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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biochemie und betrifft
ein bestimmtes Isomer eines als Zeaxanthin bezeichneten (abgekürzt als
ZX) Gelbpigments. Wird dieses Pigment Menschen als Arzneimittel
oder Vitamin verabreicht, so kann damit eine Krankheit namens Makuladegeneration,
die die Netzhaut schädigt
und zu Erblindung führen
kann, behandelt oder dieser vorgebeugt werden.
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Die
Netzhaut ist jenes Gewebe, das den hinteren Bereich des Augapfels
auskleidet. Sie ist komplex aufgebaut und enthält ein Dutzend einzelner Schichten.
In zahlreichen medizinischen Lehrbüchern, wie beispielsweise Gittinger,
1998, und Vaughn und Asbury, 1992, (die vollständigen Literaturangaben sind
nachstehend angeführt),
wird sie beschrieben und veranschaulichend dargestellt.
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Eine
spezielle kreisförmige
Region, Makula genannt, mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 1,5
mm beim Menschen befindet sich in der Mitte der Netzhaut. Die Makula
weist zwei Merkmale auf, die sie von der restlichen Netzhaut unterscheiden.
Erstens enthält
die Makula relativ wenige Stäbchen;
die meisten ihrer Photorezeptoren sind zapfenförmig (in der Fovea im Zentrum
der Makula befinden sich gar keine Stäbchen). Zweitens ist die Makula
aufgrund zweier Pigmente namens Lutein und Zeaxanthin von deutlich
gelber Farbe. Beide gehören
zur Molekülklasse
der "Carotinoide". Die Chemie dieser
Carotinoidpigmente wird nachstehend anschließend an die Zusammenfassung
von Makuladegeneration erörtert.
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Makuladegeneration
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"Makuladegeneration" bezieht sich auf
jegliche Erkrankung, die eine fortschreitende Beschädigung der
Netzhautzellen oder Photorezeptorzapfen in der gelben Makularegion
im Zentrum der Netzhaut mit sich bringt. Dies wird in Artikeln und
Texten, wie beispielsweise Taylor, 1993, Gittinger, 1998, und Vaughn
und Asbury, 1992, beschrieben und veranschaulicht.
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Es
gibt verschiedene Arten von Makuladegeneration. Die häufigste
Art ist die der "altersbedingten
Makuladegeneration",
die üblicherweise
mit AMD (oder in einigen Artikeln mit ARMD) abgekürzt wird.
AMD kann zu einer Beeinträchtigung
des Sehvermögens
von leichter Sehschwäche
bis hin zu Erblindung führen.
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Es
gibt zwei Formen von AMD, die häufig
als "feuchte" bzw. "trockene" Form bezeichnet
werden. Die feuchte Form beinhaltet ein starkes Hineinwachsen der
Kapillaren und anderer Blutgefäße in die
Netzhaut, bis die Blutgefäße platzen
und die korrekte Anordnung der Netzhautschichten zerstören. Obwohl
diese Form von AMD in einigen Fällen
durch Verschließen
der sich neu bildenden Blutgefäße mittels
Laser behandelt werden kann, kann die Laserbehandlung das Blutgefäßwachstum
nur zeitweilig verzögern
und üblicherweise
den letztendlichen Verlust des fast gesamten Sehvermögens nicht
verhindern; feuchte AMD führt
fast immer zu totaler oder fast totaler Erblindung. Die feuchte
Form tritt jedoch nur bei 5 – 10
% aller AMD-Patienten auf.
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Die
andere Form von AMD wird als "trockene" AMD bezeichnet.
Da es sich in zumindest 90 % aller AMD-Fälle um diese Form handelt,
wird sie oft einfach nur als AMD bezeichnet. Auch wenn diese AMD-Form normalerweise
nicht zur völligen
Erblindung führt,
kann sie das Augenlicht eines Patienten stark beeinträchtigen,
und der Patient ist weder zum Lesen noch zum Erkennen wohl bekannter
Objekte, wie beispielsweise die Gesichter von Freunden und Verwandten,
fähig.
Als solche führt
sie häufig
zu funktioneller Blindheit, wodurch Menschen nicht mehr Autofahren
oder gefahrlos in der Öffentlichkeit
gehen und keine normalen Tätigkeiten ausführen können.
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Es
gibt verschiedene andere Erkrankungen, die eine Makuladegeneration
als Symptom einschließen, unter
anderem das Stargardt-Syndrom, die Best-Krankheit, das Batten-Syndrom,
das Sjögren-Larsson-Syndrom,
die Stäbchen-Zapfen-Dystrophie
und ovine Ceroid-Lipofuszinose. Artikel, die jedes davon beschreiben, sind
in Dorey et al., 1993, angeführt.
Zudem stehen auch noch andere Krankheiten, die Lysosom- Speicherungsschwierigkeiten
(wie beispielsweise das Tay-Sach-Syndrom) oder progressive Nervenzellendegeneration
beinhalten (wie beispielsweise die Alzheimer-Krankheit), in Verbindung mit einer
Makuladegeneration.
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Viele
dieser Erkrankungen implizieren genetische Komponenten, was durch
Vererbung gezeigt wird; einige der Gene, die diese Krankheiten auslösen, sind
isoliert worden, und genetische Screening-Untersuchungen können anzeigen,
ob eine Person über
dieses defekte Gen verfügt.
Für jede
Person, die Träger
oder wahrscheinlicher Träger
eines solchen Gens ist, was durch einen Gentest oder die Krankheitsgeschichte
der Familie nachgewiesen werden kann, besteht ein erhöhtes Risiko,
an Makuladegeneration zu erkranken.
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AMD
fügt daran
erkrankten Personen, die langsam ihr Augenlicht verlieren, schreckliches
Leid zu. Jährlich
fallen Kosten in Höhe
von Milliarden von Dollar an, sowohl in Form von Produktivitätsausfall
als auch in Form von Belastungen für Familienmitglieder, Versicherungen,
Sozialeinrichtungen und für
Andere, die medizinische Pflege und sonstige Unterstützungen
für Blinde
oder Menschen mit starker Beeinträchtigung ihrer Sehkraft bereitstellen
oder mitfinanzieren müssen.
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Angesichts
dieser von AMD verursachten Schwierigkeiten suchten Wissenschaftler
und Ärzte
jahrzehntelang nach Wegen der Behandlung oder Vorbeugung von Erblindung
oder anderen Formen des Verlusts an Sehstärke, die von Makuladegeneration
verursacht werden. Trotz dieser mehr als fünfzig Jahre dauernden Bemühungen stehen
bis heute keine wirksamen Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung.
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Diagnose: Drusen und Lipofuszin
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Makuladegeneration
wird üblicherweise
durch spezielle Fotos der Netzhaut diagnostiziert. Bei einer Art
von Diagnoseverfahren injiziert ein Arzt ein fluoreszierendes Medikament
in einen Patienten und gibt dem Medikament Zeit, um im Patienten
zu zirkulieren, woraufhin eine vergrößertes Bild der Netzhaut, genannt
Angiogramm, auf genommen wird. Dann analysiert der Arzt das Foto,
um die Gegenwart eines oder beider Typen von Zellbruchstücken zu
bestimmen.
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Ein
Typ von Zellbruchstücken,
der seit mehreren Jahrzehnten bekannt ist und untersucht wird, wird
als Drusen bezeichnet. Diese liegen in zwei unterschiedlichen Formen
vor. Eine kleine Menge an harten Drusen (kleine Teilchen mit einem
Durchmesser von weniger 63 Mikrometern) ist üblicherweise in den Augen eines jeden Über-Vierzigjährigen vorhanden.
Solange harte Drusen nicht in einer über normalen Werten liegenden Menge
vorhanden sind, weist dies auf keine Netzhautschädigung hin.
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Im
Gegensatz dazu weist ein bedeutende Menge an größeren, weichen Drusenablagerungen
(auch als feuchte Drusen bezeichnet) darauf hin, dass eine starke
Netzhautschädigung
vorliegt oder einzusetzen beginnt, da große Klumpen weicher Drusen die
Netzhautschichten zum Bersten oder durcheinander bringen können und
verhindern können,
dass die Netzhautzellen angemessene Nahrung aus dem Blut erhalten.
Von einem Patienten, dessen Netzhaut eine bedeutende Menge an weichen
Drusen aufweist, wird üblicherweise
angenommen, dass er unter Makuladegeneration leidet.
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Der
andere Typ von Zellbruchstücken,
der üblicherweise
bei Patienten mit Makuladegeneration vorhanden ist, wird als Lipofuszin
bezeichnet. Der Zusammenhang zwischen Lipofuszin und AMD ist erst
vor kurzem geklärt
worden (z.B. Weiter et al., 1988, und Dorey et al., 1993).
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Chemie der
Carotinoide
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"Carotinoide" umfassen eine große Molekülklasse;
in der Natur wurden über
600 Carotinoide identifiziert. Diese Moleküle weisen einige gemeinsame
Merkmale auf, unter anderem die folgenden:
- 1.
Carotinoide entstehen durch Koppeln von Isoprenmolekülen, einem
5-Kohlenstoffmolekül.
Da der Grundbaustein 5 Kohlenstoffatome enthält, enthalten die meisten Carotinoide
ein Vielfaches von 5 Kohlenstoffatomen.
- 2. Carotinoide weisen mehrere ungesättigte Bindungen auf. Dies
ermöglicht
ihnen die Absorption von Hochenergie-Lichtwellen in den blauen und
nahultravioletten Bereichen des Spektrums.
- 3. Da Carotinoide Wellenlängen
im blauen und nah-ultravioletten Bereich des Spektrums absorbieren,
ohne längere
Wellenlängen
in anderen Bereichen des Spektrums zu absorbieren, sind Carotinoide üblicherweise von
gelber, oranger, brauner oder roter Farbe. Die Bezeichnung "Carotinoid" rührt von
Karotten her; die ersten bekannten Carotinoide wurden als jene Pigmente
identifiziert, die den Karotten ihre orange Farbe verleihen. Die
von Carotinoiden in Lösung
verursachte Farbe hängt
von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Konzentration und
Gegenwart von anderen Chemikalien, ab.
- 4. Carotinoide verfügen über "konjugierte" Doppelbindungen.
Dies weist darauf hin, dass die Doppelbindungen mit Einfachbindungen
alternieren, sodass jedes Kohlenstoffatom in einer Kette in Doppelbindung
an ein anderes Kohlenstoffatom gebunden ist, aber kein Kohlenstoffatom
an zwei andere Kohlenstoffatome in Doppelbindung gebunden ist. Diese
Anordnung wird bei Betrachtung von 1 besser
verständlich,
in der die Struktur von β-Carotin,
ZX und Lutein abgebildet ist.
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Verschiedene
Carotinoide weisen verschiedene Konjugationsgrade auf, und im Allgemeinen
bietet ein höher
konjugiertes Molekül
besseren Schutz vor "phototoxischer" Schädigung durch
Hochenergie-Lichtbestrahlung. Bei den drei in 1 dargestellten
Carotinoiden beispielsweise ist der gesamte unverzweigte Kettenabschnitt
eines jeden konjugiert, mit alternierenden Doppel- und Einfachbindungen.
Bei β-Carotin
und ZX erstreckt sich die Konjugation bis hin zu den ersten Bindungen
an beiden Endringen. Lutein hingegen weist einen niedrigeren Konjugationsgrad
auf, da die Doppelbindung an einem seiner Endringe nicht die richtige Platzierung
für eine
vollständige
Konjugation aufweist. Der einzige Unterschied zwischen ZX und Lutein
liegt in der Stelle der Doppelbindung an einem (aber nicht beiden)
der Endringe.
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Da
Carotinoide zur Absorption von potentiell schädlicher Energie von blauem
und nah-ultraviolettem Licht konzipiert und selektiert sind (durch
die Evolution), werden sie in der Natur als Schutzpigmente eingesetzt.
In Pflanzen kommen sie in großen
Mengen vor, da es einer der Hauptziele von Pflanzen ist, so viel
Sonnenlicht wie möglich
zu absorbieren und gleichzeitig die von blauer, ultravioletter und
nah-ultravioletter Strahlung verursachten Zellschäden zu minimieren.
Pflanzenschädigungen
durch ultraviolette Strahlung stellen ein großes Problem dar, und Carotinoide
helfen dabei, es zu minimieren.
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Da
Carotinoide zum Schutz vor phototoxischer Schädigung gut geeignet sind, haben
auch Tiere (durch die Evolution) Wege entwickelt, Carotinoide als
lichtschützende
Pigmente zu verwenden. Da Tiere nicht imstande sind, Carotinoide
im Körper
herzustellen, müssen
sie Carotinoide (oder Carotinoid-Vorläufer) pflanzlicher Herkunft
zu sich nehmen. β-Carotin
ist ein Beispiel hierfür;
Säugetiere
müssen
es aus Pflanzen oder Fleisch gewinnen. Befindet sich β-Carotinoid
erst im Körper
eines Säugers,
wird es in andere Molekülformen umgewandelt,
unter anderem in Vitamin A (Retinol), das durch Teilen von β-Carotin
in zwei Hälften
gebildet wird.
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Carotinoide
werden in zwei Hauptklassen eingeteilt, in Carotine und Xanthophylle.
Carotine enthalten keinen Sauerstoff; sie sind echte Kohlenhydrate,
die nur aus Kohlenstoff und Wasserstoff bestehen. Xanthophylle (wie
beispielsweise ZX und Lutein) hingegen enthalten zudem Sauerstoff.
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1 zeigt
die Nummerierung der Kohlenstoffatome im rechten und linken Endring
von ZX. Es ist üblich,
die Kohlenstoffatome im linken Ring mit 1 bis 6 durchzunummerieren,
während
jene im rechten Ring mit "Strich"-Nummern, wie beispielsweise
das 3'-Kohlenstoffatom
(als "drei Strich" ausgesprochen),
bezeichnet werden. Da ZX was das linke und rechte Ende betrifft
völlig
symmetrisch ist, sind die Bezeichnungen "rechts" und "links" reine Konvention zur Vereinfachung
der Beschreibung. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass Lutein
nicht symmetrisch ist; die Position der Doppelbindung im "linken" Ring entspricht
nicht der Platzierung der Doppelbindung im "rechten" Ring.
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Da
ZX durch Addieren zweier Hydroxygruppen an den mit 3 nummerierten
Kohlenstoffatomen an beiden Enden von β-Carotin gebildet wird, lautet
sein chemischer Name 3,3'-Dihydroxy-β-β-carotin;
einige Chemiker bezeichnen es als Carotindiol. Diesem Molekül wurde
der Name "Zeaxanthin" gegeben, da es zuerst
als jenes Pigment identifiziert worden ist, das Mais seine gelbe
Farbe verleiht, und die wissenschaftliche Bezeichnung für Mais lautet
Zea mays.
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Wie
zuvor festgehalten wurde, sind mehr als 600 Carotinoide in der Natur
identifiziert worden. Mehrere Dutzend davon sind in Biochemie und
Handel von Bedeutung. ZX und Lutein sind in dieser Erfindung von
besonderer Wichtigkeit, da sie in der Netzhaut von Säugern und
den meisten anderen Tieren zugegen sind.
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Lutein
ist im Handel sehr wichtig, da die Fütterung dessen (in Form von
Pflanzenextrakten, insbesondere von Ringelblumen) an Hühner weit
verbreitet ist, um ihrer Haut und dem Eidotter eine gelbere Farbe
zu geben, die Käufer
und Konsumenten anspricht.
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ZX
kann denselben Effekt haben und ist noch wirkungsvoller als Lutein,
jedoch waren ZX-Quellen zu kostspielig, um sie in Hühnerfutter
einzusetzen. Die U.S.-Patente Nr. 5.308.759 und Nr. 5.427.783 zielten
darauf ab, dem Problem des zu teuren ZX für Tierfutter Herr zu werden.
Diese Patente betreffen den Einsatz von Bakterien zur Herstellung
von ZX in wirtschaftlichen Mengen, sodass es zur Fütterung
von Geflügel
und Fisch eingesetzt werden kann.
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Abgesehen
von Pflanzen werden Carotinoide auch von bestimmten Bakterien synthetisiert.
Diese Bakterien entwickelten sich in Regionen, die direktem Sonnenlicht
ausgesetzt sind, und ihre Carotinoide üben dieselbe lichtschützende Rolle
aus wie jene von Pflanzen. Publikationen, die Carotinoide von Bakterien
beschreiben, sind unter anderem McDermott et al., 1972, das U.S.-Patent
Nr. 5.429.939 (Misawa et al., 1995) und weitere in der Liste der
Literaturverweise angeführte
Artikel.
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Das
U.S.-Patent Nr. 5.429.939 (Misawa et al., 1995) listet die DNA-Sequenzen
einer Reihe von Genen auf, die für
Enzyme kodieren, die in der Biosynthese verschiedener Carotinoide,
einschließlich
ZX, eine Rolle spielen. Die Rolle eines jeden Hauptgens (einschließlich crtE,
crtB, crtI, crtY und crtZ) bei der Bildung von ZX wird ebenfalls
beschrieben. Zellen, die Plasmide mit diesen darin enthaltenen Genen
umfassen, wurden in der American Type Culture Collection (wie beispielsweise
Erwinia uredovora, ATCC 19321, und Erwinia herbicola, ATCC 39368)
und im Fermentation Research Institute in Japan (z.B. E. coli, FERM
BP 2377) hinterlegt.
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Zeaxanthin-Stereochemie
und -Isomere
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Ein
wichtiger Aspekt der Chemie von Carotinoiden beinhaltet "Stereochemie" und "Stereoisomere". Dieses Thema wird
in jedem Universitätslehrbuch über organische
Chemie abgehandelt.
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Da
die 3- und 3'-Kohlenstoffatome
in ZX chiral sind, hat es vier mögliche
Stereoisomere. Im 3R-3'R-Isomer
weisen die 3- und 3'-Kohlenstoffatome
beide eine R-Konfiguration auf. Im 3S-3'S-Isomer weisen die 3- und 3'-Kohlenstoffatome
beide eine S-Konfiguration
auf. Der Einfachheit halber werden diese beiden Stereoisomere hierin
als R-R-Isomer und als S-S-Isomer bezeichnet.
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Das
dritte und vierte Isomer sind die beiden "Misch"- oder "Meso"-Isomere
(ein R und ein S): das 3R-3'S-Isomer
und das 3S-3'R-Isomer.
Da ZX von seinem Mittelpunkt ausgehend völlig symmetrisch ausgerichtet
ist, sind diese beiden Isomere in jeder Hinsicht identisch; wird
das 3R-3'S-Isomer
auf ein Blatt Papier gezeichnet und dieses gedreht, so erhält man das
3S-3'R-Isomer. Tatsächlich wird
durch die S-R- und
R-S-Isomere ein einziges "Meso"-Isomer gebildet.
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Werden
Standardverfahren der chemischen Synthese zur Herstellung ZX eingesetzt,
so ist jedes der vier möglichen
Isomere als etwa 25 % der Gesamtmenge gegenwärtig. Da aber die S-R- und
R-S-Isomere tatsächlich
identisch sind, macht ihr "Meso"-Isomer etwa 50 % der Gesamtmenge aus,
währen
die R-R- und S-S-Isomere zu jeweils 25 % gegenwärtig sind. Ein Gemisch aus
allen drei Stereoisomeren wird als "racemisches" Gemisch bezeichnet.
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Die
Zell- und Enzymspezifität
von Carotinoiden im Netzhautgewebe ist jedoch höchst präzise, und verschiedene Isomere
oder Stereoisomere sind nicht austauschbar. Lutein und ZX werden
von den Netzhautzellen als völlig
andere und unterschiedliche Moleküle behandelt, obwohl sie in
der herkömmlichen
chemischen Terminologie als Isomere voneinander betrachtet werden
(da sie gleiche Anzahl an Kohlenstoffatomen, Wasserstoffatomen und
Sauerstoffatomen aufweisen).
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Aufgrund
von chemischen Faktoren sind Stereoisomere die hierin einzig relevanten
Isomere. Jeder Verweis auf ein "Isomer" von Zeaxanthin bezieht
sich hierin auf ein bestimmtes Stereoisomer von ZX und schließt Lutein
nicht ein. Lutein und ZX werden als völlig unterschiedliche Carotinoide
betrachtet.
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Stereoisomerische
Unterschiede bei Carotinoiden sind, auch wenn sie klein, subtil
und unbedeutend erscheinen mögen,
in Wahrheit von größter Bedeutung,
wenn es um das Netzhautgewebe geht. Anscheinend ist das R-R-Isomer
(das 3R-3'R-Stereoisomer)
das einzige ZX-Stereoisomer, das von menschlichen Netzhautzellen
richtig aufgenommen und verwendet wird.
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Es
gab Berichte darüber,
dass Spuren des Meso-(R-S-)Isomers von ZX in Netzhautgewebe gefunden worden
sind. Diese Spurenmengen sind jedoch bestimmten molekularen Umwandlungen,
die unter gewissen Bedingungen spontan auftreten können, zuzuschreiben,
die zur Bildung von Meso-Zeaxanthin aus Luteinvorläufern führen (Bone
et al., 1993 und 1994).
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Im
Labor können
die ZX-Stereoisomere unter Verwendung von Verfahren, wie beispielsweise
chirale Säulenchromatographie
(Bone et al., 1993) oder Zirkulardichroismus-Analyse (Britton, 1994),
voneinander unterschieden werden.
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Zeaxanthin
und Lutein in der Makula
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Um
1970 war die Rolle von Carotinoiden im Schutz von Pflanzen vor phototoxischen
Schäden
wohl bekannt. Ebenfalls bekannt war, dass Carotinoide in tierischem
Gewebe gegenwärtig
sind und dass alle Carotinoide in Tieren ursprünglich pflanzlicher Herkunft
sind, da Tiere Carotinoide nicht selbst herstellen können. Auf
der Grundlage dieses Wissens wiesen verschiedene Artikel auf die Ähnlichkeiten
zwischen Carotinoiden in Tieren und Pflanzen hin und zogen den Schluss,
dass Carotinoide Schutz vor phototoxischen Schäden bei Tieren bieten.
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Nachdem
die lichtschützende
Rolle von Carotinoiden bei Tieren erkannt worden war, begannen Forscher
die Chemie und die Rolle von Carotinoiden in der Netzhaut zu untersuchen.
Eine Versuchsreihe beinhaltete Tests, bei denen Labortiere mit Futter
ohne Gehalt von Carotinoiden, das aus Körnern oder Samen ohne Carotinoidgehalt
hergestellt worden war (wie beispielsweise Milo-Samen), gefüttert wurden.
Die Ergebnisse zeigten auf, dass die Netzhaut von Labortieren, denen
Carotinoid entzogen worden war, keine gelben Makula-Zonen ausbildete
und dass die Netzhaut anormal hohe Werte an weichen Drusen aufwies,
was auf eine Netzhautschädigung
hinweist (Malinow et al., 1980, Kirschfeld, 1982, Ham et al., 1984,
und Snodderly et al., 1984). Angesichts dieser Erkenntnisse schlugen
die Forscher vor, dass Carotinoide für eine gesunde Netzhaut von
essentieller Bedeutung sind. Diese Forscher sammelten Beweise auf
molekularer Ebene, die die alte Binsenweisheit, dass Karotten und
grünes
Blattgemüse
gut für
die Augen sind, stützen.
Jedoch wussten die Forscher noch nicht, ob die Gelbpigmente in der
Makula in fertiger Form eingenommen wer den mussten oder ob sie durch
Einsatz von anderen Vorläufern,
wie beispielsweise β-Carotin
oder Lycopin, von Tieren selbst hergestellt werden können.
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Lutein
wurde 1949 als eines der Gelbpigmente in der Makula identifiziert
(Wald, 1949). ZX wurde, genauso wie die anderen Makula-Pigmente,
erst viele Jahre später
identifiziert (Bone et al., 1985). Artikel, die den Wissensstand über Makula-Pigmente
Mitte oder Ende der 1980er zusammenfassen, sind unter anderem Handelman
und Dratz, 1986, Werner et al., 1987, Pease et al., 1987, Haegerstrom-Portnoy,
1988, und Handelman et al., 1988. Neben anderen Dingen wurde in
diesen Artikeln festgestellt, dass ZX (das zur Gänze konjugiert ist und somit
einen etwas besseren Schutz vor Schäden durch Lichtenergie bietet
als Lutein) das vorherrschende Pigment in der Fovea, einer kleinen
Region im Zentrum der Makula, ist. Die Menge an ZX nimmt schrittweise
ab, während
die Menge an Lutein zunimmt, wenn man sich konzentrisch von der
Fovea weg in Richtung Außenrand
der Makula bewegt, sodass im äußeren Randbereich
der Makula Lutein als Gelbpigment vorherrscht. Artikel aus jüngerer Zeit,
die sich mit verschiedenen Aspekten der Netzhautalterung und -schädigung auseinandersetzen
und sich in erster Linie auf Carotinoide als schützende Wirkstoffe in der Netzhaut
konzentrieren, schließen
Sperduto et al., 1990, Gerster, 1991, Schalch, 1992, und Seddon
et al., 1994, ein.
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Zusammenfassend
gesagt ist nunmehr seit über
10 Jahren bekannt, dass Lutein und ZX die zwei Pigmente in der Makula
sind, und Wissenschaftler stellen seit über einem Jahrzehnt Überlegungen
darüber
an, dass diese Pigment helfen könnten,
die Makula vor phototoxischer Schädigung zu schützen.
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Obwohl
diese Entdeckungen und Annahmen alle vor mehr als 10 Jahren gemacht
wurden, hat bisher noch niemand irgendeine Art von Arzneimittel,
Nahrungsmittelergänzung
oder sonstige Form der Behandlung entwickelt, deren Wirkung als
deutlich der schrittweisen Makuladegeneration vorbeugend oder verzögernd (geschweige
denn heilend) bekannt ist.
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Die
vorige Aussage muss etwas eingeschränkt werden, da von β-Carotin,
Vitamin A und Vitamin E bekannt ist, dass sie einen bestimmten Grad
an positiver Wirkung haben, die den Schutz des Netzhautgewebes unterstützt (vgl.
beispielsweise das U.S.-Patent
Nr. 5.310.764, Baranowitz et al., 1994, und die zwei nachstehend
angeführten
Artikel der Eye Disease Case Control Study Group). Diese Patentschriften
und Artikel beanspruchten oder vermuteten, dass β-Carotin, Vitamin A und Vitamin
E eine nachweisbare Wirkung zur Verhinderung oder Verringerung von
mit Makuladegeneration in Zusammenhang stehenden Schäden ausüben.
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Derartige
Behauptungen mögen
zwar aufgrund der allgemeinen oxidationshemmenden Rolle von Carotinoiden,
Vitamin A und Vitamin E der Wahrheit entsprechen, doch ist es ebenfalls
traurig aber wahr, dass die von β-Carotin,
Vitamin A und Vitamin E bereitgestellten positiven Wirkungen auf
die Netzhaut sehr eingeschränkt
und für
eine wirksame Behandlung nicht ausreichend hoch sind. In allen Belangen
der Praxis kann Makuladegeneration nicht vorgebeugt oder aufgehalten
werden, und sie ist irreversibel. Jedwedes Breitband-Antioxidans
(wie beispielsweise β-Carotin,
Vitamin A und Vitamin E) ist ein rein palliatives Mittel. Da nichts
wirklich Wirksames erhältlich
war, wurden diese Vitamine (mit sehr eingeschränktem und unbefriedigendem
Erfolg) eingesetzt, um zu versuchen, die unaufhaltsame, durch Makuladegeneration
herbeigeführte
Schädigung
zu verlangsamen.
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Als
Tatsache, die den Stand der Technik betrifft, sollte angemerkt werden,
dass zahlreiche Reformkostläden
Carotinoidpräparate
führen,
die als gut für
Augen und Sehvermögen
etikettiert sind. Diese Aussage auf Etiketten von Carotinoidgemischen
mag sinnvoll sein, da (wie zuvor festgehalten) der Nutzen von β-Carotin und
Vitamin A als allgemeine Antioxidantien bekannt ist. Keines der
handelsüblichen
Carotinoidgemische enthält
mehr als äußerst geringe "Spurenmengen" von ZX. Die große Mehrheit
der Carotinoide in den Carotinoidgemischen, die in Reformkostläden angeboten
werden, sind Nicht-Zeaxanthin-Carotinoide (hauptsächlich β-Carotin
und Vitamin A).
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Die
Standpunkte und Forschungsziele mehrerer wichtiger Regierungsbehörden und
Forschungsgemeinschaften sind ebenfalls einen genaueren Blick wert.
In den Vereinigten Staaten von Amerika veröffentlichte das National Institute
of Health (das durch das National Eye Institute (NEI) und den National
Eye Council agierte) kürzlich
zwei Berichte mit dem Titel "Vision
Research: A National Plan 1994 – 1998", NIH-Publikation Nr.
93–3186
(1994; vgl. insbesondere Seite 55 – 65) und "Age Related Eye Disease Study", NIH-Publikation Nr.
932910 (1993). Beide Publikationen sowie die darin beschriebenen
Forschungen konzentrieren sich auf β-Carotin (und nicht ZX) als
jene Verbindung, die für
die Behandlung von AMD am vielversprechendsten ist. Nach bestem
Wissen und Gewissen der Anmelder sind, nach Erörterung des Themas mit Bediensteten
des NEI, weder das NEI noch eine andere, mit dem National Institute
of Health in Verbindung stehende Organisation bereit, Forschungsvorhaben über Zeaxanthin
als potentielle Behandlung von AMD zu finanzieren oder haben dies
in letzter Zeit getan. Statt dessen wenden das NIH und andere, mit
Steuern finanzierte Organisationen Millionen von Dollar auf, um
Forschungen über β-Carotin
als das vielversprechendste Kandidatenmittel zur Behandlung und
Vorbeugung von AMD durchzuführen.
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Andere
bekannte Forscher, die sich Aufmerksamkeit verdienen, gehören zur "Eye Disease Case
Control Study Group".
Diese Gruppe hat kürzlich
zwei Artikel mit dem Titel "Antioxidant
Status and Neovascular Age-Related Macular Degeneration", Arch. Ophthalmol.
11, 104 – 109
(1993), und "Risk
Factors for Neovascular Age-Related Macular Degeneration", Arch. Ophthalmol.
11, 1701 – 1708
(1992), veröffentlicht.
So wie in den offiziellen NIH-Berichten wird in keinem dieser Artikel
die Verwendung von Zeaxanthin als Arzneimittel zur Behandlung von
AMD gelehrt oder vorgeschlagen, und diese Forschungsgemeinschaft
hat ebenso die Finanzierung von jedwedem Forschungsvorhaben über ZX als
möglichen
Wirkstoff in der Behandlung oder Vorbeugung von AMD abgelehnt oder
verweigert.
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Auch
sollte angemerkt werden, dass großes Interesse an Carotinoiden
in der Behandlung oder Vorbeugung von Krebs (beginnend mit Peto
et al., 1981) sowie in der Vorbeugung von Cholesterinbildung und
Reduzierung von Plaqueablagerungen in Arterien (Jialal et al., 1991)
besteht. Es gibt einen enormen Bestand an wissenschaftlicher Literatur über die
verschiedenen Wirkungen von Carotinoiden, und es bestand großes Interesse
an der chemischen Synthese von Carotinoiden, einschließlich von
Lutein und ZX. Trotz all dieser Carotinoid-Studien und Synthesebemühungen der
letzen Jahrzehnte konnte noch niemand von einem wirksamen Verfahren
zur Behandlung oder Vorbeugung von Makuladegeneration berichten.
Angesichts der gewaltigen Kosten und des Leids, das den Patienten
und der Gesellschaft durch Makuladegeneration zugefügt wird,
handelt es sich hierbei um ein großes Problem, das angegangen
werden muss.
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Demgemäß stellt
die Erfindung einen möglicherweise
wichtigen Durchbruch in der Bereitstellung eines (1) sicheren und
wirksamen Arzneimittels zur Behandlung von Patienten, bei denen
Makuladegeneration diagnostiziert wurde, und einer (2) mit einer
Vitaminpille vergleichbaren Nahrungsmittelergänzung, die jeder, der das Risiko
der Erkrankung an Makuladegeneration nach dem Erreichen oder Überschreiten
der ersten Lebenshälfte
reduzieren möchte,
einnehmen kann, dar.
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Synthese von Lutein und
Zeaxanthin: Stand der Technik
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Verschiedene
Publikationen nach dem Stand der Technik beschreiben Verfahren zur
Bildung von ZX. Diese Publikationen können in zwei Kategorien eingeteilt
werden: Fermentationsverfahren, in denen Mikroben eine Schlüsselrolle
im Herstellungsverfahren spielen; und Nicht-Fermentations-Syntheseverfahren,
in denen ausschließlich
chemische Reaktionen eingesetzt werden. Die meisten Publikationen
nach dem Stand der Technik schlugen die Verwendung von ZX für bekannte
Zwecke vor, wie beispielsweise als Zusätze in Geflügel- oder Fischfutter, um die
Farbe des Fleischs dunkler und somit attraktiver zu machen. Es scheint,
dass keine dieser Bemühungen
zur Produktion oder Verkauf von ZX in wirtschaftlichen Mengen führte.
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Bis
Oktober 1995 bestand die einzige Möglichkeit des Erwerbs von ZX,
entweder in gereinigter Form oder in semikonzentrierter Form, in
der ZX mehr als etwa 5 Gew.-% ausmacht, darin, Milligramm-Mengen
von Unternehmen für
chemische Spezialartikel, wie beispielsweise Atomergic Chemicals
Corporation (Farmingdale, NY) oder Spectrum Chemicals Manufacturing
Company (Gardena, CA) zu kaufen. 1995 beliefen sich die Preise dieser
Spezialartikelhersteller für
gereinigtes ZX in synthetischen racemischen Gemischen, die die unerwünschten
S-S-Isomere und S-R-Isomere
enthalten, auf etwa $ 90 bis $ 125 pro Milligramm. Dies ergibt einen
Betrag von etwa 100.000 Dollar (U.S.-Währung) pro Gramm von ZX in
einem racemischen Gemisch. Es versteht sich von selbst, dass diese
Präparate,
sowohl aufgrund ihres Preises als auch weil sie große Mengen an
unerwünschten
und potentiell gefährlichen
S-S- und Meso-Isomeren enthalten, kein realistisches Potential für die Verwendung
als Arzneimittel oder Nahrungsergänzungen haben. Vor dieser Erfindung
ist gereinigtes oder halbgereinigtes R-R-Zeaxanthin schlicht und
einfach in keiner Form für
die Öffentlichkeit
nicht erhältlich.
-
Publikationen
nach dem Stand der Technik, die die ZX-Herstellung unter Einsatz
von mikrobieller Fermentation beschreiben, umfassen:
- (1) Courington und Goodwin, 1955, der erste bekannte Literaturhinweis,
der die ZX-Herstellung
durch Bakterien der Gattung Flavobacter beschreibt.
- (2) das U.S.-Patent Nr. 3.891.504 (Schocher und Wiss, 1975, übertragen
an Hoffmann LaRoche), das ebenfalls die ZX-Herstellung durch Flavobacter-Zellen
beschreibt. Diese ZX enthaltenden Zellen wurden an Hühner verfüttert und
sorgten für
eine geeignete Färbung.
- (3) das U.S.-Patent Nr. 3.841.967 (Dasek et al., 1974) und das
U.S.-Patent Nr. 3.951.743 (Shepherd et al., 1976). Beide wurden
an Nestlé überfragen.
Sie beschreiben Verfahren und Nährstoffe,
die zur Steigerung der von den Bakterien erzeugten Menge an ZX eingesetzt
werden könnten.
- (4) zwei jüngere
U.S.-Patente (Nr. 5.308.759 und 5.427.783, beide von Gierhart erfunden).
Diese Patente beschreiben einen Bakterienstamm (Flavobacterium multivo rum),
der aus einem Kanal des Missouri isoliert wurde. Es wurde entdeckt,
dass diese Bakterien ZX bilden, ohne wesentliche Mengen an anderen
Carotinoiden zu produzieren. Im Kontext von Geflügel- und Fischfutter, um Fleisch
und Dotter eine dunklere Farbe zu verleihen, war dies von Bedeutung,
da Carotinoide, nachdem sie von einem Tier gefressen worden sind, um
die Aufnahme in den Blutkreislauf konkurrieren. Demgemäß könnte die
Abwesenheit anderer Carotinoide im von Gierhart identifizierten
Bakterienstamm F. multivorum mehr ZX als Pigment für das tierische
Gewebe verfügbar
machen, wodurch dessen Wirkung und Leistung gesteigert würde.
-
Das '759-Patent beansprucht
Verfahren zur Herstellung von ZX für Geflügel- oder Fischfutter unter Verwendung
des Bakterienstamms F. multivorum. Das '783-Patent, ein Ausscheidungspatent,
beansprucht die Futtermischungen. Beide Patente sind auf die Verwendung
von ZX in Geflügel-
oder Fischfutter eingeschränkt, und
keines schlägt
irgend etwas im Bereich der Verwendung von ZX zur Behandlung von
Menschen vor.
-
Keines
der Gierhart-Patente kommentiert spezifische Stereisomere von ZX,
und dies aus zwei Gründen:
(1) Der Zustand der von den F.-multivorum-Zellen erzeugten ZX-Stereoisomere war
1989, als die Anmeldung eingereicht wurde, noch nicht bekannt, und
(2) es gab keinen augenscheinlichen Grund, sich mit verschiedenen
Stereoisomeren auseinanderzusetzen, da die Patente ausschließlich die
Bildung von ZX zur Verwendung in Geflügel- oder Fischfutter betrafen.
-
Der
Wildtyp-Bakterienstamm F. multivorum wurde bei der ATCC hinterlegt
und mit der ATCC-Zugriffsnummer 55238 versehen. Da diese Bakterien
eine bestimmte, als Sphingolipide bezeichnete Art von Lipiden generieren,
wurden diese Bakterien von der ATCC als Sphingobacterium multivorum
neu klassifiziert und sind in ihrem Katalog unter diesem Namen angeführt. Die
Bezeichnung Sphingobacterium, die im ATCC-Katalog aufscheint, ist
bisher in keinem der Referenzwerke, die als die offiziellen Leitfäden zur
mikrobiellen Taxonomie gelten, verwendet worden: Bergy's Manual of Systematic
Bacteriology, das als Anhang des International Journal of Systematic
Bacteriology erscheint und von diesem auf den neuesten Stand gebracht
wird.
-
Es
wurde im Laufe der letzten 20 Jahre von Bemühungen, ZX durch chemische
Standard-Syntheseverfahren (ohne Verwendung von Mikroben) herzustellen,
berichtet, unter anderem in den U.S.-Patenten Nr. 4.153.615 (Saucy,
1979), Nr. 4.952.716 (Lukac et al., 1990) und Nr. 5.227.507 (Lukac
et al., 1993). Diese Verfahren jedoch weisen jedoch ernst zu nehmende
Nachteile auf. Üblicherweise
bedürfen
sie zahlreicher Verfahrensschritte, und jeder Schritt wirft eine
Ausbeute von unter 100 % ab, sodass die endgültige ZX-Ausbeute des mehrstufigen
Verfahrens relativ gering ist. Zudem werden bei der chemischen Synthese üblicherweise
unerwünschte
S-S- und S-R-Stereoisomere von ZX sowie verschiedene Umwandlungs-
und Abbauprodukte erhalten, wie beispielsweise oxidiertes Zeaxanthin,
und die Zeaxanthinmoleküle
haben eine oder mehrere der Doppelbindungen im unverzweigten Abschnitt
und/oder den Endringen verloren.
-
Zusammenfassend
war vor dieser Erfindung keine für
den menschlichen Konsum geeignete Quelle von gereinigtem R-R-Zeaxanthin
bekannt, weder als Arzneimittel noch als Nahrungsmittelergänzung.
-
Wie
nachstehend beschrieben wird, können
der F.-multivorum-Stamm (ATCC-Zugriffsnummer 55238) und dessen mutagenisierte
Abkömmlinge
zur Bildung des R-R-Stereoisomers
von ZX als einziges nachweisbares Isomer, ohne nachweisbare Mengen
an unerwünschten
S-S- oder S-R-Stereoisomeren, verwendet werden, um dieses in einigen
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung einzusetzen.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Folgendes bereitgestellt:
die Verwendung des 3R-3'R-Stereoisomers
von Zeaxanthin in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung
von Makuladegeneration beim Menschen, worin zumindest 90 % aller
Zeaxanthinmoleküle
im Arzneimittel 3R-3'R-Stereoisomere
von Zeaxanthin sind und das Arzneimittel in Dosierungsform vorliegt
und zumindest 3 mg des 3R-3'R-Stereoisomers
von Zeaxanthin pro Dosis enthält.
-
In
einem zweiten Aspekt wird Folgendes bereitgestellt: die Verwendung
des 3R-3'R-Stereoisomers von
Zeaxanthin in der Herstellung eines Arzneimittels oder einer Nahrungsmittelergänzung zur
Vorbeugung von Makuladegeneration beim Menschen, worin zumindest
90 % aller Zeaxanthinmoleküle
im Arzneimittel oder in der Nahrungsmittelergänzung 3R-3'R-Stereoisomere von Zeaxanthin sind
und das Arzneimittel oder die Nahrungsmittelergänzung in Dosierungsform vorliegt
und zumindest 0,5 mg des 3R-3'R-Stereoisomers von
Zeaxanthin pro Dosis enthält.
-
Dem
Patienten kann, muss aber nicht notwendigerweise, Makuladegeneration
diagnostiziert worden sein. Der Patient kann auch eine erhöhte genetisch
bedingte Anfälligkeit
für Makuladegeneration
aufweisen und/oder gegebenenfalls unter einer/einem aus Stargardt-Syndrom,
Best-Krankheit, Batten-Syndrom, Sjögren-Larsson-Syndrom, Stäbchen-Zapfen-Dystrophie,
oviner Ceroid-Lipofuszinose oder einer Erkrankung leiden, die lysosomale
Speicherungsprobleme involviert. Insbesondere kann das Arzneimittel
oder die Nahrungsergänzung
zur Behandlung von altersbedingter Makuladegeneration oder vorbeugend – d.h. zur
Senkung des zukünftiges
Risikos von altersbedingter Makuladegeneration oder einer anderen
Form von Makuladegeneration – eingesetzt
werden. Nahrungsmittergänzungen,
die das 3R-3'R-Stereoisomer
von Zeaxanthin in einer zur oralen Einnahme durch Menschen geeigneter
Form enthalten, sind besonders geeignet, um das Risiko von Makuladegeneration
zu senken.
-
Im
Allgemeinen kann das Arzneimittel oder die Nahrungsmittelergänzung ein
Verdünnungsmittel
oder eine Trägersubstanz
umfassen, die zur Verabreichung an Menschen geeignet ist. Im Falle
von Nahrungsmittelergänzungen
ist das Verdünnungsmittel
oder eine Trägersubstanz
gegebenenfalls eine) solche(s), das zur oralen Einnahme von Menschen
geeignet ist.
-
Das
Arzneimittel liegt im Allgemeinen so vor, dass eine ausreichende
Menge des 3R-3'R-Stereoisomers
dem Patienten verabreicht werden kann, um eine therapeutische Wirkung
für einen
unter Makuladegeneration leidenden Menschen bereitzustellen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des ersten Aspekts der Erfindung wird Zeaxanthin in der Herstellung
einer Arzneimittels in Form von Dosierungseinheiten verwendet, die
zumindest 10 mg des 3R-3'R-Stereoisomers
von Zeaxanthin enthalten. Wird Zeaxanthin zur Reduzierung des zukünftigen
Risikos von altersbedingter oder anderer Makuladegeneration beim
Menschen gemäß dem zweiten
Aspekt eingesetzt, so kann es beispielsweise in der Herstellung
einer Nahrungsmittelergänzung,
z.B. zur gelegentlichen oder regelmäßigen oralen Einnahme, eingesetzt
werden, wobei die Nahrungsmittelergänzung zumindest 0,5 mg des
3R-3'R-Stereoisomers
von Zeaxanthin pro Dosis enthält.
-
Dosierungsformen,
die gemäß dem ersten
oder zweiten Aspekt der Erfindung hergestellt sind, enthalten vorzugsweise
einen physiologisch annehmbaren Exzipienten, Verdünnungsmittel
oder Träger.
Unter "physiologisch
annehmbar" ist insbesondere
zu verstehen, dass der Exzipient, das Verdünnungsmittel oder der Träger zur
Verabreichung an Menschen geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Zusammensetzung ist das Verdünnungsmittel
oder Träger
zur oralen Einnahme durch einen Menschen geeignet oder auf diese
ausgerichtet, und die Zusammensetzung enthält das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin in einer
Menge, die zur Verwendung in der Behandlung oder Vorbeugung von
Makuladegeneration bei Menschen therapeutisch wirksam ist.
-
Das
3R-3'R-Stereoisomer
von Zeaxanthin macht zumindest 90 %, besonders bevorzugt zumindest
95 %, der Gesamtmenge an Zeaxanthin aus, während die S-S- und S-R-Stereoisomere
weniger als 10 %, insbesondere weniger als 5 %, der Gesamtmenge
an Zeaxanthin in der Dosierungsform ausmachen. Im Besonderen umfasst
die Dosierungsform gegebenenfalls im Wesentlichen keine S-S- und
R-S-Stereoisomere. Beispielsweise ist 3R-3'R-Zeaxanthin gegebenenfalls das einzige
nachweisbar gegenwärtige
Stereoisomer von Zeaxanthin.
-
Zudem
wird bevorzugt, dass 3R-3'R-Zeaxanthin
zumindest 90 % der gesamten Carotinoide in der Dosierungsform ausmachen.
Dies wird deshalb bevorzugt, weil andere Carotinoide gegebenenfalls
mit Zeaxanthin um die Nahrungsaufnahme oder Gewebeeinlagerung nach
der Einnahme konkurrieren.
-
In
einigen Ausführungsformen
weist das 3R-3'R-Stereoisomer
von Zeaxanthin eine Schutzhülle
zur Reduktion des Abbaus des Zeaxanthins durch Magensäure auf.
-
Bevorzugte
Ausführungsformen
der nach dem ersten oder zweiten Aspekt hergestellten Dosierungsform
enthalten zumindest 1 Gew.-%, vorzugsweise zumindest 2 Gew.-%, noch
bevorzugter zumindest 5 Gew.-%, Zeaxanthin (wünschenswerterweise 3R-3'R-Zeaxanthin).
-
In
einigen Ausführungsformen
enthält
die hergestellte Dosierungsform gegebenenfalls apathogene Mikrobenzellen,
die das 3R-3'R-Stereoisomer
von Zeaxanthin in einer Konzentration von zumindest 2 Gew.-% als
Fraktion der Mikrobenzellmasse enthalten.
-
Ist
die Dosierungsform zur Verwendung als ein Nahrungsmittelergänzung ausgerichtet,
so ist Inkorporierung eines aus Nahrungsmittelsubstanzen, die zur
Einnahme durch einen Menschen geeignet oder darauf ausgerichtet
sind, ausgewählten
Trägers
gegebenenfalls wünschenswert.
-
Das
im ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung eingesetzte 3R-3'R-Stereoisomer von
Zeaxanthin kann durch Kultivieren von Zellen, die das 3R-3'R-Stereoisomer von
Zeaxanthin in einem Ausmaß von
zumindest 90 % aller von den Zellen synthetisierten Carotinoidmoleküle synthetisieren,
in einem flüssigen
Nährstoffmedium
unter Bedingungen, die die Zeaxanthinsynthese fördern, hergestellt werden.
Die Zellen sind vorzugsweise solche, die dieses Stereoisomer als
einziges nachweisbares Isomer synthetisieren. Es sind dies gegebenenfalls
Bakterienzellen, die Abkömmlinge
des Flavobacterium-multivorum-Stamms mit der ATCC-Nr. 55238 sind.
Alternativ dazu sind die Zellen gegebenenfalls genmanipuliert, um
zumindest ein Zeaxanthin-Synthesegen zu enthalten, das eine aus
Zellen, die Abkömmlinge
des Flavobacteriummultivorum-Stamms mit der ATCC-Nr. 55238 sind,
gewonnene DNA-Sequenz enthaften.
-
Bakterienzellen
des Stamms der Flavobacterium-multivorum-Zellen (ATCC-Zugriffsnummer
55238) bilden keine nachweisbaren Mengen an unerwünschten
S-S- oder S-R-Stereoisomeren und synthetisieren keine signifikanten
Mengen an anderen Carotinoiden, wie beispielsweise β-Carotin
oder Lutein, die mit ZX um die Nahrungsaufnahme nach der Einnahme
konkurrieren könnten.
Nach der Synthese unter Verwendung dieser Bakterien kann ZX durch
Verfahren, wie beispielsweise Lösungsmittelextraktion,
gereinigt werden und entweder als Arzneimittel von Patienten, die
unter Makuladegeneration leiden, oder als Nahrungsmittelergänzung von
jedem, der sein Risiko der Erkrankung an altersbedingter Makuladegeneration,
die bei Menschen über
50 oder 60 Jahren weit verbreitet ist, senken möchte, oral eingenommen werden.
Praktische Einnahmeformulierungen sind ebenfalls offenbart, wie
beispielsweise (1) wasserdichte Kapseln, die R-R-Zeaxanthin gemischt mit
einem Träger,
wie beispielsweise Pflanzenöl,
enthalten; (2) verschiedene Lebensmittel (wie beispielsweise Margarine,
Milchprodukte, Sirup, Keksteig und Fleischprodukte, die nicht stark
gekocht werden), die R-R-Zeaxanthin als Zusatzstoff enthalten; und
(3) Granulat-Formulierungen,
die Suppen, Salaten, Getränken
oder anderen Nahrungsmitteln zugemischt werden können.
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Tablette oder Kapsel
bereit, die das 3R-3'R-Stereoisomer
von Zeaxanthin und eine physiologisch annehmbaren Träger umfasst,
worin das 3R-3'R-Stereoisomer von
Zeaxanthin zumindest 90 % des gesamten Zeaxanthin in der Tablette
oder Kapsel ausmacht.
-
Vorzugsweise
enthält
die Tablette oder Kapsel dieses Aspekts der Erfindung zumindest
3 mg des 3-3'R-Stereoisomers
von Zeaxanthin.
-
KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung werden nachstehend ausschließlich als Beispiele und unter
Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen beschrieben, in denen:
-
in 1 die
molekulare Struktur von β-Carotin,
Lutein und Zeaxanthin abgebildet ist und die Struktur aller 3 Carotinoide
sowie das Nummerierungssystem für
die Endringe gezeigt wird; diese Strukturen sind nach dem Stand
der Technik bekannt;
-
2 ein
Ablaufdiagramm umfasst, das die Schritte des Fermentierens und Reinigens
von ZX, hergestellt von Mikroben, die stereoisomerisch reines 3R-3'R-Zeaxanthin synthetisieren,
beschreibt.
-
BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Diese
Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels
oder einer Nahrungsmittelformulierung zur Verabreichung an Menschen,
um Makuladegeneration, eine Krankheit, die das Sehvermögen beeinträchtigt und
zur Erblindung führen
kann, vorzubeugen oder zu behandeln. Zeaxanthinpräparate,
die auf die Einnahme durch Menschen ausgerichtet sind, sollten das
3R-3'R-Stereoisomer
von ZX (aus praktischen Gründen
auch als R-R-Isomer oder R-R-Zeaxanthin bezeichnet) als "stark dominantes". Isomer enthalten.
So wie hierin definiert bezieht sich "stark dominantes Isomer" auf ein Präparat, das
zumindest 90 % oder mehr an R-R-Isomer enthält, wobei die unerwünschten
S-S- oder S-R-Isomere weniger als 10 % des gesamten Zeaxanthins
im Präparat
ausmachen. Vorzugsweise sollten Präparate zur Verwendung beim
Menschen das R-R-Isomer von ZX als einziges nachweisbares Isomer
und keine nachweisbaren Mengen an unerwünschten S-S- oder S-R-Isomeren
enthalten. Derartige Präparate
sind hierin offenbart.
-
Vor
kurzem wurde unter Verwendung von chiraler Säulenchromatographie (so wie
in Bone et al., 1993, beschrieben) entdeckt, dass die Zellen des
F.-multivorum-Stamms (ATCC-Zugriffsnummer 55238) das R-R-Isomer
als einziges nachweisbares ZX-Isomer bilden, wenn diese so wie in
den Beispielen beschrieben fermentiert werden. Wie in Beispiel 4
beschrieben wies die von Prof. Landrum durchgeführte Analyse darauf hin, dass
keine nachweisbaren Mengen des S-S-Isomers oder des R-S-Meso-Isomers in dem durch
die Fermentierung der Zellen des F.-multivorum-Stamms gebildeten
ZX-Präparat
gegenwärtig
waren.
-
Unterschiede
zwischen den R-R-, R-S- oder S-S-Isomeren von Zeaxanthin sind von
großer
Bedeutung, wenn ZX-Präparate
als Medikament oder als Nahrungsmittelergänzung an Menschen verabreicht
werden, da das einzige in der menschlichen Netzhaut natürlich auftretende
ZX-Isomer das R-R-Isomer ist. Es wird angenommen, dass die Einnahme
von signifikanten Mengen von R-S- und S-S-Isomeren medizinisch gesehen nicht
wünschenswert
und schädlich
ist, da (1) die R-S- und S-S-Isomere in der menschlichen Netzhaut
natürlich
nicht auftreten, außer
möglicherweise
in extrem geringen Spurenmengen, die als Nebenprodukte beim Abbau
von Lutein im Inneren der Netzhautzellen gebildet werden, und (2)
die R-S- und S-S-Isomere gegebenenfalls das gewünschte R-R-Isomer kompetitiv
im Netzhautgewebe verdrängt,
was möglicherweise
zu ernsthaften Langzeit-Zellschädigungen
und medizinischen Komplikationen führen kann.
-
Die
stereoisomerische Reinheit von ZX-Präparaten, die durch die hierin
offenbarte Fermentierung des F.-multivorum-Stamms hergestellt werden,
ist von großem
Wert, da es äußerst schwierig
und kostspielig ist, Stereoisomere nach der chemischen Synthese
von ZX zu trennen. Obwohl die Trennung der Stereoisomere im Labormaßstab möglich ist,
sind die Kosten für
wirtschaftliche Mengen untragbar.
-
Verwendung
als verschreibungspflichtiges Arzneimittel für AMD-Patienten
-
In
einem Aspekt der Erfindung kann das hierin offenbarte R-R-Zeaxanthin-Präparat als
Arzneimittel formuliert und verabreicht werden, d.h. als Medikament,
das Ärzte
zur Behandlung von Patienten, denen Makuladegeneration diagnostiziert
wurde oder die unter einer Krankheit leiden, die zu Makuladegeneration
als Symptom oder Erscheinungsform führen kann, wie beispielsweise
das Stargardt-Syndrom, die Best-Krankheit, das
Batten-Syndrom, das Sjögren-Larsson-Syndrom,
die Stäbchen-Zapfen-Dystrophie,
ovine Ceroid-Lipofuszinose oder eine Lysosom-Speicherkrankheit,
wie beispielsweise das Tay-Sach-Syndrom, verschreiben können.
-
Wird
ein ZX-Präparat
zu einer derartigen Behandlung eingesetzt, so muss eine ausreichende
Menge des R-R-Isomers von ZX, um auf den Wert eines therapeutischen
Mittels zu gelangen, in einer Trägersubstanz oder
-form (beispielsweise als eine Kapsel) enthalten sein, die zur Verabreichung
an Menschen, so wie in der Folge beschrieben, geeignet ist. In einer
bevorzugten Ausführungsform
ist das ZX zur medizinischen Behandlung in Dosierungseinheitsform
verpackt, wie beispielsweise als Tabletten oder Kapseln. Jede Dosis
sollte zumindest 3 mg R-R-Zeaxanthin und, falls gewünscht, zur
besseren therapeutischen Wirksamkeit gegebenenfalls Zeaxanthin in
einem Bereich von 3 mg bis 10 mg Zeaxanthin enthalten.
-
In
einem weiteren Aspekt dieser Erfindung kann das hierin offenbarte
R-R-Zeaxanthin-Präparat
als vorbeugendes Medikament für
Patienten, denen eine erhöhte
Anfälligkeit
für Makuladegeneration,
beispielsweise aufgrund der Familien-Krankengeschichte oder der
genetischen Diagnose einer der obgenannten Krankheiten, diagnostiziert
wurde, formuliert und verabreicht werden. Dosierungseinheiten, die
zur Verabreichung an solche Patienten, die ein erhöhtes AMD-Risiko
aufweisen, jedoch noch nicht an AMD leiden, hergestellt werden,
enthalten gegebenenfalls kleinere Mengen, wie beispielsweise 2 mg
pro Dosis.
-
Eine
jede dieser Dosen kann mit wirtschaftlich angemessenem Kostenaufwand
unter Einsatz der hierin beschriebenen Offenbarungen bereitgestellt
werden. Kapseln, die 25 mg (oder eine geringere Menge) in einer öligen Trägerflüssigkeit
enthalten, können
auf wirtschaftliche Weise unter Verwendung einer mikrobiellen Fermentation
gekoppelt mit einem Lösungsmittelextraktionsschritt
gebildet werden. Pulverförmige
Formulierungen, die sogar noch größere Mengen (beispielsweise
100 mg oder mehr pro Dosierung) enthalten, können ebenfalls gebildet werden,
wenn die Reinigung extensiver durchgeführt wird, beispielsweise unter
Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren.
-
Beispiel
geeigneter ZX-Formulierungen umfassen:
- (a)
eine verdaubare, wasserdichte Kapsel und ein darin enthaltenes Fluid,
worin die Kapsel und das Fluid eine Größe und eine Konzipierung für die orale
Einnahme durch einen Menschen aufweisen und pharmakologisch annehmbar
sind und worin das Fluid das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin enthält; vorzugsweise
ist das Zeaxanthin in Mizellen eingeschlossen, die durch ein Verfahren
unter Verwendung eines Gallensalzes gebildet werden; und
- (b) ein für
die orale Einnahme durch einen Menschen konzipierte Tablette, worin
die Tablette das 3R-3'R-Stereoisomer
von Zeaxanthin und ein pressbares, mit Zeaxanthin kompatibles Bindematerial
enthält,
das ein Gemisch aus Zeaxanthin und dem Bindematerial veranlasst,
die Form nach dem Pressen unter geeignetem Druck beizubehalten,
und worin die Tablette pharmakologisch annehmbar und angemessen groß ist, um
von einem Menschen oral eingenommen zu werden; wobei die Tablette
gegebenenfalls über eine
verdaubare Hüllschicht
verfügt,
die zum Schutz des Zeaxanthins vor Oxidation beiträgt.
-
Verwendung
als Vitamin oder Nahrungsmittelergänzung
-
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung kann ZX in Form von Vitamin
oder Nahrungsmittelergänzungen
oder als Lebensmittelzusatz zum Konsum durch Menschen, die derzeit
nicht an Makuladegeneration leiden, aber ihr Risiko einer Makuladegeneration
im späteren
Leben verringern wollen, hergestellt und verpackt werden. Zu diesem
Zweck eingenommen müssen
angemessene Dosen wesentlich höher
sein als die Spurenmengen in Pulvern, die heutzutage in Reformkostläden angeboten
werden, können
jedoch im Vergleich zur Verwendung von ZX als therapeutisches Arzneimittel
für Menschen,
denen AMD diagnostiziert wurde, niedriger sein. Solche Dosierungen
sollten im Bereich von 0,05 mg bis zu 5 mg pro täglich eingenommener Dosis liegen.
Eine Dosis von 0,05 bis 1,0 mg wäre
geeignet, wenn R-R-Zeaxanthin eines aus einem Dutzend oder mehr
Wirkstoffen in einer Multi-Vitaminkapsel oder -tablette ist, während eine
Dosis von 1 bis 5 mg für
rezeptfreien Verkauf an Menschen bereitgestellt werden kann, die
eine höhere
Dosierung wünschen.
-
Beispiele
für Zusammensetzungen,
die ZX als Nahrungsmittelergänzung
enthalten, umfassen:
- (c) eine auf die orale
Einnahme durch Menschen ausgerichtete Zusammensetzung, die eine
Nahrungsmittelsubstanz für
den menschlichen Konsum (üblicherweise
eine ernährungstechnisch
annehmbare und schmackhafte), die als Träger für Zeaxanthin geeignet ist,
und das 3R-3'R-Stereoisomer
von Zeaxanthin, das der Nahrungsmittelsubstanz als Nahrungsmittelzusatz
zugesetzt ist, enthält;
wobei die Nahrungsmittelsubstanz aus Margarine, Milchprodukten,
Sirup, Backwaren, Keksteig, Rührteig
für Brownies,
Fleischprodukten und Suppenzutaten ausgewählt ist; vorzugsweise ist das
Zeaxanthin in Mikrokapseln eingeschlossen und verfügt über eine
Schutzschicht, um den Abbau von Zeaxanthin durch die Magensäure zu reduzieren;
die Nahrungsmittelsubstanz umfasst gegebenenfalls eine Granulat-Formulierung,
z.B. kann sie eine salzhaltige Geschmacksstoffmischung, eine gewürzhältige Geschmacksstoffmischung,
ein Suppenzusatz, eine Backmischung oder ein Geschmackszusatz für Milch
sein; in derartigen Granulat-Formulierungen verfügt das Zeaxanthin gegebe nenfalls über eine
Schutzschicht, um den Abbau von Zeaxanthin durch die Magensäure zu reduzieren;
- (d) eine ein Nahrungsmittel zum oralen Konsum durch Menschen
umfassende Zusammensetzung, wobei das Nahrungsmittel Mikrobenzellen
umfasst, die gegebenenfalls intakt sind, die apathogen (z.B. für den Menschen)
sind und die das 3R-3'R-Stereoisomer von
Zeaxanthin in einer Konzentration von zumindest 2 Gew.-% Zeaxanthin
als Fraktion der Mikroben-Zellmasse enthält; wobei dieses Nahrungsmittel
aus Käse, Joghurt,
Milch und Bier ausgewählt
ist; und die Mikrobenzellen gegebenenfalls durch Pasteurisierung
abgetötet
worden sind.
-
Unabhängig davon,
ob es als therapeutisches Arzneimittel oder als Nahrungsmittelergänzung eingesetzt
wird, sollte das auf den menschlichen Konsum ausgerichtete ZX-Präparat das
R-R-Isomer als einziges oder als "stark dominantes Stereoisomer" von ZX enthalten.
Der Begriff "stark
dominantes Stereoisomer" wird hierin
zur Beschreibung eines ZX-Präparats
eingesetzt, in dem das gewünschte
R-R-Isomer von ZX zumindest 90 % des gesamten ZX im Gemisch ausmacht
und die unerwünschten
S-S- oder S-R-Isomere weniger als 10 % ausmachen.
-
Vorzugsweise
sollte das R-R-Isomer das einzige nachweisbare ZX-Isomer in jedwedem
auf die Einnahme durch Menschen ausgerichteten Präparat sein.
Dies wurde nun in wirtschaftlichen Mengen und mit annehmbaren Kosten
ermöglicht,
da der hierin beschriebene Bakterienstamm F. multivorum das R-R-Isomer
als einziges nachweisbares Stereoisomer von ZX bildet. Sollten S-S-
oder S-R-Isomere nach der Reinigung überhaupt im fermentierten Gemisch
gegenwärtig
sein, dann nur in Mengen, die zu gering sind, um mittels der in Beispiel
4 beschriebenen Verfahren nachgewiesen zu werden.
-
Außerdem bilden
die hierin beschriebenen F.-multivorum-Zellen im Unterschied zu
den meisten anderen Bakterienstämmen
kein Carotinoidgemisch; diese Zellen bilden R-R-Zeaxanthin als einziges
nachweisbares Carotinoid. Da ZX mit anderen Carotinoiden um die
Nahrungsaufnahme und die Gewebeeinlagerung konkurrieren muss, kann
dies für
die Steigerung der ZX-Aufnahme und der Einlagerung in die Netzhautzellen
nach der oralen Einnahme nützlich
sein, insbesondere wenn ZX als Arzneimittel zur Behandlung von diagnostizierten
Fällen
von Makuladegeneration eingesetzt wird.
-
Großtechnische
Herstellung durch Bakterienfermentation
-
Wie
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, können zur
Fermentation von Bakterien im Labor eingesetzte Verfahren äußerst kostenintensiv
und schwer steuerbar sein, wenn sie zu großen Herstellungsverfahren umgewandelt
werden. Demgemäß haben
die Anmelder verbesserte Nährstoffe
und Verfahren zur kommerziellen Verwendung mit den F.-multivorum-Zellen
entwickelt. Die Arbeit mit den verbesserten Nährstoffen und Verfahren wird
im Vergleich zu den zuvor in den U.S.-Patenten Nr. 5.308.759 und
Nr. 5.427.783 offenbarten Medien und Bedingungen einfacher und pro
Gramm an erzeugtem ZX billiger. Bevorzugte Nährstoffe und Bedingungen werden
in Beispiel 1 beschrieben.
-
Nach
der Fermentation kann eine oder mehrere stabilisierende Verbindungen,
wie beispielsweise t-Butylhydrochinon, den Zellen zugesetzt werden,
um einen Abbau des ZX während
der Reinigung zu verhindern. Stabilisatoren können zugesetzt werden, während sich
die Zellen noch im Fermantationsgefäß befinden, bevor mit der Pasteurisierung
oder einem anderen Bearbeitungsverfahren begonnen wird. Verschiedene
Kandidatenstabilisatoren wurden von Anmeldern getestet. Die besten
bisher erhaltenen Ergebnisse wurden durch Verwendung einer Kombination
aus den Beispiel 2 aufgelisteten Stabilisatoren erzielt.
-
Nach
dem Zusetzen der Stabilisatoren können die Bakterien durch Erwärmen auf
55 °C für 25 min
pasteurisiert werden, um die Bakterien abzutöten, ohne dabei das ZX zu schädigen. Die
Kultur wird daraufhin auf Raumtemperatur abgekühlt, und die Flüssigkeit
wird durch mechanische Mittel, wie beispielsweise Querstrom-Mikrofiltration,
von den Zellen entfernt. Dies kann die Konzentration der Zellen
und Feststoffe von einem Ausgangswert von etwa 10 Vol.-% auf eine
filtrierte Konzentration von etwa 60 bis 80 Vol.-% anheben. So wird eine
Zellpaste gebildet.
-
Es
besteht die Möglichkeit,
dass F.-multivorum-Zellen in intaktem und möglicherweise lebensfähigem Zustand
für die
direkte Einnahme durch Menschen geeignet sind, vergleichbar mit
anderen Lebensmitteln (Käse,
Joghurt, Bier usw.), die lebensfähige
oder abgetötete,
aber intakte Mikrobenzellen enthalten. Es gibt keine bekannte, mit
F.-multivorum-Zellen assoziierte Pathogenität. Sie wurden aus einem kalten
Wasserkanal isoliert, und da sie an ein Leben in kaltem Wasser angepasst
sind, können
sie bei den Temperaturen im menschlichen Körper nicht überleben oder sich dort gut
vermehren. Außerdem
verfügen
diese Zellen über
keine bekannten toxischen Bestandteile; sie sind gramnegativ und
weisen nicht die für
grampositive Bakterien typische Zellwandstruktur auf. Wurden diese
Bakterienzellen direkt an Vögel
oder Fische in Form einer Zellpaste verfüttert, so schienen sie als
Transport-Vehikel geeignet zu sein. Das ZX wurde freigesetzt, sobald
die Zellen von den Tieren verdaut wurden, und das ZX wurde in den
Blutkreislauf aufgenommen und an geeigneten Stellen in verschiedenen
Geweben (einschließlich
der Netzhaut) eingelagert.
-
Demgemäß können intakte,
R-R-Zeaxanthin enthaltende F.-multivorum-Zellen für den direkten menschlichen
Konsum falls gewünscht
in jeder der drei Formen geeignet sein: (1) in intakter, lebensfähiger Form;
(2) intakter, nach Pasteurisierung abgetöteter Form; oder (3) als Formulierung,
in der die Bakterienzellen getötet
und ihre Membranen zerstört
wurden, um die Zellen aufbrechen und das ZX besser zugänglich zu
machen. Dies kann durch Mittel, wie beispielsweise Beschallung (unter
Verwendung von Hochfrequenz-Schallwellen), hohem Druck oder Mahlung,
durchgeführt
werden. Alternativ dazu kann dieser Schritt übersprungen werden, wenn eine
Lösungsmittelextraktion
eingesetzt wird, die die Zellmembranen aufbricht.
-
Falls
gewünscht
kann die ZX-Herstellung einen Schritt der Zellenspülung umfassen,
bei dem die verbleibenden Nährstoffe
und Stoffwechsel-Abfallprodukte nach der Fermentation durch Spülen der
Zellen mit einer Lösung,
die jedwede gewünschte
Be standteile, wie beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsmittel oder
Geschmacksstoffe, enthält,
entfernt werden.
-
Reinigung
-
Falls
gewünscht
kann eine Zellpaste (entweder mit intakten oder mit aufgebrochenen
Zellen) getrocknet werden, um die Zellen weiter zu konzentrieren
und die ZX-Konzentration in der Trockenmasse zu erhöhen. Dies
kann durch mechanische Mittel geschehen, wie beispielsweise Sprühtrocknen
(unter Einsatz von Hitze) oder Lyophilisierung (Gefriertrocknen
im Vakuum). Wird ein Trocknungsverfahren durchgeführt, wird
der resultierende feste Rückstand üblicherweise
als getrocknete Biomasse bezeichnet; sie enthält üblicherweise etwa 1 bis 10
Gew.-% ZX, gemeinsam mit anderen Zellfeststoffen, festen Rückständen des
Fermentationsmediums und den oben beschriebenen Stabilisatoren.
-
Vor
und nach (oder anstatt) dem Aufbrechen oder Trocknen kann eine Extraktionsschritt
zur Konzentrierung von ZX durchgeführt werden, das sich in erster
Linie in Zellmembranen ansammelt. Für die Extraktion geeignete
Lösungsmittel
schließen
polare organische Lösungsmittel
ein. Bis jetzt wurde Tetrahydrofuran (THF) als das beste Lösungsmittel
identifiziert, das die Zellen auf aggressive Weise angreift und
einen eigenen Schritt zur Aufbrechen der Membranen unnötig macht.
Obwohl bei der Verwendung von THF in Laborvorgängen kein Rühren vonnöten war, ist ein Rühren während des
Lösungsmittel-Mischschritts
bei der kommerziellen Herstellung wahrscheinlich notwendig.
-
Andere
Lösungsmittel
wurden ebenfalls getestet und werden auch in Hinkunft getestet und
bewertet werden, aber keines der bisher getesteten funktionierte
so gut wie THF. Bisher getestete organische Lösungsmittel ohne Ringstruktur
(wie beispielsweise Aceton und Diethylether) weisen ein niedrigeres
ZX-Löslichkeitsniveau
auf, während
andere Lösungsmittel,
wie beispielsweise Methanol, Ethanol und Hexan, noch niedrigere ZX-Löslichkeitsniveaus
aufweisen.
-
Das
Lösungsmittel
wird mit einer Zellpaste oder getrockneten Biomasse unter Bedingungen,
die das Lösungsmittel
zur Lösung
von so viel ZX wie möglich
veranlassen, gemischt. Die gelöste
flüssige
Fraktion wird dann von den Feststoffen unter Einsatz von Mitteln,
wie beispielsweise Zentrifugierung oder Filtration, getrennt. Die
Feststoffe können
dann verworfen oder als Ausgangsmaterial für andere Verfahrensschritte
eingesetzt werden (einschließlich
wiederholter Lösungsmittelextraktionszyklen,
falls gewünscht).
Die flüssige
Fraktion wird dann zur Entfernung des Lösungsmittels, üblicherweise
durch Abdampfen, behandelt. Zurück
bleibt ein viskoses Öl,
das R-R-Zeaxanthin gemeinsam mit anderen löslichen Komponenten, die vom
Lösungsmittel aus
der Zellpaste extrahiert wurden, enthält. Wurde THF in einer einfachen
Extraktion von Zellen, die 1 bis 3 Gew.-% ZX enthielten, eingesetzt
und daraufhin das THF abgedampft, so enthielt das resultierende
Fluid etwa 5 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% ZX.
-
Eine
weitere Art der Lösungsmittelextraktion,
die gute vorläufige
Ergebnisse lieferte, beinhaltet die Verwendung einer überkritischen
Flüssigkeit
(d.h. einer Verbindung, die üblicherweise
bei Atmosphärendruck gasförmig ist,
jedoch bei höherem
Druck eine als Lösungsmittel
agierende Flüssigkeit
wird). Kohlendioxid ist das für überkritische
Extraktion am häufigsten
eingesetzte Lösungsmittel,
und großtechnische
CO2-Extraktionssystem
stehen zur Verfügung.
In solchen Systemen wird verflüssigtes
Kohlendioxid mit einer Zellpaste oder getrockneten Biomasse im Inneren
eines Hochdruck-Reaktionsgefäßes gemischt.
Die Flüssigkeit
durchläuft dann
eine Reihe von Kammern, die den Druck schrittweise senken. ZX fällt bei
recht hohem Druck aus der Lösung
aus, sodass es während
eines frühen
Druckminderungsschritts gesammelt werden kann, während der Großteil der
Verunreinigungen im Kohlendioxid löslich bleibt und zu den anderen
Reaktionskammern weitergeleitet wird, in denen der Druck weiter
gesenkt wird. Die Effizienz der überkritischen
Lösungsmittelextraktion kann
weiter durch den Einsatz von Schleppmitteln (wie beispielsweise
Ethanol, Propylenglykol oder Ethylacetat) gesteigert werden. Mehrere
dieser Schleppmittel wurden zuvor getestet, und es wurde gezeigt,
dass sie die Löslichkeit
von ZX in überkritischem
Kohlendioxid wesentlich steigern können.
-
Obwohl
Kohlendioxid häufig
für die überkritische
Extraktion herangezogen wird, werden auch andere Verbindungen (einschließlich verschiedener
Stickstoff- oder Fluorchlorkohlenstoffverbindungen) eingesetzt. Ein
jedes derartiges Lösungsmittel,
das Gas- und Flüssigphasen
als Funktion des Drucks durchläuft,
kann getestet werden, um zu bestimmen, ob es für die Reinigung von ZX von
Bakterien, so wie hierin beschrieben, geeignet ist.
-
Falls
gewünscht
kann eine ölige,
ZX-hältige
Flüssigkeit,
die durch Lösungsmittelextraktion
oder überkritische
Extraktion gebildet wurde, mit einer Trägersubstanz, wie beispielsweise
Pflanzenöl,
gemischt werden und dann in eine Kapsel, die für die Einnahme durch den Menschen
bestimmt ist, eingeschlossen werden, ohne einer weiteren Reinigung
des ZX zu bedürfen.
So ist ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung einer halbreinen,
verdaubaren Form von R-R-Zeaxanthin bereitgestellt, die für den menschlichen
Gebrauch, entweder als Arzneimittel für an Makuladegeneration leidende
Menschen oder als Nahrungsmittelergänzung für Menschen, die ihr Risiko,
im späteren
Leben an Makuladegeneration zu erkranken, senken möchten, zur
Verfügung
steht.
-
Alternativ
dazu kann R-R-Zeaxanthin in einer halbreinen öligen Flüssigkeit weiter gereinigt werden,
um die ZX-Konzentration zu erhöhen
und jegliche Verunreinigung zu entfernen. Dies kann durch Verfahren,
wie beispielsweise (1) Zwei-Lösungsmittelsystemen,
bei denen eine Kombination aus zwei ausgewählten Lösungsmitteln eingesetzt wird;
(2) Adsorption an einem Substrat (wie beispielsweise ein Gewebefilterbett),
das die Kristallisation von ZX fördert;
oder (3) Gegenstromchromatographie durchgeführt werden. Ein zur Reinigung
von ZX bis zu einem Reinheitsgrad von 98 % verwendetes chromatographisches
Verfahren wird in Beispiel 4 beschrieben.
-
Reinigungsverfahren
für andere
Carotinoide sind in den U.S.-Patenten Nr. 5.382.714 (Khachik, 1995) und
Nr. 4.851.339 (Hills, 1989) offenbart. Aufgrund ihrer chemischen Ähnlichkeiten
liefert wahrscheinlich jedes Verfahren, das zur Reinigung von β-Carotin
oder Lutein fähig
ist, auch gute Ergebnisse bei der Reinigung von ZX.
-
Arten der
Verabreichung
-
Die
orale Einnahme ist die bevorzugte Form der Verabreichung von ZX
an Menschen zum Schutz der Netzhaut, unter Verwendung von Einnahmeformen,
wie beispielsweise die tägliche
oder wöchentliche
Einnahme von Kapseln, oder die Verwendung von Lebensmitteln oder
Nahrungsmittelzusätzen,
denen ZX zugesetzt wurde, so wie nachstehend beschrieben. Die Behandlung
bedarf keiner regelmäßigen Einnahme
in festgelegten Abständen
(wie beispielsweise eine täglich
oder wöchentliche
Pilleneinnahme), sondern bezieht sich auf eine gelegentliche, unterbrochene
Einnahme, bei der ein vernünftiger
Zeitraum (wie beispielsweise ein oder mehrere Tage, vorzugsweise
weniger als eine Woche) zwischen den Dosen liegen kann, um eine
allmähliche Einlagerung
kleiner Mengen an ZX im Makulagewebe zu ermöglichen. So wie bei allen Vitaminergänzungen kann
eine einzige Dosis positive Wirkungen haben, jedoch wird eine einzige
Dosis in einem Zeitraum von Jahren nicht gleiche positive Wirkungen
haben wie regelmäßige kleine
Dosen. Studien über
die Carotinoid-Aufnahme bei Säugetieren
zeigten, dass die tägliche
Einnahme der wöchentlichen
oder sporadischen Einnahme aufgrund von "Beladungs"-Faktoren, die sich im Blutkreislauf
zeigen, vorzuziehen ist.
-
Da
die Aufnahme von Carotinoiden nach der oralen Einnahme eher relativ
langsam voranschreitet, kann es für Patienten mit schwerer Makuladegeneration
wünschenswert
sein, andere Verabreichungsformen einzusetzen, wie beispielsweise
die intramuskuläre
oder intravenöse
Injektion oder die Implantierung einer Vorrichtung mit langsamer
Freisetzung. Injizierbare Trägerformulierungen
können
Wasser, ein Puffermittel und eine organische Verbindung mit mehreren
Hydroxygruppen, wie beispielsweise Propylenglykol, Dextran oder Cyclodextrinverbindungen,
umfassen.
-
Verschiedene
Formen der Verpackung zur oralen Einnahme können verwendet werden, solange
diese ZX vor Oxidation schützen
und die ölige
Natur von ZX berücksichtigen.
Beispiele für
geeignete Zusammensetzungen zur oralen Einnahme umfassen:
- (a) eine verdaubare, wasserdichte Kapsel und
ein darin enthaltenes Fluid, worin die Kapsel und das Fluid von
einer solchen Größe, dass
sie als Ganzes geschluckt werden können, und pharmakologisch annehmbar
sind und worin das Fluid R-R-Zeaxanthin gemischt mit einem geeigneten
Träger
oder Verdünnungsmittel,
wie beispielsweise Pflanzenöl,
enthält.
Falls gewünscht
kann das verflüssigte
ZX mikro-eingekapselt oder in Mizellen eingeschlossen werden, so
wie in den Beispielen 9 oder 10 beschrieben, um zum Schutz des ZX
vor einem Abbau im Magen beizutragen. Derartige Kapseln können aus
relativ steifem, starrem Material oder aus biegsamen Material, so
wie üblicherweise
für Vitamin
E enthaltende Kapseln verwendet, hergestellt werden. Ist die Kapsel
aus einem Material hergestellt, das gegenüber der sauren Umgebung im
Magen beständig
ist und von den Enzymen im Darmtrakt verdaut wird, kann ZX vor dem
Abbau im Magen geschützt
werden, und die biologische Verfügbarkeit
von ZX kann gesteigert werden. Es ist jedoch bekannt, dass zumindest
ein Teil des ZX, das als Bestandteil von gekauter, pflanzlicher
Masse in den Magen gelangt, unbeschadet durch den Magen gelangen
kann; es ist deshalb nicht entscheidend, ZX vor Magensäure zu schützen, und
die Wahl des Kapselmaterials beruht eher auf wirtschaftlichen Präferenzen
als auf einem Gebot der Wissenschaft.
- (b) eine Tablette zur oralen Einnahme durch einen Menschen,
worin die Tablette R-R-Zeaxanthin
und ein pressbares Bindematerial enthält, das mit Zeaxanthin kompatibel
ist und das die Tablette veranlasst, nach der Pressung unter geeignetem
Druck ihre Form beizubehalten, und worin die Tablette pharmakologisch annehmbar
und von solcher Größe ist,
dass sie als Ganze geschluckt werden kann. Falls gewünscht kann die
Tablette über
eine Beschichtung verfügen,
um zum Schutz des ZX vor der sauren Umgebung im Magen beizutragen.
- (c) eine Zusammensetzung, umfassend eine Nahrungsmittelsubstanz
für den
menschlichen Konsum, die ernährungstechnisch
annehmbar und wohlschmeckend ist, die als Träger für Zeaxanthin geeignet ist und die
R-R-Zeaxanthin als Zusatz enthält.
ZX ist ein Gelb-Orange-Pigment mit denselben allgemein hydrophoben
Eigenschaften wie Pflanzenöl,
Backfett oder Hühnerfett;
ebenfalls ähnelt
es anderen Carotinoid-Lebensmittelfarbstoffen, wie β-Carotin.
Demgemäß kann es
als Nahrungsmittelfarbstoff verschiedenen Nahrungsmittelsubstanzen,
wie beispielsweise Margarine, Milchprodukten, Sirup, gebackenen
Nahrungsmitteln, Keksteig, Rührteig
für Brownies,
Fleischprodukten, die nicht stark gekocht werden, und Suppenzutaten,
zugesetzt werden. Andere geeignete Nahrungsmittelsubstanzen umfassen
gegebenenfalls Granulat-Formulierungen, wie beispielsweise gesalzene
oder gewürzte
Geschmacksstoffmischungen, die als Zusätze für Suppen, Salate, Backwaren
usw. verwendet werden. Granulat-Formulierungen können, falls gewünscht, über eine
Schutzschicht verfügen,
um den Abbau von ZX durch die Magensäure zu verringern. Zahlreiche
Publikationen beschreiben die Verwendung von β-Carotin und anderen Carotinoiden
als Lebensmittelfarbstoffe und Nahrungsmittelzusätze; Beispiel sind unter anderem
Klaui et al., 1970; Klaui und Bauernfeind, 1981; Colombo und Gerber,
1991, und die U.S.-Patente Nr. 4.522.743 (Horn et al., 1985), Nr. 5.180.747
(Matsuda et al 1993), Nr. 5.350.773 (Schweikert et al., 1994) und
Nr. 5.356.636 (Schneider et al., 1994). Aufgrund ihrer chemischen Ähnlichkeiten
ist wahrscheinlich jedes Verfahren zum Zusetzen von β-Carotin
oder Lutein zu Nahrungsmittel für
Menschen direkt auf R-R-Zeaxanthin anwendbar.
- (d) eine Zusammensetzung, umfassend ein Lebensmittel zum oralen
Konsum durch Menschen, worin das Lebensmittel für den Menschen unschädliche Mikrobenzellen
enthält,
die das R-R-Isomer von Zeaxanthin enthalten. Derartige Lebensmittel
sind gegebenenfalls aus Käse,
Joghurt, Milch und Bier ausgewählt.
Die Mikrobenzellen können,
falls gewünscht,
lebensfähig
sein, oder sie wurden gegebenenfalls durch Verfahren wie beispielsweise
Pasteurisierung oder Fragmentierung abgetötet.
-
Andere
Verpackungsformen sind ebenfalls ausführbar und können für verschiedene Verwendungszwecke
bevorzugt sein.
-
Testen auf
R-R-Zeaxanthin bei Tieren
-
ZX,
das unter Verwendung von F.-multivorum-Zellen, Abkömmlinge
der ATCC-55238-Stamms,
synthetisiert wurde, wurde auf seine Schutzwirkung auf die Netzhaut
bei einer japanischen Vogelart, Coturnix coturnix japonica, gemeinhin
als Japanische Wachtel bezeichnet, hin untersucht. Diese Art stellt
ein nützliches tierisches
Modell für
die Makuladegeneration beim Menschen bereit, aufgrund von verschiedenen
Faktoren, einschließlich
der folgenden:
- (1) Die gesamte Netzhaut der
Japanischen Wachtel ähnelt
der menschlichen Makula in mehreren wichtigen Gesichtspunkten. Beispielsweise
enthält
die Netzhaut der Wachtel sowohl ZX als auch Lutein und ist, so wie
die menschliche Makula, reich an Photorezeptor-Zapfen und nicht
an Stäbchen.
- (2) Die Netzhaut der Japanischen Wachtel zeigt einige derselben
pathologischen Indikatoren wie die menschliche Netzhaut. Beispielsweise
sammeln sich in der Netzhaut der Japanischen Wachteln weiche Drusen
und Lipofuszin an, bei denen eine starke Verbindung zu einsetzender
AMD beim Menschen besteht.
- (3) Obwohl die Netzhaut der Wachtel sehr viel kleiner als die
menschliche Netzhaut ist, ist die gesamte Wachtelnetzhaut aufgrund
der Gegenwart von ZX und Lutein von gelber Farbe. Dies ermöglicht das
effektive Heranziehen der gesamten Netzhaut einer Wachtel als Modell
für die
kleine Makularegion im Zentrum der menschlichen Netzhaut, und Beobachtung
und Analyse werden erleichtert.
- (4) Die Netzhaut der Japanischen Wachtel ist avaskulär und weist
eine Struktur auf, die der Region der Fovea der menschlichen Netzhaut ähnlich ist.
- (5) Japanische Wachteln haben eine Lebensdauer von etwa 1 bis
1,5 Jahren für
Weibchen und 3 bis 4 Jahren für
Männchen.
Dies ermöglicht
Studien über
den Alterungsprozess, die bei Arten mit längerer Lebenserwartung sehr
schwierig auszuführen
wären.
-
Diese
Faktoren werden in Fite et al., 1991, und Fite et al., 1993, detaillierter
erörtert.
-
Diese
Tests werden in den Beispielen 5 bis 8 beschrieben. Die Ergebnisse
sind hervorragend und weisen deutlich daraufhin, dass das von F.-multivorum-Zellen
hergestellte R-R-Zeaxanthin (1) in der Makula nach der oralen Einnahme
angemessen eingelagert wird und (2) äußerst wirksam die Netzhautzellen
vor phototoxischer Schädigung
schützt.
-
Zudem
weisen, so wie in Beispiel 8 erörtert,
vorläufige
Ergebnisse darauf hin, dass R-R-Zeaxanthin die Netzhaut bei weitem
besser und wirkungsvoller vor phototoxischer Schädigung schützen als β-Carotin. Wurde β-Carotin
in sehr hoher Dosierung an Tiere verfüttert, erreichten die geringen,
von β-Carotin
bereitgestellten positiven Schutzwirkungen nicht einmal eine statistische
Signifikanz. Wurde im Gegensatz dazu R-R-Zeaxanthin in der gleichen
Dosierung an Tiere verfüttert,
wurde der gemessene Indikator für
Netzhautschäden
völlig
ausgeschaltet und verhindert.
-
Mikrobielle
R-R-Zeaxanthin-Quellen
-
Flavobacterium-multivorum-Zellen
wurden, so wie hierin offenbart, bei der ATCC hinterlegt (ATCC-Zugriffsnummer
55238; so wie zuvor festgehalten werden diese im ATCC-Katalog als
Sphingobacterium multivorum bezeichnet, aber ihre Bezeichnung im
Bergy's Manual wurde
nicht geändert).
Diese Zelllinie stellt Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung mehrere
Optionen für
die mikrobielle Synthese von isomerisch reinem R-R-Zeaxanthin zur
Verfügung.
-
Erstens
können
direkte und nicht modifizierte Abkömmlinge dieser Zellen zur Synthese
von R-R-Zeaxanthin ohne nachweisbare Mengen an anderen, unerwünschten
Stereoisomeren verwendet werden. Die gesamten durch diese Zellen
erzeugten Carotinoide bestehen zu über 90 % aus ZX, dem gewünschten
Carotinoid.
-
Zweitens
können
Abkömmlinge
des ATCC-Stamms 55238 verwendet werden, nachdem auf sie auf Weisen
modifiziert worden sind, die die Produktion des R-R-Isomers von
ZX steigern. Mutanten oder andere Variationen der Zelllinien können durch
jedes zahlreicher Verfahren gebildet werden, wie beispielsweise
(1) die Behandlung des Wildtyp-ATCC-55238-Stamms mit mutagenen Mitteln,
wie beispielsweise ultravioletter Strahlung oder Röntgenstrahlen,
oder mit bekannten chemischen Mutagenen, wie beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin;
(2) die Schaffung geschlechtlicher Kombinationen durch Mischen von
F.-multivorum-Zellen mit anderen Bakterienarten, die die Konjugation
und den Austausch von DNA zwischen Bakterienzellen aktiv fördern; oder
(3) die Behandlung von F.-multivorum-Zellen mit bakteriellen Transposonen
oder Viren, die einen Umbau von relativ großen DNA-Abschnitten verursachen
können.
Diese Verfahren führen
zufällige
Veränderungen
in Abkömmlingszellen
ein, und die Abkömmlinge
werden durch Screening-Tests zur Identifikation und Isolierung von
Nachkommenschaftszellen, die einen höheren Grad an ZX produzieren,
analysiert.
-
Die
Screening-Tests können
durch den Einsatz von Chemikalien (wie beispielsweise Diphenylamin, Nicotin
oder Lovastatin) vereinfacht werden, die ein oder mehrere involvierte
Enzyme auf dem Biosynthese-Stoffwechselweg, durch den ZX synthetisiert
wird, unterdrücken.
Um es mit den Worten eines Laien zu beschreiben, können diese
Unterdrückungswirkstoffe
Hürden
oder Hindernisse schaffen, die nur von Mutantenzellen überwunden
werden können,
die anormal hohe Mengen an ZX produzieren. Glücklicherweise sind die Tests,
die zur Identifizierung von hochproduktiven Mutanten oder Varianten
eingesetzt werden können,
einfach, schnell und leicht. Da ZX ein Gelbpigment ist, kann eine
einfache visuelle Beobachtung einer Kulturplatte zur Identifizierung
von Mutantenkolonien, die die gewünschten Eigenschaften (1) einer
guten Zellwachstumsrate und (2) der Fähigkeit zur Erzeugung von anormal
großen Mengen
des Gelbpigments aufweisen, eingesetzt werden. Falls gewünscht können bei
den Screening-Tests nach der Behandlung mit einem Mutagen auch automatisierte
Vorrichtungen (wie beispielsweise automatische Plattenleser oder
an Durchflusszytometer gekoppelte Zellsortierungsvorrichtungen)
verwendet werden.
-
Diese
Mutagenizitäts-
und Screening-Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung üblich und
wohl bekannt. Alle Zellen, die direkte Abkömmlinge des ATCC-55238-Wildtyp-Stamms sind, werden
als Abkömmlinge dieser
Zellen betrachtet, auch wenn sie auf irgendeine der oben angeführten Weisen
modifiziert, mutagenisiert oder mit anderen Zelllinien geschlechtlich
kombiniert wurden.
-
In
einer dritten alternativen Herangehensweise können Mikrobenzellen, die keine
Abkömmlinge
sind und die Gene enthalten, die von der ATCC-55238-Zellinie isoliert
wurden oder abstammen, geschaffen werden, die Enzyme exprimieren,
die die Synthese von R-R-Zeaxanthin unterstützen. Derartige Gene können unter
Verwendung bekannter Verfahren isoliert und identifiziert werden.
Beispielsweise können
DNA-Sequenzen aus
den im U.S.-Patent Nr. 5.429.939 (Misawa et al., 1995, oben erörtert) aufgelisteten
Carotinoid-produzierenden "crt"-Genen als Hybridisierungssonden
eingesetzt werden, um nach Carotinoid-produzierenden Genen mit homologen
DNA-Sequenzen im
Genom der ATCC-55238-Zellinie zu suchen. Aus diesen Zellen isolierte Carotinoid-produzierende
Gene können
dann in Plasmide, Cosmide, Phagen oder andere geeignete Vektoren, die
verwendet werden können,
um jeden gewünschten
Typ von Wirtszelle, wie beispielsweise E.-coli-Zellen, Hefezellen,
Insektenzellen oder Säugetierzellen,
genetisch zu transformiren, eingeführt werden. Diese Art der steuerbaren
gentechnischen Veränderung
ermöglicht,
dass transformierte Zellen R-R-Zeaxanthin unter Einsatz der aus
den ATCC-55238-Zellen erhaltenen Gene erzeugen.
-
Zudem
können
die für
Proteine kodierenden Abschnitte der ZX-produzierenden Gene der ATCC-55238-Zellen
(d.h. die Abschnitte der Gene, die in eine Messenger-RNA transkribiert
werden, die daraufhin in die Enzyme, die ZX synthetisieren, translatiert
wird) der Steuerung eines leistungsstarken und/oder induzierbaren
Gen-Pro motors unterstellt werden. Derartige "chimäre" Gene, die aus verschiedenen
Genen erhaltene Gen-Promotoren enthalten, können für verschiedenen Zwecke eingesetzt
werden, wie beispielsweise (1) zur Unterdrückung der ZX-Produktion während des
Wachstums und der Fortpflanzung der Zellen und in Folge zur deutlichen
Steigerung der ZX-Produktion der Zellen während der Fermentation; und
(2) zur Einführung
der Gene in neue Typen von Wirtszellen, die gegebenenfalls für die wirtschaftliche
Verwendung bevorzugt werden, wie beispielsweise E.-coli-Zellen oder
Hefezellen, für
die wohl bekannte und stark optimierte Fermentations-, Verarbeitungs-
und Reinigungsverfahren eingesetzt werden können.
-
Aus
der ATCC-55238-Zelllinie isolierte ZX-produzierende Gene können auch
durch andere bekannte Verfahren verbessert werden. Beispielsweise
verwenden Bakteriengene oft "nicht-präferierte" Codons, die die Menge
eines von einem Gen erzeugten Enzyms reduzieren und steuern. Um
diesen Einschränkungsmechanismus
zu lockern, können
nicht-präferierte
Codons in einem ZX-synthetisierenden Gen aus der ATCC-55238-Zelllinie
durch "präferierte" Codons ersetzt werden,
die die Expression des ZX-produzierenden Enzyms in einer ausgewählten Wirtszelle
steigern können.
-
Als
weiteres Beispiel können
Cysteinreste die Aktivität
oder Stabilität
eines Enzyms durch Ausbildung unerwünschter Disulfidbindungen mit
anderen Cysteinresten, entweder im selben oder in anderen Proteinmolekülen, hemmen.
Demgemäß kann die
Aktivität
oder Stabilität
eines Enzyms durch Ersetzen eines oder mehrerer Cysteinreste mit
anderen Aminosäureresten
manchmal gesteigert werden (z.B. U.S.-Patent Nr. 4.737.462, von
Mark). Zudem kann die Expression eines Proteins durch Einführen von
Codons für
herkömmliche
Aminosäuren,
wie beispielsweise Glycin, anstelle von Codons, die für Methionin
und Tryptophan kodieren, die weniger häufig auftreten und dazu tendieren,
die Expression eines Gens zu verlangsamen und zu reduzieren, häufig erhöht werden.
Nachdem ein synthetisches Gen geschaffen wurde, das eine derartige
Aminosubstitution verursacht, kann das modifizierte Protein getestet
werden, um zu bestimmen, ob es die gewünschte Enzymaktivität aufrechterhält, während es
in größeren Mengen
oder in stabilerer Form exprimiert wird.
-
Dies
sind Beispiele bekannter Gentechnikverfahren, die in Bezug auf ZX-produzierende,
aus der ATCC-55238-Zelllinie isolierte Gene evaluiert werden können, um
zu bestimmen, ob irgendeine dieser Modifikationen die Produktion
von ZX der F.-multivorum-Zellen oder von anderen Typen von Wirtszellen
verbessert.
-
Der
Satz in den Patentansprüchen,
der sich auf "Zellen,
die gentechnisch verändert
wurden, um zumindest ein Zeaxanthin-Synthese-Gen zu enthalten, das
eine aus einem Stamm von Flavobacterium multivorum, dem die ATCC-Zugriffsnummer
55238 zugeordnet wurde, erhaltene DNA-Sequenz enthält" bezieht, schließt Zellen
ein, die Gene mit chemisch synthetisierten DNA-Sequenzen enthalten,
unter Verwendung einer DNA- oder mRNA-Sequenz, die durch Analyse
der ATCC-55238-Zellinie oder Abkömmlinge
dieser bestimmt wurde. Automatisierte DNA-Synthese-Geräte sind
bekannt und können
zur Duplizierung einer jeden bekannten Gensequenz verwendet werden,
ohne dafür
einer Replikation der ursprünglichen
Wirtszelle zu bedürfen. Ein "Zeaxanthin-Synthese-Gen" umfasst jedes Gen,
das ein Enzym oder anderes Protein exprimiert, das im ZX-Biosyntheseweg
involviert ist und das zur Steigerung der ZX-Produktion verwendet
werden kann, wenn es in geeignete Wirtszellen eingeführt wird,
unabhängig
davon, für
welches bestimmte Enzym im ZX-Biosyntheseweg das Gen kodiert.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1: Fermentation
im großtechnischen
Maßstab
-
Das
Nährmedium,
das von den Anmeldern für
die anfänglichen
Labortests in kleinem Maßstab
von Flavobacterium multivorum bevorzugt wurde, wurde als das Nährmedium
E unter Beispiel 3 in den U.S.-Patenten Nr. 5.308.759 (Gierhart,
1994) und Nr. 5.427.783 (Gierhart, 1995) identifiziert. Dieses Nährmedium
enthielt verschiedene Inhaltsstoffe, die kostspielig und schwierig
zu bearbeiten waren. Um Kosten und Unannehmlichkeiten zu reduzieren,
wurde nach dem ursprünglichen
Einreichdatum dieser Anmeldungen intensiv geforscht, um ein für den großtechnischen
Maßstab
besseres Nährmedium
zu schaffen. Die derzeit bevorzugten Nährmedien zur Fermentation im
großtechnischen
Maßstab
haben Maismehl und verschiedene andere Inhaltsstoffe verdrängt. Diese
bevorzugten Medien enthalten entweder maltosereichen Maissirup oder
Zuckerrübenmelasse
in einer Konzentration von 1 bis 10 % (Gew./Vol.) zusammen 0,5 bis
4 % (Gew./Vol.) Maisquellwasser; 0,5 % (Gew./Vol.) Ammoniumsulfatheptahydrat;
0,5 % (Gew./Vol.) Natriumchlorid; 0,1 % (Gew./Vol.) Magnesiumsulfatheptahydrat;
0,1 % (Gew./Vol.) Natriumacetat; 0,001 % (Gew./Vol.) Eisensulfatheptahydrat; 0,2
% (Gew./Vol.) Hefeextrakt; 0,01 % (Gew./Vol.) Thiamin-HCl; zwischen
1 und 6 % (Gew./Vol.) hydrolysiertes Casein (wie beispielsweise
NZ-Amin HD, vertrieben von Sheffield Products, Division of Quest
International, Norwich, NY); und 1 Vol.-% Pflanzenöl.
-
Nachdem
diese Inhaltsstoffe zusammengemischt worden sind, wird ausreichend
NaOH zugesetzt, um den pH-Wert auf 6,5 anzuheben; wurde hingegen
das Medium auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, so wie in Versuchen
im Labor-Maßstab
in den U.S.-Patenten Nr. 5.308.759 und Nr. 5.427.783 beschrieben,
fielen zu viele Feststoffe aus dem Maisquellwasser aus.
-
Das
Kulturmedium wird dann durch 30-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisiert,
dann auf 27 °C abgekühlt und
mit 5 bis 10 Vol.-% einer "flüssigen Vorkultur", die einen F.-multivorum-Stamm,
der R-R-Zeaxanthin produziert, ohne die S-S- oder S-R-Stereoisomere
zu produzieren, enthält,
inokuliert.
-
Die
zur Herstellung einer flüssigen
Vorkultur eingesetzten Zellen werden auf einem Schrägröhrchen eines
Agars zur Keimzahlbestimmung gehalten. Diese Schrägkulturen
werden mit Klonkolonien von F. multivorum, die vom Stamm abstammen,
den die Anmelder bei der ATCC hinterlegt haben (ATCC-Zugriffsnummer 55238),
inokuliert. Nach einer 48-stündigen
Inkubation bei 28 °C
werden Schräg-Stammkulturen
bei 4 °C
eingekühlt,
bis sie als Inokulum für
Flüssigmedien
eingesetzt werden. Lebensfähige
Zellen können
auch unter Verwendung herkömmlicher
Tiefkühlgeräte, Trockeneis
oder flüssigem
Stickstoff zur längeren
Lagerung eingefroren werden.
-
Eine
flüssige
Vorkultur wird hergestellt, indem Zellen, die aus einer Schrägagarkultur
entnommen wurden, zur Inokulierung von 30 ml eines so wie oben beschrieben
hergestellten Flüssigmediums,
das in einem 300-ml-Prallkolben enthalten ist, verwendet werden.
Die Wachstumsbedingungen sind 28 °C
bei einem pH-Wert von 7,2 bis 7,6, Belüftung durch Rühren mit
250 U/min und Züchtung
für 24
Stunden. Nach einer anfänglichen
Inkubation von 24 Stunden werden die in einem oder mehreren 30-ml-Vorkulturkolben enthaltenen Zellen
zur Inokulation einer um das 10fache größeren Menge des Nährmediums
in einem Fermentationsgefäß von geeigneter
Größe verwendet.
Die Zellen werden dann für
48 bis 72 Stunden bei 28 °C
inkubiert. Der pH-Wert
wird unter Verwendung von NaOH und/oder Phosphorsäure zwischen
6,80 und 7,20 gehalten. Der Grad an gelöstem Sauerstoff wird bei 30
bis 40 % Sättigung
durch Durchperlenlassen von filtrierter Luft durch das Gefäß mit einer
Rate von 1 Luftvolumen pro 1 Flüssigkeitsvolumen
pro Minute gehalten, während
das Gefäß mit 400
bis 1000 U/min gerührt
wird. Tests durch regelmäßiges Ziehen
von Proben und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
zeigten, dass die größtmöglichen
Mengen an ZX üblicherweise
innerhalb von etwa 72 produziert werden, wenn die Zellen unter diesen
Bedingungen fermentiert werden.
-
Beispiel 2: Zusatz von
Stabilisatoren
-
Das
durch die Fermentationsverfahren in Beispiel 1 hergestellte ZX muss
stabilisiert werden, um die folgende Reinigung und Formulierung
zu erleichtern und um die Reinheit zu gewährleisten. Stabilisierende Verbindungen
können
den F.-multivorum-Zellen
(oder einem ZX-hältigen
Zellextrakt) zu jedem Zeitpunkt während eines Herstellungs- oder
Reinigungsverfahrens zugesetzt werden; im Allgemeinen sollten ein
oder mehrere Anfangsstabilisatoren den Zellen zugesetzt werden,
wenn diese sich noch im Fermentationsgefäß befinden.
-
Verschiedene
Kandidatenstabilisatoren wurden von den Anmeldern getestet. Die
bisher besten Ergebnisse wurden unter Verwendung einer Kombination
von Stabilisatoren erzielt, die in einer kleinen Menge eines geeigneten
Lösungsmittels
(wie beispielsweise etwa 2 ml Ethanol für ein 20-I-Fermentationsgefäß) zusammengemischt
werden, bevor sie den Zellen zugesetzt werden. Das bevorzugte Sabilisatorgemisch
enthält tert-Butylhydrochinon
(mit TBHQ abgekürzt;
auch als 2-(1,1-Dimethyl)-1,4-benzoldiol
bezeichnet) in einer Menge, die eine letztendliche Konzentration
in einem Bereich von etwa 250 μg/l
(Mikrogramm pro Liter) bis etwa 50 mg/l nach dem Mischen mit den
Zellen ergibt; Ethoxyquin in einer Konzentration nach dem Mischen von
etwa 250 μg/l
bis etwa 250 mg/l; α-Tocopherol
in einer Konzentration von etwa 250 μg/l bis etwa 250 mg/l; und EDTA
(Ethyldiamintetraessigsäure)
in einer Konzentration von etwa 500 μg/l bis etwa 500 mg/l. Geeignete Konzentrationen
können
stark variieren und hängen
von verschiedenen Faktoren, wie beispielsweise den folgenden Reinigungsschritten
und der geplanten Art der Verpackung und Einnahme, ab. Bevorzugte
Konzentrationen dieser Stabilisatoren für die Verwendung mit einer
einfachen THF-Extraktion gefolgt vom Mischen mit Pflanzenöl und dem
wasserdichten Einkapseln in vitaminpillenartiger Form liegen bei
etwa 25 bis 50 mg/l für TBHQ,
250 bis 500 μg/l
für Ethoxyquin,
250 bis 500 μg/l
für α-Tocopherol
und 500 bis 1000 μg/l
für EDTA.
-
Nach
dem Zusetzen der Stabilisatoren wird die Zellkultur durch 25- bis
50-minütiges
Erwärmen
auf 55 °C
pasteurisiert. So werden die Bakterien abgetötet, ohne dem von ihnen produzierten
ZX zu schaden. Die Kultur wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und
die ZX enthaltenden Zellen und andere in der Kulturlösung gegenwärtige Feststoffe
werden durch ein Querstrom-Mikrofiltrationssystem von der flüssigen Phase
getrennt, was die Zellen/Feststoff-Konzentration von einem Ausgangswert
von etwa 10 bis 15 Vol.-% auf eine filtrierte Konzentration von
etwa 60 bis 80 Vol.-% anhebt. Dieses Verfahren ergibt eine Zellpaste,
die auch einige Feststoffrückstände aus
dem Nährmedium
enthält.
-
Für ZX-Präparate,
die an Japanische Wachteln zum Netzhauttest verfüttert werden, so wie in den
Beispielen 5 – 7
beschrieben, wird die Zellpaste bei –70 °C eingefroren, daraufhin durch
Lyophilisierung bei 25 °C im
völligen
Vakuum getrocknet, um eine getrocknete Biomasse zu erhalten, die
etwa 1 bis 10 Gew.-% ZX enthält.
In früheren
Versuchen wurde die Menge an ZX in jeder Charge einzeln gemessen,
und Chargen mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden vereinigt
und gemischt, um gleichbleibende Konzentrationen für die Versuche
mit den Japanischen Wachteln zu gewährleisten.
-
Um
ZX für
die menschliche Einnahme herzustellen, wird eine Lösungsmittelextraktion
zur Erzeugung eines viskosen, öligen
Fluids eingesetzt, so wie in Beispiel 3 beschrieben wird.
-
Beispiel 3: Teilreinigung
zum Erhalt einer viskosen Flüssigkeit
-
Nachdem
die Zellpaste auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise erzeugt worden
ist, kann diese auf jede von vielen Weisen behandelt werden. Wie
zuvor erwähnt
können,
falls gewünscht,
die Zellmembranen zerstört
werden, um die Zellen aufzubrechen und das ZX leichter zugänglich zu
machen, und zwar durch Beschallung (Hochfrequenz-Schallwellen),
hohem Druck oder Mahlung, wobei die Temperatur der Zellen zur Verhinderung
von Oxidation unter etwa 30 °C
gehalten wird. Dieser Schritt war jedoch nicht notwendig, wenn Tetrahydrofuran
(THF) in einem Lösungsmittelex traktionsschritt
eingesetzt wurde, da THF die Zellmembranen ohne mechanische Unterstützung wirksam
zerstört.
Rühren
war bei der Verwendung von THF bei Verfahren im Labor-Maßstab nicht
vonnöten;
Rühren
während
des Lösungsmittelmischschritts
ist aber wahrscheinlich bei Herstellungsverfahren im großtechnischen
Maßstab
von Vorteil.
-
In
den bisher ausgeführten
Tests beinhaltete die THF-Extraktion ein Mischen von etwa 8 bis
20 Volumina gereinigtes, filtriertes THF mit einem Volumen Zellpaste,
die 60 – 80
% Feststoffe enthielt, über
einen Zeitraum von 2 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von unter
25 °C. Das
THF greift die Zellen auf aggressive Weise an und bildet eine Flüssigkeit
mit einer Suspension aus ausgeflockten Feststoffen. Nach einer Zentrifugation
bei bis zu 20.000 g für
einige Minuten kann der Großteil
von THF durch Dekantieren entfernt werden. Das verbleibende THF
kann im Vakuum abgedampft werden, wodurch ein viskoses Öl zurückbleibt.
Wurden Zellpasten, die 1 bis 3 % ZX enthielten, mit THF-Extraktion
in einem einfachen Vorgang behandelt, so enthielt das erhaltene Öl üblicherweise
etwa 5 bis 20 Gew.-% ZX.
-
Beispiel 4: Herstellung
von hochgereinigtem Zeaxanthin in Trockenpulverform mit 100 % reinem
R-R-Isomer
-
Ein
hochgereinigtes ZX-Präparat
in Trockenpulverform wurde durch Weiterverarbeitung des in Beispiel
3 beschriebenen THF-extrahierten öligen Fluids durch die in Folge
beschriebene Flüssigkeitschromatographie
hergestellt. Die ölige,
ZX-hältige
Flüssigkeit
wurde in Hexan gelöst
und durchlief daraufhin eine neutrales Aluminiumoxid enthaltende
Chromatographiesäule.
Zwei Säulen-Volumina
Hexan wurden zum Waschen der Säule
verwendet, um Carotinoid-Verunreinigungen, wie beispielsweise β-Carotin und Lycopen,
sowie Lipide und andere Verunreinigungen zu entfernen. Ein 80:20-Gemisch
aus Hexan und Aceton durchlief daraufhin die Säule, um das ZX herauszulösen. Das
gelöste
ZX, das erhalten wurde, wurde vakuumgetrocknet. Eine chromatographische
Analyse ergab ein zumindest 98 % reines ZX; nur Spurenmengen von
Verunreinigungen waren nachweisbar.
-
Nach
etwa 6-moantiger Lagerung in relativ ungeschütztem Zustand (üblicherweise
normal gekühlt, wobei
mit eher geringer Häufigkeit
Proben gezogen wurden, und ohne Gehalt von Antioxidantien und ohne Vorkehrungen
zur Verhinderung von Kontakt mit Luftsauerstoff getroffen zu haben)
wurde eine Probe dieses ZX-Präparats
zur stereoisomerischen Analyse an Prof. John Laudrum (Co-Autor der
Publikationen von Bone, Laudrum et al.) an der Florida International
University in Miami, Florida, geschickt. Seine unter Verwendung einer
chiralen Säulenchromatographie
mit Dicarbamat-Derivatisierung durchgeführte Analyse ergab, dass das 6
Monate alte, ungeschützte
Präparat
92 % ZX enthielt. Die Verunreinigungen waren in erster Linie Keto-Carotinoide, die
vor dem ZX eluierten; Keto-Carotinoide verfügen über ein zusätzliches Sauerstoffatom, das
an irgendeiner Stelle an ein Carotinoid gebunden ist, und sind häufige Nebenprodukte,
die bei Lagerung von Carotinoiden ohne Schutz vor Oxidation auftreten.
Die von Prof. Landrum durchgeführte
chirale Analyse zeigte, dass 100 % von ZX im Präparat das gewünschte R-R-Isomer
waren. Es lagen keine nachweisbaren Mengen an unerwünschten
S-S- oder S-R-Stereoisomeren von ZX vor.
-
Es
ist anerkannt, dass die oben beschriebene chromatographische Reinigung
für die
Herstellung von hochgereinigtem ZX in wirtschaftlichen Mengen nicht
idealerweise geeignet ist, auch wenn die zur Gänze durchführbar und äußerst wirksam ist. Ein alternatives
Verfahren, das zur Lutein-Reinigung entwickelt wurde, wird im U.S.-Patent
Nr. 5.382.714 (Khachik, 1995; vgl. auch Khachik et al., 1991) beschrieben,
bei dem ein kaltes Ethanol/Wasser-Gemisch in einem Extraktionssystem
mit zwei Lösungsmitteln
gefolgt von Lyophilisierung eingesetzt wird, und stellt ein gutes
Kandidatenverfahren zur Evaluierung für die Verwendung bei der wirtschaftlichen
Herstellung dar.
-
Beispiel 5: Zeaxanthin-Versuche
bei der Japanischen Wachtel unter Verwendung verschiedener Ernährungsgruppen
-
Alle
Versuche mit Japanischen Wachteln wurden am Schepens Eye Research
Institute der Harvard Medical School (Boston, Massachusetts) durchgeführt. Alle
Behandlungs- oder Kontrollgruppen bestanden aus einer statistisch
signifikanten Anzahl an Vögeln.
In den meisten Fällen
waren die Kontrollgruppen gleich groß wie die Behandlungsgruppen.
-
Carotinoidarmes
Vogelfutter stammte von Purina Mills (St. Louis, Missouri). Derartiges
Vogelfutter wird nur für
Versuchszwecke verkauft und wird aus natürlich carotinoidfreiem Getreide
(wie beispielsweise Milosamen) erhalten.
-
Alle
ZX-Präparate,
die an die Japanischen Wachteln verfüttert wurden, lagen in Form
von getrockneter Biomasse aus F.-multivorum-Zellen vor, die fermentiert,
mit den in Beispiel 2 beschriebenen Mitteln stabilisiert, zum Abtöten der
Zellen pasteurisiert und unter Einsatz von Lyophilisierung getrocknet
worden waren.
-
Alle
Versuchstiere wurden aus carotinoidarmen Eiern ausgebrütet. Diese
wurden erhalten, indem eine Elterngeneration (als P1-Vögel bezeichnet)
ausschließlich
mit carotinoidarmen Futter gefüttert
worden war, nachdem die Vögel
ausgewachsen waren. Ihre Eier wurden aufgeschlagen und auf Carotinoide
hin untersucht, bis die Eier einen Carotinoidmangel aufwiesen. Eier,
die daraufhin von Eltern mit Carotinmangel gelegt wurden, wurden
verwendet, um alle Versuchs- und Kontrollvögel auszubrüten.
-
Die
Versuchs- und Kontrollvögel
wurden in vier Hauptgruppen eingeteilt, die unterschiedliches Futter erhielten.
Diese Gruppen wurden als (C+)-Gruppe, (C–)Gruppe, (BC+)-Gruppe, ZX(+5)-Gruppe
und ZX(+50)-Gruppe bezeichnet, je nachdem, welche Carotinoide sie
mit ihrem Futter erhielten.
-
Die
Vögel der
(C+)-Gruppe wurden mit einem handelsüblichen Standardfutter ernährt, das
verschiedene Carotinoide enthielt; dieses Futter enthält zudem
synthetisches alpha-Tocopherol (Vitamin E) als Zusatzstoff.
-
Die
Vögel der
(C–)-Futtergruppe
wurden mit Futter ernährt,
das im Wesentlichen frei von jeglichem Carotinoid war, so wie oben
beschrieben. Dieses Futter enthielt jedoch alle anderen essentiellen
Nährstoffe,
und es enthielt synthetisches Vitamin A und E als Zusatzstoffe.
-
Die
Vögel der
(BC+)-Gruppe erhielten Futter, das frei von allen Carotinoiden war,
mit der Ausnahme von β-Carotin
als Zusatz in der Dosierung, die auch in der hochdosierten ZX-Gruppe
eingesetzt wurde (d.h. 50 mg β-Carotin
wurden pro kg Futter zugesetzt). Die Vögel der (BC+)-Gruppe wurden
sieben (7) Tage vor Beginn des Lichtschädigungsverfahrens auf die β-Carotin-hältige Diät gesetzt.
Diese Gruppe lässt
einen direkten Vergleich von β-Carotin
und einer Subgruppe der mit ZX als Ergänzung gefütterten Vögel zu, die ebenfalls sieben Tage
vor der Lichtschädigung
von einer mangelhaften Ernährung
auf eine mit ZX ergänzte
Diät gesetzt
wurden. Wie in Beispiel 8 beschrieben wird, zeigte dieser direkte
Vergleich, dass ZX für
die Verhinderung phototoxischer Schäden hochwirksam ist, während die
Schutzwirkung von β-Carotin so gering
war, dass nicht einmal ein statisch signifikantes Niveau erreicht
wurde.
-
Die
Vögel der
(ZX+)-Gruppe erhielten Futter, das frei von allen anderen Carotinoiden
war, jedoch getrocknete Biomasse enthielt, die R-R-Zeaxanthin aus
F.-multivorum-Zellen
enthielt. Zwei verschiedene Dosierungen von ZX wurden an diese Vögel verfüttert, um
eine Dosis-Wirkung-Beziehung bewerten und in Bezug zu verschiedenen
Indikatoren von Netzhautschädigung
setzen zu können.
Vögel der
ZX(+5)-Gruppe erhielten eine relativ geringe Menge an ZX, im Schnitt
5 mg zugesetztes ZX pro kg Futter. Da Japanische Wachteln etwa 25
bis 35 g Futter pro Tag zu sich nehmen, wurden in der niedrig dosierten
Gruppe etwa 0,125 bis 0,175 mg ZX pro Vogel und Tag eingenommen.
Vögel der
ZX(+50)-Gruppe erhielten die zehnfach höhere Menge (50 mg ZX pro kg
Futter), wodurch diese Vögel
im Schnitt 1,25 bis 1,75 mg ZX pro Vogel und Tag zu sich nahmen.
-
Die
Carotinoidkonzentrationen im Kontrollfutter, im carotinoidarmen
und im (ZX+)-Futter
wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung der in Stacewicz-Sapuntzakis et al., 1993,
beschriebenen Verfahren analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle
1 aufgeführt.
-
-
Alle
Vögel wurden
in gewöhnlichen
Brutkäfigen
aufgezogen und gehalten. Mit der nachstehend beschriebenen Ausnahme
wurden sie unter normaler Breitspektrumbeleuchtung, von 10 bis 14
Stunden pro Tag, gehalten.
-
Beispiel 6: Ablagerung
von oral eingenommenem Zeaxanthin
-
Chemische
Analysen wurden durchgeführt,
um die Konzentration von ZX (und anderen Carotinoiden), die in der
Netzhaut der Vögel
einer jeden der in Beispiel 5 beschriebenen unterschiedlichen Futtergruppen
abgelagert wird, zu bestimmen.
-
Um
derartige Analysen durchzuführen,
wurden Vögel,
die aus carotinoidarmen Eier geschlüpft waren und die letzten 6
Monate mit dem entsprechenden Futter ernährt worden waren, durch Genickbruch
getötet. Netzhautgewebe
wurde durch Sektion des herausgeschälten Auges entfernt, und Gewebe
einer einzelnen Netzhaut wurde mithilfe eines Stößels aus Glas oder Polytetrafluorethylen
(TEFLONTM) in 250 destilliertem entionisiertem
Wasser bis zu einem fast homogenen Zustand gemahlen. 10 μl des Homogenats
wurden entnommen und zur Proteinanalyse des Homogenats herangezogen,
um die Resultate der verschiedenen Netzhautproben zu normieren.
250 μm Methanol
mit einem Gehalt von 2 % (Gew./Vol.) Pyrogallol und 50 μl 60 % (Gew./Vol.)
Kaliumhydroxid wurden den verbliebenen 240 μl der Netzhautgewebesuspension
zugesetzt. Das Gemisch wurde in einem Wasserbad bei 70 °C eine Stunde
lang erhitzt, woraufhin 500 μl
von 50 Vol.-%igem Ethanol, gefolgt von 2 ml Hexan, zugesetzt wurden.
Das Gemisch wurde verwirbelt, um es gut durchzumischen, und dann
bei 5 °C
stehen gelassen, bis sich die Trennung vollzog. Die Epiphase (d.h.
die leichtere Phase, die auf der Oberfläche der verbleibenden Flüssigkeit
schwamm), die Hexan und extrahierte Carotinoide, Tocopherole und
Retinole enthielt, wurde entnommen. 2 ml zusätzliches Hexan wurden dem Gewebehomogenat
zugesetzt, und das Gemisch wurde erneut verwirbelt und trennen gelassen.
Diese Epiphase wurde entnommen und mit der ersten vereinigt. Dieser
Vorgang wurde einmal mehr in einem dritten Extraktionszyklus wiederholt,
um die völlige
Extraktion der Carotinoide, Tocopherole und Retinoide zu gewährleisten.
-
Die
vereinigten Hexanextrakte wurden dann mit 1 ml Wasser gewaschen,
um die Kaliumhydroxidrückstände zu entfernen.
1 ml zusätzliches
Hexan wurde dem Hexan-Wasser-Gemisch
zugesetzt, woraufhin die Hexanphase (Epiphase) vorsichtig herauspipettiert
wurde. Das Hexan wurde dann unter einem konstanten Stickstoffgasstrom
abgedampft. Der verbleibende Rückstand
enthielt Carotinoide, Tocopherole, Retinole und andere nichtidentifizierte,
Hexan-extrahierbare Verbindungen. Dieser Rückstand wurde dann in einem
Lösungsmittel
(Methanol:Chloroform:Triethylamin) gelöst und durch HPLC so wie oben
beschrieben analysiert.
-
Die
Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt, in der ebenso die Schädigungsgrade
nach der Bestrahlung mit hochintensivem Licht aufgezeigt werden.
-
-
ND:
Nicht nachgewiesen in diesen Proben. Eine luteinähnliche Verbindung wurde nachgewiesen,
aber anscheinend handelte es sich nicht um Lutein, was durch die
HPLC-Retentionszeit und ein Photodiodengruppenscanning des betreffenden
Peaks ermittelt wurde.
-
Es
sollte festgehalten werden, dass β-Carotin
in keiner Netzhaut nachgewiesen wurde, die Vögeln, die jeweils mit einem
der beschriebenen Futtermittel ernährt worden waren, entnommen
wurde.
-
Die
in Tabelle 2 aufgeführten
Netzhaut-Konzentrationen weisen darauf hin, dass das oral eingenommene
R-R-Zeaxanthin, gebildet durch Fermentation von Abkömmlingszellen
von Flavobacterium multivorum (ATCC-Zugriffsnummer 55238) tatsächlich in
der Netzhaut der Versuchstiere abgelagert wurden, die R-R-Zeaxanthin
als Nahrungsmittelergänzung
in Form eines Futterzusatzstoffs erhielten. Es handelt sich hierbei
um wichtige Erkenntnisse, da ZX normal verdaut werden muss, dann
muss es die Darmbarriere überwinden,
in den Blutkreislauf eintreten und von den Netzhautzellen in den
Augen der Vögel
in ausreichenden Mengen aufgenommen werden, um das Netzhautgewebe
vor phototoxischen Schäden
zu schützen.
All diese Hürden
wurden von den hierin beschriebenen bakteriell fermentierten R-R-Zeaxanthin-Präparaten
erfolgreich genommen.
-
Beispiel 7: Schutz der
Netzhaut durch R-R-Zeaxanthin
-
Einige
der Vögel
in jeder der Futtergruppen wurden für einen 28-stündigen Zeitraum
hochintensivem sichtbarem Licht bei 2.000 bis 3.000 lux ausgesetzt,
wobei Zyklen eingesetzt wurden, die eine Stunde Licht gefolgt von
2 Stunden fast völliger
Dunkelheit umfassten. Nach dem Lichtzyklus-Zeitraum wurden die Vögel für einen
Zeitraum von 14 Stunden in fast völliger Dunkelheit gelassen,
bevor sie getötet
wurden. Durch vorläufige
Tests wurde ermittelt, dass dieses Ausmaß der hochintensiven Lichtbe strahlung
ernsthafte bleibende Schäden
bei Vögeln
der carotinoidarmen Gruppe und mäßige Schäden bei
Vögeln
der Kontrollgruppe (normales Futter) verursacht. Bei vorläufigen Tests
wurde außerdem
ermittelt, dass der Zeitraum von 14 Stunden nach der Lichtbestrahlung
notwendig ist, um die größtmögliche Anzahl
der apoptotischen Zapfennuclei bei ungeschützten Vögeln (mit Carotinoidmangel)
zu messen.
-
Mit
Kontrollfutter ernährte
Vögel wiesen
eine maximale Apoptose etwa 24 Stunden nach der Bestrahlung, während die
mit ZX-ergänztem
Futter ernährten
Vögel eine
maximale Apoptose nach einem sehr viel längeren Zeitraum als 24 Stunden
aufwiesen. Die Verlängerung
der Zeit, die vergeht, bis eine Schädigung gemessen werden kann,
ist selbst ein aussagekräftiger
Indikator für
die schützende
Wirkung von ZX.
-
Die
Netzhäute
dieser Vögel
wurde durch Mikrosektion isoliert, in Xylol fixiert und in Ethanol
entwässert, bevor
sie in Paraplast (Oxford, 56 °C)
eingebettet wurden. Das Netzhautgewebe in Paraplast wurde dann seziert
und durch das Verfahren von Gallyas, 1990, oder durch Propidiumiodid
gefärbt,
um die pyknotischen Kerne, die für
Apoptose typisch sind, sichtbar zu machen. Die Anzahl der pyknotischen
Kerne, die in einem einzigen mikroskopischen Feld mit 400x (linearer)
Vergrößerung zu
sehen waren, wurden gezählt.
Die Nuclei in zumindest 6 bis 8 getrennten Feldern wurden für jede Behandlungsgruppe
gezählt
und die Werte gemittelt.
-
Die
Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen eindeutig, dass der Netzhautzelltod
und die -schädigungen
wie folgt waren: (1) durch das bakteriell synthetisierte R-R-Zeaxanthin
im Vergleich zu Vögeln,
die normales Futter erhielten, deutlich reduziert und/oder zeitverzögert, auch
beim niedrigen ZX(+5)-Dosierungsniveau; (2) durch die höhere ZX(+50)-Dosierung
noch stärker
reduziert. Die völlige
Abwesenheit von pyknotischen Kernen in der Netzhaut der ZX(+50)-Behandlungsgruppe
liefert einen überzeugenden
Grund zur Annahme, dass R-R-Zeaxanthin aus der F.-multivorum-Zelllinie (ATCC-Zugriffsnummer
55238) einen wichtigen und außergewöhnlichen
Durchbruch im Schutz der Netzhautzellen vor phototoxischer Schädigung darstellt.
Nach bestem Wissen und Gewissen der Anmelder war kein anderer Wirkstoff,
der jemals getestet wurde, in der Lage war, ein derartiges Ausmaß an Schutz
zu bieten oder auch nur annähernd
erreichen.
-
Beispiel 8: Direkter Vergleich
von R-R- Zeaxanthin mit β-Carotin
bei der Schutzwirkung auf das Netzhautgewebe
-
Wie
oben angedeutet wurden Vögel
der Futtergruppe BC+ mit einer Dosis β-Carotin (50 mg pro kg Futter)
gefüttert,
die der Zeaxanthin-Dosis in der ZX(+50)-Gruppe entsprach. Dies ermöglichte
den direkten Vergleich von β-Carotin
mit ZX bezüglich
des für
die Netzhautzellen gebotenen Schutzes vor phototoxischen Schäden.
-
Die
Ergebnisse zeigten auf, dass die phototoxischen Schäden in der
(BC+)-Gruppe nur minimal verringert waren (im Schnitt etwa 10 %
oder weniger). Verglichen mit den Standardabweichungen in der Kontrollgruppe
waren diese Ergebnisse statistisch nicht signifikant; die Wahrscheinlichkeit,
dass diese kleinen Verringerungen ausschließlich auf zufällige Schwankungen
zurückzuführen waren,
lag bei 0,12 bis 0,14.
-
Die
Tatsache, dass β-Carotin
nicht imstande war, einen besseren Schutz für das Netzhautgewebe vor phototoxischer
Schädigung
zu bieten, während
R-R-Zeaxanthin in derselben Dosierung eine insgesamt 100%ige Reduktion
desselben Indikators von Zellschädigung
und Zelltod erzielte, stellt die Bedeutsamkeit dieser Entdeckung
deutlich unter Beweis. Durch mikrobielle Fermentation synthetisiertes
Zeaxanthin stellt einen wichtigen Durchbruch dar, der jeden bisher
bekannten Wirkstoff bei weitem übertrifft.
-
Beispiel 9: Bildung von
Absorptionsverstärkern
-
Zeaxanthin-hältige "Mizellen", deren Durchmesser
kleiner als ein Mikrometer ist und die ausschließlich das gewünschte R-R-Isomer
von Zeaxanthin enthalten, können
sowohl aus dem Lösungsmittelextrakt
von Biomasse oder dem öligen
Fluid erhalten werden, so wie in Beispiel 3 beschreiben, unter Verwendung
von bestimmten Arten von Gallensalzen, so wie in Olsen, 1994, beschrieben.
Ein R-R-Zeaxanthin enthaltendes öliges Fluid
kann mit einem geeigneten Gallensalz gemischt werden, wie beispielsweise
die Phosphatsalze von Glyko- oder Taurocholat, käuflich zu erwerben bei Marcor
Development Company in Hackensack, New Jersey, oder durch Verwendung
von Gallenblasenextrakten, die Gemische aus Gallensalzen enthalten,
wie sie beispielsweise von Salzman Corporation in Davenport, Iowa,
angeboten werden. Dieses Gallenmaterial kann entweder mit dem Lösungsmittelextrakt
oder der öligen
Masse und mit bestimmten anderen Salzen, einschließlich Natriumchlorid,
Calciumchlorid oder Kaliumchlorid, gemischt werden. Dieses Gemisch
wird dann in einem mechanischen Homogenisator verarbeitet, der Mischvorrichtungen,
wie beispielsweise rotierende Messer, umfasst, bei einer Rotationsgeschwindigkeit
und für
eine Dauer, die durch Routineversuche durch Analyse der Größenbereiche
der Mizellen, die sich durch bestimmte Kombinationen von Messergrößen und
-formen, Rotationsgeschwindigkeiten und Dauer ergeben, optimiert
werden können.
Die resultierenden Mizellen werden, falls nötig, getrocknet, bis sie lösungsmittelfrei
waren, und daraufhin bis zu jeglicher gewünschten Konzentration unter
Verwendung eines Trägers
oder einer Verdünnungsflüssigkeit,
wie beispielsweise Pflanzenöl,
verdünnt.
Dieses Gemisch kann dann in eine Kapsel oder eine andere Vorrichtung
eingeschlossen werden, die das Schlucken erleichtert und dazu beiträgt, die
resultierenden Mizellen vor einem Abbau durch Magensäure zu schützen.
-
Andere
Emulgatoren und Lipide können
ebenfalls für
zur Bildung von Emulsionen mit kleinen Teilchengrößen eingesetzt
werden. Nichtionische Detergenzien, wie beispielsweise Tweene und
Spans, so wie in Olsen, 1994, beschreiben, genauso wie Lipidmaterialien,
wie beispielsweise Phospholipide und Sphingolipide, die Lipidvesikel
von kleiner (unter 1 Mikrometer) Größe bilden, können eingesetzt
werden.
-
Beispiel 10: In Mikrokapseln
eingeschlossenes Zeaxanthin
-
In
diesem Beispiel wird die Herstellung von Zeaxanthin in Form von
Mikrokapseln beschrieben. Mikrokapseln sind feste Teilchen von einer
Größe von 10
bis 1.000 μm,
die aus einem Kernmaterial (wie beispielsweise R-R-Zeaxanthin) bestehen,
das in ei nem Umhüllungsmaterial
oder einer Hülle
eingeschlossenen ist, die aus verschiedenen Verbindungen, wie beispielsweise
Gelatine, Gummi arabicum, Stärke
oder Zein (ein Maisprotein), hergestellt werden kann. Bei der Herstellung
des Hüllmaterials
können
auch andere Verbindungen zugesetzt werden, um die Beibehaltung der
Form, der Struktur, der Stabilität
oder anderer gewünschter Eigenschaften
des resultierenden Präparats
zu unterstützen.
Derartige Verbindungen können
Emulgatoren, Sorbit, Antioxidantien, wie beispielsweise TBHQ oder
2-[1,1-Dimethyl]-1,4-benzoldiol, oder Geliermittel, wie beispielsweise
Carrageen, einschließen.
-
Reines
oder teilweise gereinigtes Zeaxanthin wird in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie beispielsweise Ethanol, Aceton oder THF, gelöst. In Lösung werden dann durch den
Zusatz des gelösten
Zeaxanthins zu Wasser Mikrokristalle mit einem Durchmesser von unter
10 Mikrometern ausgebildet. Dieses Verfahren kann verbessert werden,
wenn während
des Zusetzens von Wasser die Zeaxanthinkristalle im Lösungsmittel in
Gegenwart von Emulgatoren, wie beispielsweise Tween 80, mit hohen
Frequenzen beschallt werden.
-
Haben
sich die Mikrokristalle gebildet, so wird dem Gemisch aus Wasser,
Zeaxanthin und Lösungsmittel
das Hüllmaterial
zugesetzt. Bei einigen Hüllmaterialien,
wie beispielsweise Gelatine, ist es notwendig, das Gemisch für bis zu
zwei Stunden bei hohen Temperaturen von 60 °C zu halten. Hat sich das Hüllmaterial zur
Gänze gelöst, so wird
das gesamte Gemisch für
einen Zeitraum von 5 bis 10 Minuten in eine Beschallungsvorrichtug
eingebracht, um die Kristalle erneut zu emulgieren.
-
Die
Bildung der Mikrokapseln wird durch Trocknen des Gemischs aus Kern-
und Hüllmaterial
unter Einsatz eines beliebigen geeigneten Trocknungsverfahren, wie
beispielsweise Sprühtrocknen,
oder die Verwendung einer Drehscheibe nach dem Verfahren von Sparks
et al., so wie im U.S.-Patent Nr. 4,675,140 beschrieben, ausgeführt. Sprühtrockner
finden in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie weit verbreitet
Anwendung. Die Drehscheibe ist ein Gerät, das aus einer Scheibe (etwa
4" im Durchmesser),
die bei einer bestimmten Temperatur unter kontrollierten Bedingungen
gehalten werden kann, besteht. Sie kann mit verschiedenen Geschwindigkeiten in
einem Bereich von 1.000 bis 10.000 Umdrehungen pro Minute (U/min)
betrieben werden. Ein Gemisch aus Kern- und Hüllmaterial wird auf die Mitte
der Scheibe zugefügt,
während
sich diese mit einer Geschwindigkeit von beispielsweise 4.000 U/min
dreht. Die Mikrokapseln werden ausgebildet, wenn die Flüssigkeit
in Kontakt mit der erwärmten
Drehscheibe kommt. Durch die Zentrifugalkraft werden die Mikrokapseln
vom Mittelpunkt der Scheibe weg ausgeworfen und auf einer flachen
Oberfläche,
die zuvor mit einem "Sammel"- oder "Auffang"-Mittel, wie beispielsweise
hydrophober Stärke
oder Dextrin, beschichtet wurden, gesammelt. Die Mikrokapseln werden
daraufhin durch Sieben nach Größe vom Auffangmittel
getrennt. Die Mikrokapseln werden in ein Behältnis gegeben, um sie vor Licht
und Luft zu schützen,
und unter Kühlbedingungen
gelagert, bevor sie in Kapseln zur oralen Einnahme portioniert werden.
-
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-
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