DE69632898T2

DE69632898T2 - 3R-3'R Diastereoisomer von Zeaxanthin zur Behandlung von der Degeneration der Macula

Info

Publication number: DE69632898T2
Application number: DE69632898T
Authority: DE
Inventors: Kevin M. Garnett; Dennis L. Gierhart; Luis H. Guerra-Santos
Original assignee: ZeaVision LLC
Current assignee: ZeaVision LLC
Priority date: 1995-10-31
Filing date: 1996-10-31
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2016-11-01
Also published as: EP0774251A3; EP0774251B1; DE69632898D1; ES2225863T3; CA2188983C; ATE270882T1; DK0774251T3; TW586930B; EP0774251A2; CA2188983A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biochemie und betrifft ein bestimmtes Isomer eines als Zeaxanthin bezeichneten (abgekürzt als ZX) Gelbpigments. Wird dieses Pigment Menschen als Arzneimittel oder Vitamin verabreicht, so kann damit eine Krankheit namens Makuladegeneration, die die Netzhaut schädigt und zu Erblindung führen kann, behandelt oder dieser vorgebeugt werden.
Die Netzhaut ist jenes Gewebe, das den hinteren Bereich des Augapfels auskleidet. Sie ist komplex aufgebaut und enthält ein Dutzend einzelner Schichten. In zahlreichen medizinischen Lehrbüchern, wie beispielsweise Gittinger, 1998, und Vaughn und Asbury, 1992, (die vollständigen Literaturangaben sind nachstehend angeführt), wird sie beschrieben und veranschaulichend dargestellt.
Eine spezielle kreisförmige Region, Makula genannt, mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 1,5 mm beim Menschen befindet sich in der Mitte der Netzhaut. Die Makula weist zwei Merkmale auf, die sie von der restlichen Netzhaut unterscheiden. Erstens enthält die Makula relativ wenige Stäbchen; die meisten ihrer Photorezeptoren sind zapfenförmig (in der Fovea im Zentrum der Makula befinden sich gar keine Stäbchen). Zweitens ist die Makula aufgrund zweier Pigmente namens Lutein und Zeaxanthin von deutlich gelber Farbe. Beide gehören zur Molekülklasse der "Carotinoide". Die Chemie dieser Carotinoidpigmente wird nachstehend anschließend an die Zusammenfassung von Makuladegeneration erörtert.
Makuladegeneration
"Makuladegeneration" bezieht sich auf jegliche Erkrankung, die eine fortschreitende Beschädigung der Netzhautzellen oder Photorezeptorzapfen in der gelben Makularegion im Zentrum der Netzhaut mit sich bringt. Dies wird in Artikeln und Texten, wie beispielsweise Taylor, 1993, Gittinger, 1998, und Vaughn und Asbury, 1992, beschrieben und veranschaulicht.
Es gibt verschiedene Arten von Makuladegeneration. Die häufigste Art ist die der "altersbedingten Makuladegeneration", die üblicherweise mit AMD (oder in einigen Artikeln mit ARMD) abgekürzt wird. AMD kann zu einer Beeinträchtigung des Sehvermögens von leichter Sehschwäche bis hin zu Erblindung führen.
Es gibt zwei Formen von AMD, die häufig als "feuchte" bzw. "trockene" Form bezeichnet werden. Die feuchte Form beinhaltet ein starkes Hineinwachsen der Kapillaren und anderer Blutgefäße in die Netzhaut, bis die Blutgefäße platzen und die korrekte Anordnung der Netzhautschichten zerstören. Obwohl diese Form von AMD in einigen Fällen durch Verschließen der sich neu bildenden Blutgefäße mittels Laser behandelt werden kann, kann die Laserbehandlung das Blutgefäßwachstum nur zeitweilig verzögern und üblicherweise den letztendlichen Verlust des fast gesamten Sehvermögens nicht verhindern; feuchte AMD führt fast immer zu totaler oder fast totaler Erblindung. Die feuchte Form tritt jedoch nur bei 5 – 10 % aller AMD-Patienten auf.
Die andere Form von AMD wird als "trockene" AMD bezeichnet. Da es sich in zumindest 90 % aller AMD-Fälle um diese Form handelt, wird sie oft einfach nur als AMD bezeichnet. Auch wenn diese AMD-Form normalerweise nicht zur völligen Erblindung führt, kann sie das Augenlicht eines Patienten stark beeinträchtigen, und der Patient ist weder zum Lesen noch zum Erkennen wohl bekannter Objekte, wie beispielsweise die Gesichter von Freunden und Verwandten, fähig. Als solche führt sie häufig zu funktioneller Blindheit, wodurch Menschen nicht mehr Autofahren oder gefahrlos in der Öffentlichkeit gehen und keine normalen Tätigkeiten ausführen können.
Es gibt verschiedene andere Erkrankungen, die eine Makuladegeneration als Symptom einschließen, unter anderem das Stargardt-Syndrom, die Best-Krankheit, das Batten-Syndrom, das Sjögren-Larsson-Syndrom, die Stäbchen-Zapfen-Dystrophie und ovine Ceroid-Lipofuszinose. Artikel, die jedes davon beschreiben, sind in Dorey et al., 1993, angeführt. Zudem stehen auch noch andere Krankheiten, die Lysosom- Speicherungsschwierigkeiten (wie beispielsweise das Tay-Sach-Syndrom) oder progressive Nervenzellendegeneration beinhalten (wie beispielsweise die Alzheimer-Krankheit), in Verbindung mit einer Makuladegeneration.
Viele dieser Erkrankungen implizieren genetische Komponenten, was durch Vererbung gezeigt wird; einige der Gene, die diese Krankheiten auslösen, sind isoliert worden, und genetische Screening-Untersuchungen können anzeigen, ob eine Person über dieses defekte Gen verfügt. Für jede Person, die Träger oder wahrscheinlicher Träger eines solchen Gens ist, was durch einen Gentest oder die Krankheitsgeschichte der Familie nachgewiesen werden kann, besteht ein erhöhtes Risiko, an Makuladegeneration zu erkranken.
AMD fügt daran erkrankten Personen, die langsam ihr Augenlicht verlieren, schreckliches Leid zu. Jährlich fallen Kosten in Höhe von Milliarden von Dollar an, sowohl in Form von Produktivitätsausfall als auch in Form von Belastungen für Familienmitglieder, Versicherungen, Sozialeinrichtungen und für Andere, die medizinische Pflege und sonstige Unterstützungen für Blinde oder Menschen mit starker Beeinträchtigung ihrer Sehkraft bereitstellen oder mitfinanzieren müssen.
Angesichts dieser von AMD verursachten Schwierigkeiten suchten Wissenschaftler und Ärzte jahrzehntelang nach Wegen der Behandlung oder Vorbeugung von Erblindung oder anderen Formen des Verlusts an Sehstärke, die von Makuladegeneration verursacht werden. Trotz dieser mehr als fünfzig Jahre dauernden Bemühungen stehen bis heute keine wirksamen Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung.
Diagnose: Drusen und Lipofuszin
Makuladegeneration wird üblicherweise durch spezielle Fotos der Netzhaut diagnostiziert. Bei einer Art von Diagnoseverfahren injiziert ein Arzt ein fluoreszierendes Medikament in einen Patienten und gibt dem Medikament Zeit, um im Patienten zu zirkulieren, woraufhin eine vergrößertes Bild der Netzhaut, genannt Angiogramm, auf genommen wird. Dann analysiert der Arzt das Foto, um die Gegenwart eines oder beider Typen von Zellbruchstücken zu bestimmen.
Ein Typ von Zellbruchstücken, der seit mehreren Jahrzehnten bekannt ist und untersucht wird, wird als Drusen bezeichnet. Diese liegen in zwei unterschiedlichen Formen vor. Eine kleine Menge an harten Drusen (kleine Teilchen mit einem Durchmesser von weniger 63 Mikrometern) ist üblicherweise in den Augen eines jeden Über-Vierzigjährigen vorhanden. Solange harte Drusen nicht in einer über normalen Werten liegenden Menge vorhanden sind, weist dies auf keine Netzhautschädigung hin.
Im Gegensatz dazu weist ein bedeutende Menge an größeren, weichen Drusenablagerungen (auch als feuchte Drusen bezeichnet) darauf hin, dass eine starke Netzhautschädigung vorliegt oder einzusetzen beginnt, da große Klumpen weicher Drusen die Netzhautschichten zum Bersten oder durcheinander bringen können und verhindern können, dass die Netzhautzellen angemessene Nahrung aus dem Blut erhalten. Von einem Patienten, dessen Netzhaut eine bedeutende Menge an weichen Drusen aufweist, wird üblicherweise angenommen, dass er unter Makuladegeneration leidet.
Der andere Typ von Zellbruchstücken, der üblicherweise bei Patienten mit Makuladegeneration vorhanden ist, wird als Lipofuszin bezeichnet. Der Zusammenhang zwischen Lipofuszin und AMD ist erst vor kurzem geklärt worden (z.B. Weiter et al., 1988, und Dorey et al., 1993).
Chemie der Carotinoide
"Carotinoide" umfassen eine große Molekülklasse; in der Natur wurden über 600 Carotinoide identifiziert. Diese Moleküle weisen einige gemeinsame Merkmale auf, unter anderem die folgenden:

1. Carotinoide entstehen durch Koppeln von Isoprenmolekülen, einem 5-Kohlenstoffmolekül. Da der Grundbaustein 5 Kohlenstoffatome enthält, enthalten die meisten Carotinoide ein Vielfaches von 5 Kohlenstoffatomen.
2. Carotinoide weisen mehrere ungesättigte Bindungen auf. Dies ermöglicht ihnen die Absorption von Hochenergie-Lichtwellen in den blauen und nahultravioletten Bereichen des Spektrums.
3. Da Carotinoide Wellenlängen im blauen und nah-ultravioletten Bereich des Spektrums absorbieren, ohne längere Wellenlängen in anderen Bereichen des Spektrums zu absorbieren, sind Carotinoide üblicherweise von gelber, oranger, brauner oder roter Farbe. Die Bezeichnung "Carotinoid" rührt von Karotten her; die ersten bekannten Carotinoide wurden als jene Pigmente identifiziert, die den Karotten ihre orange Farbe verleihen. Die von Carotinoiden in Lösung verursachte Farbe hängt von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Konzentration und Gegenwart von anderen Chemikalien, ab.
4. Carotinoide verfügen über "konjugierte" Doppelbindungen. Dies weist darauf hin, dass die Doppelbindungen mit Einfachbindungen alternieren, sodass jedes Kohlenstoffatom in einer Kette in Doppelbindung an ein anderes Kohlenstoffatom gebunden ist, aber kein Kohlenstoffatom an zwei andere Kohlenstoffatome in Doppelbindung gebunden ist. Diese Anordnung wird bei Betrachtung von 1 besser verständlich, in der die Struktur von β-Carotin, ZX und Lutein abgebildet ist.

Verschiedene Carotinoide weisen verschiedene Konjugationsgrade auf, und im Allgemeinen bietet ein höher konjugiertes Molekül besseren Schutz vor "phototoxischer" Schädigung durch Hochenergie-Lichtbestrahlung. Bei den drei in 1 dargestellten Carotinoiden beispielsweise ist der gesamte unverzweigte Kettenabschnitt eines jeden konjugiert, mit alternierenden Doppel- und Einfachbindungen. Bei β-Carotin und ZX erstreckt sich die Konjugation bis hin zu den ersten Bindungen an beiden Endringen. Lutein hingegen weist einen niedrigeren Konjugationsgrad auf, da die Doppelbindung an einem seiner Endringe nicht die richtige Platzierung für eine vollständige Konjugation aufweist. Der einzige Unterschied zwischen ZX und Lutein liegt in der Stelle der Doppelbindung an einem (aber nicht beiden) der Endringe.
Da Carotinoide zur Absorption von potentiell schädlicher Energie von blauem und nah-ultraviolettem Licht konzipiert und selektiert sind (durch die Evolution), werden sie in der Natur als Schutzpigmente eingesetzt. In Pflanzen kommen sie in großen Mengen vor, da es einer der Hauptziele von Pflanzen ist, so viel Sonnenlicht wie möglich zu absorbieren und gleichzeitig die von blauer, ultravioletter und nah-ultravioletter Strahlung verursachten Zellschäden zu minimieren. Pflanzenschädigungen durch ultraviolette Strahlung stellen ein großes Problem dar, und Carotinoide helfen dabei, es zu minimieren.
Da Carotinoide zum Schutz vor phototoxischer Schädigung gut geeignet sind, haben auch Tiere (durch die Evolution) Wege entwickelt, Carotinoide als lichtschützende Pigmente zu verwenden. Da Tiere nicht imstande sind, Carotinoide im Körper herzustellen, müssen sie Carotinoide (oder Carotinoid-Vorläufer) pflanzlicher Herkunft zu sich nehmen. β-Carotin ist ein Beispiel hierfür; Säugetiere müssen es aus Pflanzen oder Fleisch gewinnen. Befindet sich β-Carotinoid erst im Körper eines Säugers, wird es in andere Molekülformen umgewandelt, unter anderem in Vitamin A (Retinol), das durch Teilen von β-Carotin in zwei Hälften gebildet wird.
Carotinoide werden in zwei Hauptklassen eingeteilt, in Carotine und Xanthophylle. Carotine enthalten keinen Sauerstoff; sie sind echte Kohlenhydrate, die nur aus Kohlenstoff und Wasserstoff bestehen. Xanthophylle (wie beispielsweise ZX und Lutein) hingegen enthalten zudem Sauerstoff.
1 zeigt die Nummerierung der Kohlenstoffatome im rechten und linken Endring von ZX. Es ist üblich, die Kohlenstoffatome im linken Ring mit 1 bis 6 durchzunummerieren, während jene im rechten Ring mit "Strich"-Nummern, wie beispielsweise das 3'-Kohlenstoffatom (als "drei Strich" ausgesprochen), bezeichnet werden. Da ZX was das linke und rechte Ende betrifft völlig symmetrisch ist, sind die Bezeichnungen "rechts" und "links" reine Konvention zur Vereinfachung der Beschreibung. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass Lutein nicht symmetrisch ist; die Position der Doppelbindung im "linken" Ring entspricht nicht der Platzierung der Doppelbindung im "rechten" Ring.
Da ZX durch Addieren zweier Hydroxygruppen an den mit 3 nummerierten Kohlenstoffatomen an beiden Enden von β-Carotin gebildet wird, lautet sein chemischer Name 3,3'-Dihydroxy-β-β-carotin; einige Chemiker bezeichnen es als Carotindiol. Diesem Molekül wurde der Name "Zeaxanthin" gegeben, da es zuerst als jenes Pigment identifiziert worden ist, das Mais seine gelbe Farbe verleiht, und die wissenschaftliche Bezeichnung für Mais lautet Zea mays.
Wie zuvor festgehalten wurde, sind mehr als 600 Carotinoide in der Natur identifiziert worden. Mehrere Dutzend davon sind in Biochemie und Handel von Bedeutung. ZX und Lutein sind in dieser Erfindung von besonderer Wichtigkeit, da sie in der Netzhaut von Säugern und den meisten anderen Tieren zugegen sind.
Lutein ist im Handel sehr wichtig, da die Fütterung dessen (in Form von Pflanzenextrakten, insbesondere von Ringelblumen) an Hühner weit verbreitet ist, um ihrer Haut und dem Eidotter eine gelbere Farbe zu geben, die Käufer und Konsumenten anspricht.
ZX kann denselben Effekt haben und ist noch wirkungsvoller als Lutein, jedoch waren ZX-Quellen zu kostspielig, um sie in Hühnerfutter einzusetzen. Die U.S.-Patente Nr. 5.308.759 und Nr. 5.427.783 zielten darauf ab, dem Problem des zu teuren ZX für Tierfutter Herr zu werden. Diese Patente betreffen den Einsatz von Bakterien zur Herstellung von ZX in wirtschaftlichen Mengen, sodass es zur Fütterung von Geflügel und Fisch eingesetzt werden kann.
Abgesehen von Pflanzen werden Carotinoide auch von bestimmten Bakterien synthetisiert. Diese Bakterien entwickelten sich in Regionen, die direktem Sonnenlicht ausgesetzt sind, und ihre Carotinoide üben dieselbe lichtschützende Rolle aus wie jene von Pflanzen. Publikationen, die Carotinoide von Bakterien beschreiben, sind unter anderem McDermott et al., 1972, das U.S.-Patent Nr. 5.429.939 (Misawa et al., 1995) und weitere in der Liste der Literaturverweise angeführte Artikel.
Das U.S.-Patent Nr. 5.429.939 (Misawa et al., 1995) listet die DNA-Sequenzen einer Reihe von Genen auf, die für Enzyme kodieren, die in der Biosynthese verschiedener Carotinoide, einschließlich ZX, eine Rolle spielen. Die Rolle eines jeden Hauptgens (einschließlich crtE, crtB, crtI, crtY und crtZ) bei der Bildung von ZX wird ebenfalls beschrieben. Zellen, die Plasmide mit diesen darin enthaltenen Genen umfassen, wurden in der American Type Culture Collection (wie beispielsweise Erwinia uredovora, ATCC 19321, und Erwinia herbicola, ATCC 39368) und im Fermentation Research Institute in Japan (z.B. E. coli, FERM BP 2377) hinterlegt.
Zeaxanthin-Stereochemie und -Isomere
Ein wichtiger Aspekt der Chemie von Carotinoiden beinhaltet "Stereochemie" und "Stereoisomere". Dieses Thema wird in jedem Universitätslehrbuch über organische Chemie abgehandelt.
Da die 3- und 3'-Kohlenstoffatome in ZX chiral sind, hat es vier mögliche Stereoisomere. Im 3R-3'R-Isomer weisen die 3- und 3'-Kohlenstoffatome beide eine R-Konfiguration auf. Im 3S-3'S-Isomer weisen die 3- und 3'-Kohlenstoffatome beide eine S-Konfiguration auf. Der Einfachheit halber werden diese beiden Stereoisomere hierin als R-R-Isomer und als S-S-Isomer bezeichnet.
Das dritte und vierte Isomer sind die beiden "Misch"- oder "Meso"-Isomere (ein R und ein S): das 3R-3'S-Isomer und das 3S-3'R-Isomer. Da ZX von seinem Mittelpunkt ausgehend völlig symmetrisch ausgerichtet ist, sind diese beiden Isomere in jeder Hinsicht identisch; wird das 3R-3'S-Isomer auf ein Blatt Papier gezeichnet und dieses gedreht, so erhält man das 3S-3'R-Isomer. Tatsächlich wird durch die S-R- und R-S-Isomere ein einziges "Meso"-Isomer gebildet.
Werden Standardverfahren der chemischen Synthese zur Herstellung ZX eingesetzt, so ist jedes der vier möglichen Isomere als etwa 25 % der Gesamtmenge gegenwärtig. Da aber die S-R- und R-S-Isomere tatsächlich identisch sind, macht ihr "Meso"-Isomer etwa 50 % der Gesamtmenge aus, währen die R-R- und S-S-Isomere zu jeweils 25 % gegenwärtig sind. Ein Gemisch aus allen drei Stereoisomeren wird als "racemisches" Gemisch bezeichnet.
Die Zell- und Enzymspezifität von Carotinoiden im Netzhautgewebe ist jedoch höchst präzise, und verschiedene Isomere oder Stereoisomere sind nicht austauschbar. Lutein und ZX werden von den Netzhautzellen als völlig andere und unterschiedliche Moleküle behandelt, obwohl sie in der herkömmlichen chemischen Terminologie als Isomere voneinander betrachtet werden (da sie gleiche Anzahl an Kohlenstoffatomen, Wasserstoffatomen und Sauerstoffatomen aufweisen).
Aufgrund von chemischen Faktoren sind Stereoisomere die hierin einzig relevanten Isomere. Jeder Verweis auf ein "Isomer" von Zeaxanthin bezieht sich hierin auf ein bestimmtes Stereoisomer von ZX und schließt Lutein nicht ein. Lutein und ZX werden als völlig unterschiedliche Carotinoide betrachtet.
Stereoisomerische Unterschiede bei Carotinoiden sind, auch wenn sie klein, subtil und unbedeutend erscheinen mögen, in Wahrheit von größter Bedeutung, wenn es um das Netzhautgewebe geht. Anscheinend ist das R-R-Isomer (das 3R-3'R-Stereoisomer) das einzige ZX-Stereoisomer, das von menschlichen Netzhautzellen richtig aufgenommen und verwendet wird.
Es gab Berichte darüber, dass Spuren des Meso-(R-S-)Isomers von ZX in Netzhautgewebe gefunden worden sind. Diese Spurenmengen sind jedoch bestimmten molekularen Umwandlungen, die unter gewissen Bedingungen spontan auftreten können, zuzuschreiben, die zur Bildung von Meso-Zeaxanthin aus Luteinvorläufern führen (Bone et al., 1993 und 1994).
Im Labor können die ZX-Stereoisomere unter Verwendung von Verfahren, wie beispielsweise chirale Säulenchromatographie (Bone et al., 1993) oder Zirkulardichroismus-Analyse (Britton, 1994), voneinander unterschieden werden.
Zeaxanthin und Lutein in der Makula
Um 1970 war die Rolle von Carotinoiden im Schutz von Pflanzen vor phototoxischen Schäden wohl bekannt. Ebenfalls bekannt war, dass Carotinoide in tierischem Gewebe gegenwärtig sind und dass alle Carotinoide in Tieren ursprünglich pflanzlicher Herkunft sind, da Tiere Carotinoide nicht selbst herstellen können. Auf der Grundlage dieses Wissens wiesen verschiedene Artikel auf die Ähnlichkeiten zwischen Carotinoiden in Tieren und Pflanzen hin und zogen den Schluss, dass Carotinoide Schutz vor phototoxischen Schäden bei Tieren bieten.
Nachdem die lichtschützende Rolle von Carotinoiden bei Tieren erkannt worden war, begannen Forscher die Chemie und die Rolle von Carotinoiden in der Netzhaut zu untersuchen. Eine Versuchsreihe beinhaltete Tests, bei denen Labortiere mit Futter ohne Gehalt von Carotinoiden, das aus Körnern oder Samen ohne Carotinoidgehalt hergestellt worden war (wie beispielsweise Milo-Samen), gefüttert wurden. Die Ergebnisse zeigten auf, dass die Netzhaut von Labortieren, denen Carotinoid entzogen worden war, keine gelben Makula-Zonen ausbildete und dass die Netzhaut anormal hohe Werte an weichen Drusen aufwies, was auf eine Netzhautschädigung hinweist (Malinow et al., 1980, Kirschfeld, 1982, Ham et al., 1984, und Snodderly et al., 1984). Angesichts dieser Erkenntnisse schlugen die Forscher vor, dass Carotinoide für eine gesunde Netzhaut von essentieller Bedeutung sind. Diese Forscher sammelten Beweise auf molekularer Ebene, die die alte Binsenweisheit, dass Karotten und grünes Blattgemüse gut für die Augen sind, stützen. Jedoch wussten die Forscher noch nicht, ob die Gelbpigmente in der Makula in fertiger Form eingenommen wer den mussten oder ob sie durch Einsatz von anderen Vorläufern, wie beispielsweise β-Carotin oder Lycopin, von Tieren selbst hergestellt werden können.
Lutein wurde 1949 als eines der Gelbpigmente in der Makula identifiziert (Wald, 1949). ZX wurde, genauso wie die anderen Makula-Pigmente, erst viele Jahre später identifiziert (Bone et al., 1985). Artikel, die den Wissensstand über Makula-Pigmente Mitte oder Ende der 1980er zusammenfassen, sind unter anderem Handelman und Dratz, 1986, Werner et al., 1987, Pease et al., 1987, Haegerstrom-Portnoy, 1988, und Handelman et al., 1988. Neben anderen Dingen wurde in diesen Artikeln festgestellt, dass ZX (das zur Gänze konjugiert ist und somit einen etwas besseren Schutz vor Schäden durch Lichtenergie bietet als Lutein) das vorherrschende Pigment in der Fovea, einer kleinen Region im Zentrum der Makula, ist. Die Menge an ZX nimmt schrittweise ab, während die Menge an Lutein zunimmt, wenn man sich konzentrisch von der Fovea weg in Richtung Außenrand der Makula bewegt, sodass im äußeren Randbereich der Makula Lutein als Gelbpigment vorherrscht. Artikel aus jüngerer Zeit, die sich mit verschiedenen Aspekten der Netzhautalterung und -schädigung auseinandersetzen und sich in erster Linie auf Carotinoide als schützende Wirkstoffe in der Netzhaut konzentrieren, schließen Sperduto et al., 1990, Gerster, 1991, Schalch, 1992, und Seddon et al., 1994, ein.
Zusammenfassend gesagt ist nunmehr seit über 10 Jahren bekannt, dass Lutein und ZX die zwei Pigmente in der Makula sind, und Wissenschaftler stellen seit über einem Jahrzehnt Überlegungen darüber an, dass diese Pigment helfen könnten, die Makula vor phototoxischer Schädigung zu schützen.
Obwohl diese Entdeckungen und Annahmen alle vor mehr als 10 Jahren gemacht wurden, hat bisher noch niemand irgendeine Art von Arzneimittel, Nahrungsmittelergänzung oder sonstige Form der Behandlung entwickelt, deren Wirkung als deutlich der schrittweisen Makuladegeneration vorbeugend oder verzögernd (geschweige denn heilend) bekannt ist.
Die vorige Aussage muss etwas eingeschränkt werden, da von β-Carotin, Vitamin A und Vitamin E bekannt ist, dass sie einen bestimmten Grad an positiver Wirkung haben, die den Schutz des Netzhautgewebes unterstützt (vgl. beispielsweise das U.S.-Patent Nr. 5.310.764, Baranowitz et al., 1994, und die zwei nachstehend angeführten Artikel der Eye Disease Case Control Study Group). Diese Patentschriften und Artikel beanspruchten oder vermuteten, dass β-Carotin, Vitamin A und Vitamin E eine nachweisbare Wirkung zur Verhinderung oder Verringerung von mit Makuladegeneration in Zusammenhang stehenden Schäden ausüben.
Derartige Behauptungen mögen zwar aufgrund der allgemeinen oxidationshemmenden Rolle von Carotinoiden, Vitamin A und Vitamin E der Wahrheit entsprechen, doch ist es ebenfalls traurig aber wahr, dass die von β-Carotin, Vitamin A und Vitamin E bereitgestellten positiven Wirkungen auf die Netzhaut sehr eingeschränkt und für eine wirksame Behandlung nicht ausreichend hoch sind. In allen Belangen der Praxis kann Makuladegeneration nicht vorgebeugt oder aufgehalten werden, und sie ist irreversibel. Jedwedes Breitband-Antioxidans (wie beispielsweise β-Carotin, Vitamin A und Vitamin E) ist ein rein palliatives Mittel. Da nichts wirklich Wirksames erhältlich war, wurden diese Vitamine (mit sehr eingeschränktem und unbefriedigendem Erfolg) eingesetzt, um zu versuchen, die unaufhaltsame, durch Makuladegeneration herbeigeführte Schädigung zu verlangsamen.
Als Tatsache, die den Stand der Technik betrifft, sollte angemerkt werden, dass zahlreiche Reformkostläden Carotinoidpräparate führen, die als gut für Augen und Sehvermögen etikettiert sind. Diese Aussage auf Etiketten von Carotinoidgemischen mag sinnvoll sein, da (wie zuvor festgehalten) der Nutzen von β-Carotin und Vitamin A als allgemeine Antioxidantien bekannt ist. Keines der handelsüblichen Carotinoidgemische enthält mehr als äußerst geringe "Spurenmengen" von ZX. Die große Mehrheit der Carotinoide in den Carotinoidgemischen, die in Reformkostläden angeboten werden, sind Nicht-Zeaxanthin-Carotinoide (hauptsächlich β-Carotin und Vitamin A).
Die Standpunkte und Forschungsziele mehrerer wichtiger Regierungsbehörden und Forschungsgemeinschaften sind ebenfalls einen genaueren Blick wert. In den Vereinigten Staaten von Amerika veröffentlichte das National Institute of Health (das durch das National Eye Institute (NEI) und den National Eye Council agierte) kürzlich zwei Berichte mit dem Titel "Vision Research: A National Plan 1994 – 1998", NIH-Publikation Nr. 93–3186 (1994; vgl. insbesondere Seite 55 – 65) und "Age Related Eye Disease Study", NIH-Publikation Nr. 932910 (1993). Beide Publikationen sowie die darin beschriebenen Forschungen konzentrieren sich auf β-Carotin (und nicht ZX) als jene Verbindung, die für die Behandlung von AMD am vielversprechendsten ist. Nach bestem Wissen und Gewissen der Anmelder sind, nach Erörterung des Themas mit Bediensteten des NEI, weder das NEI noch eine andere, mit dem National Institute of Health in Verbindung stehende Organisation bereit, Forschungsvorhaben über Zeaxanthin als potentielle Behandlung von AMD zu finanzieren oder haben dies in letzter Zeit getan. Statt dessen wenden das NIH und andere, mit Steuern finanzierte Organisationen Millionen von Dollar auf, um Forschungen über β-Carotin als das vielversprechendste Kandidatenmittel zur Behandlung und Vorbeugung von AMD durchzuführen.
Andere bekannte Forscher, die sich Aufmerksamkeit verdienen, gehören zur "Eye Disease Case Control Study Group". Diese Gruppe hat kürzlich zwei Artikel mit dem Titel "Antioxidant Status and Neovascular Age-Related Macular Degeneration", Arch. Ophthalmol. 11, 104 – 109 (1993), und "Risk Factors for Neovascular Age-Related Macular Degeneration", Arch. Ophthalmol. 11, 1701 – 1708 (1992), veröffentlicht. So wie in den offiziellen NIH-Berichten wird in keinem dieser Artikel die Verwendung von Zeaxanthin als Arzneimittel zur Behandlung von AMD gelehrt oder vorgeschlagen, und diese Forschungsgemeinschaft hat ebenso die Finanzierung von jedwedem Forschungsvorhaben über ZX als möglichen Wirkstoff in der Behandlung oder Vorbeugung von AMD abgelehnt oder verweigert.
Auch sollte angemerkt werden, dass großes Interesse an Carotinoiden in der Behandlung oder Vorbeugung von Krebs (beginnend mit Peto et al., 1981) sowie in der Vorbeugung von Cholesterinbildung und Reduzierung von Plaqueablagerungen in Arterien (Jialal et al., 1991) besteht. Es gibt einen enormen Bestand an wissenschaftlicher Literatur über die verschiedenen Wirkungen von Carotinoiden, und es bestand großes Interesse an der chemischen Synthese von Carotinoiden, einschließlich von Lutein und ZX. Trotz all dieser Carotinoid-Studien und Synthesebemühungen der letzen Jahrzehnte konnte noch niemand von einem wirksamen Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Makuladegeneration berichten. Angesichts der gewaltigen Kosten und des Leids, das den Patienten und der Gesellschaft durch Makuladegeneration zugefügt wird, handelt es sich hierbei um ein großes Problem, das angegangen werden muss.
Demgemäß stellt die Erfindung einen möglicherweise wichtigen Durchbruch in der Bereitstellung eines (1) sicheren und wirksamen Arzneimittels zur Behandlung von Patienten, bei denen Makuladegeneration diagnostiziert wurde, und einer (2) mit einer Vitaminpille vergleichbaren Nahrungsmittelergänzung, die jeder, der das Risiko der Erkrankung an Makuladegeneration nach dem Erreichen oder Überschreiten der ersten Lebenshälfte reduzieren möchte, einnehmen kann, dar.
Synthese von Lutein und Zeaxanthin: Stand der Technik
Verschiedene Publikationen nach dem Stand der Technik beschreiben Verfahren zur Bildung von ZX. Diese Publikationen können in zwei Kategorien eingeteilt werden: Fermentationsverfahren, in denen Mikroben eine Schlüsselrolle im Herstellungsverfahren spielen; und Nicht-Fermentations-Syntheseverfahren, in denen ausschließlich chemische Reaktionen eingesetzt werden. Die meisten Publikationen nach dem Stand der Technik schlugen die Verwendung von ZX für bekannte Zwecke vor, wie beispielsweise als Zusätze in Geflügel- oder Fischfutter, um die Farbe des Fleischs dunkler und somit attraktiver zu machen. Es scheint, dass keine dieser Bemühungen zur Produktion oder Verkauf von ZX in wirtschaftlichen Mengen führte.
Bis Oktober 1995 bestand die einzige Möglichkeit des Erwerbs von ZX, entweder in gereinigter Form oder in semikonzentrierter Form, in der ZX mehr als etwa 5 Gew.-% ausmacht, darin, Milligramm-Mengen von Unternehmen für chemische Spezialartikel, wie beispielsweise Atomergic Chemicals Corporation (Farmingdale, NY) oder Spectrum Chemicals Manufacturing Company (Gardena, CA) zu kaufen. 1995 beliefen sich die Preise dieser Spezialartikelhersteller für gereinigtes ZX in synthetischen racemischen Gemischen, die die unerwünschten S-S-Isomere und S-R-Isomere enthalten, auf etwa $ 90 bis $ 125 pro Milligramm. Dies ergibt einen Betrag von etwa 100.000 Dollar (U.S.-Währung) pro Gramm von ZX in einem racemischen Gemisch. Es versteht sich von selbst, dass diese Präparate, sowohl aufgrund ihres Preises als auch weil sie große Mengen an unerwünschten und potentiell gefährlichen S-S- und Meso-Isomeren enthalten, kein realistisches Potential für die Verwendung als Arzneimittel oder Nahrungsergänzungen haben. Vor dieser Erfindung ist gereinigtes oder halbgereinigtes R-R-Zeaxanthin schlicht und einfach in keiner Form für die Öffentlichkeit nicht erhältlich.
Publikationen nach dem Stand der Technik, die die ZX-Herstellung unter Einsatz von mikrobieller Fermentation beschreiben, umfassen:

(1) Courington und Goodwin, 1955, der erste bekannte Literaturhinweis, der die ZX-Herstellung durch Bakterien der Gattung Flavobacter beschreibt.
(2) das U.S.-Patent Nr. 3.891.504 (Schocher und Wiss, 1975, übertragen an Hoffmann LaRoche), das ebenfalls die ZX-Herstellung durch Flavobacter-Zellen beschreibt. Diese ZX enthaltenden Zellen wurden an Hühner verfüttert und sorgten für eine geeignete Färbung.
(3) das U.S.-Patent Nr. 3.841.967 (Dasek et al., 1974) und das U.S.-Patent Nr. 3.951.743 (Shepherd et al., 1976). Beide wurden an Nestlé überfragen. Sie beschreiben Verfahren und Nährstoffe, die zur Steigerung der von den Bakterien erzeugten Menge an ZX eingesetzt werden könnten.
(4) zwei jüngere U.S.-Patente (Nr. 5.308.759 und 5.427.783, beide von Gierhart erfunden). Diese Patente beschreiben einen Bakterienstamm (Flavobacterium multivo rum), der aus einem Kanal des Missouri isoliert wurde. Es wurde entdeckt, dass diese Bakterien ZX bilden, ohne wesentliche Mengen an anderen Carotinoiden zu produzieren. Im Kontext von Geflügel- und Fischfutter, um Fleisch und Dotter eine dunklere Farbe zu verleihen, war dies von Bedeutung, da Carotinoide, nachdem sie von einem Tier gefressen worden sind, um die Aufnahme in den Blutkreislauf konkurrieren. Demgemäß könnte die Abwesenheit anderer Carotinoide im von Gierhart identifizierten Bakterienstamm F. multivorum mehr ZX als Pigment für das tierische Gewebe verfügbar machen, wodurch dessen Wirkung und Leistung gesteigert würde.

Das '759-Patent beansprucht Verfahren zur Herstellung von ZX für Geflügel- oder Fischfutter unter Verwendung des Bakterienstamms F. multivorum. Das '783-Patent, ein Ausscheidungspatent, beansprucht die Futtermischungen. Beide Patente sind auf die Verwendung von ZX in Geflügel- oder Fischfutter eingeschränkt, und keines schlägt irgend etwas im Bereich der Verwendung von ZX zur Behandlung von Menschen vor.
Keines der Gierhart-Patente kommentiert spezifische Stereisomere von ZX, und dies aus zwei Gründen: (1) Der Zustand der von den F.-multivorum-Zellen erzeugten ZX-Stereoisomere war 1989, als die Anmeldung eingereicht wurde, noch nicht bekannt, und (2) es gab keinen augenscheinlichen Grund, sich mit verschiedenen Stereoisomeren auseinanderzusetzen, da die Patente ausschließlich die Bildung von ZX zur Verwendung in Geflügel- oder Fischfutter betrafen.
Der Wildtyp-Bakterienstamm F. multivorum wurde bei der ATCC hinterlegt und mit der ATCC-Zugriffsnummer 55238 versehen. Da diese Bakterien eine bestimmte, als Sphingolipide bezeichnete Art von Lipiden generieren, wurden diese Bakterien von der ATCC als Sphingobacterium multivorum neu klassifiziert und sind in ihrem Katalog unter diesem Namen angeführt. Die Bezeichnung Sphingobacterium, die im ATCC-Katalog aufscheint, ist bisher in keinem der Referenzwerke, die als die offiziellen Leitfäden zur mikrobiellen Taxonomie gelten, verwendet worden: Bergy's Manual of Systematic Bacteriology, das als Anhang des International Journal of Systematic Bacteriology erscheint und von diesem auf den neuesten Stand gebracht wird.
Es wurde im Laufe der letzten 20 Jahre von Bemühungen, ZX durch chemische Standard-Syntheseverfahren (ohne Verwendung von Mikroben) herzustellen, berichtet, unter anderem in den U.S.-Patenten Nr. 4.153.615 (Saucy, 1979), Nr. 4.952.716 (Lukac et al., 1990) und Nr. 5.227.507 (Lukac et al., 1993). Diese Verfahren jedoch weisen jedoch ernst zu nehmende Nachteile auf. Üblicherweise bedürfen sie zahlreicher Verfahrensschritte, und jeder Schritt wirft eine Ausbeute von unter 100 % ab, sodass die endgültige ZX-Ausbeute des mehrstufigen Verfahrens relativ gering ist. Zudem werden bei der chemischen Synthese üblicherweise unerwünschte S-S- und S-R-Stereoisomere von ZX sowie verschiedene Umwandlungs- und Abbauprodukte erhalten, wie beispielsweise oxidiertes Zeaxanthin, und die Zeaxanthinmoleküle haben eine oder mehrere der Doppelbindungen im unverzweigten Abschnitt und/oder den Endringen verloren.
Zusammenfassend war vor dieser Erfindung keine für den menschlichen Konsum geeignete Quelle von gereinigtem R-R-Zeaxanthin bekannt, weder als Arzneimittel noch als Nahrungsmittelergänzung.
Wie nachstehend beschrieben wird, können der F.-multivorum-Stamm (ATCC-Zugriffsnummer 55238) und dessen mutagenisierte Abkömmlinge zur Bildung des R-R-Stereoisomers von ZX als einziges nachweisbares Isomer, ohne nachweisbare Mengen an unerwünschten S-S- oder S-R-Stereoisomeren, verwendet werden, um dieses in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung einzusetzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Folgendes bereitgestellt: die Verwendung des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Makuladegeneration beim Menschen, worin zumindest 90 % aller Zeaxanthinmoleküle im Arzneimittel 3R-3'R-Stereoisomere von Zeaxanthin sind und das Arzneimittel in Dosierungsform vorliegt und zumindest 3 mg des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin pro Dosis enthält.
In einem zweiten Aspekt wird Folgendes bereitgestellt: die Verwendung des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin in der Herstellung eines Arzneimittels oder einer Nahrungsmittelergänzung zur Vorbeugung von Makuladegeneration beim Menschen, worin zumindest 90 % aller Zeaxanthinmoleküle im Arzneimittel oder in der Nahrungsmittelergänzung 3R-3'R-Stereoisomere von Zeaxanthin sind und das Arzneimittel oder die Nahrungsmittelergänzung in Dosierungsform vorliegt und zumindest 0,5 mg des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin pro Dosis enthält.
Dem Patienten kann, muss aber nicht notwendigerweise, Makuladegeneration diagnostiziert worden sein. Der Patient kann auch eine erhöhte genetisch bedingte Anfälligkeit für Makuladegeneration aufweisen und/oder gegebenenfalls unter einer/einem aus Stargardt-Syndrom, Best-Krankheit, Batten-Syndrom, Sjögren-Larsson-Syndrom, Stäbchen-Zapfen-Dystrophie, oviner Ceroid-Lipofuszinose oder einer Erkrankung leiden, die lysosomale Speicherungsprobleme involviert. Insbesondere kann das Arzneimittel oder die Nahrungsergänzung zur Behandlung von altersbedingter Makuladegeneration oder vorbeugend – d.h. zur Senkung des zukünftiges Risikos von altersbedingter Makuladegeneration oder einer anderen Form von Makuladegeneration – eingesetzt werden. Nahrungsmittergänzungen, die das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin in einer zur oralen Einnahme durch Menschen geeigneter Form enthalten, sind besonders geeignet, um das Risiko von Makuladegeneration zu senken.
Im Allgemeinen kann das Arzneimittel oder die Nahrungsmittelergänzung ein Verdünnungsmittel oder eine Trägersubstanz umfassen, die zur Verabreichung an Menschen geeignet ist. Im Falle von Nahrungsmittelergänzungen ist das Verdünnungsmittel oder eine Trägersubstanz gegebenenfalls eine) solche(s), das zur oralen Einnahme von Menschen geeignet ist.
Das Arzneimittel liegt im Allgemeinen so vor, dass eine ausreichende Menge des 3R-3'R-Stereoisomers dem Patienten verabreicht werden kann, um eine therapeutische Wirkung für einen unter Makuladegeneration leidenden Menschen bereitzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung wird Zeaxanthin in der Herstellung einer Arzneimittels in Form von Dosierungseinheiten verwendet, die zumindest 10 mg des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin enthalten. Wird Zeaxanthin zur Reduzierung des zukünftigen Risikos von altersbedingter oder anderer Makuladegeneration beim Menschen gemäß dem zweiten Aspekt eingesetzt, so kann es beispielsweise in der Herstellung einer Nahrungsmittelergänzung, z.B. zur gelegentlichen oder regelmäßigen oralen Einnahme, eingesetzt werden, wobei die Nahrungsmittelergänzung zumindest 0,5 mg des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin pro Dosis enthält.
Dosierungsformen, die gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung hergestellt sind, enthalten vorzugsweise einen physiologisch annehmbaren Exzipienten, Verdünnungsmittel oder Träger. Unter "physiologisch annehmbar" ist insbesondere zu verstehen, dass der Exzipient, das Verdünnungsmittel oder der Träger zur Verabreichung an Menschen geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung ist das Verdünnungsmittel oder Träger zur oralen Einnahme durch einen Menschen geeignet oder auf diese ausgerichtet, und die Zusammensetzung enthält das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin in einer Menge, die zur Verwendung in der Behandlung oder Vorbeugung von Makuladegeneration bei Menschen therapeutisch wirksam ist.
Das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin macht zumindest 90 %, besonders bevorzugt zumindest 95 %, der Gesamtmenge an Zeaxanthin aus, während die S-S- und S-R-Stereoisomere weniger als 10 %, insbesondere weniger als 5 %, der Gesamtmenge an Zeaxanthin in der Dosierungsform ausmachen. Im Besonderen umfasst die Dosierungsform gegebenenfalls im Wesentlichen keine S-S- und R-S-Stereoisomere. Beispielsweise ist 3R-3'R-Zeaxanthin gegebenenfalls das einzige nachweisbar gegenwärtige Stereoisomer von Zeaxanthin.
Zudem wird bevorzugt, dass 3R-3'R-Zeaxanthin zumindest 90 % der gesamten Carotinoide in der Dosierungsform ausmachen. Dies wird deshalb bevorzugt, weil andere Carotinoide gegebenenfalls mit Zeaxanthin um die Nahrungsaufnahme oder Gewebeeinlagerung nach der Einnahme konkurrieren.
In einigen Ausführungsformen weist das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin eine Schutzhülle zur Reduktion des Abbaus des Zeaxanthins durch Magensäure auf.
Bevorzugte Ausführungsformen der nach dem ersten oder zweiten Aspekt hergestellten Dosierungsform enthalten zumindest 1 Gew.-%, vorzugsweise zumindest 2 Gew.-%, noch bevorzugter zumindest 5 Gew.-%, Zeaxanthin (wünschenswerterweise 3R-3'R-Zeaxanthin).
In einigen Ausführungsformen enthält die hergestellte Dosierungsform gegebenenfalls apathogene Mikrobenzellen, die das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin in einer Konzentration von zumindest 2 Gew.-% als Fraktion der Mikrobenzellmasse enthalten.
Ist die Dosierungsform zur Verwendung als ein Nahrungsmittelergänzung ausgerichtet, so ist Inkorporierung eines aus Nahrungsmittelsubstanzen, die zur Einnahme durch einen Menschen geeignet oder darauf ausgerichtet sind, ausgewählten Trägers gegebenenfalls wünschenswert.
Das im ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung eingesetzte 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin kann durch Kultivieren von Zellen, die das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin in einem Ausmaß von zumindest 90 % aller von den Zellen synthetisierten Carotinoidmoleküle synthetisieren, in einem flüssigen Nährstoffmedium unter Bedingungen, die die Zeaxanthinsynthese fördern, hergestellt werden. Die Zellen sind vorzugsweise solche, die dieses Stereoisomer als einziges nachweisbares Isomer synthetisieren. Es sind dies gegebenenfalls Bakterienzellen, die Abkömmlinge des Flavobacterium-multivorum-Stamms mit der ATCC-Nr. 55238 sind. Alternativ dazu sind die Zellen gegebenenfalls genmanipuliert, um zumindest ein Zeaxanthin-Synthesegen zu enthalten, das eine aus Zellen, die Abkömmlinge des Flavobacteriummultivorum-Stamms mit der ATCC-Nr. 55238 sind, gewonnene DNA-Sequenz enthaften.
Bakterienzellen des Stamms der Flavobacterium-multivorum-Zellen (ATCC-Zugriffsnummer 55238) bilden keine nachweisbaren Mengen an unerwünschten S-S- oder S-R-Stereoisomeren und synthetisieren keine signifikanten Mengen an anderen Carotinoiden, wie beispielsweise β-Carotin oder Lutein, die mit ZX um die Nahrungsaufnahme nach der Einnahme konkurrieren könnten. Nach der Synthese unter Verwendung dieser Bakterien kann ZX durch Verfahren, wie beispielsweise Lösungsmittelextraktion, gereinigt werden und entweder als Arzneimittel von Patienten, die unter Makuladegeneration leiden, oder als Nahrungsmittelergänzung von jedem, der sein Risiko der Erkrankung an altersbedingter Makuladegeneration, die bei Menschen über 50 oder 60 Jahren weit verbreitet ist, senken möchte, oral eingenommen werden. Praktische Einnahmeformulierungen sind ebenfalls offenbart, wie beispielsweise (1) wasserdichte Kapseln, die R-R-Zeaxanthin gemischt mit einem Träger, wie beispielsweise Pflanzenöl, enthalten; (2) verschiedene Lebensmittel (wie beispielsweise Margarine, Milchprodukte, Sirup, Keksteig und Fleischprodukte, die nicht stark gekocht werden), die R-R-Zeaxanthin als Zusatzstoff enthalten; und (3) Granulat-Formulierungen, die Suppen, Salaten, Getränken oder anderen Nahrungsmitteln zugemischt werden können.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Tablette oder Kapsel bereit, die das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin und eine physiologisch annehmbaren Träger umfasst, worin das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin zumindest 90 % des gesamten Zeaxanthin in der Tablette oder Kapsel ausmacht.
Vorzugsweise enthält die Tablette oder Kapsel dieses Aspekts der Erfindung zumindest 3 mg des 3-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nachstehend ausschließlich als Beispiele und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen:
in 1 die molekulare Struktur von β-Carotin, Lutein und Zeaxanthin abgebildet ist und die Struktur aller 3 Carotinoide sowie das Nummerierungssystem für die Endringe gezeigt wird; diese Strukturen sind nach dem Stand der Technik bekannt;
2 ein Ablaufdiagramm umfasst, das die Schritte des Fermentierens und Reinigens von ZX, hergestellt von Mikroben, die stereoisomerisch reines 3R-3'R-Zeaxanthin synthetisieren, beschreibt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Diese Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Nahrungsmittelformulierung zur Verabreichung an Menschen, um Makuladegeneration, eine Krankheit, die das Sehvermögen beeinträchtigt und zur Erblindung führen kann, vorzubeugen oder zu behandeln. Zeaxanthinpräparate, die auf die Einnahme durch Menschen ausgerichtet sind, sollten das 3R-3'R-Stereoisomer von ZX (aus praktischen Gründen auch als R-R-Isomer oder R-R-Zeaxanthin bezeichnet) als "stark dominantes". Isomer enthalten. So wie hierin definiert bezieht sich "stark dominantes Isomer" auf ein Präparat, das zumindest 90 % oder mehr an R-R-Isomer enthält, wobei die unerwünschten S-S- oder S-R-Isomere weniger als 10 % des gesamten Zeaxanthins im Präparat ausmachen. Vorzugsweise sollten Präparate zur Verwendung beim Menschen das R-R-Isomer von ZX als einziges nachweisbares Isomer und keine nachweisbaren Mengen an unerwünschten S-S- oder S-R-Isomeren enthalten. Derartige Präparate sind hierin offenbart.
Vor kurzem wurde unter Verwendung von chiraler Säulenchromatographie (so wie in Bone et al., 1993, beschrieben) entdeckt, dass die Zellen des F.-multivorum-Stamms (ATCC-Zugriffsnummer 55238) das R-R-Isomer als einziges nachweisbares ZX-Isomer bilden, wenn diese so wie in den Beispielen beschrieben fermentiert werden. Wie in Beispiel 4 beschrieben wies die von Prof. Landrum durchgeführte Analyse darauf hin, dass keine nachweisbaren Mengen des S-S-Isomers oder des R-S-Meso-Isomers in dem durch die Fermentierung der Zellen des F.-multivorum-Stamms gebildeten ZX-Präparat gegenwärtig waren.
Unterschiede zwischen den R-R-, R-S- oder S-S-Isomeren von Zeaxanthin sind von großer Bedeutung, wenn ZX-Präparate als Medikament oder als Nahrungsmittelergänzung an Menschen verabreicht werden, da das einzige in der menschlichen Netzhaut natürlich auftretende ZX-Isomer das R-R-Isomer ist. Es wird angenommen, dass die Einnahme von signifikanten Mengen von R-S- und S-S-Isomeren medizinisch gesehen nicht wünschenswert und schädlich ist, da (1) die R-S- und S-S-Isomere in der menschlichen Netzhaut natürlich nicht auftreten, außer möglicherweise in extrem geringen Spurenmengen, die als Nebenprodukte beim Abbau von Lutein im Inneren der Netzhautzellen gebildet werden, und (2) die R-S- und S-S-Isomere gegebenenfalls das gewünschte R-R-Isomer kompetitiv im Netzhautgewebe verdrängt, was möglicherweise zu ernsthaften Langzeit-Zellschädigungen und medizinischen Komplikationen führen kann.
Die stereoisomerische Reinheit von ZX-Präparaten, die durch die hierin offenbarte Fermentierung des F.-multivorum-Stamms hergestellt werden, ist von großem Wert, da es äußerst schwierig und kostspielig ist, Stereoisomere nach der chemischen Synthese von ZX zu trennen. Obwohl die Trennung der Stereoisomere im Labormaßstab möglich ist, sind die Kosten für wirtschaftliche Mengen untragbar.
Verwendung als verschreibungspflichtiges Arzneimittel für AMD-Patienten
In einem Aspekt der Erfindung kann das hierin offenbarte R-R-Zeaxanthin-Präparat als Arzneimittel formuliert und verabreicht werden, d.h. als Medikament, das Ärzte zur Behandlung von Patienten, denen Makuladegeneration diagnostiziert wurde oder die unter einer Krankheit leiden, die zu Makuladegeneration als Symptom oder Erscheinungsform führen kann, wie beispielsweise das Stargardt-Syndrom, die Best-Krankheit, das Batten-Syndrom, das Sjögren-Larsson-Syndrom, die Stäbchen-Zapfen-Dystrophie, ovine Ceroid-Lipofuszinose oder eine Lysosom-Speicherkrankheit, wie beispielsweise das Tay-Sach-Syndrom, verschreiben können.
Wird ein ZX-Präparat zu einer derartigen Behandlung eingesetzt, so muss eine ausreichende Menge des R-R-Isomers von ZX, um auf den Wert eines therapeutischen Mittels zu gelangen, in einer Trägersubstanz oder -form (beispielsweise als eine Kapsel) enthalten sein, die zur Verabreichung an Menschen, so wie in der Folge beschrieben, geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das ZX zur medizinischen Behandlung in Dosierungseinheitsform verpackt, wie beispielsweise als Tabletten oder Kapseln. Jede Dosis sollte zumindest 3 mg R-R-Zeaxanthin und, falls gewünscht, zur besseren therapeutischen Wirksamkeit gegebenenfalls Zeaxanthin in einem Bereich von 3 mg bis 10 mg Zeaxanthin enthalten.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung kann das hierin offenbarte R-R-Zeaxanthin-Präparat als vorbeugendes Medikament für Patienten, denen eine erhöhte Anfälligkeit für Makuladegeneration, beispielsweise aufgrund der Familien-Krankengeschichte oder der genetischen Diagnose einer der obgenannten Krankheiten, diagnostiziert wurde, formuliert und verabreicht werden. Dosierungseinheiten, die zur Verabreichung an solche Patienten, die ein erhöhtes AMD-Risiko aufweisen, jedoch noch nicht an AMD leiden, hergestellt werden, enthalten gegebenenfalls kleinere Mengen, wie beispielsweise 2 mg pro Dosis.
Eine jede dieser Dosen kann mit wirtschaftlich angemessenem Kostenaufwand unter Einsatz der hierin beschriebenen Offenbarungen bereitgestellt werden. Kapseln, die 25 mg (oder eine geringere Menge) in einer öligen Trägerflüssigkeit enthalten, können auf wirtschaftliche Weise unter Verwendung einer mikrobiellen Fermentation gekoppelt mit einem Lösungsmittelextraktionsschritt gebildet werden. Pulverförmige Formulierungen, die sogar noch größere Mengen (beispielsweise 100 mg oder mehr pro Dosierung) enthalten, können ebenfalls gebildet werden, wenn die Reinigung extensiver durchgeführt wird, beispielsweise unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren.
Beispiel geeigneter ZX-Formulierungen umfassen:

(a) eine verdaubare, wasserdichte Kapsel und ein darin enthaltenes Fluid, worin die Kapsel und das Fluid eine Größe und eine Konzipierung für die orale Einnahme durch einen Menschen aufweisen und pharmakologisch annehmbar sind und worin das Fluid das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin enthält; vorzugsweise ist das Zeaxanthin in Mizellen eingeschlossen, die durch ein Verfahren unter Verwendung eines Gallensalzes gebildet werden; und
(b) ein für die orale Einnahme durch einen Menschen konzipierte Tablette, worin die Tablette das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin und ein pressbares, mit Zeaxanthin kompatibles Bindematerial enthält, das ein Gemisch aus Zeaxanthin und dem Bindematerial veranlasst, die Form nach dem Pressen unter geeignetem Druck beizubehalten, und worin die Tablette pharmakologisch annehmbar und angemessen groß ist, um von einem Menschen oral eingenommen zu werden; wobei die Tablette gegebenenfalls über eine verdaubare Hüllschicht verfügt, die zum Schutz des Zeaxanthins vor Oxidation beiträgt.

Verwendung als Vitamin oder Nahrungsmittelergänzung
In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann ZX in Form von Vitamin oder Nahrungsmittelergänzungen oder als Lebensmittelzusatz zum Konsum durch Menschen, die derzeit nicht an Makuladegeneration leiden, aber ihr Risiko einer Makuladegeneration im späteren Leben verringern wollen, hergestellt und verpackt werden. Zu diesem Zweck eingenommen müssen angemessene Dosen wesentlich höher sein als die Spurenmengen in Pulvern, die heutzutage in Reformkostläden angeboten werden, können jedoch im Vergleich zur Verwendung von ZX als therapeutisches Arzneimittel für Menschen, denen AMD diagnostiziert wurde, niedriger sein. Solche Dosierungen sollten im Bereich von 0,05 mg bis zu 5 mg pro täglich eingenommener Dosis liegen. Eine Dosis von 0,05 bis 1,0 mg wäre geeignet, wenn R-R-Zeaxanthin eines aus einem Dutzend oder mehr Wirkstoffen in einer Multi-Vitaminkapsel oder -tablette ist, während eine Dosis von 1 bis 5 mg für rezeptfreien Verkauf an Menschen bereitgestellt werden kann, die eine höhere Dosierung wünschen.
Beispiele für Zusammensetzungen, die ZX als Nahrungsmittelergänzung enthalten, umfassen:

(c) eine auf die orale Einnahme durch Menschen ausgerichtete Zusammensetzung, die eine Nahrungsmittelsubstanz für den menschlichen Konsum (üblicherweise eine ernährungstechnisch annehmbare und schmackhafte), die als Träger für Zeaxanthin geeignet ist, und das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin, das der Nahrungsmittelsubstanz als Nahrungsmittelzusatz zugesetzt ist, enthält; wobei die Nahrungsmittelsubstanz aus Margarine, Milchprodukten, Sirup, Backwaren, Keksteig, Rührteig für Brownies, Fleischprodukten und Suppenzutaten ausgewählt ist; vorzugsweise ist das Zeaxanthin in Mikrokapseln eingeschlossen und verfügt über eine Schutzschicht, um den Abbau von Zeaxanthin durch die Magensäure zu reduzieren; die Nahrungsmittelsubstanz umfasst gegebenenfalls eine Granulat-Formulierung, z.B. kann sie eine salzhaltige Geschmacksstoffmischung, eine gewürzhältige Geschmacksstoffmischung, ein Suppenzusatz, eine Backmischung oder ein Geschmackszusatz für Milch sein; in derartigen Granulat-Formulierungen verfügt das Zeaxanthin gegebe nenfalls über eine Schutzschicht, um den Abbau von Zeaxanthin durch die Magensäure zu reduzieren;
(d) eine ein Nahrungsmittel zum oralen Konsum durch Menschen umfassende Zusammensetzung, wobei das Nahrungsmittel Mikrobenzellen umfasst, die gegebenenfalls intakt sind, die apathogen (z.B. für den Menschen) sind und die das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin in einer Konzentration von zumindest 2 Gew.-% Zeaxanthin als Fraktion der Mikroben-Zellmasse enthält; wobei dieses Nahrungsmittel aus Käse, Joghurt, Milch und Bier ausgewählt ist; und die Mikrobenzellen gegebenenfalls durch Pasteurisierung abgetötet worden sind.

Unabhängig davon, ob es als therapeutisches Arzneimittel oder als Nahrungsmittelergänzung eingesetzt wird, sollte das auf den menschlichen Konsum ausgerichtete ZX-Präparat das R-R-Isomer als einziges oder als "stark dominantes Stereoisomer" von ZX enthalten. Der Begriff "stark dominantes Stereoisomer" wird hierin zur Beschreibung eines ZX-Präparats eingesetzt, in dem das gewünschte R-R-Isomer von ZX zumindest 90 % des gesamten ZX im Gemisch ausmacht und die unerwünschten S-S- oder S-R-Isomere weniger als 10 % ausmachen.
Vorzugsweise sollte das R-R-Isomer das einzige nachweisbare ZX-Isomer in jedwedem auf die Einnahme durch Menschen ausgerichteten Präparat sein. Dies wurde nun in wirtschaftlichen Mengen und mit annehmbaren Kosten ermöglicht, da der hierin beschriebene Bakterienstamm F. multivorum das R-R-Isomer als einziges nachweisbares Stereoisomer von ZX bildet. Sollten S-S- oder S-R-Isomere nach der Reinigung überhaupt im fermentierten Gemisch gegenwärtig sein, dann nur in Mengen, die zu gering sind, um mittels der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren nachgewiesen zu werden.
Außerdem bilden die hierin beschriebenen F.-multivorum-Zellen im Unterschied zu den meisten anderen Bakterienstämmen kein Carotinoidgemisch; diese Zellen bilden R-R-Zeaxanthin als einziges nachweisbares Carotinoid. Da ZX mit anderen Carotinoiden um die Nahrungsaufnahme und die Gewebeeinlagerung konkurrieren muss, kann dies für die Steigerung der ZX-Aufnahme und der Einlagerung in die Netzhautzellen nach der oralen Einnahme nützlich sein, insbesondere wenn ZX als Arzneimittel zur Behandlung von diagnostizierten Fällen von Makuladegeneration eingesetzt wird.
Großtechnische Herstellung durch Bakterienfermentation
Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, können zur Fermentation von Bakterien im Labor eingesetzte Verfahren äußerst kostenintensiv und schwer steuerbar sein, wenn sie zu großen Herstellungsverfahren umgewandelt werden. Demgemäß haben die Anmelder verbesserte Nährstoffe und Verfahren zur kommerziellen Verwendung mit den F.-multivorum-Zellen entwickelt. Die Arbeit mit den verbesserten Nährstoffen und Verfahren wird im Vergleich zu den zuvor in den U.S.-Patenten Nr. 5.308.759 und Nr. 5.427.783 offenbarten Medien und Bedingungen einfacher und pro Gramm an erzeugtem ZX billiger. Bevorzugte Nährstoffe und Bedingungen werden in Beispiel 1 beschrieben.
Nach der Fermentation kann eine oder mehrere stabilisierende Verbindungen, wie beispielsweise t-Butylhydrochinon, den Zellen zugesetzt werden, um einen Abbau des ZX während der Reinigung zu verhindern. Stabilisatoren können zugesetzt werden, während sich die Zellen noch im Fermantationsgefäß befinden, bevor mit der Pasteurisierung oder einem anderen Bearbeitungsverfahren begonnen wird. Verschiedene Kandidatenstabilisatoren wurden von Anmeldern getestet. Die besten bisher erhaltenen Ergebnisse wurden durch Verwendung einer Kombination aus den Beispiel 2 aufgelisteten Stabilisatoren erzielt.
Nach dem Zusetzen der Stabilisatoren können die Bakterien durch Erwärmen auf 55 °C für 25 min pasteurisiert werden, um die Bakterien abzutöten, ohne dabei das ZX zu schädigen. Die Kultur wird daraufhin auf Raumtemperatur abgekühlt, und die Flüssigkeit wird durch mechanische Mittel, wie beispielsweise Querstrom-Mikrofiltration, von den Zellen entfernt. Dies kann die Konzentration der Zellen und Feststoffe von einem Ausgangswert von etwa 10 Vol.-% auf eine filtrierte Konzentration von etwa 60 bis 80 Vol.-% anheben. So wird eine Zellpaste gebildet.
Es besteht die Möglichkeit, dass F.-multivorum-Zellen in intaktem und möglicherweise lebensfähigem Zustand für die direkte Einnahme durch Menschen geeignet sind, vergleichbar mit anderen Lebensmitteln (Käse, Joghurt, Bier usw.), die lebensfähige oder abgetötete, aber intakte Mikrobenzellen enthalten. Es gibt keine bekannte, mit F.-multivorum-Zellen assoziierte Pathogenität. Sie wurden aus einem kalten Wasserkanal isoliert, und da sie an ein Leben in kaltem Wasser angepasst sind, können sie bei den Temperaturen im menschlichen Körper nicht überleben oder sich dort gut vermehren. Außerdem verfügen diese Zellen über keine bekannten toxischen Bestandteile; sie sind gramnegativ und weisen nicht die für grampositive Bakterien typische Zellwandstruktur auf. Wurden diese Bakterienzellen direkt an Vögel oder Fische in Form einer Zellpaste verfüttert, so schienen sie als Transport-Vehikel geeignet zu sein. Das ZX wurde freigesetzt, sobald die Zellen von den Tieren verdaut wurden, und das ZX wurde in den Blutkreislauf aufgenommen und an geeigneten Stellen in verschiedenen Geweben (einschließlich der Netzhaut) eingelagert.
Demgemäß können intakte, R-R-Zeaxanthin enthaltende F.-multivorum-Zellen für den direkten menschlichen Konsum falls gewünscht in jeder der drei Formen geeignet sein: (1) in intakter, lebensfähiger Form; (2) intakter, nach Pasteurisierung abgetöteter Form; oder (3) als Formulierung, in der die Bakterienzellen getötet und ihre Membranen zerstört wurden, um die Zellen aufbrechen und das ZX besser zugänglich zu machen. Dies kann durch Mittel, wie beispielsweise Beschallung (unter Verwendung von Hochfrequenz-Schallwellen), hohem Druck oder Mahlung, durchgeführt werden. Alternativ dazu kann dieser Schritt übersprungen werden, wenn eine Lösungsmittelextraktion eingesetzt wird, die die Zellmembranen aufbricht.
Falls gewünscht kann die ZX-Herstellung einen Schritt der Zellenspülung umfassen, bei dem die verbleibenden Nährstoffe und Stoffwechsel-Abfallprodukte nach der Fermentation durch Spülen der Zellen mit einer Lösung, die jedwede gewünschte Be standteile, wie beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsmittel oder Geschmacksstoffe, enthält, entfernt werden.
Reinigung
Falls gewünscht kann eine Zellpaste (entweder mit intakten oder mit aufgebrochenen Zellen) getrocknet werden, um die Zellen weiter zu konzentrieren und die ZX-Konzentration in der Trockenmasse zu erhöhen. Dies kann durch mechanische Mittel geschehen, wie beispielsweise Sprühtrocknen (unter Einsatz von Hitze) oder Lyophilisierung (Gefriertrocknen im Vakuum). Wird ein Trocknungsverfahren durchgeführt, wird der resultierende feste Rückstand üblicherweise als getrocknete Biomasse bezeichnet; sie enthält üblicherweise etwa 1 bis 10 Gew.-% ZX, gemeinsam mit anderen Zellfeststoffen, festen Rückständen des Fermentationsmediums und den oben beschriebenen Stabilisatoren.
Vor und nach (oder anstatt) dem Aufbrechen oder Trocknen kann eine Extraktionsschritt zur Konzentrierung von ZX durchgeführt werden, das sich in erster Linie in Zellmembranen ansammelt. Für die Extraktion geeignete Lösungsmittel schließen polare organische Lösungsmittel ein. Bis jetzt wurde Tetrahydrofuran (THF) als das beste Lösungsmittel identifiziert, das die Zellen auf aggressive Weise angreift und einen eigenen Schritt zur Aufbrechen der Membranen unnötig macht. Obwohl bei der Verwendung von THF in Laborvorgängen kein Rühren vonnöten war, ist ein Rühren während des Lösungsmittel-Mischschritts bei der kommerziellen Herstellung wahrscheinlich notwendig.
Andere Lösungsmittel wurden ebenfalls getestet und werden auch in Hinkunft getestet und bewertet werden, aber keines der bisher getesteten funktionierte so gut wie THF. Bisher getestete organische Lösungsmittel ohne Ringstruktur (wie beispielsweise Aceton und Diethylether) weisen ein niedrigeres ZX-Löslichkeitsniveau auf, während andere Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Ethanol und Hexan, noch niedrigere ZX-Löslichkeitsniveaus aufweisen.
Das Lösungsmittel wird mit einer Zellpaste oder getrockneten Biomasse unter Bedingungen, die das Lösungsmittel zur Lösung von so viel ZX wie möglich veranlassen, gemischt. Die gelöste flüssige Fraktion wird dann von den Feststoffen unter Einsatz von Mitteln, wie beispielsweise Zentrifugierung oder Filtration, getrennt. Die Feststoffe können dann verworfen oder als Ausgangsmaterial für andere Verfahrensschritte eingesetzt werden (einschließlich wiederholter Lösungsmittelextraktionszyklen, falls gewünscht). Die flüssige Fraktion wird dann zur Entfernung des Lösungsmittels, üblicherweise durch Abdampfen, behandelt. Zurück bleibt ein viskoses Öl, das R-R-Zeaxanthin gemeinsam mit anderen löslichen Komponenten, die vom Lösungsmittel aus der Zellpaste extrahiert wurden, enthält. Wurde THF in einer einfachen Extraktion von Zellen, die 1 bis 3 Gew.-% ZX enthielten, eingesetzt und daraufhin das THF abgedampft, so enthielt das resultierende Fluid etwa 5 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% ZX.
Eine weitere Art der Lösungsmittelextraktion, die gute vorläufige Ergebnisse lieferte, beinhaltet die Verwendung einer überkritischen Flüssigkeit (d.h. einer Verbindung, die üblicherweise bei Atmosphärendruck gasförmig ist, jedoch bei höherem Druck eine als Lösungsmittel agierende Flüssigkeit wird). Kohlendioxid ist das für überkritische Extraktion am häufigsten eingesetzte Lösungsmittel, und großtechnische CO₂-Extraktionssystem stehen zur Verfügung. In solchen Systemen wird verflüssigtes Kohlendioxid mit einer Zellpaste oder getrockneten Biomasse im Inneren eines Hochdruck-Reaktionsgefäßes gemischt. Die Flüssigkeit durchläuft dann eine Reihe von Kammern, die den Druck schrittweise senken. ZX fällt bei recht hohem Druck aus der Lösung aus, sodass es während eines frühen Druckminderungsschritts gesammelt werden kann, während der Großteil der Verunreinigungen im Kohlendioxid löslich bleibt und zu den anderen Reaktionskammern weitergeleitet wird, in denen der Druck weiter gesenkt wird. Die Effizienz der überkritischen Lösungsmittelextraktion kann weiter durch den Einsatz von Schleppmitteln (wie beispielsweise Ethanol, Propylenglykol oder Ethylacetat) gesteigert werden. Mehrere dieser Schleppmittel wurden zuvor getestet, und es wurde gezeigt, dass sie die Löslichkeit von ZX in überkritischem Kohlendioxid wesentlich steigern können.
Obwohl Kohlendioxid häufig für die überkritische Extraktion herangezogen wird, werden auch andere Verbindungen (einschließlich verschiedener Stickstoff- oder Fluorchlorkohlenstoffverbindungen) eingesetzt. Ein jedes derartiges Lösungsmittel, das Gas- und Flüssigphasen als Funktion des Drucks durchläuft, kann getestet werden, um zu bestimmen, ob es für die Reinigung von ZX von Bakterien, so wie hierin beschrieben, geeignet ist.
Falls gewünscht kann eine ölige, ZX-hältige Flüssigkeit, die durch Lösungsmittelextraktion oder überkritische Extraktion gebildet wurde, mit einer Trägersubstanz, wie beispielsweise Pflanzenöl, gemischt werden und dann in eine Kapsel, die für die Einnahme durch den Menschen bestimmt ist, eingeschlossen werden, ohne einer weiteren Reinigung des ZX zu bedürfen. So ist ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung einer halbreinen, verdaubaren Form von R-R-Zeaxanthin bereitgestellt, die für den menschlichen Gebrauch, entweder als Arzneimittel für an Makuladegeneration leidende Menschen oder als Nahrungsmittelergänzung für Menschen, die ihr Risiko, im späteren Leben an Makuladegeneration zu erkranken, senken möchten, zur Verfügung steht.
Alternativ dazu kann R-R-Zeaxanthin in einer halbreinen öligen Flüssigkeit weiter gereinigt werden, um die ZX-Konzentration zu erhöhen und jegliche Verunreinigung zu entfernen. Dies kann durch Verfahren, wie beispielsweise (1) Zwei-Lösungsmittelsystemen, bei denen eine Kombination aus zwei ausgewählten Lösungsmitteln eingesetzt wird; (2) Adsorption an einem Substrat (wie beispielsweise ein Gewebefilterbett), das die Kristallisation von ZX fördert; oder (3) Gegenstromchromatographie durchgeführt werden. Ein zur Reinigung von ZX bis zu einem Reinheitsgrad von 98 % verwendetes chromatographisches Verfahren wird in Beispiel 4 beschrieben.
Reinigungsverfahren für andere Carotinoide sind in den U.S.-Patenten Nr. 5.382.714 (Khachik, 1995) und Nr. 4.851.339 (Hills, 1989) offenbart. Aufgrund ihrer chemischen Ähnlichkeiten liefert wahrscheinlich jedes Verfahren, das zur Reinigung von β-Carotin oder Lutein fähig ist, auch gute Ergebnisse bei der Reinigung von ZX.
Arten der Verabreichung
Die orale Einnahme ist die bevorzugte Form der Verabreichung von ZX an Menschen zum Schutz der Netzhaut, unter Verwendung von Einnahmeformen, wie beispielsweise die tägliche oder wöchentliche Einnahme von Kapseln, oder die Verwendung von Lebensmitteln oder Nahrungsmittelzusätzen, denen ZX zugesetzt wurde, so wie nachstehend beschrieben. Die Behandlung bedarf keiner regelmäßigen Einnahme in festgelegten Abständen (wie beispielsweise eine täglich oder wöchentliche Pilleneinnahme), sondern bezieht sich auf eine gelegentliche, unterbrochene Einnahme, bei der ein vernünftiger Zeitraum (wie beispielsweise ein oder mehrere Tage, vorzugsweise weniger als eine Woche) zwischen den Dosen liegen kann, um eine allmähliche Einlagerung kleiner Mengen an ZX im Makulagewebe zu ermöglichen. So wie bei allen Vitaminergänzungen kann eine einzige Dosis positive Wirkungen haben, jedoch wird eine einzige Dosis in einem Zeitraum von Jahren nicht gleiche positive Wirkungen haben wie regelmäßige kleine Dosen. Studien über die Carotinoid-Aufnahme bei Säugetieren zeigten, dass die tägliche Einnahme der wöchentlichen oder sporadischen Einnahme aufgrund von "Beladungs"-Faktoren, die sich im Blutkreislauf zeigen, vorzuziehen ist.
Da die Aufnahme von Carotinoiden nach der oralen Einnahme eher relativ langsam voranschreitet, kann es für Patienten mit schwerer Makuladegeneration wünschenswert sein, andere Verabreichungsformen einzusetzen, wie beispielsweise die intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder die Implantierung einer Vorrichtung mit langsamer Freisetzung. Injizierbare Trägerformulierungen können Wasser, ein Puffermittel und eine organische Verbindung mit mehreren Hydroxygruppen, wie beispielsweise Propylenglykol, Dextran oder Cyclodextrinverbindungen, umfassen.
Verschiedene Formen der Verpackung zur oralen Einnahme können verwendet werden, solange diese ZX vor Oxidation schützen und die ölige Natur von ZX berücksichtigen. Beispiele für geeignete Zusammensetzungen zur oralen Einnahme umfassen:

(a) eine verdaubare, wasserdichte Kapsel und ein darin enthaltenes Fluid, worin die Kapsel und das Fluid von einer solchen Größe, dass sie als Ganzes geschluckt werden können, und pharmakologisch annehmbar sind und worin das Fluid R-R-Zeaxanthin gemischt mit einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Pflanzenöl, enthält. Falls gewünscht kann das verflüssigte ZX mikro-eingekapselt oder in Mizellen eingeschlossen werden, so wie in den Beispielen 9 oder 10 beschrieben, um zum Schutz des ZX vor einem Abbau im Magen beizutragen. Derartige Kapseln können aus relativ steifem, starrem Material oder aus biegsamen Material, so wie üblicherweise für Vitamin E enthaltende Kapseln verwendet, hergestellt werden. Ist die Kapsel aus einem Material hergestellt, das gegenüber der sauren Umgebung im Magen beständig ist und von den Enzymen im Darmtrakt verdaut wird, kann ZX vor dem Abbau im Magen geschützt werden, und die biologische Verfügbarkeit von ZX kann gesteigert werden. Es ist jedoch bekannt, dass zumindest ein Teil des ZX, das als Bestandteil von gekauter, pflanzlicher Masse in den Magen gelangt, unbeschadet durch den Magen gelangen kann; es ist deshalb nicht entscheidend, ZX vor Magensäure zu schützen, und die Wahl des Kapselmaterials beruht eher auf wirtschaftlichen Präferenzen als auf einem Gebot der Wissenschaft.
(b) eine Tablette zur oralen Einnahme durch einen Menschen, worin die Tablette R-R-Zeaxanthin und ein pressbares Bindematerial enthält, das mit Zeaxanthin kompatibel ist und das die Tablette veranlasst, nach der Pressung unter geeignetem Druck ihre Form beizubehalten, und worin die Tablette pharmakologisch annehmbar und von solcher Größe ist, dass sie als Ganze geschluckt werden kann. Falls gewünscht kann die Tablette über eine Beschichtung verfügen, um zum Schutz des ZX vor der sauren Umgebung im Magen beizutragen.
(c) eine Zusammensetzung, umfassend eine Nahrungsmittelsubstanz für den menschlichen Konsum, die ernährungstechnisch annehmbar und wohlschmeckend ist, die als Träger für Zeaxanthin geeignet ist und die R-R-Zeaxanthin als Zusatz enthält. ZX ist ein Gelb-Orange-Pigment mit denselben allgemein hydrophoben Eigenschaften wie Pflanzenöl, Backfett oder Hühnerfett; ebenfalls ähnelt es anderen Carotinoid-Lebensmittelfarbstoffen, wie β-Carotin. Demgemäß kann es als Nahrungsmittelfarbstoff verschiedenen Nahrungsmittelsubstanzen, wie beispielsweise Margarine, Milchprodukten, Sirup, gebackenen Nahrungsmitteln, Keksteig, Rührteig für Brownies, Fleischprodukten, die nicht stark gekocht werden, und Suppenzutaten, zugesetzt werden. Andere geeignete Nahrungsmittelsubstanzen umfassen gegebenenfalls Granulat-Formulierungen, wie beispielsweise gesalzene oder gewürzte Geschmacksstoffmischungen, die als Zusätze für Suppen, Salate, Backwaren usw. verwendet werden. Granulat-Formulierungen können, falls gewünscht, über eine Schutzschicht verfügen, um den Abbau von ZX durch die Magensäure zu verringern. Zahlreiche Publikationen beschreiben die Verwendung von β-Carotin und anderen Carotinoiden als Lebensmittelfarbstoffe und Nahrungsmittelzusätze; Beispiel sind unter anderem Klaui et al., 1970; Klaui und Bauernfeind, 1981; Colombo und Gerber, 1991, und die U.S.-Patente Nr. 4.522.743 (Horn et al., 1985), Nr. 5.180.747 (Matsuda et al 1993), Nr. 5.350.773 (Schweikert et al., 1994) und Nr. 5.356.636 (Schneider et al., 1994). Aufgrund ihrer chemischen Ähnlichkeiten ist wahrscheinlich jedes Verfahren zum Zusetzen von β-Carotin oder Lutein zu Nahrungsmittel für Menschen direkt auf R-R-Zeaxanthin anwendbar.
(d) eine Zusammensetzung, umfassend ein Lebensmittel zum oralen Konsum durch Menschen, worin das Lebensmittel für den Menschen unschädliche Mikrobenzellen enthält, die das R-R-Isomer von Zeaxanthin enthalten. Derartige Lebensmittel sind gegebenenfalls aus Käse, Joghurt, Milch und Bier ausgewählt. Die Mikrobenzellen können, falls gewünscht, lebensfähig sein, oder sie wurden gegebenenfalls durch Verfahren wie beispielsweise Pasteurisierung oder Fragmentierung abgetötet.

Andere Verpackungsformen sind ebenfalls ausführbar und können für verschiedene Verwendungszwecke bevorzugt sein.
Testen auf R-R-Zeaxanthin bei Tieren
ZX, das unter Verwendung von F.-multivorum-Zellen, Abkömmlinge der ATCC-55238-Stamms, synthetisiert wurde, wurde auf seine Schutzwirkung auf die Netzhaut bei einer japanischen Vogelart, Coturnix coturnix japonica, gemeinhin als Japanische Wachtel bezeichnet, hin untersucht. Diese Art stellt ein nützliches tierisches Modell für die Makuladegeneration beim Menschen bereit, aufgrund von verschiedenen Faktoren, einschließlich der folgenden:

(1) Die gesamte Netzhaut der Japanischen Wachtel ähnelt der menschlichen Makula in mehreren wichtigen Gesichtspunkten. Beispielsweise enthält die Netzhaut der Wachtel sowohl ZX als auch Lutein und ist, so wie die menschliche Makula, reich an Photorezeptor-Zapfen und nicht an Stäbchen.
(2) Die Netzhaut der Japanischen Wachtel zeigt einige derselben pathologischen Indikatoren wie die menschliche Netzhaut. Beispielsweise sammeln sich in der Netzhaut der Japanischen Wachteln weiche Drusen und Lipofuszin an, bei denen eine starke Verbindung zu einsetzender AMD beim Menschen besteht.
(3) Obwohl die Netzhaut der Wachtel sehr viel kleiner als die menschliche Netzhaut ist, ist die gesamte Wachtelnetzhaut aufgrund der Gegenwart von ZX und Lutein von gelber Farbe. Dies ermöglicht das effektive Heranziehen der gesamten Netzhaut einer Wachtel als Modell für die kleine Makularegion im Zentrum der menschlichen Netzhaut, und Beobachtung und Analyse werden erleichtert.
(4) Die Netzhaut der Japanischen Wachtel ist avaskulär und weist eine Struktur auf, die der Region der Fovea der menschlichen Netzhaut ähnlich ist.
(5) Japanische Wachteln haben eine Lebensdauer von etwa 1 bis 1,5 Jahren für Weibchen und 3 bis 4 Jahren für Männchen. Dies ermöglicht Studien über den Alterungsprozess, die bei Arten mit längerer Lebenserwartung sehr schwierig auszuführen wären.

Diese Faktoren werden in Fite et al., 1991, und Fite et al., 1993, detaillierter erörtert.
Diese Tests werden in den Beispielen 5 bis 8 beschrieben. Die Ergebnisse sind hervorragend und weisen deutlich daraufhin, dass das von F.-multivorum-Zellen hergestellte R-R-Zeaxanthin (1) in der Makula nach der oralen Einnahme angemessen eingelagert wird und (2) äußerst wirksam die Netzhautzellen vor phototoxischer Schädigung schützt.
Zudem weisen, so wie in Beispiel 8 erörtert, vorläufige Ergebnisse darauf hin, dass R-R-Zeaxanthin die Netzhaut bei weitem besser und wirkungsvoller vor phototoxischer Schädigung schützen als β-Carotin. Wurde β-Carotin in sehr hoher Dosierung an Tiere verfüttert, erreichten die geringen, von β-Carotin bereitgestellten positiven Schutzwirkungen nicht einmal eine statistische Signifikanz. Wurde im Gegensatz dazu R-R-Zeaxanthin in der gleichen Dosierung an Tiere verfüttert, wurde der gemessene Indikator für Netzhautschäden völlig ausgeschaltet und verhindert.
Mikrobielle R-R-Zeaxanthin-Quellen
Flavobacterium-multivorum-Zellen wurden, so wie hierin offenbart, bei der ATCC hinterlegt (ATCC-Zugriffsnummer 55238; so wie zuvor festgehalten werden diese im ATCC-Katalog als Sphingobacterium multivorum bezeichnet, aber ihre Bezeichnung im Bergy's Manual wurde nicht geändert). Diese Zelllinie stellt Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung mehrere Optionen für die mikrobielle Synthese von isomerisch reinem R-R-Zeaxanthin zur Verfügung.
Erstens können direkte und nicht modifizierte Abkömmlinge dieser Zellen zur Synthese von R-R-Zeaxanthin ohne nachweisbare Mengen an anderen, unerwünschten Stereoisomeren verwendet werden. Die gesamten durch diese Zellen erzeugten Carotinoide bestehen zu über 90 % aus ZX, dem gewünschten Carotinoid.
Zweitens können Abkömmlinge des ATCC-Stamms 55238 verwendet werden, nachdem auf sie auf Weisen modifiziert worden sind, die die Produktion des R-R-Isomers von ZX steigern. Mutanten oder andere Variationen der Zelllinien können durch jedes zahlreicher Verfahren gebildet werden, wie beispielsweise (1) die Behandlung des Wildtyp-ATCC-55238-Stamms mit mutagenen Mitteln, wie beispielsweise ultravioletter Strahlung oder Röntgenstrahlen, oder mit bekannten chemischen Mutagenen, wie beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin; (2) die Schaffung geschlechtlicher Kombinationen durch Mischen von F.-multivorum-Zellen mit anderen Bakterienarten, die die Konjugation und den Austausch von DNA zwischen Bakterienzellen aktiv fördern; oder (3) die Behandlung von F.-multivorum-Zellen mit bakteriellen Transposonen oder Viren, die einen Umbau von relativ großen DNA-Abschnitten verursachen können. Diese Verfahren führen zufällige Veränderungen in Abkömmlingszellen ein, und die Abkömmlinge werden durch Screening-Tests zur Identifikation und Isolierung von Nachkommenschaftszellen, die einen höheren Grad an ZX produzieren, analysiert.
Die Screening-Tests können durch den Einsatz von Chemikalien (wie beispielsweise Diphenylamin, Nicotin oder Lovastatin) vereinfacht werden, die ein oder mehrere involvierte Enzyme auf dem Biosynthese-Stoffwechselweg, durch den ZX synthetisiert wird, unterdrücken. Um es mit den Worten eines Laien zu beschreiben, können diese Unterdrückungswirkstoffe Hürden oder Hindernisse schaffen, die nur von Mutantenzellen überwunden werden können, die anormal hohe Mengen an ZX produzieren. Glücklicherweise sind die Tests, die zur Identifizierung von hochproduktiven Mutanten oder Varianten eingesetzt werden können, einfach, schnell und leicht. Da ZX ein Gelbpigment ist, kann eine einfache visuelle Beobachtung einer Kulturplatte zur Identifizierung von Mutantenkolonien, die die gewünschten Eigenschaften (1) einer guten Zellwachstumsrate und (2) der Fähigkeit zur Erzeugung von anormal großen Mengen des Gelbpigments aufweisen, eingesetzt werden. Falls gewünscht können bei den Screening-Tests nach der Behandlung mit einem Mutagen auch automatisierte Vorrichtungen (wie beispielsweise automatische Plattenleser oder an Durchflusszytometer gekoppelte Zellsortierungsvorrichtungen) verwendet werden.
Diese Mutagenizitäts- und Screening-Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung üblich und wohl bekannt. Alle Zellen, die direkte Abkömmlinge des ATCC-55238-Wildtyp-Stamms sind, werden als Abkömmlinge dieser Zellen betrachtet, auch wenn sie auf irgendeine der oben angeführten Weisen modifiziert, mutagenisiert oder mit anderen Zelllinien geschlechtlich kombiniert wurden.
In einer dritten alternativen Herangehensweise können Mikrobenzellen, die keine Abkömmlinge sind und die Gene enthalten, die von der ATCC-55238-Zellinie isoliert wurden oder abstammen, geschaffen werden, die Enzyme exprimieren, die die Synthese von R-R-Zeaxanthin unterstützen. Derartige Gene können unter Verwendung bekannter Verfahren isoliert und identifiziert werden. Beispielsweise können DNA-Sequenzen aus den im U.S.-Patent Nr. 5.429.939 (Misawa et al., 1995, oben erörtert) aufgelisteten Carotinoid-produzierenden "crt"-Genen als Hybridisierungssonden eingesetzt werden, um nach Carotinoid-produzierenden Genen mit homologen DNA-Sequenzen im Genom der ATCC-55238-Zellinie zu suchen. Aus diesen Zellen isolierte Carotinoid-produzierende Gene können dann in Plasmide, Cosmide, Phagen oder andere geeignete Vektoren, die verwendet werden können, um jeden gewünschten Typ von Wirtszelle, wie beispielsweise E.-coli-Zellen, Hefezellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen, genetisch zu transformiren, eingeführt werden. Diese Art der steuerbaren gentechnischen Veränderung ermöglicht, dass transformierte Zellen R-R-Zeaxanthin unter Einsatz der aus den ATCC-55238-Zellen erhaltenen Gene erzeugen.
Zudem können die für Proteine kodierenden Abschnitte der ZX-produzierenden Gene der ATCC-55238-Zellen (d.h. die Abschnitte der Gene, die in eine Messenger-RNA transkribiert werden, die daraufhin in die Enzyme, die ZX synthetisieren, translatiert wird) der Steuerung eines leistungsstarken und/oder induzierbaren Gen-Pro motors unterstellt werden. Derartige "chimäre" Gene, die aus verschiedenen Genen erhaltene Gen-Promotoren enthalten, können für verschiedenen Zwecke eingesetzt werden, wie beispielsweise (1) zur Unterdrückung der ZX-Produktion während des Wachstums und der Fortpflanzung der Zellen und in Folge zur deutlichen Steigerung der ZX-Produktion der Zellen während der Fermentation; und (2) zur Einführung der Gene in neue Typen von Wirtszellen, die gegebenenfalls für die wirtschaftliche Verwendung bevorzugt werden, wie beispielsweise E.-coli-Zellen oder Hefezellen, für die wohl bekannte und stark optimierte Fermentations-, Verarbeitungs- und Reinigungsverfahren eingesetzt werden können.
Aus der ATCC-55238-Zelllinie isolierte ZX-produzierende Gene können auch durch andere bekannte Verfahren verbessert werden. Beispielsweise verwenden Bakteriengene oft "nicht-präferierte" Codons, die die Menge eines von einem Gen erzeugten Enzyms reduzieren und steuern. Um diesen Einschränkungsmechanismus zu lockern, können nicht-präferierte Codons in einem ZX-synthetisierenden Gen aus der ATCC-55238-Zelllinie durch "präferierte" Codons ersetzt werden, die die Expression des ZX-produzierenden Enzyms in einer ausgewählten Wirtszelle steigern können.
Als weiteres Beispiel können Cysteinreste die Aktivität oder Stabilität eines Enzyms durch Ausbildung unerwünschter Disulfidbindungen mit anderen Cysteinresten, entweder im selben oder in anderen Proteinmolekülen, hemmen. Demgemäß kann die Aktivität oder Stabilität eines Enzyms durch Ersetzen eines oder mehrerer Cysteinreste mit anderen Aminosäureresten manchmal gesteigert werden (z.B. U.S.-Patent Nr. 4.737.462, von Mark). Zudem kann die Expression eines Proteins durch Einführen von Codons für herkömmliche Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, anstelle von Codons, die für Methionin und Tryptophan kodieren, die weniger häufig auftreten und dazu tendieren, die Expression eines Gens zu verlangsamen und zu reduzieren, häufig erhöht werden. Nachdem ein synthetisches Gen geschaffen wurde, das eine derartige Aminosubstitution verursacht, kann das modifizierte Protein getestet werden, um zu bestimmen, ob es die gewünschte Enzymaktivität aufrechterhält, während es in größeren Mengen oder in stabilerer Form exprimiert wird.
Dies sind Beispiele bekannter Gentechnikverfahren, die in Bezug auf ZX-produzierende, aus der ATCC-55238-Zelllinie isolierte Gene evaluiert werden können, um zu bestimmen, ob irgendeine dieser Modifikationen die Produktion von ZX der F.-multivorum-Zellen oder von anderen Typen von Wirtszellen verbessert.
Der Satz in den Patentansprüchen, der sich auf "Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um zumindest ein Zeaxanthin-Synthese-Gen zu enthalten, das eine aus einem Stamm von Flavobacterium multivorum, dem die ATCC-Zugriffsnummer 55238 zugeordnet wurde, erhaltene DNA-Sequenz enthält" bezieht, schließt Zellen ein, die Gene mit chemisch synthetisierten DNA-Sequenzen enthalten, unter Verwendung einer DNA- oder mRNA-Sequenz, die durch Analyse der ATCC-55238-Zellinie oder Abkömmlinge dieser bestimmt wurde. Automatisierte DNA-Synthese-Geräte sind bekannt und können zur Duplizierung einer jeden bekannten Gensequenz verwendet werden, ohne dafür einer Replikation der ursprünglichen Wirtszelle zu bedürfen. Ein "Zeaxanthin-Synthese-Gen" umfasst jedes Gen, das ein Enzym oder anderes Protein exprimiert, das im ZX-Biosyntheseweg involviert ist und das zur Steigerung der ZX-Produktion verwendet werden kann, wenn es in geeignete Wirtszellen eingeführt wird, unabhängig davon, für welches bestimmte Enzym im ZX-Biosyntheseweg das Gen kodiert.
BEISPIELE
Beispiel 1: Fermentation im großtechnischen Maßstab
Das Nährmedium, das von den Anmeldern für die anfänglichen Labortests in kleinem Maßstab von Flavobacterium multivorum bevorzugt wurde, wurde als das Nährmedium E unter Beispiel 3 in den U.S.-Patenten Nr. 5.308.759 (Gierhart, 1994) und Nr. 5.427.783 (Gierhart, 1995) identifiziert. Dieses Nährmedium enthielt verschiedene Inhaltsstoffe, die kostspielig und schwierig zu bearbeiten waren. Um Kosten und Unannehmlichkeiten zu reduzieren, wurde nach dem ursprünglichen Einreichdatum dieser Anmeldungen intensiv geforscht, um ein für den großtechnischen Maßstab besseres Nährmedium zu schaffen. Die derzeit bevorzugten Nährmedien zur Fermentation im großtechnischen Maßstab haben Maismehl und verschiedene andere Inhaltsstoffe verdrängt. Diese bevorzugten Medien enthalten entweder maltosereichen Maissirup oder Zuckerrübenmelasse in einer Konzentration von 1 bis 10 % (Gew./Vol.) zusammen 0,5 bis 4 % (Gew./Vol.) Maisquellwasser; 0,5 % (Gew./Vol.) Ammoniumsulfatheptahydrat; 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumchlorid; 0,1 % (Gew./Vol.) Magnesiumsulfatheptahydrat; 0,1 % (Gew./Vol.) Natriumacetat; 0,001 % (Gew./Vol.) Eisensulfatheptahydrat; 0,2 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt; 0,01 % (Gew./Vol.) Thiamin-HCl; zwischen 1 und 6 % (Gew./Vol.) hydrolysiertes Casein (wie beispielsweise NZ-Amin HD, vertrieben von Sheffield Products, Division of Quest International, Norwich, NY); und 1 Vol.-% Pflanzenöl.
Nachdem diese Inhaltsstoffe zusammengemischt worden sind, wird ausreichend NaOH zugesetzt, um den pH-Wert auf 6,5 anzuheben; wurde hingegen das Medium auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, so wie in Versuchen im Labor-Maßstab in den U.S.-Patenten Nr. 5.308.759 und Nr. 5.427.783 beschrieben, fielen zu viele Feststoffe aus dem Maisquellwasser aus.
Das Kulturmedium wird dann durch 30-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisiert, dann auf 27 °C abgekühlt und mit 5 bis 10 Vol.-% einer "flüssigen Vorkultur", die einen F.-multivorum-Stamm, der R-R-Zeaxanthin produziert, ohne die S-S- oder S-R-Stereoisomere zu produzieren, enthält, inokuliert.
Die zur Herstellung einer flüssigen Vorkultur eingesetzten Zellen werden auf einem Schrägröhrchen eines Agars zur Keimzahlbestimmung gehalten. Diese Schrägkulturen werden mit Klonkolonien von F. multivorum, die vom Stamm abstammen, den die Anmelder bei der ATCC hinterlegt haben (ATCC-Zugriffsnummer 55238), inokuliert. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 28 °C werden Schräg-Stammkulturen bei 4 °C eingekühlt, bis sie als Inokulum für Flüssigmedien eingesetzt werden. Lebensfähige Zellen können auch unter Verwendung herkömmlicher Tiefkühlgeräte, Trockeneis oder flüssigem Stickstoff zur längeren Lagerung eingefroren werden.
Eine flüssige Vorkultur wird hergestellt, indem Zellen, die aus einer Schrägagarkultur entnommen wurden, zur Inokulierung von 30 ml eines so wie oben beschrieben hergestellten Flüssigmediums, das in einem 300-ml-Prallkolben enthalten ist, verwendet werden. Die Wachstumsbedingungen sind 28 °C bei einem pH-Wert von 7,2 bis 7,6, Belüftung durch Rühren mit 250 U/min und Züchtung für 24 Stunden. Nach einer anfänglichen Inkubation von 24 Stunden werden die in einem oder mehreren 30-ml-Vorkulturkolben enthaltenen Zellen zur Inokulation einer um das 10fache größeren Menge des Nährmediums in einem Fermentationsgefäß von geeigneter Größe verwendet. Die Zellen werden dann für 48 bis 72 Stunden bei 28 °C inkubiert. Der pH-Wert wird unter Verwendung von NaOH und/oder Phosphorsäure zwischen 6,80 und 7,20 gehalten. Der Grad an gelöstem Sauerstoff wird bei 30 bis 40 % Sättigung durch Durchperlenlassen von filtrierter Luft durch das Gefäß mit einer Rate von 1 Luftvolumen pro 1 Flüssigkeitsvolumen pro Minute gehalten, während das Gefäß mit 400 bis 1000 U/min gerührt wird. Tests durch regelmäßiges Ziehen von Proben und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zeigten, dass die größtmöglichen Mengen an ZX üblicherweise innerhalb von etwa 72 produziert werden, wenn die Zellen unter diesen Bedingungen fermentiert werden.
Beispiel 2: Zusatz von Stabilisatoren
Das durch die Fermentationsverfahren in Beispiel 1 hergestellte ZX muss stabilisiert werden, um die folgende Reinigung und Formulierung zu erleichtern und um die Reinheit zu gewährleisten. Stabilisierende Verbindungen können den F.-multivorum-Zellen (oder einem ZX-hältigen Zellextrakt) zu jedem Zeitpunkt während eines Herstellungs- oder Reinigungsverfahrens zugesetzt werden; im Allgemeinen sollten ein oder mehrere Anfangsstabilisatoren den Zellen zugesetzt werden, wenn diese sich noch im Fermentationsgefäß befinden.
Verschiedene Kandidatenstabilisatoren wurden von den Anmeldern getestet. Die bisher besten Ergebnisse wurden unter Verwendung einer Kombination von Stabilisatoren erzielt, die in einer kleinen Menge eines geeigneten Lösungsmittels (wie beispielsweise etwa 2 ml Ethanol für ein 20-I-Fermentationsgefäß) zusammengemischt werden, bevor sie den Zellen zugesetzt werden. Das bevorzugte Sabilisatorgemisch enthält tert-Butylhydrochinon (mit TBHQ abgekürzt; auch als 2-(1,1-Dimethyl)-1,4-benzoldiol bezeichnet) in einer Menge, die eine letztendliche Konzentration in einem Bereich von etwa 250 μg/l (Mikrogramm pro Liter) bis etwa 50 mg/l nach dem Mischen mit den Zellen ergibt; Ethoxyquin in einer Konzentration nach dem Mischen von etwa 250 μg/l bis etwa 250 mg/l; α-Tocopherol in einer Konzentration von etwa 250 μg/l bis etwa 250 mg/l; und EDTA (Ethyldiamintetraessigsäure) in einer Konzentration von etwa 500 μg/l bis etwa 500 mg/l. Geeignete Konzentrationen können stark variieren und hängen von verschiedenen Faktoren, wie beispielsweise den folgenden Reinigungsschritten und der geplanten Art der Verpackung und Einnahme, ab. Bevorzugte Konzentrationen dieser Stabilisatoren für die Verwendung mit einer einfachen THF-Extraktion gefolgt vom Mischen mit Pflanzenöl und dem wasserdichten Einkapseln in vitaminpillenartiger Form liegen bei etwa 25 bis 50 mg/l für TBHQ, 250 bis 500 μg/l für Ethoxyquin, 250 bis 500 μg/l für α-Tocopherol und 500 bis 1000 μg/l für EDTA.
Nach dem Zusetzen der Stabilisatoren wird die Zellkultur durch 25- bis 50-minütiges Erwärmen auf 55 °C pasteurisiert. So werden die Bakterien abgetötet, ohne dem von ihnen produzierten ZX zu schaden. Die Kultur wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und die ZX enthaltenden Zellen und andere in der Kulturlösung gegenwärtige Feststoffe werden durch ein Querstrom-Mikrofiltrationssystem von der flüssigen Phase getrennt, was die Zellen/Feststoff-Konzentration von einem Ausgangswert von etwa 10 bis 15 Vol.-% auf eine filtrierte Konzentration von etwa 60 bis 80 Vol.-% anhebt. Dieses Verfahren ergibt eine Zellpaste, die auch einige Feststoffrückstände aus dem Nährmedium enthält.
Für ZX-Präparate, die an Japanische Wachteln zum Netzhauttest verfüttert werden, so wie in den Beispielen 5 – 7 beschrieben, wird die Zellpaste bei –70 °C eingefroren, daraufhin durch Lyophilisierung bei 25 °C im völligen Vakuum getrocknet, um eine getrocknete Biomasse zu erhalten, die etwa 1 bis 10 Gew.-% ZX enthält. In früheren Versuchen wurde die Menge an ZX in jeder Charge einzeln gemessen, und Chargen mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden vereinigt und gemischt, um gleichbleibende Konzentrationen für die Versuche mit den Japanischen Wachteln zu gewährleisten.
Um ZX für die menschliche Einnahme herzustellen, wird eine Lösungsmittelextraktion zur Erzeugung eines viskosen, öligen Fluids eingesetzt, so wie in Beispiel 3 beschrieben wird.
Beispiel 3: Teilreinigung zum Erhalt einer viskosen Flüssigkeit
Nachdem die Zellpaste auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise erzeugt worden ist, kann diese auf jede von vielen Weisen behandelt werden. Wie zuvor erwähnt können, falls gewünscht, die Zellmembranen zerstört werden, um die Zellen aufzubrechen und das ZX leichter zugänglich zu machen, und zwar durch Beschallung (Hochfrequenz-Schallwellen), hohem Druck oder Mahlung, wobei die Temperatur der Zellen zur Verhinderung von Oxidation unter etwa 30 °C gehalten wird. Dieser Schritt war jedoch nicht notwendig, wenn Tetrahydrofuran (THF) in einem Lösungsmittelex traktionsschritt eingesetzt wurde, da THF die Zellmembranen ohne mechanische Unterstützung wirksam zerstört. Rühren war bei der Verwendung von THF bei Verfahren im Labor-Maßstab nicht vonnöten; Rühren während des Lösungsmittelmischschritts ist aber wahrscheinlich bei Herstellungsverfahren im großtechnischen Maßstab von Vorteil.
In den bisher ausgeführten Tests beinhaltete die THF-Extraktion ein Mischen von etwa 8 bis 20 Volumina gereinigtes, filtriertes THF mit einem Volumen Zellpaste, die 60 – 80 % Feststoffe enthielt, über einen Zeitraum von 2 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von unter 25 °C. Das THF greift die Zellen auf aggressive Weise an und bildet eine Flüssigkeit mit einer Suspension aus ausgeflockten Feststoffen. Nach einer Zentrifugation bei bis zu 20.000 g für einige Minuten kann der Großteil von THF durch Dekantieren entfernt werden. Das verbleibende THF kann im Vakuum abgedampft werden, wodurch ein viskoses Öl zurückbleibt. Wurden Zellpasten, die 1 bis 3 % ZX enthielten, mit THF-Extraktion in einem einfachen Vorgang behandelt, so enthielt das erhaltene Öl üblicherweise etwa 5 bis 20 Gew.-% ZX.
Beispiel 4: Herstellung von hochgereinigtem Zeaxanthin in Trockenpulverform mit 100 % reinem R-R-Isomer
Ein hochgereinigtes ZX-Präparat in Trockenpulverform wurde durch Weiterverarbeitung des in Beispiel 3 beschriebenen THF-extrahierten öligen Fluids durch die in Folge beschriebene Flüssigkeitschromatographie hergestellt. Die ölige, ZX-hältige Flüssigkeit wurde in Hexan gelöst und durchlief daraufhin eine neutrales Aluminiumoxid enthaltende Chromatographiesäule. Zwei Säulen-Volumina Hexan wurden zum Waschen der Säule verwendet, um Carotinoid-Verunreinigungen, wie beispielsweise β-Carotin und Lycopen, sowie Lipide und andere Verunreinigungen zu entfernen. Ein 80:20-Gemisch aus Hexan und Aceton durchlief daraufhin die Säule, um das ZX herauszulösen. Das gelöste ZX, das erhalten wurde, wurde vakuumgetrocknet. Eine chromatographische Analyse ergab ein zumindest 98 % reines ZX; nur Spurenmengen von Verunreinigungen waren nachweisbar.
Nach etwa 6-moantiger Lagerung in relativ ungeschütztem Zustand (üblicherweise normal gekühlt, wobei mit eher geringer Häufigkeit Proben gezogen wurden, und ohne Gehalt von Antioxidantien und ohne Vorkehrungen zur Verhinderung von Kontakt mit Luftsauerstoff getroffen zu haben) wurde eine Probe dieses ZX-Präparats zur stereoisomerischen Analyse an Prof. John Laudrum (Co-Autor der Publikationen von Bone, Laudrum et al.) an der Florida International University in Miami, Florida, geschickt. Seine unter Verwendung einer chiralen Säulenchromatographie mit Dicarbamat-Derivatisierung durchgeführte Analyse ergab, dass das 6 Monate alte, ungeschützte Präparat 92 % ZX enthielt. Die Verunreinigungen waren in erster Linie Keto-Carotinoide, die vor dem ZX eluierten; Keto-Carotinoide verfügen über ein zusätzliches Sauerstoffatom, das an irgendeiner Stelle an ein Carotinoid gebunden ist, und sind häufige Nebenprodukte, die bei Lagerung von Carotinoiden ohne Schutz vor Oxidation auftreten. Die von Prof. Landrum durchgeführte chirale Analyse zeigte, dass 100 % von ZX im Präparat das gewünschte R-R-Isomer waren. Es lagen keine nachweisbaren Mengen an unerwünschten S-S- oder S-R-Stereoisomeren von ZX vor.
Es ist anerkannt, dass die oben beschriebene chromatographische Reinigung für die Herstellung von hochgereinigtem ZX in wirtschaftlichen Mengen nicht idealerweise geeignet ist, auch wenn die zur Gänze durchführbar und äußerst wirksam ist. Ein alternatives Verfahren, das zur Lutein-Reinigung entwickelt wurde, wird im U.S.-Patent Nr. 5.382.714 (Khachik, 1995; vgl. auch Khachik et al., 1991) beschrieben, bei dem ein kaltes Ethanol/Wasser-Gemisch in einem Extraktionssystem mit zwei Lösungsmitteln gefolgt von Lyophilisierung eingesetzt wird, und stellt ein gutes Kandidatenverfahren zur Evaluierung für die Verwendung bei der wirtschaftlichen Herstellung dar.
Beispiel 5: Zeaxanthin-Versuche bei der Japanischen Wachtel unter Verwendung verschiedener Ernährungsgruppen
Alle Versuche mit Japanischen Wachteln wurden am Schepens Eye Research Institute der Harvard Medical School (Boston, Massachusetts) durchgeführt. Alle Behandlungs- oder Kontrollgruppen bestanden aus einer statistisch signifikanten Anzahl an Vögeln. In den meisten Fällen waren die Kontrollgruppen gleich groß wie die Behandlungsgruppen.
Carotinoidarmes Vogelfutter stammte von Purina Mills (St. Louis, Missouri). Derartiges Vogelfutter wird nur für Versuchszwecke verkauft und wird aus natürlich carotinoidfreiem Getreide (wie beispielsweise Milosamen) erhalten.
Alle ZX-Präparate, die an die Japanischen Wachteln verfüttert wurden, lagen in Form von getrockneter Biomasse aus F.-multivorum-Zellen vor, die fermentiert, mit den in Beispiel 2 beschriebenen Mitteln stabilisiert, zum Abtöten der Zellen pasteurisiert und unter Einsatz von Lyophilisierung getrocknet worden waren.
Alle Versuchstiere wurden aus carotinoidarmen Eiern ausgebrütet. Diese wurden erhalten, indem eine Elterngeneration (als P₁-Vögel bezeichnet) ausschließlich mit carotinoidarmen Futter gefüttert worden war, nachdem die Vögel ausgewachsen waren. Ihre Eier wurden aufgeschlagen und auf Carotinoide hin untersucht, bis die Eier einen Carotinoidmangel aufwiesen. Eier, die daraufhin von Eltern mit Carotinmangel gelegt wurden, wurden verwendet, um alle Versuchs- und Kontrollvögel auszubrüten.
Die Versuchs- und Kontrollvögel wurden in vier Hauptgruppen eingeteilt, die unterschiedliches Futter erhielten. Diese Gruppen wurden als (C+)-Gruppe, (C–)Gruppe, (BC+)-Gruppe, ZX(+5)-Gruppe und ZX(+50)-Gruppe bezeichnet, je nachdem, welche Carotinoide sie mit ihrem Futter erhielten.
Die Vögel der (C+)-Gruppe wurden mit einem handelsüblichen Standardfutter ernährt, das verschiedene Carotinoide enthielt; dieses Futter enthält zudem synthetisches alpha-Tocopherol (Vitamin E) als Zusatzstoff.
Die Vögel der (C–)-Futtergruppe wurden mit Futter ernährt, das im Wesentlichen frei von jeglichem Carotinoid war, so wie oben beschrieben. Dieses Futter enthielt jedoch alle anderen essentiellen Nährstoffe, und es enthielt synthetisches Vitamin A und E als Zusatzstoffe.
Die Vögel der (BC+)-Gruppe erhielten Futter, das frei von allen Carotinoiden war, mit der Ausnahme von β-Carotin als Zusatz in der Dosierung, die auch in der hochdosierten ZX-Gruppe eingesetzt wurde (d.h. 50 mg β-Carotin wurden pro kg Futter zugesetzt). Die Vögel der (BC+)-Gruppe wurden sieben (7) Tage vor Beginn des Lichtschädigungsverfahrens auf die β-Carotin-hältige Diät gesetzt. Diese Gruppe lässt einen direkten Vergleich von β-Carotin und einer Subgruppe der mit ZX als Ergänzung gefütterten Vögel zu, die ebenfalls sieben Tage vor der Lichtschädigung von einer mangelhaften Ernährung auf eine mit ZX ergänzte Diät gesetzt wurden. Wie in Beispiel 8 beschrieben wird, zeigte dieser direkte Vergleich, dass ZX für die Verhinderung phototoxischer Schäden hochwirksam ist, während die Schutzwirkung von β-Carotin so gering war, dass nicht einmal ein statisch signifikantes Niveau erreicht wurde.
Die Vögel der (ZX+)-Gruppe erhielten Futter, das frei von allen anderen Carotinoiden war, jedoch getrocknete Biomasse enthielt, die R-R-Zeaxanthin aus F.-multivorum-Zellen enthielt. Zwei verschiedene Dosierungen von ZX wurden an diese Vögel verfüttert, um eine Dosis-Wirkung-Beziehung bewerten und in Bezug zu verschiedenen Indikatoren von Netzhautschädigung setzen zu können. Vögel der ZX(+5)-Gruppe erhielten eine relativ geringe Menge an ZX, im Schnitt 5 mg zugesetztes ZX pro kg Futter. Da Japanische Wachteln etwa 25 bis 35 g Futter pro Tag zu sich nehmen, wurden in der niedrig dosierten Gruppe etwa 0,125 bis 0,175 mg ZX pro Vogel und Tag eingenommen. Vögel der ZX(+50)-Gruppe erhielten die zehnfach höhere Menge (50 mg ZX pro kg Futter), wodurch diese Vögel im Schnitt 1,25 bis 1,75 mg ZX pro Vogel und Tag zu sich nahmen.
Die Carotinoidkonzentrationen im Kontrollfutter, im carotinoidarmen und im (ZX+)-Futter wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung der in Stacewicz-Sapuntzakis et al., 1993, beschriebenen Verfahren analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
TABELLE 1
Alle Vögel wurden in gewöhnlichen Brutkäfigen aufgezogen und gehalten. Mit der nachstehend beschriebenen Ausnahme wurden sie unter normaler Breitspektrumbeleuchtung, von 10 bis 14 Stunden pro Tag, gehalten.
Beispiel 6: Ablagerung von oral eingenommenem Zeaxanthin
Chemische Analysen wurden durchgeführt, um die Konzentration von ZX (und anderen Carotinoiden), die in der Netzhaut der Vögel einer jeden der in Beispiel 5 beschriebenen unterschiedlichen Futtergruppen abgelagert wird, zu bestimmen.
Um derartige Analysen durchzuführen, wurden Vögel, die aus carotinoidarmen Eier geschlüpft waren und die letzten 6 Monate mit dem entsprechenden Futter ernährt worden waren, durch Genickbruch getötet. Netzhautgewebe wurde durch Sektion des herausgeschälten Auges entfernt, und Gewebe einer einzelnen Netzhaut wurde mithilfe eines Stößels aus Glas oder Polytetrafluorethylen (TEFLON^TM) in 250 destilliertem entionisiertem Wasser bis zu einem fast homogenen Zustand gemahlen. 10 μl des Homogenats wurden entnommen und zur Proteinanalyse des Homogenats herangezogen, um die Resultate der verschiedenen Netzhautproben zu normieren. 250 μm Methanol mit einem Gehalt von 2 % (Gew./Vol.) Pyrogallol und 50 μl 60 % (Gew./Vol.) Kaliumhydroxid wurden den verbliebenen 240 μl der Netzhautgewebesuspension zugesetzt. Das Gemisch wurde in einem Wasserbad bei 70 °C eine Stunde lang erhitzt, woraufhin 500 μl von 50 Vol.-%igem Ethanol, gefolgt von 2 ml Hexan, zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde verwirbelt, um es gut durchzumischen, und dann bei 5 °C stehen gelassen, bis sich die Trennung vollzog. Die Epiphase (d.h. die leichtere Phase, die auf der Oberfläche der verbleibenden Flüssigkeit schwamm), die Hexan und extrahierte Carotinoide, Tocopherole und Retinole enthielt, wurde entnommen. 2 ml zusätzliches Hexan wurden dem Gewebehomogenat zugesetzt, und das Gemisch wurde erneut verwirbelt und trennen gelassen. Diese Epiphase wurde entnommen und mit der ersten vereinigt. Dieser Vorgang wurde einmal mehr in einem dritten Extraktionszyklus wiederholt, um die völlige Extraktion der Carotinoide, Tocopherole und Retinoide zu gewährleisten.
Die vereinigten Hexanextrakte wurden dann mit 1 ml Wasser gewaschen, um die Kaliumhydroxidrückstände zu entfernen. 1 ml zusätzliches Hexan wurde dem Hexan-Wasser-Gemisch zugesetzt, woraufhin die Hexanphase (Epiphase) vorsichtig herauspipettiert wurde. Das Hexan wurde dann unter einem konstanten Stickstoffgasstrom abgedampft. Der verbleibende Rückstand enthielt Carotinoide, Tocopherole, Retinole und andere nichtidentifizierte, Hexan-extrahierbare Verbindungen. Dieser Rückstand wurde dann in einem Lösungsmittel (Methanol:Chloroform:Triethylamin) gelöst und durch HPLC so wie oben beschrieben analysiert.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt, in der ebenso die Schädigungsgrade nach der Bestrahlung mit hochintensivem Licht aufgezeigt werden.
Tabelle 2
ND: Nicht nachgewiesen in diesen Proben. Eine luteinähnliche Verbindung wurde nachgewiesen, aber anscheinend handelte es sich nicht um Lutein, was durch die HPLC-Retentionszeit und ein Photodiodengruppenscanning des betreffenden Peaks ermittelt wurde.
Es sollte festgehalten werden, dass β-Carotin in keiner Netzhaut nachgewiesen wurde, die Vögeln, die jeweils mit einem der beschriebenen Futtermittel ernährt worden waren, entnommen wurde.
Die in Tabelle 2 aufgeführten Netzhaut-Konzentrationen weisen darauf hin, dass das oral eingenommene R-R-Zeaxanthin, gebildet durch Fermentation von Abkömmlingszellen von Flavobacterium multivorum (ATCC-Zugriffsnummer 55238) tatsächlich in der Netzhaut der Versuchstiere abgelagert wurden, die R-R-Zeaxanthin als Nahrungsmittelergänzung in Form eines Futterzusatzstoffs erhielten. Es handelt sich hierbei um wichtige Erkenntnisse, da ZX normal verdaut werden muss, dann muss es die Darmbarriere überwinden, in den Blutkreislauf eintreten und von den Netzhautzellen in den Augen der Vögel in ausreichenden Mengen aufgenommen werden, um das Netzhautgewebe vor phototoxischen Schäden zu schützen. All diese Hürden wurden von den hierin beschriebenen bakteriell fermentierten R-R-Zeaxanthin-Präparaten erfolgreich genommen.
Beispiel 7: Schutz der Netzhaut durch R-R-Zeaxanthin
Einige der Vögel in jeder der Futtergruppen wurden für einen 28-stündigen Zeitraum hochintensivem sichtbarem Licht bei 2.000 bis 3.000 lux ausgesetzt, wobei Zyklen eingesetzt wurden, die eine Stunde Licht gefolgt von 2 Stunden fast völliger Dunkelheit umfassten. Nach dem Lichtzyklus-Zeitraum wurden die Vögel für einen Zeitraum von 14 Stunden in fast völliger Dunkelheit gelassen, bevor sie getötet wurden. Durch vorläufige Tests wurde ermittelt, dass dieses Ausmaß der hochintensiven Lichtbe strahlung ernsthafte bleibende Schäden bei Vögeln der carotinoidarmen Gruppe und mäßige Schäden bei Vögeln der Kontrollgruppe (normales Futter) verursacht. Bei vorläufigen Tests wurde außerdem ermittelt, dass der Zeitraum von 14 Stunden nach der Lichtbestrahlung notwendig ist, um die größtmögliche Anzahl der apoptotischen Zapfennuclei bei ungeschützten Vögeln (mit Carotinoidmangel) zu messen.
Mit Kontrollfutter ernährte Vögel wiesen eine maximale Apoptose etwa 24 Stunden nach der Bestrahlung, während die mit ZX-ergänztem Futter ernährten Vögel eine maximale Apoptose nach einem sehr viel längeren Zeitraum als 24 Stunden aufwiesen. Die Verlängerung der Zeit, die vergeht, bis eine Schädigung gemessen werden kann, ist selbst ein aussagekräftiger Indikator für die schützende Wirkung von ZX.
Die Netzhäute dieser Vögel wurde durch Mikrosektion isoliert, in Xylol fixiert und in Ethanol entwässert, bevor sie in Paraplast (Oxford, 56 °C) eingebettet wurden. Das Netzhautgewebe in Paraplast wurde dann seziert und durch das Verfahren von Gallyas, 1990, oder durch Propidiumiodid gefärbt, um die pyknotischen Kerne, die für Apoptose typisch sind, sichtbar zu machen. Die Anzahl der pyknotischen Kerne, die in einem einzigen mikroskopischen Feld mit 400x (linearer) Vergrößerung zu sehen waren, wurden gezählt. Die Nuclei in zumindest 6 bis 8 getrennten Feldern wurden für jede Behandlungsgruppe gezählt und die Werte gemittelt.
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen eindeutig, dass der Netzhautzelltod und die -schädigungen wie folgt waren: (1) durch das bakteriell synthetisierte R-R-Zeaxanthin im Vergleich zu Vögeln, die normales Futter erhielten, deutlich reduziert und/oder zeitverzögert, auch beim niedrigen ZX(+5)-Dosierungsniveau; (2) durch die höhere ZX(+50)-Dosierung noch stärker reduziert. Die völlige Abwesenheit von pyknotischen Kernen in der Netzhaut der ZX(+50)-Behandlungsgruppe liefert einen überzeugenden Grund zur Annahme, dass R-R-Zeaxanthin aus der F.-multivorum-Zelllinie (ATCC-Zugriffsnummer 55238) einen wichtigen und außergewöhnlichen Durchbruch im Schutz der Netzhautzellen vor phototoxischer Schädigung darstellt. Nach bestem Wissen und Gewissen der Anmelder war kein anderer Wirkstoff, der jemals getestet wurde, in der Lage war, ein derartiges Ausmaß an Schutz zu bieten oder auch nur annähernd erreichen.
Beispiel 8: Direkter Vergleich von R-R- Zeaxanthin mit β-Carotin bei der Schutzwirkung auf das Netzhautgewebe
Wie oben angedeutet wurden Vögel der Futtergruppe BC+ mit einer Dosis β-Carotin (50 mg pro kg Futter) gefüttert, die der Zeaxanthin-Dosis in der ZX(+50)-Gruppe entsprach. Dies ermöglichte den direkten Vergleich von β-Carotin mit ZX bezüglich des für die Netzhautzellen gebotenen Schutzes vor phototoxischen Schäden.
Die Ergebnisse zeigten auf, dass die phototoxischen Schäden in der (BC+)-Gruppe nur minimal verringert waren (im Schnitt etwa 10 % oder weniger). Verglichen mit den Standardabweichungen in der Kontrollgruppe waren diese Ergebnisse statistisch nicht signifikant; die Wahrscheinlichkeit, dass diese kleinen Verringerungen ausschließlich auf zufällige Schwankungen zurückzuführen waren, lag bei 0,12 bis 0,14.
Die Tatsache, dass β-Carotin nicht imstande war, einen besseren Schutz für das Netzhautgewebe vor phototoxischer Schädigung zu bieten, während R-R-Zeaxanthin in derselben Dosierung eine insgesamt 100%ige Reduktion desselben Indikators von Zellschädigung und Zelltod erzielte, stellt die Bedeutsamkeit dieser Entdeckung deutlich unter Beweis. Durch mikrobielle Fermentation synthetisiertes Zeaxanthin stellt einen wichtigen Durchbruch dar, der jeden bisher bekannten Wirkstoff bei weitem übertrifft.
Beispiel 9: Bildung von Absorptionsverstärkern
Zeaxanthin-hältige "Mizellen", deren Durchmesser kleiner als ein Mikrometer ist und die ausschließlich das gewünschte R-R-Isomer von Zeaxanthin enthalten, können sowohl aus dem Lösungsmittelextrakt von Biomasse oder dem öligen Fluid erhalten werden, so wie in Beispiel 3 beschreiben, unter Verwendung von bestimmten Arten von Gallensalzen, so wie in Olsen, 1994, beschrieben. Ein R-R-Zeaxanthin enthaltendes öliges Fluid kann mit einem geeigneten Gallensalz gemischt werden, wie beispielsweise die Phosphatsalze von Glyko- oder Taurocholat, käuflich zu erwerben bei Marcor Development Company in Hackensack, New Jersey, oder durch Verwendung von Gallenblasenextrakten, die Gemische aus Gallensalzen enthalten, wie sie beispielsweise von Salzman Corporation in Davenport, Iowa, angeboten werden. Dieses Gallenmaterial kann entweder mit dem Lösungsmittelextrakt oder der öligen Masse und mit bestimmten anderen Salzen, einschließlich Natriumchlorid, Calciumchlorid oder Kaliumchlorid, gemischt werden. Dieses Gemisch wird dann in einem mechanischen Homogenisator verarbeitet, der Mischvorrichtungen, wie beispielsweise rotierende Messer, umfasst, bei einer Rotationsgeschwindigkeit und für eine Dauer, die durch Routineversuche durch Analyse der Größenbereiche der Mizellen, die sich durch bestimmte Kombinationen von Messergrößen und -formen, Rotationsgeschwindigkeiten und Dauer ergeben, optimiert werden können. Die resultierenden Mizellen werden, falls nötig, getrocknet, bis sie lösungsmittelfrei waren, und daraufhin bis zu jeglicher gewünschten Konzentration unter Verwendung eines Trägers oder einer Verdünnungsflüssigkeit, wie beispielsweise Pflanzenöl, verdünnt. Dieses Gemisch kann dann in eine Kapsel oder eine andere Vorrichtung eingeschlossen werden, die das Schlucken erleichtert und dazu beiträgt, die resultierenden Mizellen vor einem Abbau durch Magensäure zu schützen.
Andere Emulgatoren und Lipide können ebenfalls für zur Bildung von Emulsionen mit kleinen Teilchengrößen eingesetzt werden. Nichtionische Detergenzien, wie beispielsweise Tweene und Spans, so wie in Olsen, 1994, beschreiben, genauso wie Lipidmaterialien, wie beispielsweise Phospholipide und Sphingolipide, die Lipidvesikel von kleiner (unter 1 Mikrometer) Größe bilden, können eingesetzt werden.
Beispiel 10: In Mikrokapseln eingeschlossenes Zeaxanthin
In diesem Beispiel wird die Herstellung von Zeaxanthin in Form von Mikrokapseln beschrieben. Mikrokapseln sind feste Teilchen von einer Größe von 10 bis 1.000 μm, die aus einem Kernmaterial (wie beispielsweise R-R-Zeaxanthin) bestehen, das in ei nem Umhüllungsmaterial oder einer Hülle eingeschlossenen ist, die aus verschiedenen Verbindungen, wie beispielsweise Gelatine, Gummi arabicum, Stärke oder Zein (ein Maisprotein), hergestellt werden kann. Bei der Herstellung des Hüllmaterials können auch andere Verbindungen zugesetzt werden, um die Beibehaltung der Form, der Struktur, der Stabilität oder anderer gewünschter Eigenschaften des resultierenden Präparats zu unterstützen. Derartige Verbindungen können Emulgatoren, Sorbit, Antioxidantien, wie beispielsweise TBHQ oder 2-[1,1-Dimethyl]-1,4-benzoldiol, oder Geliermittel, wie beispielsweise Carrageen, einschließen.
Reines oder teilweise gereinigtes Zeaxanthin wird in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethanol, Aceton oder THF, gelöst. In Lösung werden dann durch den Zusatz des gelösten Zeaxanthins zu Wasser Mikrokristalle mit einem Durchmesser von unter 10 Mikrometern ausgebildet. Dieses Verfahren kann verbessert werden, wenn während des Zusetzens von Wasser die Zeaxanthinkristalle im Lösungsmittel in Gegenwart von Emulgatoren, wie beispielsweise Tween 80, mit hohen Frequenzen beschallt werden.
Haben sich die Mikrokristalle gebildet, so wird dem Gemisch aus Wasser, Zeaxanthin und Lösungsmittel das Hüllmaterial zugesetzt. Bei einigen Hüllmaterialien, wie beispielsweise Gelatine, ist es notwendig, das Gemisch für bis zu zwei Stunden bei hohen Temperaturen von 60 °C zu halten. Hat sich das Hüllmaterial zur Gänze gelöst, so wird das gesamte Gemisch für einen Zeitraum von 5 bis 10 Minuten in eine Beschallungsvorrichtug eingebracht, um die Kristalle erneut zu emulgieren.
Die Bildung der Mikrokapseln wird durch Trocknen des Gemischs aus Kern- und Hüllmaterial unter Einsatz eines beliebigen geeigneten Trocknungsverfahren, wie beispielsweise Sprühtrocknen, oder die Verwendung einer Drehscheibe nach dem Verfahren von Sparks et al., so wie im U.S.-Patent Nr. 4,675,140 beschrieben, ausgeführt. Sprühtrockner finden in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie weit verbreitet Anwendung. Die Drehscheibe ist ein Gerät, das aus einer Scheibe (etwa 4" im Durchmesser), die bei einer bestimmten Temperatur unter kontrollierten Bedingungen gehalten werden kann, besteht. Sie kann mit verschiedenen Geschwindigkeiten in einem Bereich von 1.000 bis 10.000 Umdrehungen pro Minute (U/min) betrieben werden. Ein Gemisch aus Kern- und Hüllmaterial wird auf die Mitte der Scheibe zugefügt, während sich diese mit einer Geschwindigkeit von beispielsweise 4.000 U/min dreht. Die Mikrokapseln werden ausgebildet, wenn die Flüssigkeit in Kontakt mit der erwärmten Drehscheibe kommt. Durch die Zentrifugalkraft werden die Mikrokapseln vom Mittelpunkt der Scheibe weg ausgeworfen und auf einer flachen Oberfläche, die zuvor mit einem "Sammel"- oder "Auffang"-Mittel, wie beispielsweise hydrophober Stärke oder Dextrin, beschichtet wurden, gesammelt. Die Mikrokapseln werden daraufhin durch Sieben nach Größe vom Auffangmittel getrennt. Die Mikrokapseln werden in ein Behältnis gegeben, um sie vor Licht und Luft zu schützen, und unter Kühlbedingungen gelagert, bevor sie in Kapseln zur oralen Einnahme portioniert werden.
LITERATURVERZEICHNIS

Bauernfeind, J.C. (ed.), Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precursors: Technological and Nutritional Applications (Academic Press, New York, 1981)
Bone, R.A., "The rote of the macular pigment in the detection of polarized light," Vision Research 20: 213-220 (1980)
Bone, R.A., et al, "Preliminary identification of the human macular pigment," Vision Res. 25: 1531–1535 (1985)
Bone, R.A., et al, "Analysis of the macular pigment by HPLC: retinal distribution and age study," Invest.
Opthalmol. Vis. Sci. 29: 843–849 (1988)
Bone R.A., et al, "Stereochemistry of the macular carotenoids," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 2033–2040 (1993)
Bone, R.A., et al, "Distribution of macular pigment stereomers in individual eyes, including those with agerelated macular degeneration (AMD)," ARVO Abstracts: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35: 1502 (1994)
di Mascio, P., et al, "Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher," Archives of Biochemistry and Biophysics 274: 532–538 (1989)
Dorey, C.K., et al, "Lipofuscin in aged and AMD eyes," in Retinal Degeneration (Hollyfield et al, editors, Plenum Press, New York, 1993)
Eye Disease Case Control Study Group, "Antioxidant status and neovascular age-related macular degeneration," Arch. Ophthalmol. 11: 104–109 (1993)
Eye Disease Case Control Study Group, "Risk factors for neovascular age-related macular degeneration," Arch. Ophthalmol. 10: 1701–1708 (1992)
Foote, C.S., et al, "Chemistry of singlet oxygen. XI. Cis-Trans isomerization of carotenoids by singlet oxygen and a probable quenching mechanism," J. Amer. Chem. Soc. 92: 5218–5219 (1970)
Foote, C.S., et al, "Chemistry of singlet oxygen. X. Carotenoid quenching parallels biological protection," J. Amer. Chem. Soc. 92: 5216–5218 (1970.)
Gallyas, F., Acta Neuropathologica 79: 620 (1990)
Gerster, H., "Review: antioxidant protection of the ageing macula," Age and Aging 20: 60–69 (1991)
Gittinger, J.W., Manual of Clinical and Problem Ophthalmology (Little-Brown, Boston, 1988)
Haegerstrom-Portnoy, G., "Short-wavelength-sensitive-cone sensitivity loss with aging: a protective role for macular pigment?," J. Opt. Soc. Am. A5: 2140–2144 (1988)
Ham, W.T.,Jr., et al, "Basic mechanisms underlying the production of photochemical lesions in the mammalian retina," Current Eye Research 3: 165–174 (1984)
Handelman, G.J. and Dratz, E.A., "The role of antioxidants in the retina and retinal pigment epithelium and the nature of prooxidant-induced damage," Adv. in Free Radical Biology & Medicine 2: 1–89 (1986)
Handelman, G.J.; et al, "Carotenoids in the human macula and whole retina," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 850-855 (1988)
Jialal, I., et al, "β-Carotene inhibits the oxidative modification of low-density lipoprotein," Biochimica et Biophysica Acta 1086: 134–138 (1991)
Khachik, F., et al, "Separation, identification and quantification of carotenoids in fruits, vegetables and human plasma by high performance liquid chromatography," Pure and Applied Chemistry 63: 71–80 (1991)
Kirschfeld, K., "Carotenoid pigments: their possible role in protecting against photooxidation in eyes and photoreceptor cells," Proc. R. Soc. Lond. B 216: 71–85 (1982)
Malinow, M.R., et al, "Diet-related macular anomalies in monkeys," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 19: 857–863 (1980)
Pease, P.L., et al, "Optical density of human macular pigment," Vision Res. 2 7: 705–710 (1987)
Peto, R., et al, "Can dietary beta-carotene materially reduce human cancer rates?" Nature 290: 201–208 (1981)
Schalch, W., "Carotenoids in the retina-a review of their possible role in preventing or limiting damage caused by light and oxygen," EXS 62: 280–298 (1992)
Seddon, J.M., et al, "Dietary carotenoids, vitamins A, C, and E, and advanced age-related macular degeneration, " JAMA 272: 1413–1420 (1994)
Snodderly, D.M., et al, "The macular pigment. I. Absorbance spectra, localization, and discrimination from other yellow pigments in primate retinas," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25: 660–673 (1984)
Sperduto, R.D., et al, "Do we have a nutritional treatment for age-related cataract or macular degeneration?," Arch. Ophthalmol. 108: 1403–1405 (1990) Taylor, A.-, et al, "Oxidation and aging: impact on vision," Journal of Toxicology and Industrial Health 9: 349–371 (1993)
Vaughn, D. and Asbury, T., General Ophthalmology, 13th ed. (Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1992)
Wald, G., "The photochemistry of vision," Doc. Ophthalmol. 3: 94 (1949)
Weiter, J.J., et al, "Central sparing in annular macular degeneration," Am. J. Ophthalmol. 106: 286–292 (1988) Werner, J.S., et al, "Aging and human macular pigment density," Vision Res. 27: 257–268 (1987)

Claims

Verwendung des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Makuladegeneration bei Menschen, worin zumindest 90 % aller Zeaxanthinmoleküle in diesem Medikament das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin sind und das Medikament in Dosierungsform vorliegt und zumindest 3 mg des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin pro Dosis enthält.
Verwendung des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin bei der Herstellung eines Medikaments oder einer Nahrungsmittelergänzung zur Vorbeugung gegen Makuladegeneration bei Menschen, worin zumindest 90 % aller Zeaxanthinmoleküle in diesem Medikament oder in dieser Nahrungsmittelergänzung das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin sind und das Medikament oder die Nahrungsmittelergänzung in Dosierungsform vorliegt und zumindest 0,5 mg des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin pro Dosis enthält.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Dosierungsform eine Kapsel oder Tablette ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die Dosierungsform eine Kapsel ist, die Zeaxanthin-Mikrokapseln enthält, wobei die Mikrokapseln eine Größe von 10 bis 1.000 μm aufweisen und einen Kern aus R-R-Zeaxanthin enthalten, der von einem Beschichtungsmaterial eingekapselt ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Zeaxanthin durch ein Verfahren hergestellt wird, das die Züchtung von Zellen, die das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin in einem Ausmaß von zumindest 90 % aller von den Zellen synthetisierten Carotinoidmoleküle synthetisieren, in einem flüssigen Medium unter Bedingungen, die die Zeaxanthinsynthese fördern, umfasst.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament oder die Nahrungsmittelergänzung zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Makuladegeneration bei einem Patienten dient, der am Stargardt-Syndrom, an der Best-Krankheit, am Batten-Syndrom, am Sjogren-Larsson-Syndrom, an Zapfen-Stäbchen-Dystrophie oder an oviner Ceroidlipofuscinose, einer Krankheit, die Speicherprobleme in Lysosomen mit sich bringt, leidet oder erhöhte genetische Anfälligkeit für Makuladegeneration aufweist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin zumindest 90 % aller Carotinoide im Medikament ausmacht.
Tablette oder Kapsel, umfassend das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin und einen physiologisch annehmbaren Träger, worin das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin zumindest 90 % des gesamten Zeaxanthins in der Tablette oder Kapsel ausmacht.
Tablette oder Kapsel nach Anspruch 8, die zumindest 3 mg des 3R-3'R-Stereoisomers von Zeaxanthin enthält.
Tablette oder Kapsel nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, worin das 3R-3'R-Stereoisomer von Zeaxanthin zumindest 90 % aller Carotinoide in der Tablette oder Kapsel ausmacht.
Tablette oder Kapsel nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Behandlung von Makuladegeneration bei Menschen.