ES2225863T3 - Estereoisomero 3r-3'r de la zeaxantina para el tratamiento de la degeneracion macular en humanos. - Google Patents

Abstract

SE MUESTRAN METODOS Y FORMULACIONES PARA HACER Y PURIFICAR EL ESTEREOISOMERO 3R-3`R DE ZEAXANTINA COMO UN UNICO ISOMERO DETECTABLE, EN CUALQUIER CANTIDAD DESEADA, PARA UTILIZAR COMO MEDICAMENTO O VITAMINA O SERES HUMANOS. LA ZEAXANTINA, UN PIGMENTO AMARILLENTO QUE SE HALLA NATURALMENTE PRESENTE EN LAS CELULAS MACULARES EN EL CENTRO DE LA RETINA HUMANA, ABSORBEN LA RADIACION DE LA ENERGIA AZUL Y CUASI-ULTRAVIOLETA, CON LO QUE SE PROTEGEN LAS CELULAS RETINALES CONTRA EL DAÑO FOTOTOXICO. LAS PREPARACIONES DE ZEAXANTINA QUE CONTIENEN SOLO EL ESTEREOISOMERO 3R-3`R PUEDEN PRODUCIRSE MEDIANTE UNA CADENA DE CELULAS BACTERIALES DE FLAVOBACTERIUM MULTIVIRUM ( NUMERO DE ACCESO ATCC 55238). ESTAS CELULAS ( Y OTRAS CELULAS TRANSFORMADAS CON SUS GENES PRODUCTORES DE ZEAXANTINA) NO CREAN CANTIDADES DETECTABLES DE LOS ISOMEROS INDESEABLES S-S O S-R DE ZEAXANTINA. DESPUES DE LA SINTESIS UTILIZANDO LA FERMENTACION MICROBIANA , LA ZEAXANTINA PUEDE CONCENTRARSE HASTA UN NIVEL APROXIMADO DEL 5% AL 20% ( DE PESO) MEDIANTE MEDIOS SIMPLES Y BARATOS, COMO UNA EXTRACCION SOLVENTE. TAMBIEN PUEDE PURIFICARSE A NIVELES MUCHO MAS ALTOS MEDIANTE OTROS METODOS, SI SE DESEA. EL ISOMERO PURO R-R PUEDE TOMARSE ORALMENTE, TANTO COMO MEDICAMENTO TERAPEUTICO POR PACIENTES QUE SUFREN DEGENERACION MACULAR, O COMO UNA VITAMINA O SUPLEMENTO NUTRICIONAL POR CUALQUIERA QUE QUIERA REDUCIR SU RIESGO DE SUFRIR DEGENERACION MACULAR RELACIONADA CON LA EDAD, QUE SE HALLA AMPLIAMENTE EXTENDIDA ENTRE LA GENTE DE 50 A 60 AÑOS DE EDAD. TAMBIEN SE MUESTRAN SOLVENTES DE EXTRACCION, AGENTES DE ESTABILIZACION, Y FORMULACIONES ADECUADAS PARA LA INGESTION ORAL (COMO LAS MEZCLAS CON ACEITE VEGETAL Y CAPSULAS, O UTILIZACIONES COMO ADITIVOS ALIMENTICIOS).

Description

Estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina para el tratamiento de la degeneración macular en humanos.

Antecedentes de la invención.

Esta invención pertenece al campo de la bioquímica, y se refiere a un cierto isómero de un pigmento amarillo denominado zeaxantina (abreviado como ZX). Si se administra a humanos como un fármaco o vitamina, este pigmento puede tratar o prevenir una enfermedad denominada degeneración macular, la cual daña la retina y puede causar ceguera.

La retina es un tejido que recubre el fondo del glóbulo ocular. Es complicada, y contiene una docena de capas diferentes. Está descrita e ilustrada en muchos libros médicos, tales como Gittinger, 1988, y Vaughn y Asbury, 1992 (las referencias completas se listan más abajo).

En medio de la retina se halla una región circular especial, denominada la mácula, con aproximadamente de 1 a 1,5 milímetros de diámetro en humanos. La mácula tiene dos características que la distinguen del resto de la retina. En primer lugar, la mácula contiene relativamente pocos bastones; la mayoría de sus fotorreceptores tiene forma de cono (en la fóvea, en el centro exacto de la mácula, no hay bastones en absoluto). Y en segundo lugar, la mácula tiene un color amarillo característico, causado por dos pigmentos denominados luteína y zeaxantina. Ambos pertenecen a una clase de moléculas denominada "carotenoides". La química de estos pigmentos carotenoides se discute más abajo, después del resumen sobre la degeneración macular.

Degeneración macular

"Degeneración macular" se refiere a cualquier condición que implique la lesión progresiva de las células retinales o conos fotorreceptores en la región macular amarilla que hay en el centro de la retina. Se describe y se ilustra en textos tales como Taylor, 1993, Gittinger, 1988, y Vaughan y Asbury, 1992.

Hay varios tipos de degeneración macular. El tipo más común es el denominado "degeneración macular asociada con la edad", usualmente abreviada como AMD (o como ARMD en algunos artículos). La AMD puede dañar la vista en formas que oscilan desde una ligera pérdida hasta la ceguera total.

Hay dos formas de AMD, a menudo denominadas como las formas "húmeda" y "seca". La forma húmeda implica el crecimiento agresivo de los capilares y otros vasos sanguíneos en la retina, hasta un punto en el que los vasos sanguíneos alteran y destruyen la correcta organización de las capas de la retina. Aunque esta forma de AMD puede tratarse a veces usando un láser para cerrar los vasos sanguíneos recién formados, el tratamiento con láser sólo puede retardar el crecimiento de los vasos sanguíneos durante algún tiempo, y usualmente no puede impedir la pérdida eventual de casi toda la visión; la ADM húmeda casi siempre conduce eventualmente a una ceguera total o prácticamente total. La forma húmeda ocurre en sólo aproximadamente un 5 a 10 por ciento de los pacientes que padecen la AMD.

La otra forma de la AMD se denomina AMD "seca". Puesto que ocurre en el 90% de la totalidad de los casos, a menudo se denomina simplemente como AMD. Aunque esta forma de ADM usualmente no causa una ceguera total, puede causar una lesión severa a la vista de los pacientes, y hacer que los pacientes sean incapaces de leer o identificar objetos bien conocidos, tales como las caras de amigos o parientes. Como tal, a menudo conduce a una ceguera funcional, haciendo que la gente sea incapaz de conducir o caminar de forma segura en público, y que sea incapaz de llevar a cabo una actividad normal.

Hay también varias enfermedades que implican la degeneración macular como un síndrome, incluyendo la enfermedad de Stargardt, la enfermedad de Best, la enfermedad de Batten, el síndrome de Sjogren-Larsson, la distrofia de conos y bastones, y la lipofuscinosis ceroide ovina. Los artículos que describen cada una de éstas se citan en Dorey et al., 1993. Además, otras enfermedades que implican problemas de almacenamiento lisosomal (tales como la enfermedad de Tay-Sach) o la degeneración progresiva de células nerviosas (tales como la enfermedad de Alzheimer) también están correlacionadas con la degeneración macular.

Muchas de estas enfermedades tienen componentes genéticos, como lo evidencia la herencia; algunos de los genes que causan estas enfermedades han sido aislados, y los ensayos de exploración genética pueden indicar si una persona tiene un gen defectuoso. Cualquier persona portadora o posiblemente portadora de un gen tal, tal como se evidencia mediante ensayo genético o historia familiar, tiene un riesgo elevado de degeneración macular.

Mediante el robo lento de la vista de la gente, la AMD causa un sufrimiento terrible a sus víctimas. Cuesta miles de millones de dólares cada año, tanto en pérdida de productividad como en las pesadas cargas que impone a los miembros de la familia, a las empresas aseguradoras, a las agencias sociales, y a otros que deben proporcionar o ayudar a pagar los cuidados médicos y otras asistencias a la gente que padece ceguera o una lesión grave de su vista.

En vista de los problemas causados por la AMD, los científicos y doctores han estado buscando durante décadas formas de tratar o prevenir la ceguera y la pérdida de visión causadas por la degeneración macular. Sin embargo, a pesar de todos esos esfuerzos durante más de medio siglo, hoy no hay disponible ningún tratamiento efectivo.

Diagnóstico: Drusen y Lipofuscina

La degeneración macular se diagnostica habitualmente mediante fotografías especiales de la retina. En un tipo de procedimiento de diagnóstico, un médico inyecta un fármaco fluorescente en un paciente, permite el fármaco tiempo suficiente para circular a través del paciente, y entonces toma una fotografía ampliada de la retina, denominada un angiograma. A continuación, el médico analiza la fotografía para determinar la presencia y concentración de uno o ambos de los dos tipos de restos celulares.

Un tipo de resto celular, el cual se ha conocido y estudiado durante décadas, se denomina drusen. Se origina de dos formas distintas. Un pequeña cantidad de drusen duro (partículas pequeñas con un diámetro de menos de 63 micrómetros) está usualmente presente en los ojos de cualquiera con más de 40 años de edad. A menos que esté presente en niveles anormales, el drusen duro no indica lesión retinal.

Por contra, una cantidad significativa de depósitos de drusen blando (también denominado drusen húmedo) mayores indica que ha ocurrido o comenzado una lesión retinal sustancial, puesto que las porciones grandes de drusen blando pueden alterar y desorganizar las capas de la retina, y pueden impedir que las células de la retina reciban una nutrición apropiada de la sangre. Un paciente cuyas retinas contienen una cantidad significativa de drusen blando usualmente se considera que padece degeneración macular.

El otro tipo de restos celulares que está usualmente presente en pacientes que padecen degeneración macular se denomina lipofuscina. La correlación entre la lipofuscina y la AMD ha pasado a ser clara sólo recientemente (por ejemplo, Weiter et al., 1988, y Dorey et al., 1993).

Química de los carotenoides

Los "carotenoides" incluyen una amplia clase de moléculas; se han identificado más de 600 carotenoides en la naturaleza. Estas moléculas comparten varios rasgos, incluyendo:

1.

los carotenoides se crean acoplando juntas moléculas de isopreno, una molécula de 5 carbonos. Puesto que el bloque de construcción contiene 5 carbonos, la mayoría de los carotenoides contienen múltiplos de 5 átomos de carbono.

2.

Los carotenoides tiene múltiples enlaces insaturados. Esto les permite absorber ondas de luz de elevada energía en las regiones azul y ultravioleta cercana del espectro.

3.

Puesto que los carotenoides absorben longitudes de onda en las regiones azul y ultravioleta cercana del espectro, sin absorber longitudes de onda más largas en otras regiones del espectro, los carotenoides son usualmente de color amarillo, naranja, marrón, o rojo. El término "carotenoide" deriva de las zanahorias (carrots); los primeros carotenoides conocidos se identificaron como los pigmentos que proporcionan a las zanahorias un color anaranjado. El color causado por los carotenoides en solución dependerá de varios factores, incluyendo la concentración y presencia de otros compuestos químicos.

4.

Los carotenoides tiene dobles enlaces "conjugados". Esto indica que los dobles enlaces se alternan con enlaces sencillos, de forma que cada átomo de carbono en la cadena está doblemente unido a otro átomo de carbono, pero que ningún carbono está doblemente unido a otros dos átomos de carbono. Esta disposición puede entenderse considerando la Figura 1, la cual muestra las estructuras del \beta-caroteno, la ZX, y la luteína.

Carotenoides diferentes tienen niveles de conjugación diferentes, y en general, una moléculas más elevadamente conjugada proporcionará una mejor protección frente a la lesión "fototóxica" por radiación luminosa de energía elevada. Por ejemplo, en los tres carotenoides mostrados en la Figura 1, la porción de cadena lineal completa de cada uno está conjugada, con enlaces dobles y sencillos alternándose. En el \beta-caroteno y la ZX, la conjugación se extiende hasta los primeros enlaces en los anillos de ambos extremos. Por contra, la luteína tiene un nivel de conjugación inferior, puesto que el doble enlace en uno de sus anillos del extremo no tiene la ubicación apropiada para una conjugación completa. La única diferencia entre la ZX y la luteína está en la ubicación del doble enlace en un extremo (pero no en ambos) de los anillos de los extremos.

Puesto que los carotenoides se han diseñado y seleccionado (a través de la evolución) para absorber la luz azul y ultravioleta cercana con energía potencialmente dañina, se usan como pigmentos protectores en la naturaleza. Se hallan extensamente en plantas, puesto que uno de los principales objetivos de las plantas es absorber tanta luz solar como sea posible, a la vez que se minimiza el daño celular causado por la radiación azul, ultravioleta, y ultravioleta cercana. La lesión ultravioleta de las plantas es un problema principal, y los carotenoides ayudan a minimi-
zarlo.

Puesto que los carotenoides están preparados para proteger contra la lesión fototóxica, los animales han adquirido también (a través de la evolución) vías para utilizar los carotenoides como pigmentos fotoprotectores. Puesto que los animales no pueden sintetizar carotenoides en sus cuerpos, deben ingerir carotenoides (o precursores de carotenoides) a partir de fuentes vegetales. El \beta-caroteno es un ejemplo; los mamíferos deben obtenerlo a partir de plantas, o a partir de carne. Una vez dentro del cuerpo del mamífero, el \beta-caroteno se convierte en otras formas moleculares, incluyendo la vitamina A (retinol), la cual se forma dividiendo el \beta-caroteno en dos mitades.

Los carotenoides se dividen en dos clases principales, los carotenos y las xantofilas. Los carotenos no contienen ningún oxígeno; son verdaderos hidrocarburos, formados sólo a partir de carbono e hidrógeno. Por contra, las xantofilas (tales como la ZX y la luteína) también contienen oxígeno.

La Figura 1 muestra la numeración de los átomos de carbono en los anillos de los extremos izquierdo y derecho de la ZX. Por convención, los átomos de carbono en el anillo del extremo izquierdo se numeran del 1 al 6, mientras que los átomos de carbono en el anillo del extremo derecho se denominan como número "prima", tales como el carbono 3' (pronunciado "tres prima"). Puesto que la ZX es completamente simétrica en relación con los extremos izquierdo y derecho, los términos "izquierdo" y "derecho" son meramente una convención, para simplificar la discusión. No obstante, debería apreciarse que la luteína no es simétrica; la posición del doble enlace en el anillo "izquierdo" no es la misma que la posición del doble enlace en el anillo "derecho".

Puesto que la ZX se forma por la adición de dos grupos hidroxilo al \beta-caroteno, en los átomos de carbono #3 en ambos extremos, su nombre químico es 3,3'-dihidroxi-\beta-caroteno; algunos químicos se refieren a ella como caroteno-diol. A esta molécula se le asignó el nombre "zeaxantina" puesto que se identificó por primera vez como el pigmento que proporciona al maíz su color amarillo, y el nombre científico del maíz es Zea mays.

Tal como se ha destacado más arriba, se han identificado más de 600 carotenoides en la naturaleza. Varias docenas son importante en la bioquímica y en el comercio. La ZX y la luteína son especialmente importantes en esta invención, puesto que están presentes en las retinas de mamíferos y de la mayoría de los otros animales.

La luteína es comercialmente importante, puesto que es ampliamente suministrada (en forma de extractos de plantas, principalmente de caléndulas) a los pollos, para proporcionar a su piel y a la yema de sus huevos un color amarillo más intenso, el cual atrae a los vendedores y consumidores.

La ZX puede tener el mismo efecto y es más potente que la luteína, pero las fuentes de ZX han sido demasiado caras para usarlas en la alimentación de aves de corral. Las patentes US-5.308.759 y 5.427.783 tenían la finalidad de resolver el problema de que la ZX fuera demasiado cara para usarla en la alimentación de animales. Estas patentes se refieren al uso de bacterias para producir la ZX en cantidades comerciales, de forma que pueda proporcionarse a las aves de corral y peces.

Además de por las plantas, algunos carotenoides son sintetizados por ciertas bacterias. Estas bacterias evolucionaron en lugares expuestos a la luz solar directa, y sus carotenoides tiene el mismo papel foto-protector que en las plantas. Las referencias que describen carotenoides procedentes de bacterias incluyen McDermott et al., la patente US-5.429.939 (Misawa et al., 1995), y otros artículos citados en esas referencias.

La patente US-5.429.939 (Misawa et al., 1995) lista las secuencias de ADN de un cierto número de genes que codifican enzimas implicados en la biosíntesis de varios carotenoides, incluyendo la ZX. También se describe el rol de cada gen principal (incluyendo los crtE, crtB, crtI, crtY, y crtZ) en la creación de la ZX. Las células que contenían estos genes se depositaron en la American Type Culture Collection (tal como Erwinia uredovora ATCC 13.931, y Erwinia herbicola ATCC 39.368), y en el Fermentation Research Institute de Japón (por ejemplo, E. coli FERM BP 2377).

Estereoquímica e isómeros de la zeaxantina

Un aspecto importante de la química de los carotenoides implica la "estereoquímica" y los "estereoisómeros". Este tópico se explica en cualquier libro de texto sobre química orgánica.

Puesto que ambos, los carbonos #3 y #3' en ZX son quirales, hay cuatro posibles estereoisómeros. En el isómero 3R-3'R los átomos de carbono #3 y #3' tienen ambos configuraciones R. En el isómero 3S-3S', los átomos de carbono #3 y #3' tienen ambos configuraciones S. Por conveniencias, estos dos estereoisómeros se denominan en ésta como el isómero R-R y el isómero S-S.

Los isómeros tercero y cuarto son los dos isómeros "mezclados" o "meso" (uno R y el otro S): el isómero 3R-3'S y el isómero 3S-3'R. Puesto que la ZX es completamente simétrica respecto su punto central, estos dos isómeros son idénticos en cada aspecto; si el isómero 3R-3'S se dibuja sobre un papel, girando el papel lo convertiremos en el isómero 3S-3'R. En efecto, un único isómero "meso" está formado por ambos, los isómeros S-R y R-S.

Si se emplearan técnicas de síntesis estándares para preparar la ZX, cada uno de los cuatro isómeros posibles estaría presente aproximadamente como un 25% del total. No obstante, puesto que los isómeros S-R y R-S son en realidad idénticos, su isómero "meso" formará el 50% del total, mientras que los isómeros R-R y S-S estarán presentes en aproximadamente el 25% cada uno. Una mezcla de los tres estereoisómeros se denomina una mezcla "racémica".

Sin embargo, las especificidades de las células y de los enzimas por los carotenoides en el tejido retinal son extremadamente precisas, y los diferentes isómeros y estereoisómeros no son intercambiables. La luteína ya la ZX son tratadas por las células retinales como moléculas completamente diferentes y distintas, incluso aunque ellas serían consideradas como isómeros entre ellas bajo la terminología química convencional (puesto que tienen un número idéntico de átomos de carbono, hidrógeno, y oxígeno).

A causa de los factores biológicos, los únicos isómeros que son importantes aquí, son los estereoisómeros. Cualquier referencia en ésta a un "isómero" de la zeaxantina se refiere a un estereoisómero concreto de la ZX y no incluye a la luteína. La luteína y la ZX son consideradas como carotenoides completamente diferentes.

Las diferencias estereoquímicas en los carotenoides, que podrían parecer pequeñas, sutiles e insignificantes, son, de hecho, extremadamente importantes cuando tratamos sobre el tejido retinal. Aparentemente, el único estereoisómero de la ZX que correctamente captado y usado por las células retinales humanas es el isómero R-R' (el estereoisómero 3R-3R').

Ha habido informes de que se han hallado cantidades traza del isómero meso (R-S) de la ZX en el tejido retinal. No obstante, estas cantidades traza puede atribuirse probablemente a ciertas conversiones moleculares que pueden ocurrir espontáneamente en ciertas condiciones, conduciendo a la formación de meso-zeaxantina a partir de precursores de la luteína (Bone et al., 1993 y 1994).

En un laboratorio, los estereoisómeros de la ZX pueden distinguirse entre ellos usando procedimientos tales como la cromatografía con columna quiral (Bone et al., 1993) o el análisis de dicroísmo circular (Britton, 1994).

La zeaxantina y la luteína en la mácula

Hacia 1970, el papel de los carotenoides en la protección de las plantas frente a lesiones fototóxicas era bien conocido. Se sabía también que los carotenoides estaban presentes en los tejidos animales, y todos los carotenoides en animales se derivaban originalmente de plantas, puesto que los animales no pueden sintetizar carotenoides. En base a toda esta información, varios artículos señalaron las similitudes entre los carotenoides en los animales y plantas, y concluyeron que los carotenoides protegen frente a la lesión fototóxica en los animales.

Después de que se hubiera reconocido el papel foto-protector de los carotenoides en los animales, los investigadores empezaron a estudiar la química y funciones de los carotenoides en la retina. Una línea de experimentos implicó ensayos en los que se alimentaba animales de laboratorio con dietas que no contenían carotenoides, constituidas por granos o semillas que no contenían carotenoides (tales como las semillas de milo). Los resultados indicaron que las retinas en animales privados de carotenoides no desarrollaban ninguna área macular amarilla, y que estas retinas contenían niveles anormalmente elevados de drusen blando, que indicaba lesión retinal (Malinow et al., 1980; Kirschfeld, 1982; Ham et al., 1984; y Snodderly et al., 1984). En vista de estos hallazgos, los investigadores sugirieron que los carotenoides parecían ser esenciales para las retinas sanas. Estos investigadores estaban acumulando evidencia molecular en favor de la sabiduría tradicional de que las zanahorias y los vegetales de hojas verdes son buenos para los ojos. No obstante, los científicos todavía no conocían si los pigmentos amarillos en la mácula se tenían que ingerir en su forma final, o si se podían sintetizar en los animales usando otros precursores, tales como el \beta-caroteno y el licopeno.

En 1949 se identificó la luteína como uno de los pigmentos amarillos en la mácula (Wald, 1949). La ZX no fue identificada como el otro pigmento macular hasta muchos años más tarde (Bone et al., 1985). Los artículos que resumen los que se sabía sobre los pigmentos maculares hacia la mitad o finales de 1980 incluyen Handelman y Dratz, 1986; Werner et al., 1987; Pease et al., 1987; Haegerstrom-Portnoy, 1988; y Handelman et al., 1988. Entre otras cosas, estos artículos establecieron que la ZX (la cual está completamente conjugada, y la cual ofrece por tanto una protección algo mejor que la luteína frente a la lesión causada por la energía de la luz) es el pigmento predominante en la fóvea, una pequeña región en el centro exacto de la mácula. La cantidad de ZX disminuye gradualmente, y la cantidad de luteína incrementa, a medida de uno viaja concéntricamente, alejándose de la fóvea, hacía los límites exteriores de la mácula, de forma que en la periferia exterior de la mácula la luteína es el pigmento amarillo dominante. Los artículos más recientes han tratado varios aspectos del envejecimiento y de las lesiones de la retina, los cuales específicamente se centran en los carotenoides como agentes protectores de la retina, incluyen Sperduto et al., 1990; Gerster, 1991; Schalch, 1992; y Seddon et al., 1994.

En resumen, durante más de 10 años se ha sabido que la luteína y la ZX son los dos pigmentos en la mácula, y los científicos han estado especulando durante más de una década que estos pigmentos podrían ayudar a proteger la mácula contra la lesión fototóxica.

No obstante, a pesar del hecho de que estos descubrimientos y sugerencias se hicieron hace más de 10 años, nadie ha desarrollado todavía ningún tipo de fármaco, ningún suplemento nutricional o dietético, u otra forma de tratamiento, que se sepa que es efectivo para prevenir o retardar (menos aún invertir) significativamente la progresión gradual de la degeneración macular.

Los frase anterior ha modificarse algo, puesto que se sabe que todos, el \beta-caroteno, la vitamina A, y la vitamina E, tienen cierto nivel de efecto beneficioso para ayudar a proteger el tejido retinas (ver, por ejemplo, la patente US-5.310.764; Barnowitz et al., 1994; u los dos artículos por el Eye Disease Case Control Study Group, citados más abajo). Estas patentes y artículos han reivindicado o sugerido que el \beta-caroteno, la vitamina A, y la vitamina E, pueden tener un efecto detectable en la prevención o reducción de daño asociado con la degeneración macular.

Tales reivindicaciones podrían ser ciertas, debido a los papeles de antioxidantes generales de los carotenoides, la vitamina A, y la vitamina E. Sin embargo, es también tristemente cierto que los beneficios proporcionados por el \beta-caroteno, la vitamina A y la vitamina E en la retina son muy limitados, y que no alcanzan el nivel de tratamientos efectivos. A todos los efectos prácticos, la degeneración macular no puede prevenirse, no puede detenerse, y es irreversible. Cualquier antioxidante de amplio espectro (tal como el \beta-caroteno, la vitamina A y la vitamina E) es meramente una medida paliativa. Puesto no ha habido disponible nada realmente efectivo, esas vitaminas se han usado (con éxitos muy limitados e insatisfactorios) para intentar retardar la lesión inexorable causada por la degeneración macular.

Como materia de la técnica previa, también debería destacarse que muchas tiendas de alimentación sana venden preparaciones de carotenoides que están etiquetadas como particularmente beneficiosas para los ojos y la vista. Esta reivindicación en la etiqueta de las mezclas de carotenoides podría ser razonable, puesto que (como se ha destacado más arriba) se sabe que el \beta-caroteno y la vitamina A son útiles como antioxidantes generales. Sin embargo, ninguna mezcla de carotenoides comercialmente disponible contiene más que unas pequeñas cantidades "traza" de ZX. La gran mayoría de los carotenoides, que hay en las mezclas de carotenoides que se venden en las tiendas de alimentación sana, son carotenoides distintos de la zeaxantina (principalmente \beta-caroteno y vitamina A).

Vale la pena también prestar atención a las posiciones y objetivos de la investigación de varias importantes agencias gubernamentales y consorcios de investigación. En los Estados Unidos de América, los National Institutes of Health (actuando a través del National Eye Institute (NEI) y del National Advisory Eye Council) publicaron dos informes recientes titulado, "Vision Research: A National Plan 1994-1998", NIH Publication Nº 93-3186 (1994; en concreto, consultar las páginas 55-65), y "Age related eye disease study," NIH Publication Nº 93-2910 (1993). Ambas publicaciones, y la investigación que ellas describen, se concentran en el \beta-caroteno (en vez de la ZX) como el compuesto que sostiene la mayor promesa para tratar la AMD. Hasta donde alcanza el conocimiento y creencia de los solicitantes, después de discutir el tema con responsables del NEI, ni el NEI ni ninguna otra organización afiliada con los National Institutes of Health, desea financiar, o ha financiado recientemente, ninguna investigación sobre las zeaxantinas como un tratamiento potencial de la AMD. En cambio, el NIH y otras organizaciones financiadas con impuestos están destinando millones de dólares a realizar investigación sobre el \beta-caroteno como el agente candidato más prometedor para tratar y prevenir la AMD.

Otros investigadores prominentes que merecen especial atención pertenecen al "Eye Disease Case Control Study Group". Este grupo publicó recientemente dos artículos titulados, "Antioxidant status and neovascular age-related macular degeneration," Arch. Ophthalmol. 11:104-109 (1993), y "Risk factors for neovascular age-related macular degeneration," Arch. Ophthalmol. 10:1701-1708 (1992). Al igual que en los informes oficiales del NIH, ninguno de estos artículos enseña o sugiere el uso de la zeaxantina como un fármaco para tratar la AMD, y este consorcio también ha declinado o rechazado financiar ninguna investigación sobre la ZX como un posible agente para tratar o prevenir la AMD.

También debería destacarse que hay un gran interés en los carotenoides para tratar o prevenir el cáncer (que empieza con Peto et al., 1981), y para impedir la formación de colesterol y reducir los depósitos de placa dentro de las arterias (Jialal et al., 1991). Hay una enorme cantidad de literatura científica que trata de las diferentes actividades de los carotenoides, y ha habido un gran interés en las formas de sintetizar químicamente los carotenoides, incluyendo la luteína y la ZX. Sin embargo, a pesar de todos los estudios sobre carotenoides y los esfuerzos sintéticos de las décadas pasadas, nadie ha descrito todavía ningún procedimiento efectivo para tratar o prevenir la degeneración macular. En vista del enorme coste y sufrimiento causado a las víctimas y a la sociedad por la degeneración macular, éste es un problema enorme, el cual debe estudiarse.

En consecuencia, la presente invención ofrece un adelanto potencialmente importante al proporcionar ambos (1) un fármaco seguro y efectivo para tratar pacientes a los que se les ha diagnosticado que padecen degeneración macular, y (2) un suplemento nutricional, comparable a una píldora de vitamina, el cual puede ser tomado por cualquiera que quiera reducir el riesgo de que él o ella pueda padecer degeneración macular después de alcanzar o sobrepasar la edad media.

La Síntesis de la Luteína y de la Zeaxantina: La Técnica Previa

Varias referencias de la técnica previa describen procedimientos para crear la ZX. Estas referencias pueden agruparse en dos categorías: procedimientos de fermentación, en los cuales los microbios juegan un papel clave en el proceso de manufacturación; y procedimientos de síntesis sin fermentación, en los cuales se usan simplemente reacciones químicas. La mayoría de las referencias de la técnica previa sugieren que la ZX debería usarse para propósitos conocidos, tal como aditivo en los alimentos de aves de corral y peces, para oscurecer el color de las carne y hacerla más atractiva. Aparentemente, ninguno de estos esfuerzos resulto nunca en producción o venta alguna de ZX en cantidades comerciales.

A fecha de octubre de 1995, la única forma de adquirir ZX, bien en forma purificada o en forma semi-concentrada en donde la ZX constituye más de aproximadamente el 5% en peso, requiere la compra de cantidades de miligramos de ZX, a partir de compañías químicas especializadas tales como Atomergic Chemicals Corporation (Farmingdale, NY) o Spectrum Chemical Manufacturing Company (Gardena, CA). Los precios de 1995 de la ZX purificada procedente de estos fabricantes especializados, en mezclas sintéticas racémicas que contienen los isómeros S-S y S-R no deseados, oscila desde aproximadamente 90 dólares hasta aproximadamente 125 dólares por miligramo. Esto se traduce en aproximadamente 100.000 dólares (en moneda estadounidense) por gramo de ZX, en una mezcla racémica. Claramente, estas preparaciones no tienen un potencial realista de uso como fármacos o suplementos nutricionales, tanto debido a su precio, como debido a que contienen grandes cantidades de los isómeros S-S y meso no deseables y posiblemente peligrosos. Antes de esta invención, la R-R zeaxantina purificada o semi-purificada simplemente no estaba disponible para el público, en ninguna forma.

Las referencias de la técnica previa que describen la producción de la ZX usando la fermentación microbiana incluyen:

(1)

Courington y Goodwin, 1995, la primera referencia conocida que describe la producción de la ZX mediante bacterias procedentes del género Flavobacter.

(2)

Patente US-3.891.504 (Schocher y Wiss, 1975, asignada a Hoffman LaRoche), que también describe la producción de ZX mediante células de Flavobacter. Estas células que contenían ZX se suministraron a pollos y causaron una coloración apropiada.

(3)

Patente US-3.841.967 (Dasek et al., 1974) y patente US-3.951.743 (Shepherd et al., 1976). Ambas se asignaron a Nestlé. Estas describen procedimientos y nutrientes que podrían usarse para incrementar la cantidad de ZX producida por las bacterias.

(4)

Dos pacientes estadounidenses más recientes (US-5.308.759 y 5.427.783, ambas inventadas por Gierhart), solicitante en ésta. Estas patentes describen una cepa de bacteria (Flavobacterium multivorum) aislada de un canal navegable del Missouri. Estas bacterias se descubrieron para crear ZX sin crear cantidades sustanciales de otros carotenoides. Esto es importante en el contexto de la alimentación de aves de corral y peces para proporcionar carne y yemas de huevo con un color más oscuro, puesto que los carotenoides, después de haber sido ingeridos por el animal, compiten entre ellos por la captación en el torrente sanguíneo. En consecuencia, la ausencia de otros carotenoides en la cepa de F. multivorum identificada por Gierhart podría hacer que hubiera más ZX disponible como pigmento para el tejido animal, y, por tanto, incrementaría su potencia y prestaciones.

La patente '759 reivindica procedimientos para producir ZX para alimentos de aves de corral y peces, usando la cepa de la bacteria F. multivorum. La patente '783, de división, reivindica las mezclas de alimentación. Ambas patentes están limitadas por el uso de la ZX para alimentos de aves de corral y peces, y ninguna sugiere nada sobre usar la ZX para tratar humanos.

Ninguna de las patentes de Gierhart hace ninguna afirmación sobre estereoisómeros específicos de la ZX por dos razones: (1) en 1989 no se conocía el estatus de los estereoisómeros de la ZX generada por las células de F. multivorum, cuando se registraron las solicitudes, y (2) puesto que las patentes solamente concernían a la creación de la ZX para su uso en alimentos para aves de corral o peces, no había ninguna razón evidente de preocupación por los diferentes estereoisómeros.

La cepa del tipo salvaje de la F. multivorum se depositó en la ATCC, y se le asignó el número de acceso ATCC 55.238. Puesto que estas bacterias generar un cierto tipo de lípidos denominado esfingolípidos, la ATCC reclasificó estas bacterias como Sphingobacterium multivorum, y listó estas células bajo este nombre en su catálogo. El nombre Sphingobacterium que aparece en el catálogo de la ATCC todavía no ha aparecido en ninguna de las publicaciones de referencia que son consideradas como las guías oficiales para la taxonomía bacteriana: Bergy's Manual of Systematic Bacteriology, la cual es completada y actualizada por el International Journal of Systematic Bacteriology.

Los esfuerzos para crear ZX mediante síntesis química estándar (sin usar microbios) han sido descritos a lo largo de los últimos 20 años, incluyendo las patentes estadounidenses 4.153.615 (Saucy, 1979), 4.952.716 (Lukac et al., 1990), y 5.227.507 (Lukac et al., 1993). No obstante, estos procesos presentan serias desventajas. Típicamente requieren numerosos pasos de reacción, y cada paso tiene un rendimiento de menos del 100%, de forma que el rendimiento final de ZX al final del proceso de múltiples pasos es relativamente pobre. Además, la síntesis química usualmente rinde los estereoisómeros no deseados S-S y S-R de la ZX, así como varios productos de conversión y degradación, tales como zeaxantina oxidada, y moléculas de zeaxantina que han perdido uno o más de los dobles enlaces en la porción recta y/o en los anillos de los extremos.

En resumen, antes de esta invención, no había una fuente conocida de zeaxantina R-R purificada apropiada para consumo humano, bien como fármaco o como suplemento nutricional.

Tal como se describe más abajo, la cepa de F. multivorum (nº de acceso de la ATCC 55.238) y sus descendientes mutados podrían usarse para generar el estereoisómero R-R de la ZX como único isómero detectable, sin cantidades detectables de los estereoisómeros no deseados S-S o S-R, para su uso en algunas realizaciones de la presente invención.

Resumen de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona: el uso del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la degeneración macular en humanos, en donde al menos el 90% de todas las moléculas de zeaxantina en dicho medicamento son el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina, y el medicamento se dispone en formas de dosificación y contiene al menos 3 mg del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina por dosis.

En un segundo aspecto se proporciona: el uso del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina en la fabricación de un medicamento o suplemento nutricional para la profilaxis de la degeneración macular en humanos, en donde al menos el 90% de todas las moléculas de zeaxantina en dicho medicamento o suplemento nutricional son el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina, y el medicamento o suplemento nutricional se dispone en formas de dosificación y contiene al menos 0,5 mg del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina por dosis.

Al paciente se le podría haber diagnosticado ya, aunque no es necesario, que padece degeneración macular. El paciente podría tener una susceptibilidad genética elevada hacia la degeneración macular, y/o podría padecer de cualquiera de la enfermedad de Stargardt, la enfermedad de Best, la enfermedad de Batten, el síndrome de Sjogren-Larsson, la distrofia de conos-bastones, la lipofuscinosis ceroide ovina, o una enfermedad que implique problemas de almacenamiento lisosomal. En particular, el medicamento o suplemento nutricional podría ser para el tratamiento de la degeneración macular asociada con la edad, y podría se profiláctico - - -es decir, para reducir el riesgo futuro de degeneración macular relacionada con la edad, u otra. Los suplementos nutricionales conteniendo el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina en una forma apropiada para la ingestión oral por parte de humanos son especialmente apropiados para reducir el riesgo de degeneración macular.

En general, el medicamento o suplemento nutricional podría incluir una sustancia diluyente o portadora, la cual es apropiada para su administración a humanos. En el caso de suplementos nutricionales, el diluyente o portador podría ser uno apropiado para ingestión oral por humanos.

El medicamento generalmente se dispone de forma que podría administrarse una cantidad suficiente del estereoisómero 3R-3'R al paciente para proporcionar un beneficio terapéutico en un humano que padece degeneración
macular.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la zeaxantina se usa en la fabricación de un medicamento en una forma de dosis unitaria, la cual contiene al menos 10 mg del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina. Cuando la zeaxantina se emplea para reducir el riesgo futuro de degeneración macular relacionada con la edad, u otras, en humanos, de acuerdo con el segundo aspecto, podría, por ejemplo, usarse en la fabricación de un suplemento nutricional, por ejemplo, para su ingestión oral ocasional o periódica, suplemento que contiene al menos 0,5 mg del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina en cada dosis.

Las formas de dosificación fabricadas de acuerdo con el primer o segundo aspecto de la invención preferiblemente contienen un excipiente, diluyente o portador fisiológicamente aceptable. Por "fisiológicamente aceptable" se pretende indicar particularmente que el excipiente, diluyente o portador sea apropiado para su administración a humanos. En una realización preferida de composición el diluyente o portador es apropiado o está destinado a la ingestión oral por parte de humanos, y la composición contiene el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina en una cantidad que es terapéuticamente efectiva para su uso en el tratamiento o prevención de la degeneración macular en humanos.

El estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina constituye al menos el 90 por ciento de la zeaxantina total, particularmente de forma preferible al menos el 95%, y los estereoisómeros S-S y S-R constituyen menos del 10 por ciento, particularmente menos del 5 por ciento de la zeaxantina total en la forma de dosificación. En particular, la forma de dosificación podría comprender sustancialmente ningún estereoisómero S-S y R-S. Por ejemplo, la 3R-3'R zeaxantina podría ser el único estereoisómero detectable de zeaxantina presente.

Es también preferible que la 3R-3'R zeaxantina constituya al menos el 90 por ciento del total de carotenoides en la forma de dosificación. Esto es preferible porque otros carotenoides podrían competir contra la zeaxantina por la captación alimentaria, o la deposición en tejidos después de la ingestión.

En algunas realizaciones el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina tiene un recubrimiento protector para reducir la degradación de la zeaxantina por el ácido del estómago.

Las realizaciones preferidas de la forma de dosificación fabricada de acuerdo con el primer o segundo aspecto comprenden al menos el 1%, preferiblemente el 2%, y de forma particularmente preferida el 5% en peso de zeaxantina (deseablemente 3R-3'R zeaxantina).

En algunas realizaciones, la forma de dosificación producida podría contener células microbianas no patógenas, las cuales contienen el estereoisómero 3R-3'R de zeaxantina en una concentración de al menos el 2% en peso como una fracción de masa celular microbiana.

Cuando la forma de dosificación está destinada a un uso como suplemento nutricional podría ser deseable incorporar un portador seleccionado de entre sustancias alimenticias apropiadas para, o destinadas a la ingestión oral por humanos.

El estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina empleado en el primer o segundo aspecto de la invención podría producirse cultivando, en un medio nutriente líquido, en condiciones que promueven la síntesis de zeaxantina, células que sintetizan el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina con un nivel de al menos el 90% de todas las moléculas de carotenoide sintetizadas por las células. Las células son preferiblemente unas que sintetizan este estereoisómero como único isómero detectable. Ellas podrían ser células bacterianas descendientes de la cepa ATCC nº 55.238 de Flavobacterium multivorum. Alternativamente, las células podrían haber sido manipuladas genéticamente para contener al menos un gen para la síntesis de zeaxantina, conteniendo una secuencia de ADN obtenida de células descendientes de la cepa ATCC nº 55.238 de Flavobacterium multivorum.

Las células bacterianas de la cepa de células de Flavobacterium multivorum (ATCC nº de acceso 55.238) no crean ninguna cantidad detectable de estereoisómeros S-S o S-R no deseados, y no sintetizan cantidades significativas de otros carotenoides tales como el \beta-caroteno o luteína, los cuales podrían competir contra la ZX por la captación alimentaria después de la ingestión oral. Después de su síntesis usando estas células, la ZX puede purificarse mediante procedimientos tales como extracción con solvente, y puede tomarse oralmente, bien como fármaco terapéutico por pacientes que padecen degeneración macular, o como un suplemento nutricional por cualquiera que quiera reducir su riesgo de sufrir degeneración macular relacionada con la edad, la cual está extendida entre la gente con edades por encima de aproximadamente los 50 ó 60 años. También se descubren formulaciones ingeribles convenientes, tales como (1) cápsulas estancas conteniendo R-R zeaxantina mezclada con un portador tal como un aceite vegetal; (2) varios alimentos (tales como margarina, productos lácteos, jarabe, masa de bizcocho, y preparaciones de alimentos que no están sometidas a una cocción agresiva) que contienen R-R zeaxantina como un aditivo; y (3) formulaciones granulares que pueden añadirse a sopas, ensaladas, bebidas, u otros alimentos.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una tableta o cápsula que comprende el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina y un portador fisiológicamente aceptable, en donde el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina constituye al menos el 90 por ciento de toda la zeaxantina en la tableta o cápsula.

Preferiblemente, la tableta o cápsula de este aspecto de la invención contiene al menos 3 mg del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina.

Breve descripción de las figuras

Las realizaciones preferidas de esta invención se describen más abajo solamente a modo de ejemplo y con referencia a las figuras que la acompañas, de las cuales:

Figura 1, ilustra las estructuras moleculares del beta-caroteno, luteína, y zeaxantina, mostrando la estructura de los tres carotenoides y el sistema de numeración de los anillos de los extremos. Estas estructuras son conocidas en la técnica previa.

Figura 2, comprende una gráfica de flujo que describe los pasos de fermentación y purificación de la ZX generada por microbios que sintetizan 3R-3'R zeaxantina estereoisoméricamente pura.

Descripción de las realizaciones preferidas

Esta invención descubre un procedimiento para fabricar un medicamento o suplemento nutricional, para administración a humanos, para prevenir o reducir la degeneración macular, una condición patológica que daña la vista y puede causar ceguera. Las preparaciones de zeaxantina destinadas a ingestión humana deberían contener el estereoisómero 3R-3'R de la ZX (también denominado, por conveniencia, isómero R-R, o R-R zeaxantina) como un isómero "altamente dominante". Tal como se define en ésta "isómero altamente dominante" se refiere a una preparación que contiene al menos el 90% o más del isómero R-R, comprendiendo los isómeros S-S o S-R no deseados menos del 10% de toda la zeaxantina en la preparación. Preferiblemente, cualesquiera preparaciones destinadas a humanos debería contener el isómero R-R de la zeaxantina como el único isómero detectable, sin cantidades detectables de los isómeros S-S o S-R no deseados. Tales preparaciones se descubren en ésta.

Recientemente se ha descubierto, usando análisis de cromatografía con columna quiral (tal como se descubre en Bone et al., 1993) que las células de la cepa bacteriana de F. multivorum (número de acceso de ATCC 55.238) generan el isómero R-R como único isómero detectable de la ZX, cuando se fermentan tal como se describe en los Ejemplos. Tal como se describe en el Ejemplo 4, un análisis por parte del Profesor Landrum indicó que no había cantidades detectables de ninguno de los dos isómeros, el isómero S-S o el isómero meso R-S, en las preparaciones de ZX creadas fermentando células procedentes de esta cepa de F. multivorum.

Las diferencias en los isómeros R-R, R-S o S-S de la zeaxantina serían muy importantes si las preparaciones de ZX se administran a humanos como un medicamento o suplemento nutricional, puesto que el único isómero de la ZX que está presente de forma natural en las retinas humanas es el isómero R-R. Se cree que la ingestión de cantidades significativas de los isómeros R-S y S-S la haría muy indeseable y peligrosas, desde un punto de vista médico, puesto que (1) los isómeros R-S y S-S no existen de forma natural en las retinas humanas, excepto posiblemente en cantidades trazas extremadamente pequeñas como productos secundarios que se forman cuando la luteína se degrada dentro de las células retinales, y (2) los isómeros R-S y S-S podrían desplazar competitivamente el isómero R-R deseado en el tejido retinal, conduciendo posiblemente a una lesión celular a largo plazo y a complicaciones médicas.

La pureza estereoisomérica de las preparaciones de ZX, obtenidas mediante fermentación de la cepa de F. multivorum descubierta en ésta, es extremadamente valiosa, puesto que es extremadamente difícil y caro separar estereoisómeros después de que la ZX haya sido sintetizada químicamente. Aunque la separación de estereoisómeros podría ser posible en equipos de laboratorio a pequeña escala, es prohibitivamente cara en volúmenes comerciales.

Uso como fármaco de Prescripción para Pacientes de AMD

En un aspecto de esta invención, la preparación de R-R zeaxantina descubierta en ésta puede formularse y administrarse como un fármaco, es decir, como un medicamento que puede ser prescrito por médicos para tratar pacientes a los que se les ha diagnosticado que padecen degeneración macular, o una enfermedad que puede causar degeneración macular como síntoma o manifestación, tales como la enfermedad de Stargardt, la enfermedad de Best, la enfermedad de Batten, el síndrome de Sjogren-Larsson, la distrofia de conos-bastones, la lipofuscinosis ceroide ovina, o una enfermedad de almacenamiento lisosomal, tal como la enfermedad de Tay-Sach.

Cuando se usa para tal tratamiento, una preparación de ZX debe tener un cantidad suficiente del isómero R-R de la ZX para elevarse al nivel de un agente terapéutico, en un sustancia portadora o forma (tal como una cápsula) apropiada para la administración a humanos, tal como se describe más abajo. En una realización preferida, la ZX para tratamiento médico se empaqueta en forma de dosis unitaria, tal como una cápsula o tabletas. Cada dosis debería contener al menos 3 mg de R-R zeaxantina, y podría contener zeaxantina en un rango de desde 3 mg hasta 10 mg de zeaxantina, si se desea, para una mejor eficacia terapéutica.

En otro aspecto de esta invención, la preparación de R-R zeaxantina descubierta en ésta puede formularse y administrarse como un medicamento profiláctico, para pacientes a los que se les ha diagnosticado que tienen una susceptibilidad incrementada hacia la degeneración macular, tal como a causa de una historia familiar o diagnóstico genético de cualquiera de las enfermedades listadas más arriba. Las dosis unidad preparadas para su administración a tales paciente, que tienen un riesgo elevado de AMD, pero que todavía no padecen de AMD real, podrían contener cantidades menores, tales como 2 mg por dosis.

Cualquiera de estas dosis puede proporcionarse a un coste comercialmente razonable, usando los descubrimientos en ésta. Las cápsulas conteniendo 25 miligramos (o una cantidad inferior) en un fluido portador oleoso pueden crearse de forma económica, usando la fermentación microbiana acoplada con un paso de extracción con solvente. También pueden crearse formulaciones en polvo que contienen cantidades más elevada incluso (tales como 100 miligramos o más por dosis) si se usa una purificación más extensa, tales como los procedimientos descritos en el Ejemplo 4.

Los ejemplos de formulaciones de ZX apropiadas incluyen:

(a)

un cápsula estanca digestible y un fluido contenido en la misma, en donde la cápsula y el fluido están dimensionados y diseñados para su ingestión oral por un humano, y son farmacológicamente aceptables, y en donde el fluido contiene el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina; preferiblemente, la zeaxantina está encerrada dentro de micelas creadas mediante un proceso usando una sal biliar; y

(b)

una tableta diseñada para ingestión oral por un humano, en donde la tableta contiene el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina y un material unidor compresible, el cual es compatible con la zeaxantina, y el cual causa que una mezcla de zeaxantina y del material unidor retenga su forma después de su compresión bajo una presión apropiada, y en donde la tableta es farmacológicamente aceptable y está convenientemente dimensionada para su ingestión oral por un humano; la tableta podría tener una capa de recubrimiento digestible que ayude a proteger la zeaxantina contra la oxidación.

Uso como Vitamina o Suplemento Nutricional

En todavía otro aspecto adicional de esta invención, la ZX puede fabricarse y empaquetarse en forma de un vitamina o suplemento nutricional o aditivo alimenticio, para consumo por parte de gente que no padecen actualmente de degeneración macular, pero que quieren reducir el riesgo de degeneración macular más tarde en su vida. Cuando se ingiere con tal propósito, las dosis apropiadas deben ser sustancialmente más elevadas que las cantidades trazas halladas en los polvos que se venden actualmente en las tiendas de alimentación sana, pero más bien deberían ser inferiores a cuando se usa la ZX como un fármaco terapéutico para gente a las que se ha diagnosticado que padecen la AMD. Tales dosis es posible que estén en el rango de 0,05 miligramos hasta 5 miligramos, para una dosis que deba ser ingerida diariamente. Por ejemplo, una dosis de 0,05 a 1,0 mg sería apropiada cuando la R-R zeaxantina es uno de una docena o más agentes en un cápsula o tableta multi-vitamina, mientras que una dosis de 1 a 5 mg puede hacerse accesible para su compra controlada por parte de gente que quiere dosis más elevadas.

Los ejemplos de composiciones que contienen ZX como un suplemento nutricional incluyen:

(c)

una composición destinada a la ingestión oral por humanos, que contiene una sustancia alimenticia para consumo humano (generalmente una que es nutricionalmente aceptable y gustosa), la cual es apropiada como portador de la zeaxantina, y el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina añadido a la sustancia alimenticia como un aditivo nutricional; la sustancia alimenticia podría seleccionarse de entre margarina, productos lácteos, jarabe, comestibles cocidos al horno, masa de bizcocho, batido de chocolate y nueces, preparaciones de carne, e ingredientes de sopas; preferiblemente, la zeaxantina está microencapsulada y tiene un recubrimiento protector para reducir la degradación de la zeaxantina por el ácido del estómago; la sustancia alimenticia podría comprender una formulación granular, por ejemplo, podría ser una mezcla de condimento que contiene sal, una mezcla de condimento que contiene especias, un aditivo de sopas, mezcla de panadería o aditivos condimentados para leche; en tal formulación granular, la zeaxantina podría tener un recubrimiento protector para reducir la degradación de la zeaxantina por parte del ácido del estómago;

(d)

una composición que comprende un comestible para consumo oral por humanos, conteniendo el comestible células microbianas, las cuales podrían estar intactas, las cuales no son patógenas (por ejemplo, para los humanos), y las cuales contienen el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina en una concentración de al menos el 2% de zeaxantina en peso como fracción de la masa celular microbiana; el comestible podría escogerse de entre, queso, yogur, leche y cerveza; las células microbianas podrían haberse matado mediante pasteurización.

Con independencia de si se usa como fármaco terapéutico o suplemento nutricional, la preparación de ZX destinada a uso humano debería contener el isómero R-R como único estereoisómero o "estereoisómero altamente dominante" estereoisómero de la ZX, El término "estereoisómero altamente dominante" se usa en ésta para describir una preparación de ZX en la cual el isómero R-R de la ZX deseado constituye al menos el 90 por ciento de toda la ZX en la mezcla, y los isómeros S-S o S-R no deseados constituyen menos del 10 por ciento.

Preferiblemente, el isómero R-R debería ser el único isómero de ZX detectable en cualquier preparación destinada a ingestión humana. Esto se ha hecho posible, en volúmenes comerciales y con un gasto razonable, porque la línea bacteriana de F. multivorum descrita en ésta genera el isómero R-R como único estereoisómero detectable de la ZX. Si cualesquier isómeros S-S o S-R está presente en las mezclas fermentadas después de su purificación, su cantidad es demasiado pequeña para ser detectada por los procedimientos descritos en el Ejemplo 4.

Además, a diferencia de la mayoría de las cepas bacterianas, las células de F. multivorum descritas en ésta no generan una mezcla de carotenoides; estas células crean R-R zeaxantina como único carotenoide detectable. Puesto que la ZX debe competir contra otros carotenoides por su captación alimenticia y deposición en tejido, esto podría ser útil para incrementar la captación de ZX y la deposición retinal después de su ingestión oral, especialmente en casos en los que la ZX se usa como un fármaco para tratar casos diagnosticados de degeneración macular.

Fabricación a Escala Comercial Mediante Fermentación Bacteriana

Como es conocido por los especialistas en la técnica, los procedimientos usados para fermentar bacterias en instalaciones de laboratorio pueden ser muy caros y difíciles de controlar cuando se convierten en grandes operaciones de fabricación. En consecuencia, los solicitantes han desarrollado nutrientes y procedimientos mejorados para su uso comercial con sus células de F. multivorum. Es mucho más fácil trabajar con los nutrientes y procedimientos mejorados, y es mucho menos costoso por gramo de ZX producido, que con los medios y condiciones previamente descubiertos en las patentes estadounidenses 5.308.759 y 5.427.783. Los nutrientes y condiciones preferidos se describen en el Ejemplo 1.

Después de la fermentación, pueden añadirse a las células uno o más compuestos estabilizadores, tales como la t-butil-hidroquinona, para prevenir la degradación de la ZX durante la purificación. Los estabilizadores pueden añadirse mientras las células están todavía en un recipiente de fermentación, antes de que empiece la pasteurización u otro proceso. Varios estabilizadores candidatos han sido ensayados por los solicitantes. Los mejores resultados obtenidos hasta la fecha usan una combinación de estabilizadores listados en el Ejemplo 2.

Una vez se han añadido los estabilizadores, las bacterias pueden pasteurizarse calentándolas hasta 55ºC durante 25 minutos, para matar las células sin dañar la ZX. A continuación se enfría el cultivo hasta temperatura ambiente, y se retira el líquido de las células mediante medios mecánicos, tales como microfiltración mediante flujo cruzado. Esto puede incrementar la concentración de células y sólidos desde un valor inicial de aproximadamente el 10% hasta una concentración filtrada de aproximadamente el 60 a 80% en volumen. Esto crea una pasta de células.

Es posible que las células de F. multivorum, intactas y posiblemente en un estado viable, pudieran ser apropiadas para su ingestión directa por humanos, comparables a otros alimentos (queso, yogur, cerveza, etc.) que contienen células microbianas viables o matadas pero intactas. No hay ninguna patogenicidad conocida asociada con las células de F. multivorum. Ellas se aislaron de un canal navegable frío, y puesto que están adaptadas a vivir en agua fría, no pueden sobrevivir o reproducirse bien a las temperaturas del cuerpo humano. Además, estas células no tienen ningún constituyente tóxico conocido; son gram-negativas, y no tienen las estructuras de pared celular que caracterizan a las bacterias gram-positivas. Cuando se suministraron directamente a pájaros o peces, en forma de una pasta de células, las células bacterianas parecieron ser apropiadas como vehículos de suministro. La ZX se liberó cuando las células eran digeridas por los animales, y la ZX se absorbió hacia la circulación sanguínea y se depositó en varios tejidos (incluyendo las retinas) en las ubicaciones apropiadas.

En consecuencia, las células de F. multivorum intactas que contienen R-R zeaxantina podrían ser apropiadas para consumo humano directo, si se desea, en cualquiera de las tres formas: (1) forma viable intacta; (2) forma matada intacta, después de la pasteurización; o (3) una formulación en la cual se han matado las células bacterianas y se han roto sus membranas, para abrir las células y hacer más accesible la ZX. Esto puede hacerse por medios tales como la sonicación (usando ondas sonoras de alta frecuencia), presión elevada, o molienda. Alternativamente, este paso puede saltarse si se usa un procedimiento de extracción con solvente para romper las membranas celulares.

Si se desea, la preparación de ZX puede incluir un paso de lavado de las células, en el cual se eliminan los nutrientes sobrantes y los metabolitos de deshecho, después de la fermentación, limpiándolas con un chorro de una solución que contenga cualesquier ingredientes deseados, tales como estabilizadores, conservantes, o agentes de condimento.

Purificación

Si se desea, una pasta de células (bien con células intactas o rotas) puede secarse hasta concentrar aún más las células e incrementar la concentración de ZX en la masa seca. Esto puede hacerse mediante procedimientos mecánicos tales como secado en aerosol (usando calor) o liofilización (congelado-secado bajo vacío). Se usa el secado, el residuo sólido resultante se denomina usualmente como biomasa seca; usualmente contiene aproximadamente un 1 a 10% de ZX en peso, junto con otros sólidos celulares, sólidos residuales procedentes del medio de fermentación, y los estabilizadores descritos más arriba.

Antes o después (o en vez de) la rotura o secado, puede realizarse un paso de extracción para concentrar la ZX, la cual se acumula principalmente en las membranas celulares. Los solventes apropiados para la extracción generalmente incluyen solventes orgánicos polares. El mejor solvente identificado hasta la fecha es el tetrahidrofurano (THF), el cual ataca agresivamente las células y hace innecesario un paso separado de rotura de la membrana. Aunque la agitación no fue necesaria cuando se uso el THF en las operaciones de laboratorio, la agitación durante el paso de mezcla con el solvente probablemente sería necesaria en la fabricación comercial.

También se han ensayado otros solventes, y se continuará ensayando y evaluando, pero ninguno de los ensayados hasta la fecha funcionó tan bien como el THF. Los solventes orgánicos no anillados ensayados hasta la fecha (tales como la acetona y el dietiléter) tienen niveles de solubilidad de la ZX inferiores, mientras que otros solventes tales como el metanol, etanol, y el hexano tienen niveles de solubilidad de la ZX incluso inferiores.

El solvente se mezcla con una pasta de células o biomasa seca, en condiciones que causan que el solvente disuelva tanta ZX como sea posible. La fracción líquida disuelta se separa a continuación de los sólidos usando medios tales como la centrifugación o filtración. Los sólidos pueden descartarse o usarse reciclado a materia prima para otros pasos de procesamiento (incluyendo, si se desea, ciclos repetidos de extracción con solvente). La fracción líquida se trata para suprimir el solvente, usualmente mediante evaporación. Esto deja detrás un aceite viscoso que contiene la R-R zeaxantina, junto con otros componentes solubles que fueron extraídos de la pasta de células por el solvente. Cuando se usó el THF en un único paso de extracción con células que contenían del 1 al 3% de ZX en peso, y cuando el THF se extrajo subsiguientemente mediante evaporación, el fluido resultante contenía de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20% de ZX en peso.

Otro tipo de extracción con solvente que ha mostrado buenos resultados preliminares implica el uso de un líquido supercrítico (es decir, un compuesto que normalmente es un gas a presiones atmosféricas, pero que deviene un líquido que actúa como un solvente a presiones elevadas). El dióxido de carbono es el solvente más ampliamente usado en la extracción supercrítica, y hay disponibles sistemas de extracción con CO_{2} a escala comercial. En tales sistemas, el dióxido de carbono licuado se mezcla con una pasta de células o biomasa seca dentro de un recipiente de reacción de alta presión. A continuación se pasa el líquido a través de una serie de cámaras que reducen la presión de forma progresiva. La ZX precipita de la solución a una presión bastante elevada, por tanto puede recolectarse durante un paso de despresurización inicial, mientras que la gran mayoría de impurezas permanece soluble en el dióxido de carbono y será transportada a otras cámaras de reacción en donde la presión se reduce aún más. La eficiencia de la extracción con solvente supercrítica puede incrementarse usando agentes de arrastre (tales como etanol, propilenglicol, o etilacetato). Varios de estos agente de arrastre se han ensayados preliminarmente, y se ha observado que incrementan sustancialmente la solubilidad de la ZX en el dióxido de carbono supercrítico.

Aunque el dióxido de carbono se usa ampliamente en la extracción supercrítica, también se han usado otros compuestos (incluyendo varios compuestos de nitrógeno o de clorofluorocarbono). Puede ensayarse cualquier solvente tal que pase a través de fases gaseosas y líquidas en función, para determinar si es apropiado para purificar la ZX a partir de bacterias tal como se describe en ésta.

Si se desea, un fluido aceitoso que contiene ZX, generado mediante extracción con solvente o supercrítica, puede mezclarse con una sustancia portadora, tal como un aceite vegetal, y a continuación encerrarse dentro de una cápsula diseñada para la ingestión humana, sin requerir ninguna purificación ulterior de la ZX. Esto proporcionará un procedimiento económico para preparar una forma semi-pura digestible de R-R zeaxantina disponible para uso humano, bien como fármaco para gente que padece degeneración macular, o como un suplemento nutricional para gente que quiere reducir su riesgo de padecer degeneración macular más tarde en la vida.

Alternativamente, la R-R zeaxantina en un líquido aceitoso semi-puro puede purificarse aún más para incrementar la concentración de ZX y retirar cualquier impureza. Esto puede realizarse mediante procedimientos tales como (1) sistemas de dos solventes que usan una combinación de dos solventes seleccionados; (2) adsorción sobre un sustrato (tal como un lecho de filtro tejido) que promueve la cristalización de la ZX); o (3) cromatografía a contracorriente. En el Ejemplo 4 se describe un procedimiento de cromatografía usado para purificar la ZX hasta aproximadamente el 98% de pureza.

En las patentes estadounidenses 5.382.714 (Khachik, 1995) y 4.851.339 (Hills, 1989) se descubren técnicas de purificación para otros carotenoides. Debido a sus similitudes químicas, cualquier técnica que pueda purificar \beta-caroteno o luteína se probable que proporcione buenos resultados para purificar la ZX.

Modos de Administración

La ingestión oral es el modo preferido de administración de la ZX a humanos para la protección retinal, usando modos de ingestión tales como cápsulas diarias o semanales, o el uso de alimentos o aditivos de alimentos suplementados con ZX, tal como se describe más abajo. El tratamiento no requiere la ingestión regular a intervalos fijos (tales como píldoras diarias o semanales), sino que se refiere a la ingestión intermitente, ocasional, que permite que un período de tiempo razonable (tal como uno o más días, preferiblemente menos de una semana) transcurra entre dosificaciones, par permitir la deposición gradual de pequeñas cantidades de ZX en el tejido macular. Como con cualquier suplemento vitamínico, una única dosis podría ser beneficiosa, pero una única dosis no será tan beneficiosa a los largo de un período de años como pequeñas dosis periódicas. Los estudios sobre captación de carotenoides en mamíferos indican que la ingestión diaria es preferible a la semanal, o a otras tomas esporádicas, debido a factores de "acumulación" que se manifiestan en las concentraciones en sangre.

Puesto que la captación de los carotenoides después de su ingesta oral tiende a ser relativamente baja, para los pacientes con degeneración macular severa podría ser deseable usar otras formas de administración, tales como la inyección intramuscular o intravenosa, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta. Las formulaciones del portador inyectable pueden incluir agua, un agente tamponante, y un compuesto orgánico que tenga múltiples grupos hidroxilo, tales como el propilenglicol, el dextrano, o compuestos de ciclodextrina.

Pueden usarse varios modo de empaquetamiento para la ingestión oral, con tal que protejan la ZX de la oxidación y tengan en cuenta la naturaleza aceitosa de la ZX. Los ejemplos de composiciones apropiadas para ingestión oral incluyen:

(a)

un cápsula estanca digestible y un fluido contenido en la misma, en donde la cápsula y el fluido se dimensionan para ser tragados intactos, y son farmacológicamente aceptables, y en donde el fluido contiene R-R zeaxantina mezclada con un portador o diluyente apropiado, tal como un aceite vegetal. Si se desea, la ZX fluidizada puede micro-encapsularse o encerrarse dentro de micelas, tal como se describe en los Ejemplos 9 ó 10, para ayudar a proteger la ZX frente a la degradación en el estómago. Tales cápsulas podrían hacerse de material duro, relativamente rígido, o de un material flexible tal como se usa comúnmente en cápsulas que contienen vitamina E. Si la cápsula se prepara con material que resista la acidez del estómago y sea digerido por enzimas en los intestinos, la ZX puede protegerse contra la degradación en el estómago, y puede incrementarse la biodisponibilidad de la ZX. No obstante, se sabe que al menos una porción de la ZX que entra en el estómago como un constituyente de una masa vegetal masticada puede pasar inalterada a través del estómago; por tanto, no es esencial proteger la ZX de la acidez del estómago, y la elección del material de la cápsula será una preferencia económica en vez de un imperativo científico.

(b)

una tableta para ingestión oral por un humano, en donde la tableta contiene R-R zeaxantina y un material unidor compresible que es compatible con la zeaxantina, y que causa que la tableta retenga su forma después de compresión bajo una presión apropiada, y en donde la tableta es farmacológicamente aceptable y está dimensionada para ser tragada intacta. Si se desea, la tableta podría tener un recubrimiento para ayudar a proteger la ZX de la acidez del estómago.

(c)

una composición que comprende una sustancia alimenticia para consumo humano, la cual es nutricionalmente aceptable y de gusto agradable, la cual es apropiada como portadora para la zeaxantina, y la cual contiene R-R zeaxantina como un aditivo. La ZX es un pigmento amarillo-anaranjado con las mismas características generalmente hidrofóbicas que un aceite vegetal, manteca, y grasa de pollo; es también similar a otros colorantes de alimentos que son carotenoides, tales como el \beta-caroteno. En consecuencia, puede añadirse como agente colorante nutritivo a diferentes sustancias alimenticias, tales como la margarina, los productos lácteos, el jarabe, los alimentos de panadería, la masa de bizcocho, el batido de chocolate y nueces, preparaciones de carne, que no se someterán a condiciones de cocción agresivas, e ingredientes de sopas. Otras sustancias alimenticias apropiadas podrían comprender las formulaciones granulares, tales como las mezclas de condimento saladas o especiadas usadas como aditivos en sopas, ensaladas, panadería, etc. Si se desea, las formulaciones granulares podrían tener un recubrimiento protector, para reducir la degradación de la ZX por el ácido del estómago. Numerosas referencias describen el uso de \beta-caroteno y otros carotenoides como colorantes alimenticios o aditivos nutricionales; los ejemplos incluyen Klaui et al., 1970; Klaui y Bauernfeind, 1981; Colombo y Gerber, 1991, y las patentes estadounidenses 4.522.743 (Horn et al., 1985), 5.180.747 (Matsuda et al., 1993), 5.350.773 (Schweikert et al., 1994), y 5.356.636 (Schneider et al., 1994). Debido a sus similitudes químicas, es probable que cualquier procedimiento para añadir \beta-caroteno o luteína a alimentos destinados a humanos sea directamente aplicable a la R-R zeaxantina.

(d)

una composición que comprende un comestible para consumo oral por humanos, en donde el comestible contiene células microbianas que son inocuas para los humanos, y que contienen el isómero R-R de la zeaxantina. Tales comestibles podrían seleccionarse de entre el queso, el yogur, la leche y la cerveza. Las células microbianas podrían ser viables, si se desea, o podrían haberse matado mediante procedimientos tales como la pasteurización o fragmentación.

También son posibles otras formas de empaquetamiento y podrían preferirse para varios usos.

Ensayando la R-R Zeaxantina en Animales

La protección retinal de la ZX que se sintetizó usando células de F. multivorum descendientes de la línea 55.238 de la ATCC se ensayó en una especie de pájaro, Coturnix coturnix japonica, comúnmente denominada codorniz japonesa. Esta especie proporciona un modelo animal útil de la degeneración macular en humanos, debido a un cierto número de factores:

(1)

La totalidad de la retina de las codornices japonesas se parece a la macula humana en un cierto número de aspectos importante. Por ejemplo, la retina de la codorniz contiene tanto ZX como luteína y, al igual que la retina humana, es rica en conos fotorreceptores en vez de en bastones.

(2)

La retina de la codorniz japonesa muestra algunos de los mismos indicadores de patología que la retina humana. Por ejemplo, las retinas de las codornices japonesas acumulan drusen blando y lipofuscina, los cuales están fuertemente correlacionados con el inicio de la AMD en humanos.

(3)

Aunque las retinas de codorniz son mucho más pequeñas que las retinas humanas, la totalidad de la retina de codorniz es de color amarillo, debido a la presencia de ZX y luteína. Este permite de forma efectiva que toda la retina de codorniz sirva como un modelo de la pequeña región macular que hay en el centro de la retina humana, y hace el análisis y la observación mucho más fáciles.

(4)

La retina de la codorniz japonesa es avascular, y tiene una estructura similar a la de la región foveal de la retina humana.

(5)

La codorniz japonesa tiene una esperanza de vida de aproximadamente 1 a 1,5 años para la hembras, y de 3 a 4 años para los machos. Esto permite estudios de procesos de envejecimiento que serían difíciles de realizar en otras especies con una vida más larga.

Estos factores se discuten con más detalle en Fite et al., 1991 y Fite et al., 1993.

Los ensayos se describen en los Ejemplos 5 a 8. Los resultados son excelentes, e indican claramente que la R-R zeaxantina producida por las células de F. multivorum (1) se deposita correctamente en la mácula después de su ingestión oral, y (2) es altamente efectiva en la protección de las células retinales frente la lesión fototóxica.

Además, tal como se discute en el Ejemplo 8, los resultados preliminares indican que la R-R zeaxantina es mucho más potente y efectiva que el \beta-caroteno en la protección de las retinas frente la lesión fototóxica. Cuando se suministró \beta-caroteno a animales de ensayo en dosis elevadas, los menores beneficios protectores del \beta-caroteno ni siquiera alcanzaron un nivel de significación estadística. Por contra, cuando se suministró la R-R zeaxantina en la misma dosis, ésta bloqueó y previno completamente el indicador de lesión retinal que se estaba midiendo.

Fuentes Microbianas de R-R Zeaxantina

Las células de Flavobacterium multivorum, tal como se descubren en ésta, se depositaron en la ATCC (nº de acceso de la ATCC 55.238; tal como se ha mencionado más arriba, se denominan como Sphingobacterium multivorum en el catálogo de la ATCC, pero su nombre no ha sido cambiado en el Bergy's Manual). Esta línea celular proporciona a los especialistas en la técnica varias opciones para sintetizar de forma microbiana R-R zeaxantina isoméricamente pura.

En primer lugar, los descendientes directos y no modificados de estas células pueden usarse para sintetizar la R-R zeaxantina sin cantidades detectables de otros estereoisómeros no deseados. Los carotenoides totales generados por estas células contienen más del 90% de ZX, el carotenoide deseado.

En segundo lugar, los descendientes de la cepa 55.238 de la ATCC pueden usarse después de que hayan sido modificados de formas que incrementan la producción del isómero R-R de la ZX. Los mutantes u otras líneas celulares modificadas pueden crearse mediante cualquiera de varios procedimientos, tales como (1) tratar los descendientes del tipo salvaje de la cepa ATCC 55.238 con agentes mutagénicos tales como la radiación ultravioleta o de rayos-X, o con mutágenos químicos conocidos tales como el N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina; (2) generando combinaciones sexuales mediante la mezcla de células de F. multivorum con otros tipos de bacterias que promueven activamente la conjugación e intercambio de ADN entre células bacterianas; o (3) tratando células de F. multivorum con transposones bacterianos o virus que pueden causar la reordenación de fragmentos relativamente grandes del ADN. Estas técnicas introducen alteraciones aleatorias en las células descendientes, y los descendientes se analizan mediante ensayos de búsqueda para identificar y aislar células descendientes que producen niveles más elevados de ZX.

Los ensayos de búsqueda pueden facilitarse usando compuestos químicos (tales como la difenilamina, nicotina, o lovastatina) que suprimen uno o más enzimas implicados en la vía biosintética que genera la ZX. En términos sencillos, estas drogas supresoras crean dificultades u obstáculos, los cuales pueden ser superados sólo por las células mutantes que producen cantidades anómalamente elevadas de ZX. Afortunadamente, los ensayos que pueden usarse para identificar mutantes o variantes de elevada producción son sencillos, rápidos, y fáciles. Puesto que la ZX es un pigmento amarillo, la simple observación visual de un placa de cultivo puede usarse para identificar colonias mutantes que tengan los rasgos deseados de (1) buenas velocidades de crecimiento celular, y (2) capacidad para generar cantidades anómalamente elevadas del pigmento amarillo. Si se desea, también puede usarse equipamiento automatizado (tal como lectores de placas automáticos, o dispositivos para la clasificación de células acoplados a citómetros de flujo) en los ensayos de búsqueda después del tratamiento con un mutágeno.

Estas técnicas mutagénicas y de examen son convencionales y bien conocidas en este campo de la técnica. Cualesquiera células que sean descendientes directas de la cepa del tipo salvaje de la ATCC 55.238 son consideradas como descendientes de estas células, incluso si han sido modificadas, mutadas, o combinadas sexualmente con otras líneas celulares en cualquiera de las formas listadas más arriba.

En una tercera estrategia, pueden crearse células microbianas no descendientes que contengan genes que se derivaron o aislaron de la línea celular ATCC 55.238, los cuales expresan enzimas que ayudan a sintetizar la R-R zeaxantina. Tales genes pueden aislarse e identificarse usando técnicas conocidas. Por ejemplo, las secuencias de ADN procedentes de los genes "crt" productores de carotenoides, listados en la patente estadounidense 5.429.939 (Misawa et al., 1995, discutida más arriba) pueden usarse como sondas de hibridación para buscar genes productores de carotenoide, que tengan secuencias de ADN homólogas, en el genoma de la línea celular ATCC 55.238. Los genes productores de carotenoides aislados de estas células pueden entonces insertarse en plásmidos, cósmidos, fagos, u otros vectores apropiados que pueden usarse para transformar genéticamente cualquier tipo de célula huésped deseada, tal como células de E. coli, células de levadura, células de insecto, o células de mamífero. Este tipo de manipulación genética controlable permitirá que las células transformadas creen R-R zeaxantina, usando genes obtenidos de las células ATCC 55.238.

Además, las porciones que codifican proteína de los genes productores de la ZX procedentes de las células ATCC 55.238 (es decir, las porciones de los genes que se transcriben en ARN mensajero, el cual es subsiguientemente traducido en los enzimas que sintetizan la ZX) pueden colocarse bajo el control de promotores de genes de alta potencia y/o inducibles. Tales genes "quiméricos", que contienen promotores de genes obtenidos de diferentes genes, pueden usarse para varios propósitos, tales como (1) suprimir la producción de ZX mientras las células están creciendo y reproduciéndose, y a continuación incrementar enormemente la producción de ZX por parte de las células durante la fermentación; y (2) insertar los genes en nuevos tipos de células huéspedes que podrían ser preferibles para uso comercial, tales como células de E. coli o células de levadura, las cuales pueden usar técnicas de fermentación, manipulación y purificación bien conocidas y altamente optimizadas.

Los genes productores de ZX aislados de la línea celular ATC 55.238 también pueden potenciarse mediante otras técnicas bien conocidas. Como un ejemplo, los genes bacterianos a menudo usan codones "no preferidos", los cuales reducen y controlan la cantidad de un proteína creada por un gen. Para relajar este mecanismo limitante, los codones no preferidos en un gen que sintetiza la ZX y procede de la línea celular ATCC 55.238 pueden reemplazarse con codones "preferidos", los cuales pueden incrementar la expresión del enzima productor de ZX en un célula huésped seleccionada.

Como otro ejemplo, los residuos cisteína pueden perjudicar la actividad o estabilidad de un enzima, mediante la formación de enlaces disulfuro no deseados con otros residuos cisteína, bien en la misma u otras moléculas de proteína. En consecuencia, la actividad o estabilidad de un enzima puede a veces incrementarse remplazando uno o más residuos cisteína con otros residuos aminoácidos (por ejemplo, la patente estadounidense 4.737.462, por Mark). Además, la expresión de una proteína puede incrementarse a menudo mediante la inserción de codones para aminoácidos comunes, tales como glicina, en lugar de codones que codifican la metionina o triptófano, los cuales son menos comunes y tienden a aminorar y reducir la expresión de una proteína. Después de que se haya creado un gen sintético que cause una sustitución de aminoácido de esta naturaleza, la proteína modificada puede ensayarse para determinar si retiene la actividad enzimática deseada a la vez que se expresa en cantidades más elevadas o en una forma más estable.

Estos son ejemplos de técnicas de manipulación genética conocidas que pueden evaluarse con genes productores de ZX aislados a partir de la línea celular ATCC 55.238, para determinar si una cualquiera de tales modificaciones potenciará la producción de ZX por parte de las células de F. multivorum, o por parte de otros tipos de células huéspedes.

La frase en las reivindicaciones que se refiere a "células que han sido manipuladas genéticamente para contener al menos un gen de la síntesis de la zeaxantina que contiene una secuencia de ADN obtenida a partir de una cepa de Flavobacterium multivorum, a la cual se le ha asignado el número de acceso 55.238 de la ATCC" incluye las células que contienen genes que tienen secuencias de ADN que se sintetizaron químicamente, usando una secuencia de ADN o mARN determinada mediante el análisis de la línea celular ATCC 55.238 o de descendientes de la misma. Las máquinas de síntesis automatizada de ADN son bien conocidas y pueden usarse para duplicar la secuencia de cualquier gen conocido, sin requerir la replicación de la célula huésped original. Un "gen de la síntesis de la zeaxantina" incluye cualquier gen que exprese un enzima u otra proteína que está implicada en la vía biosintética de la ZX, y el cual puede usarse para incrementar la producción de ZX si se inserta en células huésped apropiadas, con independencia del enzima concreto en la vía biosintética de la ZX que codifique el gen.

Ejemplos Ejemplo 1 Fermentación a Escala Comercial

El medio nutriente preferido por los solicitantes para el ensayo inicial de Flavobacterium multivorum en laboratorio a pequeña escala se identificó como el medio nutriente E en el Ejemplo 3 en las patentes estadounidenses 5.308.759 (Gierhart, 1994) y 5.427.783 (Gierhart, 1995). Este medio nutriente contiene varios ingredientes que eran caros y difíciles de manipular. Para reducir el gasto y los inconvenientes, después de la fecha inicial de registro de esas solicitudes, se llevó a cabo una investigación sustancial para crear un medio nutriente mejor de escala comercial. Los medios nutrientes actualmente preferidos para la fermentación a escala comercial han eliminado la harina de maíz y varios otros ingredientes. Estos medios preferidos contienen uno de dos, o jarabe de maíz rico en maltosa o melazas de remolacha de azúcar, en concentraciones que oscilan desde el 1 hasta el 10% en p/v, junto con licor de maíz empapado al 0,5 a 4% p/v; amonio sulfato heptahidrato al 0,5% p/v; cloruro sódico al 0,5% p/v; sulfato magnésico heptahidrato al 0,1% p/v; acetato sódico al 0,1% p/v; sulfato ferroso heptahidrato al 0,001% p/v; extracto de levadura al 0,2% p/v; tiamina-HCl at 0,01% p/v; entre el 1 y el 6% p/v de caseína hidrolizada (tal como NZ Amine HD, vendida por Sheffield Products, Division of Quest International, Norwich, NY); y aceite vegetal al 1% v/v.

Después de mezclar juntos estos ingredientes, se añade suficiente NaOH como para elevar el pH hasta 6,5; por contra, cuando el medio nutriente se ajustó a pH 7,5, tal como se describe en los experimentos a escala de laboratorio en las patentes estadounidenses 5.308.759 y 5.427.783, demasiados sólidos precipitaron del licor de maíz empapado.

El medio de cultivo se esterilizó mediante autoclavado a 121ºC durante 30 minutos, a continuación se enfrió hasta 27ºC y se inoculó con del 5 al 10% v/v de un "precultivo líquido" que contenía una cepa de F. multivorum que produce R-R zeaxantina sin producir los estereoisómeros S-S o S-R.

Las células usadas para preparar un precultivo líquido se mantuvieron en un tubo inclinado de agar de recuento en placa. Estos cultivos inclinados se inocularon con colonial clonadas de descendientes de F. multivorum procedentes de la cepa depositada por los solicitantes con la ATCC (número de acceso de la ATCC 55.238). Después de su incubación durante 48 horas a 28ºC, los cultivos inclinados de reserva se refrigeran a 4ºC hasta su uso como inóculo para medios líquidos. Las células viables también pueden congelarse usando congeladores convencionales, hielo seco, o nitrógeno líquido, para un almacenamiento prolongado.

Se preparó un precultivo líquido, usando células tomadas de un cultivo inclinado en agar, para inocular 30 ml de medio líquido preparado tal como se ha descrito más arriba, contenido en un frasco con deflectores de 300 ml. Las condiciones de cultivo son, 28º a pH 7,2 a 7,6, aireado mediante agitación a 250 r.p.m. y cultivado durante 24 horas. Después de una incubación inicial de 24 horas, las células contenidas en uno o más frascos de precultivo de 30 ml se usaron para inocular una cantidad diez veces mayor de medio nutriente en un frasco de fermentación de tamaño apropiado. A continuación, las células se incubaron durante 48 a 72 horas a 28ºC. El pH se mantuvo entre 6,80 y 7,20 usando NaOH y/o ácido fosfórico. El nivel de oxígeno disuelto se mantiene a del 30 al 40% de saturación burbujeando aire filtrado a través del frasco a una velocidad de 1 volumen de aire por un volumen de líquido por minuto, mientras se agita el frasco a de 400 a 1000 r.p.m. Los ensayos, usando muestreo periódico y cromatografía líquida de elevadas prestaciones, han indicado que las máximas cantidades de ZX se producirán usualmente dentro de aproximadamente las 72 horas cuando las células fermentan en estas condiciones.

Ejemplo 2 Adición de Agentes Estabilizadores

La ZX producida mediante los procesos de fermentación del Ejemplo 1 tiene que estabilizarse con objeto de facilitar la purificación y formulación subsiguiente, y para asegurar la pureza. Los compuestos estabilizadores pueden añadirse a las células de F. multivorum (o a un extracto celular que contenga la ZX) en cualquier momento durante una proceso de preparación o purificación; en general, deberían añadirse a las células uno o más estabilizadores iniciales mientras están todavía en el recipiente de fermentación.

Varios estabilizadores candidatos han sido ensayados por los solicitantes. Los mejores resultados obtenidos hasta la fecha han usado una combinación de agentes estabilizadores, los cuales se mezclan juntos en una pequeña cantidad de un solvente apropiado (tal como aproximadamente 2 mililitros de etanol para un recipiente de fermentación de 20 litros) antes de añadirse a las células. La mezcla de estabilizadores preferida contiene ter-butil hidroquinona (abreviada TBHQ; también denominada 2-(1,1-dimetil)-1,4-bencenediol) en una cantidad que generará una concentración final que oscila desde aproximadamente 250 \mug/l (microgramos por litro) hasta aproximadamente 50 mg/l después de mezclarse con las células; etoxiquina en una concentración posterior a la mezcla que oscila desde aproximadamente
250 \mug/l hasta aproximadamente 250 mg/l; \alpha-tocoferol en una concentración que oscila desde aproximadamente 250 \mug/l hasta aproximadamente 250 mg/l; y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) en una concentración que oscila desde aproximadamente 500 \mug/l hasta aproximadamente 500 mg/l. La concentración apropiada puede variar ampliamente, y dependerá de varios factores tales como los pasos de purificación subsiguientes y el modo previsto de empaquetamiento e ingestión. Las concentraciones preferidas de estos estabilizadores, para uso con una extracción con un único paso de THF seguida por mezcla con aceite vegetal y encapsulación estanca en una píldora del tipo de las de vitaminas, son aproximadamente 25 a 50 mg/ll para la THBHQ; 250 a 500 \mug/l para la etoxiquina, 250 a 500 \mug/l para el \alpha-tocoferol; y 500 a 1000 \mug/l para el EDTA.

Una vez se han añadido los estabilizadores, el cultivo de células se pasteuriza mediante calor hasta 55ºC durante de 25 a 50 minutos. Esto mata las bacterias sin dañar la ZX que han producido. A continuación se enfría el cultivo hasta temperatura ambiente, y las células que contienen la ZX y los otros sólidos presentes en el caldo de cultivo se separan de la fase líquida por medio de un sistema de microfiltración de flujo cruzado, el cual incrementa la concentración de células/sólidos desde un valor inicial de aproximadamente el 10 a 15%, hasta una concentración filtrada de aproximadamente el 60 a 80%, en volumen. Este procedimiento resulta en una pasta celular, la cual también contiene algunos sólidos residuales procedentes del medio nutriente.

Para las preparaciones de ZX que se suministran a codornices japonesas para ensayos retinales, tal como se describe en los Ejemplos 5-7, la pasta celular se congela hasta -70ºC, a continuación se seca mediante liofilización a 25ºC hasta el vacío total, para crear una biomasa seca que contiene aproximadamente del 1 al 10% de ZX en peso. En los ensayos de pasta, la cantidad de ZX en cada lote se midió individualmente, y los lotes que tenían concentraciones diferentes se combinaron y mezclaron juntos para asegurar concentraciones consistentes para los ensayos con codornices
japonesas.

Para crear la ZX para ingestión humana, la extracción con solvente se usa para generar un fluido aceitoso viscoso, tal como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3 Semi-Purificación hasta un Líquido Aceitoso

Después de que se haya creado una pasta celular tal como se describe en el Ejemplo 2, esta puede tratarse en cualquiera de una variedad de formas. Tal como se ha mencionado más arriba, las membranas celulares pueden romperse, si se desea, para abrir las células y hacer la ZX más asequible, por medios tales como la sonicación (ondas sonoras de alta frecuencia), presión elevada, o molienda, manteniendo la temperatura de las células por debajo de aproximadamente 30ºC para evitar la oxidación. No obstante, este paso no ha sido necesario cuando se ha usado tetrahidrofurano (THF) en un paso de extracción con solvente, puesto que el THF es muy efectivo para romper las membranas celulares sin asistencia mecánica. La agitación no ha sido necesaria cuando el THF se ha usado en operaciones a escala de laboratorio; sin embargo, es probable que la agitación durante el paso de mezcla con solvente fuera probablemente beneficiosa en las operaciones de fabricación comercial.

En los ensayos realizados hasta la fecha, la extracción con THF implicó mezclar aproximadamente de 8 a 20 volúmenes de THF purificado y filtrado con un volumen de pasta celular conteniendo un 60-80% de sólidos, a una temperatura inferior a 25ºC, durante un período de 2 a 24 horas. El THF ataca agresivamente las células, creando un líquido con una suspensión de sólidos floculantes. Después de su centrifugación hasta 20.000 \timesg durante varios minutos, la mayoría del THF se retirará mediante decantación. El THF que permanece puede evaporarse bajo vacío, para dejar detrás un aceite viscoso. Cuando las pastas celulares conteniendo un 1 a 3% de ZX se trataron mediante extracción con THF en una operación de un único paso, el aceite resultante contenía aproximadamente del 5 al 20% de ZX, en peso.

Ejemplo 4 Preparación de Zeaxantina Altamente Purificada en Forma Pulverizada Seca, con 100% de Isómero R-R puro

Se creo una preparación de ZX altamente purificada en forma pulverizada seca procesando el fluido aceitoso extraído con THF en el Ejemplo 3 por medio de cromatografía líquida, como sigue. El líquido conteniendo la ZX aceitosa se disolvió en hexano, a continuación se pasó a través de una columna de cromatografía que contenía polvo de alúmina neutral. Se usaron dos volúmenes de columna de hexano para lavar la columna, para retirar las impurezas de carotenoides tales como el \beta-caroteno y licopeno, así como los lípidos y otros contaminantes. A continuación se pasó una mezcla de hexano:acetona al 80:20 a través de la columna, para liberar la ZX. La ZX disuelta que emergió se secó bajo vacío. El análisis cromatográfico indicó una ZX al menos el 98% pura; sólo fueron detectables cantidades trazas de cualquier impureza.

Después de aproximadamente seis meses de almacenamiento en un estado relativamente desprotegido (usualmente bajo refrigeración normal, con retiradas moderadamente frecuentes para muestreo, y sin contener antioxidantes algunos, y sin tomar ninguna precaución para impedir el contacto con el oxígeno atmosférico), se envió una muestra de esta ZX para su análisis estereoisomérico al Profesor John Landrum (co-autor de los artículos de Bone, Landrum et al.) de la Florida International University en Miami, Florida. Su análisis, usando cromatografía con columna quiral mediante derivatización con dicarbamato indicó que la preparación no protegida de seis meses contenía un 92% de ZX. Las impurezas parecían ser mayoritariamente ceto-carotenoides, los cuales pre-eluyeron antes que la ZX; los ceto-carotenoides tienen un átomo de oxígeno extra unido de algún modo a un carotenoide, y son productos secundarios comunes que surgen cuando los carotenoides se almacenan sin estar protegidos frente la oxidación. El análisis quiral del Profesor Landrum indicó que el 100% de la ZX en la preparación era el isómero R-R deseado. No había cantidades detectables de los estereoisómeros S-S o S-R no deseados de la ZX.

Se admite que la purificación mediante cromatografía tal como se describe más arriba, aunque totalmente realizable y altamente efectiva, no está idealmente adaptada para preparar ZX altamente purificada en cantidades comerciales. Un procedimiento alternativo, que se desarrolló para purificar la luteína, descrito en la patente estadounidense 5.382.714 (Khachik 1995; ver también Khachik et al., 1991), el cual usa una mezcla de etanol frío-agua en un sistema de extracción con dos solventes, seguido por liofilización, ofrece un buen procedimiento candidato, para su evaluación para uso en la fabricación comercial.

Ejemplo 5 Ensayos de Zeaxantina en Codornices Japonesas, Usando Grupos Dietarios Diferentes

Todos los ensayos que implicaban codornices japonesas se realizaron en el Schepens Eye Research Institute de la Harvard Medical School (Boston, Massachussets). Todos los grupos de tratamiento o control contenían números estadísticamente significativos de pájaros. En la mayoría de los casos, los grupos control fueron del mismo tamaño que los grupos de tratamiento.

Los alimentos para pájaros deficientes en carotenoides se obtuvieron de Purina Mills (St. Louis, Missouri). Estos alimentos para pájaros se venden sólo para uso experimental, y se obtienen usando granos (tales como semillas de milo) que carecen de carotenoides de forma natural.

Todas las preparaciones de ZX que se suministraron a las codornices japonesas estaban en forma de biomasa seca procedente células de F. multivorum que se habían fermentado, estabilizado con los agentes descritos en el Ejemplo 2, pasteurizado para matar las células, y secado usando liofilización.

Todos los animales de ensayo se empollaron a partir de huevos deficientes en carotenoides. Estos se crearon alimentando a la generación progenitora (designada como pájaros P1) sólo con alimentos deficientes en carotenoides después de que los pájaros alcanzaran la madurez. Sus huevos se abrieron y analizaron en busca de carotenoides hasta que los huevos pasaron a ser deficientes en carotenoides. Los huevos puestos subsiguientemente por pájaros progenitores deficientes en carotenoides se usaron para empollar todos los pájaros de ensayo y control.

Los pájaros de ensayo y control se dividieron en cuatro grupos principales, los cuales recibieron dietas diferentes. Estos grupos se denominaron como el grupo C+, el grupo C-, el grupo BC+, el grupo ZX(+5), y el grupo ZX(+50), dependiendo de qué carotenoides recibían en sus dietas.

Los pájaros en el grupo C+ se alimentaron con una dieta comercial estándar que contenía varios carotenoides; esta dieta también contiene alfa-tocoferol (Vitamina E) sintético como un aditivo.

Los pájaros en el grupo de dieta C- se alimentaron con una dieta que carece esencialmente de todos los carotenoides, tal como se describe más arriba. Sin embargo, esta dieta contenía todos los otros nutrientes esenciales, y contenía las vitaminas A y E sintéticas como aditivos.

Los pájaros en el grupo BC+ recibieron una dieta carente de todos los carotenoides excepto del \beta-caroteno como un aditivo, en las mismas dosis que se usaron en el grupo de dosis elevada de ZX (es decir, se añadieron 50 mg de \beta-caroteno por kilogramo de comida). Los pájaros en el grupo BC+ se transfirieron a la dieta que contenía \beta-caroteno siete (7) días antes de que se iniciara el procedimiento de lesión con luz. Este grupo permite una comparación directa del \beta-caroteno y un subgrupo de los pájaros suplementados con ZX, los cuales también se transfirieron desde una dieta deficiente a una dieta suplementada con ZX siete días antes de la lesión con luz. Tal como se describe en el Ejemplo 8, esta comparación directa mostró que la ZX es altamente efectiva para prevenir la lesión fototóxica, mientras que los efectos protectores del \beta-caroteno son tan débiles que no consiguieron alcanzar un nivel de significación
estadística.

Los pájaros en el grupo ZX+ recibieron una dieta carente de todos los otros carotenoides, pero que contenía biomasa seca que contenía R-R zeaxantina procedente de células de F. multivorum. Se suministraron dos dosis diferentes de ZX a estos pájaros con objeto de permitir que se evaluara una relación dosis-efecto y se correlacionara con varios indicadores de lesión retinal. Los pájaros en el grupo ZX(+5) recibieron una cantidad relativamente pequeña de ZX, promediando 5 mg de ZX añadida por kilogramo de alimento. Puesto que la codorniz japonesa come aproximadamente de 25 a 35 gramos de comida por día, se ingirieron aproximadamente de 0,125 a 0,175 miligramos de ZX por pájaro y día en el grupo de dosis baja. Los pájaros en el grupo ZX(+50) recibieron una cantidad diez veces superior (50 mg de ZX añadida por kilogramo de alimento), que causó que estos animales consumieran un promedio de 1,25 a 1,75 miligramos de ZX por pájaro y día.

Las concentraciones de carotenoide en las dietas control, deficiente, y ZX+ se analizaron mediante cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC), usando los procedimientos descritos en Stacewicz-Sapuntzakis et al., 1993. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

3

	CLAVES
	ZX = 3R-3'R-Zeaxantina
	\beta-Cryp = \beta-Critoxantina
	\beta-Car = \beta-Caroteno
	Canthax = Cantaxantina
	Lycop = Licopeno
	* = Identificación preliminar. También podría ser un isómero cis de la zeaxantina.

Todos los pájaros se criaron y mantuvieron en jaulas de cría normales. Excepto cuando se indica más abajo, se mantuvieron bajo iluminación normal de amplio espectro, oscilando desde 10 hasta 14 horas por día.

Ejemplo 6 Deposición Retinal de Zeaxantina Ingerida Oralmente

Se realizaron análisis químicos para determinar las concentraciones de ZX (y de otros carotenoides) que se depositaron en las retinas de los pájaros en cada uno de los diferentes grupos dietarios descritos en el Ejemplo 5.

Para realizar estos análisis, los pájaros que se habían incubado a partir de huevos deficientes en carotenoides, y los cuales se habían criado en sus respectivas dietas durante al menos seis meses, se sacrificaron mediante dislocación cervical. El tejido retinal se retiró mediante disección del ojo enucleado, y el tejido procedente de una única retina se molió hasta prácticamente su homogeneidad en 250 \mul de agua desionizada destilada, usando una mano de mortero de vidrio o politetrafluoroetileno (TEFLON™). Se retiraron 10 \mul del homogenado y se usaron para análisis de proteína del homogenado con objeto de normalizar los resultados procedentes de varias muestras de retina. Se añadieron 250 \mul de metanol, conteniendo un 2% p/v de pirogallol y 50 \mul de hidróxido potásico al 60% p/v, a los 240 \mul restantes de suspensión de tejido retinal. La mezcla se calentó en un baño de agua a 70ºC durante una hora, a continuación se añadieron 500 \mul de etanol al 50% v/v, seguidos por 2 ml de hexano. Se agitó la mezcla con formación de vórtice para mezclarla concienzudamente, a continuación se dejó reposar a 5ºC hasta que ocurrió la separación. La epifase (es decir, la fase más ligera que flota encima del líquido restante), conteniendo hexano y los carotenoides, tocoferoles y retinoles extraídos, se retiró. Se añadieron 2 ml adicionales de hexano al homogenado de tejido, y la mezcla se agitó y dejó separar de nuevo. Esta epifase se retiró y combinó con la primera. Este procedimiento se repitió una vez más, en un tercer ciclo de extracción, para asegurar la completa extracción de carotenoides, tocoferoles y retinoides.

Los extractos con hexano combinados se lavaron a continuación con 1 ml de agua para retirar el hidróxido potásico residual. Se añadió 1 ml adicional de hexano a la mezcla de hexano-agua, y entonces la capa de hexano (epifase) se retiró cuidadosamente mediante pipeteado. A continuación se evaporó el hexano bajo una corriente constante de nitrógeno gas. El residuo que permanecía contenía carotenoides, tocoferoles, retinoles y otros compuestos no identificados extraíbles mediante hexano. Este residuo se disolvió a continuación en solvente (metanol:cloroformo:trietilamina) y se analizó mediante HPLC, tal como se describe más arriba.

Los resultados se listan en la Tabla 2, más abajo, la cual también muestra los niveles de lesión después de la exposición a luz de elevada intensidad.

TABLA 2

4

Debería destacarse que no se detectó \beta-caroteno en ninguna retina obtenida de pájaros en ninguna de las dietas descritas.

Estas concentraciones retinales listadas en la Tabla 2 indican que la R-R zeaxantina ingerida oralmente, creada mediante células en fermentación descendientes de Flavobacterium multivorum (ATCC, número de acceso 55.238) se depositaba realmente en las retinas de los animales de ensayo que recibían la R-R zeaxantina como un suplemento dietario, en forma de un aditivo alimenticio. Estos son hallazgos importantes, puesto que la ZX debe ser digerida de una forma normal, deber cruzar la barrera intestinal, debe entrar en la circulación sanguínea, y debe ser captada por las células retinales en los ojos de los pájaros en cantidades suficientes para proteger el tejido retinal frente a la lesión fototóxica. La totalidad de estas barreras fueron superadas por las preparaciones de R-R zeaxantina fermentada bacterialmente descritas en ésta.

Ejemplo 7 Protección de las Retinas mediante R-R Zeaxantina

Algunos de los pájaros en cada grupo dietario se sometieron a luz visible de elevada intensidad, de 2000 a 3000 lux, durante un período de 28 horas, usando ciclos que comprendían 1 hora de luz seguida por dos horas de oscuridad casi total. A continuación del período de ciclos de luz, los pájaros se colocaron en oscuridad casi total durante un período de 14 horas antes de ser sacrificados. En ensayos preliminares se había determinado que esta cantidad de exposición a luz de elevada intensidad causaba de forma consistente lesiones graves en pájaros en el grupo deficiente en carotenoide, y lesiones moderadas en pájaros en el grupo control (dieta normal). También se determinó en ensayos preliminares que el período de 14 horas posterior a las exposición a la luz era necesario para medir el máximo número de núcleos apoptóticos en conos en pájaros no protegidos (deficientes en carotenoide).

Los pájaros alimentados con una dieta control mostraron una apoptosis máxima a aproximadamente 24 horas post-exposición, mientras que los pájaros alimentados con una dieta suplementada con ZX mostraron una apoptosis máxima en un instante mucho mayor que las 24 horas. La extensión de tiempo antes de la lesión puede medirse y es, en y por sí misma, un fuerte indicador de los efectos protectores de la ZX.

Las retinas de estos pájaros se aislaron mediante microdisección, se fijaron en xileno, y se desecaron en etanol antes de embeberlas en paraplast (Oxford, 56ºC). Los tejidos de retina en paraplast se seccionaron a continuación y tiñeron mediante el procedimiento de Gallyas, 1990, o mediante yoduro de propidio para visualizar el núcleo picnótico que caracteriza la apoptosis. Se contó el número de núcleos picnóticos que podían observarse en un único campo del microscopio con un aumento de 400\times (lineal). Se contaron los núcleos en al menos 6 a 8 campos separados para cada grupo de tratamiento, y se promediaron los valores.

Los resultados, en la Tabla 2, demuestran claramente que la muerte de células retinales y las lesiones estaban: (1) muy reducidas y/o retrasadas por la R-R zeaxantina sintetizada por bacterias, incluso en el nivel de dosis bajo ZX(+5), en comparación con los pájaros que recibieron la dieta control normal; (2) reducidas incluso más por la dosis mayor ZX(+50). La ausencia completa de cualquier núcleo picnótico en las retinas del grupo de tratamiento ZX(+50) ofrece una evidencia convincente de que la R-R zeaxantina procedente de la línea celular de F. multivorum (ATCC, número de acceso 55.238) ofrece un avance dramático y extraordinario en la protección de las células retinales frente la lesión fototóxica. Hasta donde alcanza el conocimiento y saber de los solicitantes, ningún otro agente alguna vez ensayado ha sido capaz de igualar o incluso aproximarse a este nivel de protección.

Ejemplo 8 Comparación Directa de la R-R Zeaxantina frente el \beta-Caroteno en la Protección del Tejido Retinal

Tal como se indicó más arriba, los pájaros en el grupo dietario BC+ se alimentaron con un dosis de \beta-caroteno (50 mg por kilogramo de comida) que igualaba la dosis de zeaxantina en el grupo ZX(+50). Esto permitió una comparación directa del \beta-caroteno respecto la ZX, en la protección de células retinales contra la lesión fototóxica.

Los resultados mostraron que la lesión fototóxica en el grupo BC+ estaba reducida por sólo un pequeño margen (aproximadamente el 10% o menos, en promedio). En comparación con la desviaciones estándares en el grupo control, esta reducción no era estadísticamente significativa; la probabilidad de que las pequeñas reducciones se debieran exclusivamente a fluctuaciones aleatorias era del 0,12 a 0,14.

Esta incapacidad del \beta-caroteno para ofrecer una mejor protección frente la lesión fototóxica en tejido retinal, mientras que la R-R zeaxantina en la misma dosis ofrecía un 100% total de reducción en el mismo indicador de lesión y muerte celular, demuestra evidentemente la importancia de este descubrimiento. La R-R zeaxantina, sintetizada mediante fermentación microbiana, ofrece un gran adelanto que sobrepasa en mucho cualquier agente previamente conocido.

Ejemplo 9 Formación de Potenciadores de la Absorción

Pueden obtenerse "micelas" que contienen zeaxantina, las cuales tienen menos de 1 micrómetro de diámetro, y las cuales contienen sólo el isómero R-R de zeaxantina deseado, a partir bien del extracto con solvente de la biomasa o del fluido aceitoso descrito en el Ejemplo 3, mediante el uso de cierto tipo de sales biliares, tal como se describe en Olson, 1994. Un fluido aceitoso que contiene R-R zeaxantina puede mezclarse con una sal biliar apropiada, tal como las sales de fosfato de glico- o taurocolato vendidas por Marcor Development Company de Hackensack, New Jersey, o mediante el uso de extractos de glándula biliar que contengan mezclas de sales biliares, tales como los vendidos por Salzman Corporation de Davenport, Iowa. Este material de bilis puede mezclarse bien con el extracto del solvente o la masa aceitosa y con ciertas otras sales, incluyendo el cloruro sódico, el cloruro cálcico, o el cloruro potásico. A continuación, esta mezcla se procesa en un homogeneizador mecánico, el cual contiene dispositivos mezcladores tales como palas rotativas, a una velocidad de rotación y durante una duración que pueden optimizarse mediante experimentación rutinaria, analizando los rangos de tamaños de las micelas creadas por varias combinaciones de tamaños de palas, velocidad de rotación, y duración. Las micelas resultantes se secan libres del solvente, si es necesario, a continuación se diluyen hasta cualquier concentración deseada usando un fluido portador o diluyente, tal como el aceite vegetal. Esta mezcla puede entonces encerrarse dentro de una cápsula u otro dispositivo que ayudará a tragarla y ayudará a proteger las micelas resultantes de la degradación por los ácidos del
estómago.

También pueden usarse otros emulsionantes y lípidos para formar emulsiones con partículas de tamaño pequeño. Pueden utilizarse detergentes no iónicos tales como los Tween y Span, tal como se describe en Olson, 1994, así como los materiales lipídicos tales como los fosfolípidos y esfingolípidos, los cuales formarían vesículas lipídicas de pequeño tamaño (menos de 1 micrómetro).

Ejemplo 10 Zeaxantina Micro-Encapsulada

Este ejemplo describe la preparación de zeaxantina en forma microencapsulada. Las microcápsulas son partículas sólidas en el rango de 10 a 1000 \mum que consisten en un material del núcleo (tal como la R-R zeaxantina) encapsulado por un material de recubrimiento o cubierta, pueden prepararse a partir de diferentes compuestos tales como la gelatina, goma arábiga, almidón o zein (una proteína del maíz). Durante la preparación del material de la cubierta también pueden añadirse otros materiales, para ayudar a mantener la forma, textura, estabilidad, u otras características deseadas de la preparación resultante. Tales compuestos pueden incluir emulsionantes, sorbitol, antioxidantes tales como la TBHQ o el 2-[1,1-dimetil]-1,4-bencenediol, o agentes gelificantes tales como el carragenato.

La zeaxantina pura o parcialmente purificada se disuelve en un solvente apropiado, tal como el etanol, acetona o THF. Una vez en solución, se forman microcristales de menos de 10 micrómetros de diámetro mediante la adición en agua de la zeaxantina disuelta. Este proceso se mejora si durante la adición al agua, los cristales de zeaxantina en el solvente se sonican a frecuencias elevadas en presencia de un agente emulsionante como el Tween 80.

Una vez se han formado los microcristales, se añade el material de recubrimiento a la mezcla de agua, zeaxantina y solvente. Con algunos materiales de recubrimiento, tales como la gelatina, es necesario mantener la mezcla a temperaturas tan elevadas como 60ºC durante hasta dos horas. Una vez se ha disuelto completamente el material de recubrimiento, toda la mezcla se coloca en un sonicador durante un período de 5 a 10 minutos, con objeto de re-emulsionar los cristales.

La formación de las microcápsulas se consigue secando la mezcla del núcleo y del material de recubrimiento usando cualquier procedimiento de secado apropiado, tal como secado por aerosol, o el uso de un disco rotativo mediante el procedimiento de Sparks et al., tal como se describe en la patente estadounidense nº 4.675.140. Los secadores por aerosol se usan ampliamente en la industria de alimentación y comida. Los discos rotativos es un instrumento que consiste en un disco (de aproximadamente 4'' de diámetro) que puede mantenerse a una temperatura determinada bajo condiciones controladas. Puede operarse a varias velocidades en el rango de 1000 a 10.000 revoluciones por minuto (r.p.m.). Se añade una mezcla de materiales del núcleo y cubierta al centro del disco mientras está girando a una velocidad tal como 4000 r.p.m. El material se forma cuando el líquido se pone en contacto con el disco rotativo calentado. Las microcápsulas son expulsadas lejos del centro del disco por la fuerza centrífuga, y se recogen sobre una superficie plana que ha sido previamente recubierta con un agente "recolector" o "pegajoso" tal como el almidón hidrofóbico o la dextrina. Las microcápsulas se separan a continuación del agente pegajoso mediante cribado por tamaño. Las microcápsulas se colocan en un contenedor para protegerlas de la luz y del aire, y se almacenan en condiciones refrigeradas hasta que se disponen en cápsulas para ingestión oral.

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Claims (11)

1. Utilización del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la degeneración macular en humanos, en donde al menos el 90% de todas las moléculas de zeaxantina en dicho medicamento son el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina, y el medicamento se dispone en una forma de dosificación y contiene al menos 3 mg del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina por dosis.

2. Utilización del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina en la fabricación de un medicamento o suplemento nutricional para la profilaxis de la degeneración macular en humanos, en donde al menos el 90% de todas las moléculas de zeaxantina en dicho medicamento o suplemento nutricional son el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina, y el medicamento o suplemento nutricional se dispone en una forma de dosificación y contiene al menos 0,5 mg del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina por dosis.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en donde la forma de dosificación es una cápsula o tableta.

4. Utilización según la reivindicación 3, en donde la forma de dosificación es una cápsula que contiene microcápsulas de zeaxantina, teniendo las microcápsulas un tamaño de 10 a 1000 \mum, y conteniendo un núcleo de R-R zeaxantina encapsulada por un material de recubrimiento.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la zeaxantina se produce mediante un procedimiento que incluye el cultivo, en un medio líquido, en condiciones que promueven la síntesis de la zeaxantina, células que sintetizan el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina a un nivel de al menos el 90 por ciento de todas las moléculas de carotenoides sintetizadas por las células.

6. Utilización acorde con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento o suplemento nutricional es para el tratamiento o profilaxis de la degeneración macular en un paciente que padece la enfermedad de Stargardt, la enfermedad de Best, la enfermedad de Batten, el síndrome de Sjogren-Larsson, la distrofia de conos-bastones, la lipofuscinosis ceroide ovina, una enfermedad que implique problemas de almacenamiento lisosomal, o que tenga una susceptibilidad genética elevada de degeneración macular.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina constituye al menos el 90 por ciento del total de carotenoides en el medicamento.

8. Tableta o cápsula que comprende el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina y un portador fisiológicamente aceptable, en donde el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina constituye al menos el 90 por ciento de toda la zeaxantina en la tableta o cápsula.

9. Tableta o cápsula según la reivindicación 8 que contiene al menos 3 mg del estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina.

10. Tableta o cápsula según la reivindicación 8 ó reivindicación 9, en donde el estereoisómero 3R-3'R de la zeaxantina constituye al menos el 90 por ciento del total de carotenoides en la tableta o cápsula.

11. Tableta o cápsula según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para el tratamiento de la degeneración macular en humanos.