에서 A2E의 증가된 축적을 수반한다 (문헌 [Bhosale et al., 2009]). 청색광의 작용 하에 및 산소의 존재 하에, A2E는 단백질, 지질 및 DNA를 손상시키는 반응 종, 및 따라서 노화하는 RPE 세포에 심각한 산화 스트레스를 발생시킨다 (문헌 [Sparrow & Cai, 2001]). 이 손상은 RPE 세포의 리소좀 활성을 파괴하고 노폐물의 축적을 유발하며, 이는 결국 이곳 저곳에서 RPE 세포의 사멸을 일으킨 후, 그들과 관련된 광수용체를 사멸시킨다.
건성 ARMD의 치료를 위한 약제가 시장에 존재하지 않는 반면, 항-VEGF (혈관 내피 성장 인자) 항체의 유리체내 주사에 의한 약제가 판매되며, 이것은 신생혈관의 형성을 부분적으로 차단할 수 있고 따라서 습성 ARMD을 위한 대안적 치료를 제공한다. 식품 보조제는, 실제이지만 제한된 치료 효능을 갖는 일반적인 항산화 화합물, 즉 항산화 성질이 있는 미네랄 및 비타민, 예를 들어 아연, 비타민 A, C, E와 제제화되었다. 5 년 동안 진행성 ARMD의 위험을 25 %까지, 시력 손실의 위험을 19 %까지 감소시킨 AREDS 건강기능식품 제제 1 (문헌 ["Age-Related Eye Disease Study", AREDS 2001])은 미국에서 건성 ARMD의 치료를 위한 케어에 대해 표준으로 간주된다.
수많은 제품이 흔한 제제 기초: 아연 및 비타민 C 및 E를 제공하며, 이에 다양한 성분: 루테인, 레스베라트롤, 오메가-3 지방산이 첨가되지만, 이들 추가 성분에 관련된, 또는 이들 다양한 분자에 유리하게 반응할 수 있는 환자의 범주에 관련된 효능에 대한 설득력 있는 데이터를 제공하지 않는다 (문헌 [Elliot & Williams, 2012]). 특히, 종래 기술에, 질환의 영향 후 안구의 시력 손실을 예방하거나 그들을 제한하도록 의도된 식품 보조제에 관한 국제 출원 WO 2005/110375이 있다.
카로티노이드 (오로지 음식물로 제공되는 분자)는 그들 중 일부 (루테인, 제아크산틴 = 크산토필)가 황반에 자연적으로 존재하고 (문헌 [Subczynski et al., 2010]), 이들 화합물이 강한 항산화력을 갖는다는 것이 알려졌기 때문에, 보다 특히 연구되었다. 따라서, 이들 화합물이 AREDS 제제에 (단독으로 또는 조합하여) 테스트된 것은 논리적이지만, 얻어진 결과는 보충제가 이들 화합물이 결핍된 환자의 부분집합에만 효능이 있는 것으로 입증되어 제한적이었다 (문헌 [Pinazo-Duran et al., 2014]). 이들 분자는 시험관 내에서 과산화수소의 독성에 대해 RPE 세포 (인간 D407)를 보호하기 위한 효능이 있다 (문헌 [Pintea et al., 2011]).
일본 특허 출원 JP 2010285364는 크로세틴 및 크산토필 또는 또 다른 디아포카로티노이드, 즉 빅신 또는 노르빅신일 수 있는 또 다른 카로티노이드로 구성된 혼합물로 나아간다. 이 혼합물은 이것의 항산화 성질 때문에 산화 현상이 관련된 질환을 경감시키거나 예방하기 위해 제공된다.
또한 다른 크산토필이 단독으로 또는 루테인 및/또는 제아크산틴 (예를 들어 아스타크산틴 - 문헌 [Parisi et al., 2008])과의 조합으로 경구 보충제에 의한 연구의 대상이었다. 최근, 디아포카로티노이드 (= 양 말단이 절단된 카로티노이드 - IUPAC 화학 명명법), 특히 크로세틴 (= 8,8'-디아포카로틴-8,8'-디오에이트) 및 그의 글리코시드 (크로신)가 시험관 내 및 생체 내에서 테스트되었다. 크로신은 시험관 내에서 소 또는 영장류 광수용체의 초대 배양물에 대해 광보호 효과를 갖고 (문헌 [Laabich et al., 2006]), 크로세틴은 산화 스트레스로부터 신경절 세포를 보호한다 (문헌 [Yamauchi et al., 2011]). 경구 투여된 사프론 (크로신/크로세틴이 풍부한 향신료)은 생체 내에서 망막의 품질에 대한 활성이 있다고 입증되었다 (문헌 [Maccarone et al., 2008]; [Falsini et al., 2010]; [Boisti et al., 2014]). 그러나, 사프론이 크로세틴과 동시에 형성된 다른 카로티노이드 및 또한 사향소와 같이, 망막에 대한 활성이 있을 수 있는 다른 분자를 함유하기 때문에 (문헌 [Verma & Middha, 2010]; [Fernandez-Sanchez et al., 2012]), 크로세틴의 단독 영향에 관한 결론에 도달하기 어렵다.
또한 신경절 세포에 대해 시험관 내에서 및 소포체의 스트레스의 영향을 중화하기 위해 유리체내 주사에 의해 생체 내에서, 또 다른 아포카로티노이드, 빅신 (= 메틸히드로겐 6,6'-디아포카로틴-6,6'-디오에이트) 또는 그의 특정 유도체에 대한 실험이 수행되었다 (문헌 [Tsuruma et al., 2012]). 따라서 가장 흔하게 수행되는 테스트는 산화제 (예를 들어 과산화수소)로 처리된 망막의 다양한 세포 유형에 대해 화합물의 항산화 및 따라서 보호 활성을 평가하고, 따라서 그들은 ARMD에 직접적으로 관련이 있지 않다.
과거에 개발된 우루쿰(Urucum) (빅사 오렐라나(Bixa orellana)) 종자의 추출물 (빅실리아(Bixilia)®)이 자외선에 노출된 인간 피부에 대한 (FR 2947173, 문헌 [Veillet et al., 2009]) 및 광산화 스트레스를 받은 RPE 세포에 대한 (Fontaine et al., 2011) 광보호 효과를 나타냈다. 빅실리아® 추출물은 빅신이 풍부한 우루쿰의 천연 추출물이다. 빅실리아®는 페놀계 성질의 다른 광보호 화합물을 함유하며, 이것의 존재가 빅신 단독과 비교하여 조추출물의 더 큰 광보호 활성을 설명할 수 있다. 특허 FR 11 54172 (문헌 [Fontaine et al., 2011])에서, 빅실리아® 추출물의 화합물 중 일부의 RPE 세포에 대한 보호 효과가 분석된다. 0.1 마이크로몰 (μM), 1 μM 및 10 μM 농도에서 빅신 또는 노르빅신을 사용한 테스트의 결과는 어떠한 광보호 활성을 갖지 않고 심지어 빅신 또는 노르빅신 농도가 더 높아지면, RPE 세포가 덜 생존하고 따라서 광보호 효과가 더 약해진다는 것을 암시한다. 무엇보다도, 시아니딘 및 엘라그산과 같은 물질이 10 μM 및 20 μM의 농도에서 RPE 세포에 대해 유리한 광보호 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
보다 철저한 연구는 빅실리아® 추출물에 존재하는 활성 분자를 확인하고 그들의 작용 메커니즘을 구체화하고, 그 다음 그들의 생체 내 효능을 마우스 및 래트에서 입증시켰다. 이 연구가 본 발명을 이끌었다. 따라서 본 발명은 이미 존재하는 치료법에 대한 대안인, RPE 세포를 보호하기 위한 치료법을 찾는 것을 구상한다.
본 발명자들은 노르빅신, 특히 이것의 9'-시스 형태가 N-레티닐-N-레티닐리덴 에탄올아민 (A2E)으로 전처리된 RPE 세포의, 청색 방사선으로의 조명에 의해 유발된 세포 사멸을 강력하게 감소시킬 수 있게 한 것을 발견하였다.
첫 번째 측면에 따라, 본 발명은 포유동물에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 광보호하는데 사용하기 위한, 빅사 오렐라나 종자의 추출물로부터 정제함으로써 얻어진 노르빅신을 90 중량% 초과로 포함하는 조성물을 목적으로 한다.
본 발명에 관련하여, 용어 "빅사 오렐라나 종자의 추출물"은 종자의 외부 부분으로부터, 즉 빅사 오렐라나 종자를 덮는 왁스상 물질로부터 제조된 추출물을 의미하는 것으로 의도된다. 이 왁스상 물질은 빅신 및 다른 미량 카로티노이드가 풍부하고, 또한 이것이 식용 염료로서 사용된다고 알려졌다.
경구 투여 후 포유동물에서 생체이용성이 있는 노르빅신은 빅신보다 훨씬 더 잘 흡수되고 눈에서, 특히 망막에서 발견된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물은 노르빅신을 90 중량% 초과로 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물은 노르빅신을 95 중량% 초과로 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물은 9'-시스 형태의 하기 화학식 (I)인 노르빅신을 90 중량% 초과로 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 아연, 비타민 C 및 비타민 E로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 식품 보조제 또는 약제의 형태로 사용될 수 있다.
용어 "식품 보조제"는 유럽 지침(European Directive) 2002/46/EC에 의해 주어진 정의에 따라 건강에 유익한 영양분을 제공함으로써 음식물을 보충하는 목적을 갖는 상기 조성물을 함유하는 제품을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 식품 보조제는 삼켜지는 겔 캡슐제 또는 정제 또는 음식과 혼합되는 분말 또는 작은 바이알일 수 있고 이것은 RPE 세포에 대해 유익한 영향을 미친다.
용어 "약제"는 유럽 지침 65/65/EC에 의해 주어진 정의에 따라 상기 화합물 또는 상기 추출물, 즉 인간 또는 동물 질환에 대해 치료적 또는 예방적 성질을 갖는 것으로 나타난 임의의 물질 또는 조성물의 정확한 용량을 함유하는 제품을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 치료 용량의 화합물을 함유하는 약제는 겔 캡슐제 또는 정제의 형태로 경구 투여되거나, 유리체내 또는 망막에 대한 유익한 효과를 부여할 수 있게 만드는 임의의 다른 경로를 통해 주사될 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 섭취되거나, 눈으로 주사되거나, 전신으로 주사되거나 혈액으로 주사되기 위해 허용가능한 지지체를 포함한다.
실시양태에서, 조성물은 하루에 체중 1 kg 당 0.48 mg 내지 48 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 0.6 mg 내지 20 mg의 양으로 포유동물에 투여된다.
본 발명의 다른 특정 실시양태에 따라, 조성물은 청색 방사선에 노출됨으로써 유발될 수 있는 망막 손상을 예방하기 위해 의도된다. 용어 "청색 방사선"은 가시광 스펙트럼의 청색 밴드에 상응하고 435 nm 내지 490 nm의 파장을 갖는 방사선을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물은 포유동물에서 연령-관련 황반 변성 (ARMD)의 치료를 위해 의도된다.
다른 특정 실시양태에서, 조성물은 포유동물에서 스타가르트병 및/또는 색소성 망막염의 치료를 위해 의도된다. 스타가르트병 또는 스타가르트 증후군은 양쪽 시력 감소 및 황반의 위축이 조합된 유전성 병리 상태이며, 이는 어린 연령에서 건성 형태의 ARMD의 증상을 재현한다.
도 1은 조명을 받은 후 N-레티닐-N-레티닐리덴 에탄올아민 (A2E) 및 빅실리아® 추출물 또는 빅신 (20 μM) 또는 노르빅신 (20 μM)의 존재 하에 생존한 RPE 세포의 백분율을 도시한다.
도 2는 A2E의 존재 하에 놓이고 조명을 받은 RPE 세포에 대한 우루쿰 종자의 연속 추출물 (C = 시클로헥산; D = 디클로로메탄; M = 메탄올)의 광보호 활성을 도시한다.
도 3a는 C57Bl/6 마우스에서 빅신 (왼쪽) 또는 노르빅신 (오른쪽)의 섭취 후 혈장 농도를 도시한다.
도 3b는 C57Bl/6 마우스에서 노르빅신의 약력학적 분석을 도시한다.
도 4는 복강내 주사 (10 mg/kg) 후 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 눈에서 노르빅신의 HPLC-MS/MS 분석을 도시한다 (3: 주사된 노르빅신, 1 및 2: 이 화합물의 모노글루쿠로니드).
도 5는 정상 마우스와 비교하여 연령의 함수로서, 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 눈에서 A2E 축적의 동력학을 도시한다.
도 6은 24 시간 동안 어둠에 놓인 다음 청색광에 노출된 (4000 lux, 1 시간), 노르빅신의 한쪽 유리체내 주사를 맞은 (유리체에서 130 μM의 최종 농도를 얻기 위함) 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 망막전위도 (왼쪽 A-파동 및 오른쪽 B-파동)를 도시한다. 망막전위도는 조명 7 일 후 수행된다.
도 7은 도 6에서와 같이 처리된 마우스의 눈에서 시신경으로부터의 거리의 함수로서 광수용체 핵의 층수를 도시한다.
도 8a는 "래트 청색광" 모델을 만드는 실험 프로토콜을 도시한다.
도 8b는 양성 대조군으로서 PBN (페닐-N-tert-부틸니트론, 50 mg/kg, 9 ‰ NaCl 내 20 mg/ml 용액)을 사용하는, 노르빅신 (100 mg/kg, 래트 당 9 ‰ NaCl 내 50 mM 용액의 4 회 주사, 4 래트/시리즈)이 주사된 래트의 망막전위도의 결과를 도시한다. 망막전위도는 처리 7 일 후 수행된다.
도 9a는 알파-페닐-N-tert-부틸니트론 (PBN) 또는 노르빅신의 복강내 주사 및 청색광으로의 조명 후 래트의 눈에서 시신경으로부터 거리의 함수로서 광수용체 핵의 층수를 도시한다. 조직학 분석은 처리 7 일 후 수행된다.
도 9b는 도 9a의 각 곡선 아래 면적을 도시한다.
도 10은 3 개월 동안 노르빅신으로 보충된 먹이를 섭취했거나 섭취하지 않은 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 눈에 축적된 A2E의 양을 도시한다.
도 11은 3 개월 동안 0.3 mg/g의 순수 노르빅신을 함유하는 먹이가 공급되었거나 그렇지 않은 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 망막전위도를 도시한다.
도 12는 망막전위도 (A-파동)의 진폭 및 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 눈에 축적된 A2E의 양 간의 관계를 도시한다.
도 13은 빅사 오렐라나의 추출물로부터 정제된 노르빅신의 역상 HPLC 분석의 결과를 도시한다 (문헌 [Scotter et al., 1998] 및 [Polar-Cabrera et al., 2010]에 따라 이성질체가 확인됨).
도 2는 A2E의 존재 하에 놓이고 조명을 받은 RPE 세포에 대한 우루쿰 종자의 연속 추출물 (C = 시클로헥산; D = 디클로로메탄; M = 메탄올)의 광보호 활성을 도시한다.
도 3a는 C57Bl/6 마우스에서 빅신 (왼쪽) 또는 노르빅신 (오른쪽)의 섭취 후 혈장 농도를 도시한다.
도 3b는 C57Bl/6 마우스에서 노르빅신의 약력학적 분석을 도시한다.
도 4는 복강내 주사 (10 mg/kg) 후 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 눈에서 노르빅신의 HPLC-MS/MS 분석을 도시한다 (3: 주사된 노르빅신, 1 및 2: 이 화합물의 모노글루쿠로니드).
도 5는 정상 마우스와 비교하여 연령의 함수로서, 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 눈에서 A2E 축적의 동력학을 도시한다.
도 6은 24 시간 동안 어둠에 놓인 다음 청색광에 노출된 (4000 lux, 1 시간), 노르빅신의 한쪽 유리체내 주사를 맞은 (유리체에서 130 μM의 최종 농도를 얻기 위함) 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 망막전위도 (왼쪽 A-파동 및 오른쪽 B-파동)를 도시한다. 망막전위도는 조명 7 일 후 수행된다.
도 7은 도 6에서와 같이 처리된 마우스의 눈에서 시신경으로부터의 거리의 함수로서 광수용체 핵의 층수를 도시한다.
도 8a는 "래트 청색광" 모델을 만드는 실험 프로토콜을 도시한다.
도 8b는 양성 대조군으로서 PBN (페닐-N-tert-부틸니트론, 50 mg/kg, 9 ‰ NaCl 내 20 mg/ml 용액)을 사용하는, 노르빅신 (100 mg/kg, 래트 당 9 ‰ NaCl 내 50 mM 용액의 4 회 주사, 4 래트/시리즈)이 주사된 래트의 망막전위도의 결과를 도시한다. 망막전위도는 처리 7 일 후 수행된다.
도 9a는 알파-페닐-N-tert-부틸니트론 (PBN) 또는 노르빅신의 복강내 주사 및 청색광으로의 조명 후 래트의 눈에서 시신경으로부터 거리의 함수로서 광수용체 핵의 층수를 도시한다. 조직학 분석은 처리 7 일 후 수행된다.
도 9b는 도 9a의 각 곡선 아래 면적을 도시한다.
도 10은 3 개월 동안 노르빅신으로 보충된 먹이를 섭취했거나 섭취하지 않은 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 눈에 축적된 A2E의 양을 도시한다.
도 11은 3 개월 동안 0.3 mg/g의 순수 노르빅신을 함유하는 먹이가 공급되었거나 그렇지 않은 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 망막전위도를 도시한다.
도 12는 망막전위도 (A-파동)의 진폭 및 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)의 눈에 축적된 A2E의 양 간의 관계를 도시한다.
도 13은 빅사 오렐라나의 추출물로부터 정제된 노르빅신의 역상 HPLC 분석의 결과를 도시한다 (문헌 [Scotter et al., 1998] 및 [Polar-Cabrera et al., 2010]에 따라 이성질체가 확인됨).
과거 공개된 대부분의 연구와 달리, 본 발명에 사용된 모델 (시험관 내 및 생체 내 모두)은 N-레티닐-N-레티닐리덴 에탄올아민 (A2E) 및 이것의 광독성의 역할을 전면에 가져오고, 이 측면에서 인간 병리 상태와 가깝다. 시험관 내 사용된 테스트는 그들의 원리의 관점에서 인간 RPE 세포주 (ARPE-19 세포 - 문헌 [Young et al., 2005]) 상에서 다른 천연 물질로 사용된 그것과 유사하다.
프로토콜 및 결과
1-
빅신
및
노르빅신의
제조
95 중량% 순수한 빅신이 우루쿰 종자의 유기 추출물로부터 및 85 중량% 초과의 농도의 빅신으로부터 유래된 시판 제품 (안나토(Annatto) B)으로부터 제조된다. 정제는 연속 재결정화에 의해 수행된다.
95 중량% 순수한 노르빅신은 정제된 빅신의 알칼리성 가수분해 (5 % KOH, 60 ℃, 3 시간) 후 얻어진다. 얻어진 용액은 농축된 염산으로 산성화되고 노르빅신은 원심분리에 의해 회수된다. 펠릿은 염을 제거하기 위해 물로 2 회 세척되고, 최종 펠릿은 동결건조된다.
화합물의 순도는 UV-Vis 분광광도계 및 역상 HPLC에 의해 평가된다: 화합물은 9'-시스 이성질체를 필수적으로 함유한다 (90 중량% 초과 농도, 도 13).
2- 시험관 내 테스트
A2E의 존재 하에 놓인 RPE 세포에 대한 다양한 천연 물질의 광보호 효과를 연구하도록 의도된 시험관 내 테스트가 사용되었다. 분자의 광보호 효과는 A2E로 처리된 후 청색광으로의 조명에 의해 유도된 광독성의 세포 모델에서 평가된다. 용어 "청색 방사선"은 가시광 스펙트럼의 청색 밴드에 상응하고 즉 435 내지 490 nm의 파장을 갖는 방사선을 의미하는 것으로 의도된다.
이 모델은 성숙한 돼지 RPE의 초대 배양물을 사용한다. 세포 생존율은 세포 생존율 테스트에 의해 정량화된다. -48 시에, 테스트될 화합물 (DMSO 내 5 mM 용액임)은 1 내지 20 μM의 최종 농도를 얻도록 첨가된 다음, -19 시에, A2E가 첨가되고 (30 μM의 최종 농도) 세포는 조사된다 (시간 0 시). 24 시간 후, 세포 생존율이 측정된다. 이미지의 획득 및 또한 그의 처리가 메타모르프(Metamorph) 소프트웨어에 의해 제어되는 형광 현미경 및 전용 정량화 프로그램에 의해 수행된다. 실험은 4 회씩 96-웰 마이크로플레이트 상에서 수행되고 실험은 최소 4 회 재현된다. 결과는 테스트될 분자로 처리된 웰 내 살아있는 세포의 수를 대조군 웰 (A2E가 없는 희석 배지로 처리됨) 내 살아있는 세포의 수로 나누어 나타낸 비의 형태로 표현된다.
이 테스트는 과거에 안나토 종자의 에탄올계 추출물 (빅실리아® - 문헌 [Fontaine et al., 2011] 참조)의 매우 양호한 광보호 활성을 입증하였다. 과거의 연구에서, 안나토의 추출물의 활성이 입증된 반면, 광보호 물질(들)의 성질은 확인되지 않았고, 이 추출물의 주요 성분 (빅신)이 0.1 μM, 1 μM 및 10 μM의 농도에서 효과가 없는 것으로 입증되었다. 따라서 보충적 연구가 활성 화합물(들)을 확인하기 위해 착수되었다.
a.
빅신은
빅실리아
®
의
광보호
활성의 큰 부분에 책임이 있다.
도 1은 빅신 및 노르빅신 (20 μM)이 A2E가 있는 대조군과 비교하여 A2E의 존재 하에 유도된 광독성으로부터 RPE 세포를 효과적으로 보호한다는 것을 보여준다. 20 μM의 빅신을 제공하도록 희석된, 우루쿰 종자의 조추출물은 높은 광보호 활성을 갖는다. 매우 순수한 및 20 μM의 농도인 빅신의 사용은 이 성분이 사실상 상당한 광보호 활성을 갖는 것 (도 1) 및 이것이 동일한 양의 빅신을 제공하도록 희석된 빅실리아® 추출물의 활성의 상당 부분을 설명한다는 것을 보여주었다. 또한 빅신의 주요 순환 대사체를 나타내는 노르빅신에 대해 견줄만한 활성이 발견되었다 (문헌 [Levy et al., 1997]). 이들 결과는 과거에 인간 피부의 광보호에 대해 입증된, 이들 동일한 화합물의 광보호 활성과 일치한다 (문헌 [Veillet et al., 2009]).
b.
빅실리아
®
는 다른
광보호
화합물을 함유한다.
빅실리아®는 페놀계 성질의 다른 광보호 화합물을 함유하며, 이것의 존재가 빅신 단독과 비교하여 조추출물의 더 큰 활성을 설명할 수 있다 (하나의 및 동일한 빅신 농도에 대해). 우루쿰 종자의 껍질의 순차적 추출은 시클로헥산, 디클로로메탄 및 메탄올 순서로 수행되었다 (각각 1 L/종자 100 g).
시클로헥산으로의 추출 후, 0.65 μM의 빅신 농도의 분획이 얻어지고; 디클로로메탄으로의 추출 후, 1485 μM의 빅신 농도를 갖는 분획이 얻어지고; 메탄올로의 추출 후, 45 μM의 빅신 농도를 갖는 분획이 얻어진다.
그 다음 과거의 시험관 내 테스트가 재현된다.
도 2에 따라, 97 %의 빅신을 함유하는 디클로로메탄 분획이 매우 활성이 있지만, 또한 페놀계 화합물이 풍부한 메탄올계 추출물이 상당한 활성을 갖는다는 것이 나타난다 (C = 시클로헥산; D = 디클로로메탄; M = 메탄올).
3-
빅신
및
노르빅신의
생체이용율
빅신 및 노르빅신의 생체이용율의 연구가 C57Bl/6 마우스에서 수행되었다. 화합물은 경구 투여되었다 (50 mg/kg). 혈액 샘플은 0.25, 0.5, 1, 3, 6, 8 및 24 시간 후 얻어졌고 HPLC-DAD (UV 460 nm)-MS/MS에 의해 분석되었다. 표 1 및 도 3a는 섭취된 빅신이 빠르게 노르빅신으로 전환되는 것 및 2 개의 화합물이 견줄만한 농도로 순환하며; 그들이 8 시간 후 더 이상 검출되지 않는 것을 개시한다. 또한, 섭취된 노르빅신이 빅신보다 훨씬 더 큰 생체이용성을 갖는 것도 나타난다.
표 1
복강내 주사 (5 mg/kg) 및 경구 투여 (50 mg/kg) 후 혈장 분석의 비교 (도 3b)는 노르빅신의 생체이용율이 55 %라는 것을 보여준다.
눈 내 노르빅신의 존재는 노르빅신의 복강내 주사 (10 mg/kg) 3 시간 후 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)에서 조사되었다. 6 마리의 동물의 눈이 절단되었고 샘플이 아세토니트릴로 추출되고, 풀링되고, 그 다음 RPE 및 망막 내 노르빅신의 존재를 구체적으로 검출할 수 있는 HPLC-MS/MS (도 4)에 의해 분석되었다 (표 2).
표 2
도 4에 따라, 혈장에서, 그러나 또한 눈에서, 노르빅신이 또한 접합된 형태로 존재하는 것이 나타난다: 사실상 최초 화합물이, 의심할 여지 없이 질량 분석계의 공급원 내 글루쿠로니드의 분해로 인해 원래 화합물보다 먼저 용리되고 유사한 단편형성을 나타내는 2 개의 모노글루쿠로니드를 제공한다. 글루쿠로니드화는 또한 크로세틴의 사례에 기재되었다 (문헌 [Asai et al., 2005]).
실험의 기간에 따라 다양한 정도인 노르빅신의 시스-트랜스 이성질체화가 또한 관찰될 수 있다. 이것은 (폴리)불포화 화합물에서 통상적인 현상이며, 하나 이상의 이중 결합의 시스-트랜스 이성질체화에 상응하고 문헌 [Levy et al. (1997)]에 의해 노르빅신의 사례에서 인간에서 관찰되었다. 본원에 사용된 화합물은 시판 화합물 (안나토 B)로부터 정제된다; 이것은 9'-시스 형태를 매우 주로 함유하고 매우 소량의 올-트랜스(all-trans) 형태 및 다른 시스 또는 디-시스(di-cis) 형태를 함유한다 (도 13).
4- 마우스에서
유리체내
주사에 의한
광보호
활성
문헌 [Maeda et al. (2008)]에 의해 개발된 유전적으로 변형된 마우스 모델이 노르빅신의 광보호 활성을 테스트하기 위해 사용되었다. 이 마우스 모델에서, 시각 색소 주기에 관련된 2 개의 유전자 (ABCA4 및 RDH8)가 불활성화되고, 그 결과 눈에서 A2E를 초기에 축적시킨다 (도 5). 이 동물 모델은 결과적으로 인간 병리 상태와 유사하며, 물론 설치류 및 영장류 간의 눈의 조직의 차이와 관련된 이것의 한계는 있다.
따라서 7 주령 마우스가 노르빅신의 한쪽 유리체내 주사 (유리체에서 130 μM의 최종 농도를 얻기 위함)를 수행하기 위해 사용되었다. 어둠에서 24 시간 후, 마우스는 청색광에 노출되었다 (4000 lux, 1 시간). 7 일 후 수행된 망막전위도는 노르빅신의 보호 효과를 보여주었고, 이것의 존재가 도 6에 의해 나타난 바와 같이 상당한 전기적 활성을 유지시켰다.
외부 핵의 층의 두께의 조직학 연구는 광수용체에 대한 노르빅신의 보호 효과를 입증한다 (도 7). 노르빅신이 유리체내 주사 24 시간 후 실제로 제거되었고 따라서 오직 조명할 때 눈에서 매우 낮은 농도로 존재한다는 것을 주목해야 한다.
5-
래트에서
전신 (
복강내
) 주사에 의한
광보호
활성
"래트 청색광" 모델은, 7 일 후 망막전위도를 수행한 다음 조직학 분석에 의해 평가되는 안구 손상을 유발하기 위해 6 시간 동안 강한 청색광을 동물이 받는 것으로 구성된다. 항산화 화합물, PBN (페닐-N-tert-부틸니트론)은 양성 대조군으로서 사용된다 (문헌 [Ranchon et al., 2001]; [Tomita et al., 2005]). 광보호 활성을 결정하고자 하는 화합물이 조명 단계 전 및 그 동안 (복강내) 주사된다. 상기 단계는 6 시간 동안 필립스(Philips) 청색 네온 튜브 (4.2 mW/cm2)로 수행된다. 실험 프로토콜은 도 8a에 나타난다.
3 개의 시리즈의 실험이 양성 대조군으로서 PBN (페닐-N-tert-부틸니트론, 50 mg/kg, 9 ‰ NaCl 내 20 mg/ml 용액)을 사용하여, 노르빅신 (100 mg/kg, 래트 당 9 ‰ NaCl 내 50 mM 용액의 4 회 주사, 4 래트/시리즈)으로 수행되었다. 망막전위도 (A-파동 및 B-파동)의 분석이 도 8b에 나타난다.
이 테스트는 PBN의 효능과 가까운 노르빅신의 상당한 그것을 입증했다. 상응하는 조직학 데이터 (도 9a 및 9b)는 광수용체의 생존에 대한 노르빅신의 광보호 작용을 확인한다.
6- 마우스에서 만성 경구 투여에 의한
광보호
활성
0.3 mg/g의 순수 노르빅신을 함유하는 먹이가 제조되고 3 개월의 기간 동안 이중 KO 마우스 (ABCA4-/-, RDH8-/-)에 제공되었다.
노르빅신이 보충된 먹이를 받은 동물은 눈에서 A2E 축적이 감소되는 것을 보였다 (도 10): 2 개의 군 간의 차이는 매우 유의하다 (p = 0.0109).
또한 노르빅신으로 보충된 먹이가 망막전위도 (ERG)의 진폭에 대한 양성 효과를 갖는다 (도 11).
이들 분석은 또한 눈에 축적된 A2E의 양 및 ERG의 진폭 사이의 역관계가 있다는 것을 보여주며 (도 12), 이는 병리 상태의 발달에서 A2E 축적의 역할 (문헌 [Wu et al., 2014]) 및 투여가 눈에서 A2E 축적을 감소시키는 것인 이것의 분자의 이점을 확인한다.
그러나, 이 만성 처리 동안 노르빅신의 상당한 축적이 눈에서 관찰되지 않으며, 이는 크산토필과 달리, 이 분자가 분해되는 것으로 보인다는 결론에 도달한다. 이 활성 물질이 축적되지 않는 것은 일부 카로티노이드 (예를 들어 칸타크산틴)의 축적이 RPE 세포 내에 침착물을 형성시킬 수 있기 때문에 이점으로 고려될 수 있다 (문헌 [Goralczyk et al., 1997]). 또한 루테인 및 제아크산틴에 대해 가정된 바와 같이, 이것은 오히려 필터 또는 항산화제의 역할보다 RPE 세포의 활성을 변형시키는 작용의 지표이다. 이 결과는 유리체내 주사 동안 나타난 것 (즉 조명할 때 노르빅신이 사라짐)과 일치한다.
경구 투여 후 마우스에서 망막 변성을 상당히 늦출 수 있는 1 일 섭취량은 체중 1 kg 당 48 mg이다. 인간으로 전치하면 4.8 mg/kg의 유효 1 일 섭취량이 제공된다. 또한 노르빅신의 허용가능한 1 일 섭취량 또는 ADI는 체중 1 kg 당 0.6 mg/일 이하라고 알려져 있다 (JECFA/67/FC). 이 값은 최대 20 mg/kg/일에서 독성이 관찰되지 않는다는 지식 하에, 인간에서 부작용 수준이 관찰되지 않는 11 mg/kg의 1 일 섭취량에 동등한, 래트에서 부작용 수준 또는 NOAEL이 관찰되지 않는 체중 1 kg 당 69 mg/일의 섭취량을 기준으로 확립되었다 (문헌 [Hagiwara et al., 2003]). 제안된 투약법은 0.48 mg/kg/일 내지 48 mg/kg/일, 이상적으로 0.6 mg/kg/일 내지 20 mg/kg/일이다.
참고문헌
Claims (10)
- 포유동물에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 광보호하는데 사용하기 위한, 빅사 오렐라나(Bixa orellana) 종자의 추출물로부터 정제함으로써 얻어진 노르빅신을 90 중량% 초과 또는 95 중량% 초과로 포함하는 식품 보조제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 9'-시스 형태의 하기 화학식 (I)인 노르빅신을 90 중량% 초과로 포함하는 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 아연, 비타민 C 및 비타민 E로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 조성물.
- 포유동물에서 연령-관련 황반 변성 (ARMD)의 치료에 적용하기 위한 또는 포유동물에서 스타가르트병(Stargardt disease) 및/또는 색소성 망막염의 치료에 적용하기 위한, 빅사 오렐라나(Bixa orellana) 종자의 추출물로부터 정제함으로써 얻어진 노르빅신을 90 중량% 초과 또는 95 중량% 초과로 포함하는 제약 조성물.
- 제4항에 있어서, 9'-시스 형태의 하기 화학식 (I)인 노르빅신을 90 중량% 초과로 포함하는 제약 조성물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 섭취되거나, 눈으로 주사되거나, 전신으로 주사되거나, 또는 혈액으로 주사되기 위한 제약 조성물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 하루에 체중 1 kg 당 0.48 mg 내지 48 mg, 또는 체중 1 kg 당 0.6 mg 내지 20 mg의 양으로 포유동물에 투여되는 제약 조성물.
- 가시광 스펙트럼의 청색 밴드에 상응하고 435 nm 내지 490 nm의 파장을 갖는 청색 방사선에 노출됨으로써 유발되는 망막 손상의 예방에 적용하기 위한, 빅사 오렐라나(Bixa orellana) 종자의 추출물로부터 정제함으로써 얻어진 노르빅신을 90 중량% 초과 또는 95 중량% 초과로 포함하는 조성물.
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