KR20160140859A - 당뇨성 안질환에 대한 친지질성 영양소의 효과 - Google Patents

당뇨성 안질환에 대한 친지질성 영양소의 효과 Download PDF

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Abstract

친지질성 영양소를 포함하는 조성물을 투여하여 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키기 위하여, 친지질성 영양소의 분자 분산을 포함하는 조성물 및 이의 제조방법이 제공된다. 보다 상세하게, 방법은 사람 소비에 안전하고 특히 영양 및 건강 증진에 이로운 식이 보충제로서 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 루테인 및 이의 이성질체, 루테인 에스테르, 제아잔틴 이성질체, 강황 추출물, 커큐민 또는 커큐미노이드를 포함하는 조성물을 투여하여 눈 관련된 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 것에 관련된다.

Description

당뇨성 안질환에 대한 친지질성 영양소의 효과{EFFECT OF LIPOPHILIC NUTRIENTS ON DIABETIC EYE DISEASES}
본 발명은 친지질성 영양소를 포함하는 조성물을 투여하여 눈 관련된 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 사람 소비에 안전하고 특히 영양 및 건강 증진에 이로운 식이 보충제로서 유용한, 크산토필(xanthophylls)/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진(oleoresin)으로부터 유도된 루테인(lutein) 및 이의 이성질체, 루테인 에스테르(lutein ester), 제아잔틴 이성질체(zeaxanthin isomers), 강황 추출물(turmeric extract), 커큐민(curcumin) 또는 커큐미노이드의 단독, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 투여하여 눈 관련된 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법에 관한 것이다.
눈은 눈의 골질 안검부(bony orbit)에 의해 보호되는 인체 내에서 가장 중요하고 복잡한 기관이다. 눈은 각막, 홍채, 수정체, 모양체 및 공막의 다른 부분으로 구성된 전안부로 나뉜다. 후안부는 수정체에 의해 앞쪽에 결합되고 눈의 뒤쪽으로 연장된다. 또한, 망막 시신경 원판이 후안부에 포함된다. 빛은 각막으로 불리는 전반부, 수양액, 수정체, 동공, 유리액을 통해 통과하여 눈의 망막에 도달하는데, 이러한 경로를 눈의 시축(visual axis)이라 한다. 수정체는 광선을 반사시키고 조절작용(accommodation)을 통해 망막(황반,foeva)상에 물체의 상의 초점을 맞춘다.
당뇨병 및 당뇨합병증: 당뇨병은 인슐린 대사장애, 인슐린 작용에 대한 저항 또는 둘다에 의한 고혈당증에 의해 특징되는 가장 잘 발생하는 비-전염성, 이질성, 대사장애 질환 중 하나로, type 1 및 type 2 당뇨병 형태가 있다. Type 1 진성 당뇨병은 인슐린 결핍을 유발하는, 췌장-β-세포들의 자가면역-매개성(autoimmune-mediated) 파괴의 결과이다.
Type 2 진성 당뇨병은 인슐린 저항 및 절대적이 아닌 상대적 인슐린 결핍에 의해 특징된다. 최신의 세계 건강 기구(WHO)의 추정에 의하면, 전 세계에 약 366백만명의 당뇨병 환자가 있으며 2040년까지 552백만명으로 증가할 것으로 예상되고, 인도에는 약 62백만명의 당뇨병 환자들이 있다. 만성 고혈당증에 대한 장기적 노출은 혈관 및 비-혈관 합병증을 포함하는 다양한 합병증을 유발할 수 있다. 혈관 합병증들은 대혈관 및 미세혈관 합병증으로 더울 나뉜다. 망막, 신장, 말초 신경 및 수정체와 같은 조직들은 당뇨병의 장기적 합병증에 의해 가장 많은 영향을 받는데, 각각 당뇨망막병증, 신장병, 신경통 및 백내장으로 발전된다.
당뇨성 백내장: 백내장은 눈의 수정체를 불투명하게 하는 것에 의해 특징되고, 세계적인 실명의 원인이 된다. 당뇨병에서는 비-당뇨 대조군과 비교하여 2-5 배 더 많이 백내장으로 발전된다. 또한, 진성 당뇨병 환자들은 백내장 수술로부터 더 높은 합병증 발생율을 갖는다. 당뇨병 및 백내장은 모두 막대한 건강 및 경제적 부담을 야기하는데, 특히 당뇨병 치료가 충분하지 못하고 백내장 수술에 접근하기 어려운 개발도상국에서 더욱 그러하다. 많은 임상적 해결책들이 당뇨성 백내장을 포함한 백내장에 대응하는 것으로 보고되었지만, 임상적인 실천에서 완전히 성공적이지는 않다.
당뇨성 망막증: 당뇨성 망막증(Diabetic retinopathy,DR)은 가장 흔한 대혈관 당뇨 합병증의 하나이다. DR은 15년 이상 당뇨병을 갖는 모든 사람들의 70% 에서 발생하고 실명의 가장 흔한 원인이다. DR은 시력 손실, 황반 부종, 재발 유리 모양 출혈(recurrent vitreous hemorrhages), 수축적(tractional) 또는 이차 파열성 망막 분리(secondary rhegmatogenous retinal detachment) 등을 야기하는 망막 질환이다. 지난 이십년간 DR 약물 요법의 새로운 분야에 상당한 발전이 있었다. 30년전 레이저 광응고화의 출현은 대부분의 경우에 제한적인 시력 손실에서 매우 유용하였고, 여전히 DR 치료에 대한 표준 치료로서 고려된다. 그러나, 코르티코스테로이드(corticosteroids) 및 항-VEGF 제제는 신-혈관화(neo-vascularisation) 예방에 대하여 우수한 결과를 보여주지만, 이들의 단기-지속 효과로 인하여 사용에 있어 제한된다. 따라서, DR 약물 요법은 여전히 망막 광응고화를 발생시키는 차선책에 불과하다.
최근 몇 년 동안, 카로테노이드의 생물학적 활성들에 대한 큰 관심이 집중되고 있다. 카로테노이드는 집광 반응(light harvesting reactions) 및 단일항 산소 유도된 손상에 대하여 식물 세포 기관의 보호와 관련된 식물 내 크산토필을 자연적으로 발생시킨다. 식이 카로테노이드는 조직에서 항산화제로 작용하고(Thurnham DL. Carotenoids: function and fallacies. Proc Nutr Soc 1994; 53: 77-87) 산화 손상으로부터 신체를 보호한다.
포유류는 카로테노이드를 합성하지 않아 과일 및 채소 및/또는 식이 보충제와 같은 음식물 원료로부터 얻어져야 한다. 많은 역학적 연구들이 카로테노이드 풍부 과일 및 채소들의 소비와 퇴행성 질환들의 발현 사이의 강한 상반 관계를 지지한다(Coleman H, Chew E. Nutritional supplementation in age-related macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol 2007; 18(3): 220-223).
루테인은 녹색잎 채소들 및 난황에 존재하는 주요 크산토필의 하나이다. 루테인 및 제아잔틴은 사람 망막의 황반 내에 선택적으로 축적되는 것으로 알려져 있다. 이들은 노화관련 황반 퇴행 및 백내장을 유발하는 담배 연기 및 태양광선 노출과 같은 산화 스트레스들로부터 눈을 보호하는 항산화제 및 청색광 필터로 작용하는 것으로 생각된다.
크산토필은 광학(R- 및 S- 입체 이성질체들) 및 기하학적 이성질체들(트랜스, E- 및 시스, Z-)을 모두 나타낸다. R- 및 S- 입체 이성질체의 구조는 원편광 이색성(circular dichroism, CD) 스펙트럼 및 키랄 컬럼(chiral column) 고속액체크로마토그래피(HPLC) 연구들에 기초하고, 시스- 및 트랜스-이성질체의 구조는 전자, 적외선, 핵자기공명(NMR), 고-성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법(HPLC-MS) 및 고-성능 액체 크로마토그래피-핵자기 공명(HPLC-NMR) 온-라인 분광학 연구들에 기초한다.
유기 분자는 분자에 결합된 네 개의 서로 다른 원자들을 갖는 탄소 원자를 가질 때, 이러한 탄소 원자는 키랄 탄소 원자로 지정된다. 키랄 탄소 원자는 광학적 이성질체의 형성을 유도하는 두 개의 서로 다른 공간 배열의 원인이고, 폴리엔사슬(polyene chain)의 이중 결합의 개수 및 메틸기의 존재 및 입체 장애의 부재는 트랜스- 및 시스-이성질체의 개수를 결정한다. 트랜스-제아잔틴의 경우, 두 개의 말단 고리에서 3 및 3' 위치에서의 탄소 원자는 모두 키랄 원자이다.
따라서, 트랜스-제아잔틴은 이에 결합된 2차 하이드록시기의 위치들에 기초하여 C3 및 C3' 탄소 원자들에서 두 개의 키랄 중심들을 갖는다. 따라서, 네 개의 가능한 트랜스-제아잔틴 입체 이성질체, 즉, (3R-3'R)-이성질체, (3S-3'S)-이성질체 및 (3R-3'S)- 또는 (3S-3'R)-이성질체가 존재한다. 이러한 이성질체들의 경우에, (3R-3'S)- 및 (3S-3'R)- 는 동일하다. 따라서, 트랜스-제아잔틴의 세 개의 키랄 이성질체들이 존재한다. 오른손 법칙으로 편광 회전을 일으키는 이성질체를 R-입체 이성질체라고 하고, 왼손 법칙으로 편광 회전을 일으키는 이성질체를 S-입체 이성질체라고 하며, 두 개의 반대 효과들(R,S; 광학적으로 비활성)을 갖는 제3 이성질체는 제아잔틴의 메소-형태라 한다.
루테인 및 제아잔틴의 콘쥬게이트된 이중 결합들은 각각의 안료의 구별되는 색상들에 기여하고 또한, 이들의 단일항 산소 퀸칭(quench) 성능에 영향을 미친다. 추가의 콘쥬게이트된 이중 결합에 의해, 제아잔틴은 루테인에 비하여 더 강한 항산화제인 것으로 생각된다. 세포 수치에서 크산토필의 위치에 대하여, 크산토필 결합 단백질(XBP)이라 불리우는 특정 단백질에 결합되는 것으로 보고된다. XBP는 망막내 혈류로부터 루테인 및 제아잔틴의 섭취 및 이들의 안정화에 관계되는 것으로 제안된다. 시분해 분광법(femto-second transient absorption spectroscopy)에 의한 크산토필 및 XBP 연구는 (3R,3'R)-제아잔틴과 비교하여 (3R,3'S)-제아잔틴이 강화 XBP에 대한 더 우수한 안정도를 나타내었고, 크산토필: (3R,3'R)-제아잔틴 및 (3R, 3'S,메소)-제아잔틴의 광물리 특성들은 일반적으로 동일하다. 메소-제아잔틴이 XBP을 더 잘 수용(accommodated)하는데, 단백질은 자유 라디칼들에 의해 크산토필이 분해되는 것을 보호한다. 따라서, 복합체는 자유 크산토필보다 우수한 항산화제이고, 산화 손상으로부터 안구조직의 개선된 보호를 가능하게 한다(Billsten et al., Photophysical Properties of Xanthophylls in Caroteno proteins from Human Retina, Photochemistry and Photobiology, 78, 138-145, 2003).
역학적 연구들은 루테인 및 제아잔틴의 더 높은 식이 섭취가 백내장 및 노화관련된 황반 변성의 위험을 감소시킨다는 것을 제안한다. 선행 연구들은 인슐린과 루테인 조합으로 처리된 쥐들이 루테인 또는 인슐린 단독 처리된 것보다 백내장의 지연된 발달 및 성숙을 지연시키는 것으로 나타났다. DR 환자 내에서 혈청 루테인 및 제아잔틴 농축들은 정상안에서의 이들보다 상당히 낮은 것으로 알려졌고, 이들의 섭취는 시력, 대비 감도(contrast sensitivity) 및 황반 부종을 향상시키는 것으로 증명되었는데, 이는 루테인 및 제아잔틴 보충이 DR을 치료하는데 있어서 잠재적 치료제로 목표될 수 있다는 것을 제안한다.
커큐민은 강황의 활성 원리로 확인되었고, 항산화성, 항-염증성, 항균성 및 항발암성 특성들을 나타낸다. 커큐민은 매운 강황으로부터의 자연 추출물이다. 강황은 생강종의 하나인 식물 울금으로부터 유도된다. 커큐민은 본질적으로 많은 건강 이점들을 갖는 항산화제로 알려진다. 커큐민은 인감 망막 내피 세포 내에 세포소멸(apoptosis)을 유도하고 생체 외 매개체 내로 VEGF 방출을 감소시키는 것으로 알려지고, 또한 쥐에서 혈청 VEGF 수치의 당뇨병-유발된 증가를 억제한다.
높은 글루코스 수치 및 저산소증에 의해 유도된 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 발현은 망막증의 주요 특징이다. 몇몇 연구들은 또한 VEGF가 망막증의 초기 단계 발달에 역할을 한다는 것을 나타낸다.
비록 임상 연구들에서 커큐민, 루테인, 제아잔틴 등과 같은 식이보충제는 몇몇 이점들을 제공하지만, 변형은 매우 낮고 임상적 실험들에서 사용된 용량은 실제 적용하기에 불가능하다. 커큐민에 의한 임상적 성공의 결여에 대한 주요 이유들 중 하나는 낮은 생물학적 이용가능성의 결과를 가져오는 이의 광범위한 장내 및 간내 신진 대사 생체 변화에 관계된다. 최근, 관심은 치료적 효능을 향상시키는 관점에서 보충제의 생물학적 이용가능성에 집중된다.
커큐민, 루테인, 제아잔틴, 생강 등과 같은 친지질성 영양소는, 현재 사용되는 형태인 오일 서스펜션 또는 비들렛으로 투여되지 않으면 흡수가 잘 되지 않는다. 낮은 흡수의 주요한 이유는 이들의 물에서의 낮은 용해도 때문이다. 이들의 불용해성으로 인하여, 이들의 생물학적 이용가능성은 매우 낮다. 친지질성 영양소들은 위장관 내에서의 제한된 용해도로 인하여 신체 내에서 제한된 흡수를 갖는다. 일반적으로, 이러한 영양소의 생물학적 이용가능성은 40% 미만이다. 생물학적 이용가능성은 입자 크기를 감소시키는 것에 의해 강화될 수 있는데, 결과적으로 이들의 미셀화(micellization) 효율을 높인다. 분자 레벨에서 영양학적 생성물의 분산액은 일반적으로 입자 크기를 감소시키는 기술로 고려된다. 이러한 분자 분산액은 물에서 영양소의 미셀화에 대하여 더 높은 효율을 제공하고 이에 의해 생물학적 이용가능성을 증가시킨다.
따라서, 당뇨병 쥐에서 용해가능한 친지질성 영양소를 포함하는 조성물의 효과를 영양유전체학(Nutrigenomics) 접근에 의해 망막에 대한 이의 유익한 효과에 대하여 연구하고 효과를 통상의 친지질성 영양소와 비교하는 것은 흥미롭다. 영양유전체학은 영양소과 유전체 사이의 상호 작용의 과학이다. 이는 유전자 발현 효과가 특정 영양소에 대한 요구에 어떻게 영양을 미치는지 및 생애를 통해 최적의 건강을 유지하는 것을 돕는지에 대한 연구이다. 영양유전체학은 영양이 신진대사 경로에 어떤 영향을 미치는지 및 이러한 통제가 식이-관련 질병의 초기 단계에서 어떻게 배분되는지 및 개별적인 민감 유전자형(sensitizing genotypes)이 이러한 질병에 기여하는 정도에 대한 증가된 이해를 촉진시킨다. 우리의 목표는 식물영양소가 어떻게 유전자 발현에 영향을 미치는지에 대하여 더욱 잘 이해하는 것이다.
당뇨성 눈 질환의 예방/치료에 사용되는 카로테노이드를 포함하는 조성물을 제공하는 다수의 문헌들이 이용가능하다.
Brown et al. (Am J Clin Nutr.　1999)에서, 카로테노이드를 포함하는 식이 항산화제는 수정체 내에서 단백질 또는 지질들이 산화되는 것을 방지하는 것에 의해 노화관련 백내장의 위험을 감소시키는 것으로 추측된다. 그러나, 이러한 현상에 관한 예상 역학 데이터는 제한된다. 저자들은 사람에서 카로테노이드와 비타민 A 흡수와 백내장 적출 사이의 연관을 예상하여 평가하였다. 1986년에 45-75세의 미국 남자 건강 전문가들(n = 36644)이 상기 예상 집단 연구에 포함되었다. 이어서 다른이들은 45세가 되었을 때 포함되었다. 8년의 추적 동안, 840 사례의 노화 백내장이 기록되었다. 이들은 다른 카로테노이드(알파-카로텐, 베타-카로텐, 리코펜 및 베타-크립토잔틴) 또는 비타민 A가 아닌, 루테인 및 제아잔틴의 더 높은 흡수를 가진 사람에게서 나이 및 흡연을 포함한 다른 잠재적 위험 요소들이 조절된 이후에, 백내장 적출술의 보통의 낮은 위험도를 관찰하였다. 루테인 및 제아잔틴 흡수의 가장 높은 1/5의 사람은 가장 낮은 1/5 사람에 대하여 백내장의 위험도가 19% 낮았다(상대 위험도: 트렌드(trend) = 0.03에 대하여 0.81; 95% CI: 0.65, 1.01; P). 카로테노이드가 높은 특정 음식 사이에서, 브로콜리 및 시금치가 백내장의 더 낮은 위험도와 가장 일관적으로 관련되었다. 루테인 및 제아잔틴은 비록 이 연관이 규모에 있어서 가장 평범한 것으로 나타나지만, 적출이 필요할 정도로 심한 백내장의 위험을 감소시킨다. 이 연구는 미국 남자 인구(US male population)로 행해진 집단 연구이다. 이 연구는 영양 결핍과 백내장 발생 사이의 관계를 규명한다.
EP 2618832 A2는 루테인 및 하나 이상의 제아잔틴 입체이성질체와 관련한, 슈퍼옥사이드 디스무타아제(superoxide dismutase, SOD) 및 SOD 미믹스(mimics) 및 이의 유사체를 포함하는 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 조성물에 대한 것이고; 및 또한, 이러한 조성물을 포함하는 부분의 키트를 포함하는데, 키트는 상기 효소를 포함하는 제1 부분 및 루테인 및 하나 이상의 제아잔틴 입체이성질체를 포함하는 제2 부분을 포함한다.
조성물 또는 부분들의 키트는 기능성 식품, 기능성 식품 조성물 또는 식품 또는 식이 영양제, 약제 또는 약학적 조성물 또는 수의학(veterinarian) 생산물을 포함할 수 있다. 문헌은 또한 필요한 대상체에 약제 또는 약학적 조성물을 투여하는 것에 의해 산화적 스트레스와 연관된 눈 질병 질환 및/또는 장애를 치료, 예방 및/또는 안정화 시키는데 사용되는 조성물에 관한 것이다. 그러나, 문헌은 제아잔틴 이성질체들의 사용은 언급하지 않는다.
WO2010032267A2는 선택된 인디안(Indian) 약초 추출물을 포함하는 당뇨병 및 관련 합병증들의 예방 및 치료를 위한 약제에 관한 것이다. 문헌은 서로 다른 당뇨병 관련 합병증들에 대한 관련 제제들에 관한 것으로, 신장 건강을 증진시키고 신장 질환을 예방하고, 당뇨성 망막증을 예방하고/예방하거나 심장 및/또는 혈관에 대한 산화적 손상의 예방 및 치료에서와 같은 임상적 필요에 개별적으로 유용하다. 제제들은 다목적이고, 추출물/농축물로 가공될 수 있고 또한 정제 또는 입자 또는 과립 또는 시럽 또는 약초 건강 드링크 또는 흡입용 약제 또는 안약제 또는 연고/젤 또는 주입가능 약품과 같은 경피 흡수가능 약제로 약학적으로 변형가능하다. 이것은 다중 약초(poly herbal) 약제이고 청구항을 지지하는 상조(synergistic) 데이터가 없다.
CN 102178925A은 시력 보호를 위한 루테인 안약제에 관한 것으로, 다음 원료 물질들로부터 제조된다: 수용성 루테인(C40H56O2에 기초) 5 내지 13 부, 타우린 50 내지 80부, 셀레늄(Se에 기초) 0.1 내지 0.5부, 아연(Zn에 기초) 10 내지 25부, 수용성 비타민 A 0.5 내지 1.0 부 및 글루타티온 0.8 내지 2.0 부; 희석액, 습윤제, 등장(isoosmotic) 조절제, 보존제, 항산화제 및 주입용 물로 구성된 보조 물질; 점안액, 안약 및 유사체를 포함하는 제제;　및　루테인　안약제는 근시, 원시,　백내장, 녹내장, 망막세포변성증, 황반 변성 및 이들의 유사체와 같은 안질환에 적합하다. 다양한 영양 인자들이 합리적으로 양립가능하고, 루테인 외용제의 블랭크(blank)가 채워지고, 생물학적 이용가능성 및 헬스-케어 효과가 명백하게 증가된다;　및 300,000 명에 의한 실제 적용을 통해, 근시, 백내장 및 당뇨성 안질환에 대한 전체 효율이 90 퍼센트 이상이고, 루테인 안약제는 양성 증진값(positive promotion value)을 갖는다. 이 안약제는 오직 하나의 황반 카르테노이드, 즉, 루테인만을 포함하고 제아잔틴 이성질체의 사용을 언급하지 않는다.
Sasaki et al. (IOVS, March 2009, Vol. 50, No. 3) 에서, 이 연구의 목적은 쥐 내독소-유발된 포도막염(endotoxin-induced uveitis, EIU) 모델을 사용하여, 염증에 의한 망막 신경 손상에 대한 루테인의 신경보호 효과이다. EIU는 리포다당류(LPS)의 복강내 주사에 의해 유발된다. 각 동물들에 세번의 루테인 또는 매개체의 피하주사가 행해졌다: 동시에 및 LPS 주사 이전 및 이후 3시간. EIU 유발 이후 24시간 분석이 행해졌다. 로돕신 단백질의 수치 및 신호 트랜스듀서(signal transducer) 및 전사 3(transcription 3, STAT3) 활성제가 면역블러팅법(immunoblotting)에 의해 분석되었다. 광수용체 세포의 외부 세그먼트 길이가 측정되었다. 암순응 전계-영역(full-field) 망막전위도가 기록되었다. 망만 내 산화적 스트레스가 디하이드로에디튬(dihydroethidium) 및 형광 프로브에 의해 분석되었다. 신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP) 발현이 면역조직화학적으로 나타났다. 로돕신 발현에서 EIU 유도된 감소, 이후의 외부 세그먼트의 단축 및 파진폭이 감소되는 것이 루테인 치료에 의해 예방되었다. STAT3 활성 수치, 염증성 사이토카인 신호(inflammatory cytokine signals)의 다운스트림(downstream) 및 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 모두 EIU동안 상향조절되는데, 루테인에 의해 감소되었다. GFAP 발현에 의해 나타나는 뮐러아교세포(Muller glial cells)의 병리학적 변화 또한 루테인에 의해 예방되었다. 제시된 데이터는 항산화 루테인은 EIU 동안 신경보호적이라는 것을 나타내며, 염증 동안 망막 신경 손상을 억제하는 잠재적 접근을 제안한다. 루테인은 영양 보충제이고 대상체는 임의의 질병의 예방 또는 치료를 위해 매일 복용해야 한다. 이 연구에서, 루테인은 주사 투여되었다. 매일 주사를 통한 루테인 보충은 통증이 있어 대상체에게 불편을 야기한다.
CA 2760932 A1는 비제한적으로 라파마이신(시롤리무스), 이들의 유사체들(라파고스) 또는 다른 포유류 타겟 라파마이신 (mTOR) 저해제들을 포함하는 다양한 치료제들을 연장된 주기동안 대상체에게 전달하는 안약제들에 관한 것이다. 안약제들은 대상체의 수성 매질 내에 위치될 수 있고, 비제한적으로 안내 또는 눈 주위 투여 또는 대상체 내에서 치료되는 질병 또는 질환 부위에 근접하여 위치되는 것을 포함한다. 방법은 노화관련 황반 변성, 황반 부종, 당뇨성 망막증, 포도막염, 건조성 각막염 또는 과투과성(hyperpermeability)을 치료하거나 예방하는 치료제를 대상체에 투여하도록 사용된다.
요약
눈의 특정 영역에 대한 치료적/예방적 약제를 전달하는 것의 어려움을 극복하는 것은 대부분의 눈 질환들을 치료하는데 있어 주요한 과제이다. 친지질성 영양소의 낮은 생물학적 이용가능성으로 인하여, 눈에 대하여 잠재적으로 중요한 많은 치료적/예방적 약제들의 전달이 방해된다.
이로부터 당뇨성 눈 합병증들에 대하여 감소된 복용량 수치에서도 치료적/예방적 약제들을 전달하는 것의 어려움을 극복할 수 있는 기술을 제공하는 것에 대한 필요성이 명백히 존재한다.
눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는데 유용하고, 사람 소비에 안정하고, 영양 및 건강 증진 이점들을 위한 식이 보충제로서 특히 유용한 친지질성 영양소의 분자 분산액이 제공된다.
일 구현예에서, 크산토필/ 크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진로부터 유래된 고체 또는 액체 친수성 담체 내의 커큐민 또는 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들, 즉 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴 또는 트랜스-루테인 및 (R,R)-제아잔틴과 같은 친지질성 영양소의 분자 분산액들이 제공되는데, 이들은 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는데 유용하다.
일 구현예에서, 적어도 80%의 전체 크산토필 중량, 이 중 트랜스-루테인 함량 80-95% w/w; (R,R)-제아잔틴 14-20% w/w; (R,S)-제아잔틴 0.01-1% w/w, 또는 트랜스-루테인 함량 80-95% w/w; (R,R)-제아잔틴 14-20% w/w, 및 크산토필/크산토필 에스테르 또는 5-95% 커큐미노이드를 포함하는 커큐민을 포함하는 식물 추출물들/올레오레진으로부터 유래된 미량의 다른 카로테노이드를 포함하는, 조성물의 분산액이 제공된다.
일 구현예에서, 고체 또는 액체 친수성 담체 내의 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들, 즉 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴, 또는 트랜스-루테인 및 (R,R)-제아잔틴을 포함하는 크산토필의 분자 분산액이 제공되는데, 조성물은 자유 크산토필보다 더 높은 항산화제 가능성을 갖고 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는데 유용하다.
일 구현예에서, 고체 또는 액체 친수성 담체 내의 커큐미노이드를 포함하는 커큐민 조성물의 분자 분산액이 제공되는데, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는데 유용하다.
일 구현예에서, 친지질성 영양소의 분자 분산액이 제공되는데, 생물학적 이용가능성을 강화시켜 조직 내에서 친지질성 영양소의 증가된 수치 결과를 가져오는 미셀화에 대한 고 효율성을 가지고, 이러한 분자 분산액들은 상대적으로 낮은 농도에서 효과적이어서 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는데 유용하다.
일 구현예에서, 고체 또는 액체 친수성 담체 내의 친지질성 영양소의 분자 분산액이 제공되는데, 더 높은 생물학적 이용가능성을 갖는다.
임의의 구현예들에서, 안전 용매(safe solvents)(GRAS)를 사용하여 제조되고 최소 용매 잔기들에 의해 사람 소비에 적합한 친지질성 영양소의 분자 분산액이 제공된다.
본원의 조성물 및/또는 방법들의 다른 이점들이 후술하는 설명으로부터 명백해진다.
실시예에서 설명되는 본원에 후술되는 생성물, 조성물 및/또는 방법들의 유용성은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원의 방법들은 친지질성 영양소를 포함하는 조성물을 투여하는 것에 의해 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 것에 관련된다. 보다 상세하게, 본원의 방법들은 사람 소비에 안전하고 특히 영양 및 건강 증진에 이로운 식이 보충제로서 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 루테인 및 이의 이성질체들, 루테인 에스테르, 제아잔틴 이성질체들, 강황 추출물, 커큐민 또는 커큐미노이드를 포함하는 조성물을 투여하여 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 것에 관련된다.
본원의 분자 분산액은 분말, 정제, 캡슐, 샤셋(sachets), 비들렛(beadlets), 미세캡슐화된 분말, 오일 서스펜션(oil suspensions), 액상 분산액, 펠렛(pellets), 연질 젤 캡슐, 츄어블 정제(chewable tablets) 또는 액상 제제(liquid preparations)의 형태이다.
본원의 고체 또는 액체 친수성 담체 내의 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들, 즉 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴, 또는 트랜스-루테인 및 (R,R)-제아잔틴, 및/또는 커큐미노이드를 포함하는 커큐민의 분자 분산액은 강화된 물 용해도 및 생물학적 이용가능성을 갖는데, 이는 분자들을 효과적으로 이동시키고 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는데 가능성을 갖는다. 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키기 위한 강화된 생물학적 이용가능성을 갖는 높은 수용성 형태에서 더 높은 항산화 포텐셜을 갖는 카로테노이드 즉, 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들을 사용하는 것은 선행 문헌들에 개시되지 않았다.
임의의 구현예들에서, 본원의 조성물들은 친수성 액체 및 고체 담체들의 분자 분산액이다.
임의의 구현예들에서, 본원의 조성물들을 제조하는 방법은 친수성 액체 및 고체 담체들의 분자 분산액 내에서 이들을 제조하는 단계를 포함하는데, 이는 영양소의 물 용해도를 강화시켜 음료 또는 연질 젤라틴 캡슐 또는 리캡스들(licaps)로 추가로 제형화하는데 이로운 특성들을 갖는다.
본원의 조성물들은 임의의 구현예들에서 다음을 포함하는 수용성, 친지질성 영양소의 수용성, 분자 분산액을 포함한다:
(a) 안정제,
(b) 수용성 친수성 담체, 및
(c) 선택적으로 계면활성제,
및 분말, 정제, 캡슐, 연고, 페이스트, 로션, 도포제(liniments), 구강청결제, 샤셋, 가글 내에 유성의 영양소를 전환시키기에 적합하고 음료로 통합하기에 적합하다.
임의의 구현예들에서, 본원의 조성물들은 수용성 액체 또는 고체 친수성 담체들 내의 루테인, 제아잔틴, 베타 카로틴 및 리코펜과 같은 친지질성 영양소의 자유 유동 수용성 분자 분산액으로서, 음료 또는 연질 젤라틴 캡슐 또는 리캡스로 추가로 제형화될 수 있다.
임의의 구현예들에서, 음료 또는 연질 젤라틴 캡슐 또는 리캡스로서 추가로 제형화될 수 있는, 수용성 액체 또는 고체 친수성 담체들 내의 루테인, 제아잔틴, 베타 카로틴 및 리코펜과 같은 친지질성 영양소의 자유 유동 수용성 분자 분산액의 제조방법이 제공된다.
임의의 구현예들에서, 극성 또는 비극성 유기 용매 내의 친지질성 영양소 용액이 특정 수용성 친수성 액체 또는 고체 담체 시스템 내에 분산될 수 있다. 진공하에서 용매를 제거하면, 결과 분산액은 연질 젤 캡슐들 또는 리캡스 내에 채워지기에 적합한 균일한 액체 또는 고체 분산액으로 존재한다. 이러한 액체 또는 고체 분산액은 캡슐 내에 채워지거나 입자, 정제로 제조되기에 적합하고, 샤셋 내에 채워지거나 음료로 제조되기에 적합하다.
임의의 구현예들에서, 본원의 조성물들은 수용성 친수성 액체 또는 고체 담체들 내의 루테인, 제아잔틴, 베타 카로틴 및 리코펜과 같은 친지질성 영양소의 자유 유동 수용성 분자 분산액으로서, 연질 젤라틴 캡슐, 리캡스, 연고, 페이스트, 로션, 도포제, 구강청결제, 가글 등으로 전환시키기에 유용하고, 또한 음료로 통합하기에 적합하다.
임의의 구현예들에서, 수용성 친수성 액체 또는 고체 담체들 내의 친지질성 영양소의 자유 유동 수용성 분자 분산액의 제조방법이 제공되는데, 연질 젤라틴 캡슐, 리캡스, 연고, 페이스트, 로션, 도포제, 구강청결제, 가글 등으로 전환시키기에 유용하고, 또한 음료로 통합하기에 적합하며,
(i) 비극성/극성 용매 또는 이들의 혼합물 내에 친지질성 영양소를 용해하여 용액을 형성하는 단계;
(ii) 결과 용액을 여과하여 불용성 불순물들을 제거하는 단계;
(iii) 분리적으로 수용성 친수성 액체 또는 고체 담체, 안정제 및 선택적으로 계면활성제를 극성 용매 내에 용해시켜 맑은 용액(clear solution)을 형성하는 단계;
(iv) 단계 (i)에서 수득된 용액과 단계 (iii)에서 수득된 용액을 혼합하는 단계;
(v) 20-45℃ 범위 온도 및 500-760 mm 사이 범위 수은압력하에서 결과 혼합물을 가열하여 용매를 제거하는 단계;
(vi) 결과 분자 분산액을 주위 온도(ambient temperature)로 냉각시키는 단계; 및
(vii) 단계 (vi)에서 수득된 냉각된 분자 분산액을 적절한 메시 크기의 거름망(sieve)을 통과시켜 임의의 응집체 또는 고형체(lumps)를 제거하여 친지질성 영양소의 자유 유동 수용성 또는 고체 분산액을 생성하는 단계.
용어 '친지질성'은 비록 지질-친화를 나타내지만, 일반적으로 낮은 수용성 화합물들을 모두 포함한다. 따라서, 용어의 범위는 낮은 수용성 아미노산, 단백질, 미네랄, 커큐민과 같은 약초 추출물들, 탄수화물, 알칼로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoids) 및 글리코사이드(glycosides)를 포함한다.
사용될 수 있는 친지질성 영양소는 비제한적으로 루테인, 루테인 에스테르, 제아잔틴 이성질체들, 리코펜, 베타 카로틴, 토코페롤(tocopherols), 아스타잔틴(astaxanthin), 오메가-3 지방산(omega-3 fatty acids), 유비퀴논(ubiquinone), 피토스테롤(phytosterols), 레시틴(lecithins) 및 이들의 혼합물을 포함한다.
분산 용액을 형성하는데 사용될 수 있는 수용성 친수성 액체 또는 고체 담체는 폴리에틸렌 글리콜 200(polyethylene glycol 200), 폴리에틸렌 글리콜 400(polyethylene glycol 400), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(propylene glycol), 글리세롤(glycerol), 소르비톨(sorbitol), 글루코스 시럽(glucose syrup), 콘 스티프 리쿼(corn steep liquor), 마니톨(mannitol), 폴리에틸렌 글리콜 6000(polyethylene glycol 6000), 폴리에틸렌 글리콜 10000(polyethylene glycol 10000), 폴리에틸렌 글리콜 20000(Polyethylene glycol 20000), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 하이드록시프로필메틸셀룰로스 (hydroxyl propyl methyl cellulose), 수크로스(sucrose), 글루코스(glucose), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 하이드록시프로필셀룰로스(hydroxyl propyl cellulose), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 가용성 녹말, 가수분해 녹말(hydrolyzed starch) 및 이들의 혼합물을 포함한다.
임의의 구현예들에서 친지질성 영양소의 용액 제조에 사용되는 용매는 아세톤, 헥산, 에틸 아세테이트, 이소프로필 알코올, 에탄올, 디클로로메탄, 메탄올 등으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게 아세톤, 에탄올, 디클로로메탄, 이소프로필 알로올로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게 디클로로메탄 및 이소프로필 알코올로부터 선택될 수 있다.
공정에서 사용될 수 있는 안정제는 아스코르브산(ascorbic acid), BHA, BHT, 팔미트산아스코빌(ascorbyl palmitate), 로즈마리(rosemary) 추출물, 혼합된 천연 토코페롤(mixed natural tocopherols), 알파 토코페릴아세테이트(alpha tocopheryl acetate), 소듐아스코베이트(sodium ascorbate), 카스터 오일 유도체(castor oil derivatives), 소듐라우릴설페이트(sodium lauryl sulfate) 및 이들의 혼합물에서 선택될 수 있다.
공정에서 사용될 수 있는 계면활성제는 폴리소르베이트 20(polysorbate 20), 폴리소르베이트 60(polysorbate 60), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 소듐라우릴설페이트(sodium lauryl sulfate) 및 이들의 혼합물에서 선택될 수 있다.
영양소 분산액에서 용매를 증발시키기 위한 진공에서의 가열 단계는 바람직하게 35 내지 45℃의 범위 온도에서 수행될 수 있다.
임의의 구현예들에서, 친지질성 영양소는 분자 레벨로 수용성 친수성 액체 또는 고체 담체 내에 분산되어, 이의 용해도 및 따라서 이의 생물학적 이용가능성은 몇 배 더 강화된다. 친수성 액체 또는 고체 담체들 내에 친수성 영양소를 분산시키면, 영양소의 결과 분산액은 상당히 더 높은 용해도 및 생물학적 이용가능성을 갖는다. 또한, 친수성 액체 또는 고체 담체 내에 친지질성 영양소를 분산시키는 것은 경질 젤라틴 캡슐 및 연질 젤라틴 캡슐과 같은 형태로 친지질성 영양소를 제형화 하는데 도움을 준다.
분자 분산액을 얻기 위하여, 친지질성 영양소는 극성 또는 비극성 용매 내에 용해될 필요가 있다. 친지질성 영양소의 화학적 본질에 의존하여, 극성 또는 비극성 또는 극성 및 비극성 용매의 혼합물이 사용될 수 있다. 만일 필요하면, 친지질성 영양소의 혼합물 및 용매는 가열되어 용해 속도를 강화시킨다. 자주, 친지질성 영양소는 용해를 완성할 추가 시간을 위한 교반을 필요로 한다. 완전한 용해를 보장하기 위하여, 결과 용액을 필터 여재에 통과시키고 분자 분산액에 대한 여과액만을 사용하는 것이 필요하다. 만일 용액의 점도가 높으면, 용해에 사용된 용매로 추가로 희석되어 여과 단계가 더 빨리 수행될 수 있다.
친수성(수용성) 담체는 에탄올, 이소프로필 알콜, 아세톤, 메탄올, 프로필렌 글리콜 및/또는 물과 같은 적합한 극성 용매 내에 용해되어 맑은 용액을 형성한다. 분산에 사용된 친수성 수용성 담체는 안정제들과 혼합될 수 있고, 선택적으로 계면활성제와 혼합될 수 있다. 필요하면, 안정제는 친수성 담체와 혼합되기 이전에 용매 내에 용해되는 것이 필요할 수 있다. 만일 결과 혼합물이 맑은 용액이 아니면, 용액은 잔기를 제거하도록 여과된다.
친지질성 영양소의 분산액은 이어서 친수성 액체 또는 고체 담체와 혼합되어 균일 매스(mass)를 수득한다. 이를 위하여, 단순 자석 교반기 또는 전기적으로 작동된 교반기가 사용될 수 있다. 혼합은 또한 액체-액체 균질기 또는 유화제를 사용하여 영향을 받을 수 있다.
결과 혼합물의 점도에 따라서, 균일 매스를 얻는데 필요한 시간은 15분 내지 1시간일 수 있다. 대기 산화에 민감한 이러한 영양소에 대하여, 혼합 단계는 불활성 분위기 또는 항산화제 안정제의 존재하에서 수행될 수 있다.
더 빠른 용해가 위장관 내에 필요한 영양소에 대하여, 하나는 선택적으로 식품 등급 계면활성제와 통합되어 친지질성 영양소의 용해도 및 이의 생물학적 이용가능성을 강화시킨다.
이어서 균일 매스가 얻어지고 감소된 압력하에서 가열 단계가 진행된다. 친지질성 영양소의 대다수가 열, 빛 및 산소에 민감하기 때문에, 낮은 온도, 바람직하게 45℃를 초과하지 않는 온도에서 이러한 가열을 수행하는 것이 필요하다.
질소 또는 아르곤과 같은 불활성 기체를 사용한 불활성 분위기에서 가열하는 것 또한 바람직하다. 가열 공정은 결과 분산액이 용매의 25 백만분율(parts per million) 미만까지 지속된다.
25 백만분율 미만까지 용매 잔기들이 감소된 이후에, 결과 분자 분산액은 주위 온도로 냉각되고, 이어서 100 메시 거름망을 통과하여 임의의 응집체 또는 고형체가 제거된다. 이어서 균일 매스는 적절한 용기에 채워진다.
도 1은 STZ-유발된 당뇨병 쥐에서 공복혈장혈당(fasting plasma glucose)의 치료 효과를 도시한 그래프이다.
도 2는 치료에 의해 쥐에서 백내장 지연을 도시한 그래프이다.
도 3은 수정체 단백질의 가용성 분획(soluble fraction)의 SDS-PAGE 패턴을 도시한 그래프이다.
도 4는 수정체 단백질 가용성 분획의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 그래프이다.
도 5는 수정체 소르비톨의 분광형광측정(spectrofluoremetric measurement)을 도시한 그래프이다.
도 6은 혈장 루테인 수치의 HPLC 측정을 도시한 그래프이다.
도 7은 서로 다른 그룹들 및 총 진폭으로부터 진동 포텐셜(oscillatory potentials, OPs)의 파형을 나타내는 도면이다.
도 8은 망막의 대표적인 생물 조직도를 나타내는 도면이다.
도 9는 실-시간 PCR(A) 및 면역조직화학(B)에 의한 로돕신 발현을 나타내는 도면이다.
도 10은 실-시간 PCR(A) 및 면역조직화학(B)에 의한 NGF 발현을 나타내는 도면이다.
도 11은 면역블러팅법에 의한 VEGF 발현을 나타내는 도면이다.
도 12는 면역조직화학법에 의한 PDGF 발현을 나타내는 도면이다.
도 13은 RP-HPLC에 의해 측정된 혈청 루테인 수치를 도시한 도면이다.
도 14는 서로 다른 그룹들 및 총 진폭의 개별적인 동물들로부터 OPs의 파형을 나타내는 도면이다.
도 15는 망막의 대표적인 생물 조직도를 나타내는 도면이다.
도 16은 실-시간 PCR(A) 및 면역조직화학(B)에 의한 로돕신 발현을 나타내는 도면이다.
도 17은 실-시간 PCR(A) 및 면역조직화학(B)에 의한 NGF 발현을 나타내는 도면이다.
도 18은 면역블러팅법에 의한 VEGF 발현을 나타내는 도면이다.
도 19는 면역조직화학법에 의한 PDGF 발현을 나타내는 도면이다.
진성 당뇨병은 다양한 안질환들을 유발하는데, 가장 흔하게는 실명의 원인이 되는 당뇨성 망막증(DR) 및 당뇨성 백내장을 유발한다. 항산화제 화합물들은 노화관련 황반 변성, 백내장, 당뇨성 눈 합병증 및 다양한 다른 질병들과 같은 다수의 인간 질병들의 예방에 있어 높은 항산화 포텐셜을 가지는 것으로 고려된다.
루테인은 시금치와 같은 녹색잎 채소들에서 발견되는 천연 발생 항산화제이다. 루테인은 또한 망막 황반에 주로 존재하며 눈에서 발견된다. 루테인이 카로테노이드이고 강력한 항산화제라는 것은 잘 알려져 있다. 이는 노화 관련된 퇴행성 장애인 백내장 및 황반 변성을 치료하는데 사용되어왔다. 루테인은 또한 인간 HepG2 세포 계(cell line)에서 보호 항산화 활성을 나타낸다.
제아잔틴은 자연에서 발견되는 가장 흔한 카로테노이드 알콜들 중 하나이다. 루테인 및 제아잔틴은 동일한 화학식을 갖고 이성질체이지만, 이들은 입체이성질체가 아니다. 이들 사이의 유일한 다른점은 말단 고리 중 하나에서 이중 결합의 위치이다. 이러한 차이점은 루테인에 세 개의 키랄 중심을 부여하지만 제아잔틴에는 두 개의 키랄 중심을 부여한다. 대칭으로 인하여, 제아잔틴의 (3R,3'S) 및 (3S,3'R) 입체이성질체들은 동일하다. 따라서, 제아잔틴은 오직 세 개의 입체이성질체 형태를 갖는다. (3R,3'S) 입체이성질체는 메소-제아잔틴으로 불리운다.
루테인 및 제아잔틴의 컨쥬게이트된 이중 결합들은 각각의 안료의 구별되는 색의 원인이 되고, 또한 단일항 산소를 퀸치(quench)하는데 대한 이들의 능력에 영향을 준다. 추가로 컨쥬게이트된 이중 결합으로 인하여, 제아잔틴은 루테인에 비하여 더 강한 항-산화제인 것으로 생각된다.
루테인 및 제아잔틴 이성질체들의 복합체가 자유 크산토필에 비하여 더 우수한 항산화제로 작용하는 것이 증명되었는데, 산화적 손상으로부터 개선된 보호를 가능하게 한다.
커큐민은 울금으로부터의 황색 안료로서 강황의 주요 성분이고 주로 향신료 및 식품-착색료로 사용된다. 이는 또한 미용적 및 일부 의학적 제제로 사용된다. 커큐민의 바람직한 예방적 또는 추정되는 치료적 특징들은 또한 이의 항산화제 및 항-염증성 특성들과 연관되는 것으로 고려된다. 커큐민은 암,죽상동맥경화증(atherosclerosis) 및 신경퇴행성 질병들과 같은 다양한 임상병리학적 합병증들에 대하여 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
친지질성 영양소는 통상 사용되는 형태인, 오일 서스펜션 또는 비들렛으로 투여되면 낮게 흡수된다. 낮은 흡수율의 주된 이유는 물에 대한 낮은 용해도이다. 이들의 불용해성으로 인하여, 이들의 생물학적 이용가능성은 매우 낮다. 분자 레벨의 영양적 생산물의 분산액은 물에서 영양소의 미셸화에 대한 더 높은 효율성을 제공하고 이에 의해 생물학적 이용가능성이 증가된다.
본원에서 친지질성 영양소의 조성물은 적어도 중량으로 80%의 전체 크산토필을 포함하는데, 이 중 트랜스-루테인 함량 80-95% w/w; (R,R)-제아잔틴 14-20% w/w; (R,S)-제아잔틴 0.01-1% w/w, 또는 트랜스-루테인 함량 80-95% w/w; (R,R)-제아잔틴 14-20% w/w, 및 크산토필/크산토필 에스테르 또는 높은 수용성 형태에서 5-95% 커큐미노이드를 포함하는 커큐민을 포함하는 식물 추출물들/올레오레진으로부터 유래된 미량의 다른 카로테노이드를 포함하고, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는데 있어 강화된 생물학적 이용가능성을 갖는다.
본원의 조성물들은 친지질성 영양소; 안정제; 수용성 친수성 담체; 및 선택적으로 계면활성제를 포함한다.
본원에서 조성물은 적어도 80%의 전체 크산토필 중량을 포함하는데, 이 중 트랜스-루테인 함량 80-95% w/w; (R,R)-제아잔틴 14-20% w/w; (R,S)-제아잔틴 0.01-1% w/w, 또는 트랜스-루테인 함량 80-95% w/w; (R,R)-제아잔틴 14-20% w/w, 및 크산토필/크산토필 에스테르 또는 5-95% 커큐미노이드를 포함하는 커큐민을 포함하는 식물 추출물들/올레오레진으로부터 유래된 미량의 다른 카로테노이드를 포함한다.
사용된 안정제는 아스코르브산, 부틸 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole,BHA), 부틸 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 팔미트산아스코빌, 로즈마리 추출물, 혼합된 천연 토코페롤, 알파 토코페릴아세테이트, 소듐아스코베이트, 카스터 오일 유도체, 소듐라우릴설페이트 및 이들의 혼합물에서 선택된다.
사용된 담체는 폴리에틸렌 글리콜 200, 폴리에틸렌 글리콜 400, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 글루코스 시럽, 콘 스티프 리쿼, 마니톨, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 폴리에틸렌 글리콜 10000, 폴리에틸렌 글리콜 20000, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 수크로스, 글루코스, 소듐 클로라이드, 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐 알코올, 가용성 녹말, 가수분해 녹말 및 이들의 혼합물에서 선택된다.
쥐를 사용하여 네 개의 샘플들, 즉 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들(브랜드 명칭 UltraSol Lutemax2020TM 로 판매);트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들(브랜드 명칭 Lutemax2020TM 로 판매)을 포함하는 농축물 및 커큐민(브랜드 명칭 UltraSol CurcuWinTM 로 판매)를 포함하는 수용성 조성물 및 커큐민 분말의 수용성 조성물들에 의한 당뇨성 눈 합병증에서 친지질성 영양소의 활성을 시험하기 위한 연구들이 수행되었다.
임의의 구현예들에서, 본원의 조성물들은 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴을 포함하는 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들의 황반 색소들을 포함하는 크산토필 조성물들을 포함한다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 조성물들은 적어도 80%의 전체 크산토필 중량을 포함하는데, 이 중 트랜스-루테인 함량은 중량으로 적어도 80%이고, 잔여물들은 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴을 포함하는 제아잔틴 이성질체들이다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 조성물들은 적어도 80%의 전체 크산토필 중량을 포함하는데, 이 중 트랜스-루테인 함량은 중량으로 적어도 85%이고, 잔여물들은 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴을 포함하는 제아잔틴 이성질체들이다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 조성물들은 적어도 85%의 전체 크산토필 중량을 포함하는데, 이 중 트랜스-루테인 함량은 중량으로 적어도 80%이고, 잔여물들은 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 중량으로 적어도 6%의 (R,R)-제아잔틴 및 중량으로 적어도 6%의 (R,S)-제아잔틴이다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 조성물들은 중량으로 적어도 85%의 트랜스-루테인 및 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 중량으로 적어도 4%의 (R,R)-제아잔틴 및 중량으로 적어도 5%의 (R,S)-제아잔틴을 포함한다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 조성물들은 적어도 85%의 전체 크산토필 중량을 포함하는데, 이 중 트랜스-루테인 함량은 중량으로 적어도 80%이고, 중량으로 적어도 15%의 잔여물들은 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴을 포함하는 제아잔틴 이성질체들이다.
임의의 구현예들에서, 트랜스-루테인, 제아잔틴 이성질체들, 즉, 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 (R,R)- 제아잔틴 및 (R,S)- 제아잔틴으로 구성된 황반 색소를 포함하는 크산토필 조성물의 제조방법은:
a) 크산토필 식물 추출물 / 올레오레진 내에 존재하는 크산토필 에스테르를 탈-에스테르화 형태로 전환하는 비누화(saponification) 단계는 루테인의 제한된 이성질체화와 조합되어 더 높은 양의 트랜스-루테인을 포함하는 크산토필을 생성할 수 있는데, 잔여물들은 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴을 포함하는 제아잔틴 이성질체들이다.
b) 비누화 단계에서, 수산화칼슘 또는 수산화나트륨이 추가의 물 없이 1-프로판올에 용해될 수 있다;
c) 비누화 / 이성질체화의 온도는 70 내지 10℃, 바람직하게 약 95℃이고, 비누화 주기는 1-2 시간일 수 있다; 및
d) 만일 필요하면 공정에서 사용된 에틸 아세테이트는 회수되고 재사용될 수 있고, 이에 의해 공정을 경제적으로 만든다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 조성물은 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴을 포함하는 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들의 황반 색소들을 포함하는데, 전체 크산토필은 중량으로 적어도 80%를 포함하고, 이 중 트랜스- 루테인과 제아잔틴 이성질체들의 비율은 4:1 내지 6:1 범위이고, 제아잔틴 이성질체들의 비율은 80:20 내지 20:80 범위이다. 임의의 구현예들에서, 트랜스- 루테인과 제아잔틴 이성질체들의 비율은 약 5:1의 비율이다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 조성물은 중량으로 적어도 85%의 전체 크산토필을 포함하는데, 이 중 트랜스-루테인 함량은 중량으로 적어도 85%이고 트랜스- 루테인과 제아잔틴 이성질체들의 비율은 4:1 내지 6:1 범위이고, 제아잔틴 이성질체들의 비율은 80 내지 20: 20 내지 80의 범위이다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 조성물들의 제조방법은 사람 소비에 안전하고 영양 및 헬스케어에 유용한, 크산토필/크산토필 에스테르를 포함하는 식물 추출물/올레오레진으로부터 유도된 (R,R)-제아잔틴 및 (R,S)-제아잔틴을 포함하는 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들의 황반 색소들을 포함하고, 다음 단계들을 포함한다:
(a) 크산토필 에스테를 포함하는 식물 추출물 / 올레오레진 내에 존재하는 크산토필 에스테르를 추출물 / 올레오레진과 알칼리 및 1-프로판올의 비율이 중량 / 부피로 1:0.5 내지 1:1의 범위인 1-프로판올의 알칼리 용액을 혼합하는 것에 의해
동시에 비누화하고 부분적으로 이성질체화 하는 단계, 결과 매스를 70-100℃ 범위, 바람직하게는 95℃ 온도에서 1 내지 5 시간 범위의 시간으로 가열하여 비누화된/이성질체화 조 농축액(crude concentrate)을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a) 에서 수득된 결과 비누화된/이성질체화 조 농축액 및 물을 1:2 내지 1:3 부피/부피의 범위로 혼합하여 희석된 유성 혼합물을 형성하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 희석된 유성 혼합물과 에틸 아세테이트의 비율이 1:1.5 내지 1:2 부피/부피의 범위로 에틸 아세테이트로 희석된 유성 혼합물을 추출하여 크산토필 조성물을 포함하는 추출물을 얻는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수듣된 조성물을 증발시켜 에틸 아세테이트를 제거하는 단계;
(e) 단계 (d)로부터 얻어진 조성물을 처음에 비극성 용매 다음으로 극성 용매로 세정하여 정제하고 여과하는 단계;
(f) 결과 조성물을 40 내지 45℃ 범위의 온도에서 48-72 시간의 범위 동안 진공하에서 건조시키는 단계;
(g) 만일 바람직하고 재사용되는 것이 필요하면, 종래의 방법에 의해 단계 (c)에서 사용된 에틸 아세테이트를 회수하는 단계; 및
(h) 만일 바람직하면 불활성 대기 내의 -20℃ 에서 결과 조성물을 저장하는 단계.
온도, 단계 (a) 에서 기간 및 알칼리의 양 및 단계 (b) 및 (c)에서 비율을 조절하는 것에 의해 바람직한 조성물이 수득된다.
다엽성(leafy) 및 녹색 채소들, 옥수수, 과일들 및/또는 매리골드(marigolds)가 크산토필 올레오레진에 대한 원료로 사용될 수 있다. 그러나, 루테인이 다량의 크산토필으로부터 자유로운 형태인 제아잔틴으로 존재하고 대부분의 과일들에 다른 바람직하지 않은 카로테노이드가 존재한다는 것을 고려하고, 본 발명에 의한 다엽성 및 녹색 채소들, 옥수수, 과일들이 사용가능할지라도, 상술한 물질들 내에 루테인 및 제아잔틴의 낮은 농도 및 또한 경제적이지 않은, 필요한 정제를 위한 세밀한 단계를 고려하면, 본 발명의 조성물을 준비하기 위한 출발 물질로서 매리골드가 바람직한 선택이다.
특히, 헥산 추출에 의해 생성된 상업적으로 이용가능한 식품 등급 매리골드 올레오레진이 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들을 포함하는 크산토필 조성물의 제조를 위한 출발 물질로 사용될 수 있다(Kumar et.al Process for the Preparation of Xanthophylls Crystals, US Patent No. 6,743,953,2004 ;Kumar US Patent No .6,737,535, 2004).
매리골드 꽃(타제타스 에렉타, Tagetes erecta)는 그것이 주요 카로테노이드 구성 성분으로서 루테인 모노- 및 디에스터를 포함하기 때문에 트랜스-루테인에 대한 가장 우수한 가능한 상업적 원료로 고려된다. 단계(a)에서 사용된 알칼리는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨으로부터 선택될 수 있다.
단계 (d)에서 사용된 비-극성 용매는 펜탄, 헥산 및 헵탄 및 이의 유사체들로부터 선택된, 바람직하게 헥산인, 탄화수소 용매일 수 있다. 단계 (e)에서 사용된 극성 용매는 저급 지방족 알콜로부터 선택될 수 있다.
결과 조성물을 저장하기 위해 사용된 불활성 대기는 질소와 같은 불활성 기체로 유지될 수 있다.
임의의 구현예들에서, 크산토필 에스테르를 포함하는 추출물은 알칼리가 이미 용해된 1-프로판올과 혼합된다. 알칼리 대 1-프로판올및 식물 추출물의 비율은 각각 0.5-1.0 및 1.0 이다. 혼합물은 90℃의 온도로 가열되어 교반하에서 1-5시간 동안 유지된다.
반응 혼합물 내의 총 크산토필은 분광분석(AOAC-16th Edition Method 970.64)에 의해 결정되고, 동일한 HPLC 분석이 트랜스-루테인 및 제아잔틴의 퍼센트를 제공한다(Hadden et al., J.Agric.Food.Chem, 47, 4189-494, 1999).
추출물/올레오레진의 비누화는 지방산의 알칼리염과 자유 형태 크산토필이 유리되는 결과를 가져온다. 이성질체화 반응은 루테인을 매리골드로부터 (R,S)-제아잔틴으로 전환시킨다. 루테인을 제아잔틴 이성질체들로 이성질체화하는 것은 알칼리: 용매 비율, 온도 및 기간과 같은 공정 파라미터들을 변화시키는 것에 의해 변화될 수 있다. 반응 혼합물에서 크산토필의 조성물은 헥산:아세톤:에탄올:톨루엔(0:7:6:7 v/v) 으로 추출하고, 헥산 및 10% 황산 나트륨 용액을 추가하고 HPLC에 의해 상층을 분석하는 것에 의해 분석된다.
원하는 이성질화도(degree of isomerization) 및 트랜스-루테인 함량이 전형적으로 약85%인 크산토필 조성물을 수득한 이후에, 반응 혼합물은 물로 희석되고 실온에서 잘 교반되어 지방산, 비누 및 불순물들로부터 자유로운 형태인 크산토필을 포함하는 황색 유성층이 수득된다.
이 유성층을 분별 깔때기로 이동한 이후에, 에틸 아세테이트가 더해지고 크산토필이 추출된다. 에틸 아세테이트층은 동일한 부피의 탈이온수로 2회 세척된다. 따라서, 지방산들 및 비누 함유 물질들은 물로 제거되어 버려진다. 에틸 아세테이트 추출물은 감압하에 용매를 증류시키는 것에 의해 농축되어 에틸 아세테이트 및 조 크산토필 농축액이 회수된다.
크산토필 농축 조성물은 실온에서 한 시간 동안 헥산으로 교반시켜 정제되고, 이어서 여과된다. 크산토필 매스는 에탄올로 추가로 세정되고 얻어진 오렌지색 결정은 주위 온도에서 72 시간 동안 진공하에서 건조된다.
임의의 구현예들에서, 조성물은 커큐민, 하나 이상의 항산화제, 친수성 담체 및 지방의 상승적 조합을 포함하는 강화된 생물학적 이용가능성을 갖는 수용성 조성물이다.
임의의 구현예들에서, 커큐민 조성물을 제조하는 방법은, 커큐민, 하나 이상의 항산화제, 친수성 담체 및 지방을 용매 내에 용해시켜 균일 매스를 형성하는 단계; 결과 매스를 25℃ 내지 60℃의 범위 온도에서 4 내지 8시간 동안 가온(warming)하여 건조 습식 매스를 수득하는 단계; 증발에 의해 용매를 제거하여 건조 매스를 형성하고 건조 매스를 분쇄하여 미세 분말을 형성하는 단계를 포함한다.
임의의 구현예들에서, 수용성 조성물은 경구투여가능한 형태로 이용가능한 커큐민을 포함하는 강화된 생물학적 이용가능성을 갖는다.
임의의 구현예들에서, 수용성 조성물은 어떠한 명백한 부작용 없이 사람 소비에 안전한 커큐민을 포함하는 강화된 생물학적 이용가능성을 갖는다.
임의의 구현예들에서, 공정은 강화된 생물학적 이용가능성을 갖는 커큐민을 포함하는 수용성 조성물의 제조방법을 기술한다.
임의의 구현예들에서, 수용성 조성물은 커큐민, 하나 이상의 항산화제, 친수성 담체 및 지방의 상승적 조합을 포함하는 강화된 생물학적 이용가능성을 갖는다.
임의의 구현예들에서, 강화된 생물학적 이용가능성을 갖는 신규한 수용성 조성물의 제조방법은 다음을 포함한다:
(i) 커큐민, 하나 이상의 항산화제, 친수성 담체 및 지방을 용매 내에서 용해시켜 균일 매스를 형성하는 단계;
(ii) 결과 매스를 25℃ 내지 60℃의 범위 온도에서 4 내지 8시간 동안 가온하여 건조 습식 매스를 수득하는 단계
(iii) 증발에 의해 용매를 제거하여 건조 매스를 형성하는 단계 및
(iv) 건조 매스를 분쇄하여 미세 분말을 형성하는 단계
단계 (i)에서 사용된 커큐민은 85-96% 사이 범위의 어세이(assay)를 갖는 상업적으로 이용가능한 것일 수 있다. 또한 커큐민 내에서 강황 풍부 추출물일 수 있다. 첨가된 커큐민의 양은 1-55% 커큐민 어세이를 갖는 수용성 커큐민을 제조하기에 충분하다.
단계 (i)에서 사용된 항산화제들은 천연 토코페롤, 팔미트산아스코빌, 로즈마리 추출물, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 카테킨, 아스코르브산 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 사용된 항산화제의 양은 1-10% 사이의 범위일 수 있다.
단계 (i)에서 사용된 친수성 담체는 가용성 녹말, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 소듐카르복시메틸셀룰로스(sodium carboxy methyl cellulose), 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 200-20000, 글리세롤, 소르비톨, 마니톨, 글루코스, 당 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 추가된 친수성 담체의 양은 10-90% 사이 범위일 수 있다.
단계 (i)에서 사용된 지방은 우유 지방, 중쇄 중성지방(medium chain triglycerides), 장쇄 중성지방, 수소화 야채유 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 사용된 지방의 양은 1-25% 범위일 수 있다.
단계 (i)에서 용해시키는데 사용된 용매는 이소프로필 알콜, 아세톤, 메탄올, 알콜 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
균질 매스를 얻기 위해 유지되는 온도는 주위 온도에서 70℃; 바람직하게 20℃ 내지 60℃ 일 수 있다.
단계 (ii)에서 용매의 제거는 진공 증류 또는 증발 기법 또는 스프레이 건조 기법으로 수행될 수 있다. 결과 건조 매스는 막자사발 및 막자, 믹서-그라인더(mixer-grinder), 다중-밀(multi-mill), 볼 밀(ball mill), 제트 밀(jet mill) 및 유사체들을 사용하여 분쇄된다.
커큐민의 이점들은 잘 알려져 있다. 그러나, 구강투여 형태로 전달될 때 커큐민의 생물학적 이용가능성과 관련된 많은 문제점들이 있다. 섭취된 커큐민의 대부분이 비대사된(unmetabolized) 대변으로 배출되고 흡수된 작은 부분은 다른 대사 산물로 전환되고 배출된다.
커큐민은 쉽게 위장관에 침투하지 못하고 간 및 다른 장내 효소의 영향을 받기 쉽다. 이러한 효소들로 인하여, 신체 내에서 커큐민은 빠르게 대사 작용되어 신체 내에서 이의 생물학적 이용가능성이 감소된다. 혈류로 들어가는 소량의 커큐민은 간 및 신장에 의해 빠르게 대사 작용된다. 따라서, 비록 커큐민이 높은 친지질성(및 매우 쉽게 혈액 뇌 장벽을 교차하지만) 이지만, 단지 매우 소량의 경구 투여된 커큐민이 혈청 및 뇌 조직 내에 허여된다.
시토크롬 P450은 상 I 대사 동질 효소(phase I metabolizing isoenzyme)로, 헤테로시클릭 아민과 같은 대사 독성 화합물에 필요로하여 암을 유발하는 DNA 부가물 형성을 유도한다. 신체 내에서 섭취될 때 커큐민은 위장관으로 들어가 시토크롬 P450을 억제하는 것으로 알려진다.
상술된 바와 같이, 피페린과 함께 사용될 때 커큐민의 생물학적 이용가능성을 증가시키기 위한 연구가 수행되고 있다. 피페린은 시토크롬 P450을 억제하는 생물학적 강화제(bioenhancer)이고 이에 의해 신체 내에서 커큐민의 대사가 방해된다.
본원의 조성물들은 어떤 추가의 생물학적 강화제의 존재 없이 생물학적 이용가능성을 강화시키는 것을 보여준다.
커큐민의 수용성 조성물은 항산화제, 친수성 담체 및 지방을 포함한다. 커큐민과 항산화제는 시토크롬 P450을 억제한다. 반면, 조성물 상에 지방 코팅은 조성물이 간 마이크로솜(liver microsomal) 또는 다른 장내 효소들에 의해 공격받는 것으로부터 보호하는데, 이 효소들은 오직 수성 화합물들(aqueous compounds)만 공격하기 때문이다. 따라서, 항산화제 및 지방은 커큐민의 생물학적 이용가능성을 강화시키는데 있어 중요한 역할을 한다.
이전 연구들은 Lutemax2020®가 식이에서 (0.1%)는 아니지만 1%에서 쥐들의 당뇨성 백내장을 지연시키는 것을 증명하였다. 또한, (1%)는 단지 지연시키기는 하지만 당뇨성 백내장을 완전히 예방하지는 않아 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들 (UltraSol Lutemax2020TM)의 수용성 조성물이 당뇨성 백내장 및 당뇨성 망막증과 같은 당뇨성 눈 합병증들의 예방/치료에 대한 효과를 추가로 측정하는데 사용되었다.
후술하는 실시예들은 본 발명의 설명을 위한 것으로 이들의 범위를 제한하는 것을 해석되어서는 안된다. 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들을 포함하는 통상의 조성물 및 커큐민을 포함하는 통상의 조성물과 비교하여 트랜스-루테인 및 제아잔틴 이성질체들을 포함하는 수용성 조성물 및 커큐민을 포함하는 수용성 조성물의 당뇨성 백내장 및 당뇨성 망막증을 예방 또는 지연시키는 효과를 측정하기 위하여, 스트렙토조신(streptozotocin, STZ)을 사용하여 쥐들에게 당뇨병을 유발시켰다.
실시예1
당뇨성 백내장에 UltraSol Lutemax2020 TM 및 UltraSol CurcuWin TM 의 효과
실험설계
수컷 위즈타 스트레인(Male Wistar strain)(WNIN) 쥐들은 (2개월; 평균무게 213±14 g) 인도 하이데라바드 국립영양연구원 국립실험동물센터(National Center for Laboratory Animal Sciences, National Institute of Nutrition, Hyderabad, India, NCLAS, NIN)에서 얻어졌다. 동물들은 NCLAS, NIN에서 보관되었으며, 2주동안 실험실에서 순응되었다. pH 4.5, 0.1 M 시트레이트 버퍼(citrate buffer) 내 STZ (30 mg/ kg)의 단일 복강내 주사에 의해 밤새 금식한 동물들에게 당뇨병이 유발되었다. 오직 매개체만 수여받은 또 다른 세트의 쥐들은 통제군으로서 작용했다(그룹 I, n=12). 공복혈당수치는 STZ 주사 후 72시간을 측정했다. 혈당수치가 150 mg/dL 이상인 동물들은 당뇨병으로 간주하고, 그것들을 다섯 개 그룹으로 나누었다(그룹 II- VI). 통제군 쥐들(n=6)에게 0.01% 가용성 커큐민(그룹 VII) 및 0.5% 가용성 루테인(그룹 VIII) 만이 공급되었다.
연구 기간 동안 모든 동물들은 12주 동안 이들의 각각의 식이요법을 유지하며 개별 사육장에 수용되고 식수가 임의로 공급되었다.
표 1: 실험군과 식이
Figure pct00001
동물 관리: 동물 관리 및 사용을 위하여 제도 및 국가 가이드를 따랐으며 동물과 관련된 모든 실험 절차들은 국립영양연구원의 IAEC(institutional animal ethical committee, 동물윤리위원회)에 의해 승인되었다.
동물들은 12시간 밤/낮 주기의 온도(22℃) 및 습도가 통제되는 개별 사육장에 수용되었다. 모든 동물들은 물에 자유로이 접근하도록 하였다.
음식 섭취(매일) 및 체중(매주)이 관찰되었다.
세극등 검사(Slit lamp examination) 및 백내장 등급: 눈은 확장된 동공에 세극등생체현미경을 사용하여 매주 조사되었다. 백내장의 개시와 진행은 다섯 개의 카테고리(0-4)로 등급을 매겼다.
사망률: 연구 과정에서, 예상대로 그룹 II의 동물 3마리와 그룹 III-VI의 동물 각각 2마리가 사망하였다.
혈액 / 수정체 수집 및 처리: 혈액은 글루코스와 인슐린 추정을 위해 안와후신경총(retro orbital plexus)에서 매주 한 번 채혈되었다. 12주의 말에, 동물들은 CO2 질식에 의해 희생되었고 수정체는 후방접근법으로 절개되었으며 추후 분석이 이루어질 때까지 -70℃에서 보관되었다. 10%의 균질액은 pH 7.4, 50 mM 인산완충액 내의 혼주 수정체들(pooled lenses)로부터 제조되었다. 모든 생화학 파라미터들은 전체 균질액으로 결정된, 수정체 말론디알데히드(malondialdehyde,MDA)를 제외한 수정체 균질액(4℃에서 15,000x g)의 가용성 부분에서 분석되었다.
생화학 추정(Biochemical estimations): 티오바르비투르산반응 물질(thiobarbituric acid reacting substances, TBARS) 단백질 카보닐 함량으로서의 Lens MDA 는 저자 Suryanarayana P 외. 연구논문 "Curcumin and turmeric delay streptozotocin-induced diabetic cataract in rats," 미국 안과학회지(Invest Ophthalmol Vis Sci) 2005;46(6):2092-9에 기재된 단백질 카보닐 함량 추정 방법에 따라 결정되었다. 총 가용성 및 불용성 단백질은 소혈청알부민(bovine serum albumin,BSA)을 표준으로 사용한 로리법(Lowry method)에 의해 분석되었다.
혈장 루테인 수치: 혈장 루테인 수치는 급속 분리 액체 크로마토그래피(Rapid Separation Liquid Chromatography, RSLC)에 연결된 4.6x150 mm, 5 ㎛, spherisorb waters C18 컬럼을 사용한 HPLC에 의해 측정되었다. 컬럼은 25℃, 2㎕의 컬럼에 로딩된 혈장 샘플(헥산에서 추출된)이 0.5 ml/min 이동률로, 이동상인, 아세트나이트릴의 등용매 혼합물(isocratic solvent mixture):디클로로에탄(dichloroethane): 70:20:10 (v/v) 비율의 메탄올(methanol)로 평형이 되었고, 루테인은 300-600nm 에서 검출되었다.
도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)(SDS-PAGE) 및 수정체 단백질의 크기 배제 크로마토그래피: 가용성 단백질의 소단위 프로파일(Subunit profile) 및 가교는 감소상태에서 도데실황산나트륨(SDS)의 존재하에 10% 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide) 상에서 분석되었다. 가용성 단백질 분획의 결정분포는 HPLC시스템을 사용한 600x7.5 mm TSK-G4000 SW 컬럼(TOSOH Co., 일본) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 컬럼은 1 ml/min의 이동률로 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 pH 6.7, 0.1 M의 인산 나트륨 버퍼와 평형이 되었다.
통계적 분석: 일원분산분석(One-way analysis of variance,ANOVA)이 데이터 그룹 간 통계적 유의도 시험에 사용되었고 개별적인 쌍 차이는 던컨의 다중검정(Duncan's multiple-range test)에 의해 검사되었다. 분산의 이질도는 P<0.05가 유의수준으로 간주되는 비모수 만-위트니 검정(nonparametric Mann Whitney test)에 의해 검사되었다.
결과들
공복혈당: 도 1은 치료 주기를 통해 서로 다른 동물 그룹에서 공복혈장혈당 결과를 요약한 도면이다. 실험에 의하면 당뇨병 통제 쥐들의 혈장혈당 농도는 비-당뇨병 통제 쥐들에 비하여 상당히 더 높았다. 비록 SC 및 SL으로 처리된 그룹에서 관찰된 평균 공복혈장혈당 수치가 더 낮지만, 당뇨병 쥐에서 혈장혈당에 대한 명백한 치료 효과는 관찰되지 않았다.
도 1: STZ-유발된 당뇨병 쥐에서 공복혈장혈당의 치료 효과(도 1은 명세서와 수반된 도면에서 도시된다). 데이터는 평균±측정 표준오차(standard error of measurement, SEM)로 표시되었다. Control (비-당뇨병 통제); D (당뇨병 통제); D+RL (당뇨병 + 일반 루테인); D+SL (당뇨병 + 가용성 루테인); D+RC
(당뇨병 + 일반 커큐민); D+SC (당뇨병 + 가용성 커큐민) ***=p<0.001.
백내장 발달 및 진행 : 백내장의 발병 및 진행이 후술되는 바와 같이 슬릿 램프 생체현미경에 의해 모니터링 되었다: 눈은 확대된 동공으로 슬릿 램프 생체현미경(Kowa SL15, Portable, Japan)을 사용하여 매주 평가되었다. 수정체 혼탁의 개시 및 진행은 다음와 같은 다섯 개의 카테고리들로 등급화되었다:
"투명(clear)", 투명 수정체 및 액포(vacuoles)가 존재하지 않음; "스테이지 1(stage 1)", 수정체 앞극(anterior pole)의 약 이분의 일을 액포가 덮어서 수정체피막하백내장을 형성; "스테이지 2", 일부 액포가 사라지고 피질이 희미한 혼탁을 나타냄; "스테이지 3", 희미한 피질이 남아있고, 밀집된 핵 혼탁이 존재; 및 "스테이지 4", 피질 및 핵 모두에 밀집된 혼탁이 나타나 성숙 백내장이 관찰된다(도 2).
도 2: 치료에 의한 쥐에서 당뇨성 백내장의 지연(도 2는 명세서와 수반된 도면에서 도시된다). 데이터는 평균±SEM으로 표시되었다. Control (비-당뇨병 통제); D (당뇨병 통제); D+RL (당뇨병 + 일반 루테인); D+SL (당뇨병 + 가용성 루테인); D+RC(당뇨병 + 일반 커큐민); D+SC (당뇨병 + 가용성 커큐민)
고혈당으로 인한 백내장의 발병이 STZ 주사 후 세째주에 당뇨성 동물들에서 관찰되었다. 백내장의 평균 발병율이 계산되어 도 2에 나타난다. 비록 발병에는 지연이 없었지만, 그룹-D와 비교할 때 모든 치료 그룹에서 백내장 진행 및 성숙에서 명백한 지연이 있다. 그룹-D 동물들은 10주차 끝까지 수정체 혼탁화(단계-IV)를 나타냈고, 치료 그룹은 약 스테이지-2.5 내지 3을 나타냈다. 데이터는 그룹-D와 비교하여, 6째주부터 계속하여 백내장 조정 그룹의 진행 및 성숙이 상당히 지연된다는 것을 명백하게 나타낸다. 10주 말기에 백내장 중증도가 그룹-D (스테이지 4)에서 보다 그룹 D+RL (스테이지 3.1), D+SL (스테이지 2.7), D+RC (스테이지 3.0) 및 D+SC (스테이지 3.2)에서 상당히 낮았고, 느린 진행으로 인하여 당뇨성 백내장의 성숙이 지연된 임의의 제제에 의한 조정을 지시하며, SL 은 RL 보다 더 효과적인 것으로 보이지만, SC는 백내장 진행에 있어서 RC 에 대하여 효능이 우세하지 않았다. 전체 실험 기간 동안 그룹-C에서 모든 수정체들은 정상이고 투명하며 혼탁하지 않은 것으로 나타났다.
수정체 생물화학적 분석: 개별적 수정체들의 무게가 측정되고 하나의 풀(pool)에 대하여 4개의 수정체들이 모아지고, 이러한 4-5 풀들이 하나의 그룹을 형성한다. 초과 열 발생을 피하기 위하여 간헐적 시간차로 조직 균질기(tissue homogenizer)에 의해 10 % 균질액이 pH 7.4 50 mM 인산나트륨 버퍼에서 준비되었다. 총 균질액(TH)의 분리된 분리 표본이 TBARS 어세이에 대하여 250Ｂ㎕, 소르비톨 추정에 대하여 150㎕ 및 단백질 추정에 대하여 20㎕ 제조되었다. 잔여 균질액이 4℃에서 30분 동안 10,000 RPM으로 원심분리되었다. 상청액이 총 가용성 단백질(TSP)로서 라벨링된 바이알 내로 분리되었다.
수정체 균질액 내에서 단백질의 가용성 백분율의 결정: 단백질 추정이 수정체 균질액 및 가용성 부분(fraction)에서 로리법(Lowry's method)에 의해 행해졌다. 수정체의 그램 중량(per gram weight)에 존재하는 단백질의 양이 계산되었다. 가용성 단백질의 백분율은 가용성 단백질의 부분에 100을 곱하여 계산되었다.
우리는 모든 실험 그룹들의 수정체 내에서 전체 및 가용성 단백질의 함량을 분석하였다. 통제군과 비교하여 그룹-D에서 전체 및 가용성 단백질 모두의 상당한 감소가 있었다. 이는 수양액 내로 단백질의 부분 유출 또는 단백질 응집 및 불용성에 기인한 것으로 생각된다. 치료 그룹들 가운데, SL 및 RC는 그룹-D와 비교하여 가용성 단백질의 손실을 상당히 예방하는 반면, SL 단독은 가용성 단백질 백분율에서 그룹 D와 상당히 다름을 보여주었다. SC 및 RL 은 수정체 단백질의 불용화를 예방하는데 부분적으로 유익한 효과를 나타내지만, 통계상으로 상대적으로 적은 의미를 나타내었다.
표 2: 수정체 균질액의 전체 및 가용성 부분에서 단백질 함량. 데이터는 평균±SEM으로 표시되었다. n=6; Control (비-당뇨병 통제); D (당뇨병 통제); D+RL (당뇨병 + 일반 루테인); D+SL (당뇨병 + 가용성 루테인); D+RC(당뇨병 + 일반 커큐민); D+SC (당뇨병 + 가용성 커큐민); ***=p<0.001, **=P<0.01 및 *=P<0.05 Vs C; ##= P<0.01 및 #= P<0.05 Vs D
표 2
Figure pct00002
SDS-PAGE 단백질 프로파일링: 단백질 분포 패턴의 차이가 12% 폴리크릴아미드 젤 상에서 수정체 단백질 샘플들을 이용하여 관찰되었다. 30㎍의 단백질이 SDS-PAGE 분자량 마커(Broad range SDS-PAGE marker, BioRad)와 함께 로딩되었다. SDS-전기영동패턴이 그룹-C에 대하여 그룹-D 내에서 ~50 kDa 에서 응집 단백질에 대응하는 밴드로 나타나고, 처리 그룹들 RL, SL, RC 및 SC에서 감소된 밴드 강도로 나타났다. 도 3은 명세서와 수반된 도면에서 도시된 바와 같이, 수정체 단백질의 가용성 부분의 SDS-PAGE 패턴을 나타낸다.
크기 배제 고 성능 액체 크로마토그래피: TSK-3000 HPLC 컬럼 상에 크기 배제 크로마토그래피는 수정체 단백질의 해상도 결과를 가져왔다. HPLC 프로파일은 그룹-C(흑색선)과 비교하여, 그룹-D(적색선) TSP 내의 저분자량 영역에서 감소된 피크 영역 및 고분자량 단백질 영역에서 증가된 피크 영역을 입증한다. 이는 당뇨성 질병에서 단백질 응집 현상이 존재한다는 것을 제안한다. RL, 즉, SL, RC 및 SC을 제외한 모든 조정이 TSP 프로파일로 정상화된다. RL을 제외한, 모든 다른 조성물들 SL, RC 및 SC이 TSP로 조정되고 프로파일로 정상화되지만, RL은 TSP 수치에 어떠한 영향도 나타내지 않았고, 당뇨성 질환과 같은 비정상으로 남아있다.
도 4는 명세서와 수반된 도면에서 도시된 바와 같이, 수정체 단백질 가용성 부분의 크기 배제 크로마토그래피를 나타낸다.
소르비톨 수치: 우리는 모든 실험 동물들의 수정체 내에 소르비톨의 축적을 평가하였고 데이터가 도 8에 도시되었다. 그룹-C(0.301±0.04 u moles/gm 수정체 소르비톨)에 비교하여 그룹-D(5.877±0.27)는 소르비톨 수치의 상당한 상승을 나타냈다. 조정 그룹들 중에, SC를 제외한, 나머지 처리들은 그룹-D와 비교하여 소르비톨 축적이 더 낮아지지 않았다. 그룹-SC는 그룹-D와 비교하여 상당히 낮은 소르비톨 수치를 나타냈고, 그룹-C와 비교하여 상당시 높은 소르비톨 수치를 나타냈다. 이는 알도스 환원효소 억제제(aldose reductase inhibitor)로서의 커큐민의 추가적인 약학적 작용에 기인하는 것으로 여겨진다.
도 5: 수정체 소르비톨의 분광형광 측정(도 5는 명세서와 수반된 도면에서 도시된다). 데이터는 평균±SEM으로 표시되었다. n=6; Control (비-당뇨병 통제); D (당뇨병 통제); D+RL (당뇨병 + 일반 루테인); D+SL (당뇨병 + 가용성 루테인); D+RC(당뇨병 + 일반 커큐민); D+SC (당뇨병 + 가용성 커큐민); *=P<0.05 Vs C; # = P<0.05 Vs D.
혈장 루테인 수치: 혈장 루테인 수치가 HPLC에 의해 측정되었다. 설치류 음식 규정식이 카로테노이드를 포함하지 않기 때문에, 루테인은 통제 및 당뇨병 쥐들에서 검출되지 않았다. 그러나, 루테인은 루테인 공급 그룹에서 검출될 수 있다.
당뇨병 쥐들에 일반 루테인을 공급하면 0.01 micromoles/L의 혈장 루테인 결과를 나타냈다(도 6). 가용성 루테인의 공급은 혈장 루테인이 0.07 마이크로몰에서 7배의 증가를 유도하여(도 6), 가용성 루테인이 루테인의 생물학적 이용가능성을 상당히 증가시는 것을 제안하고, 일반 루테인과 비교하여 가용성 루테인의 개선된 유익한 효과에 대한 원인이 될 수 있다.
도 6: 혈장 루테인 수치의 HPLC 측정(도 6은 명세서와 수반된 도면에서 도시된다).
데이터는 평균±SEM으로 표시되었다. n=6; Control (비-당뇨병 통제); D (당뇨병 통제); D+RL (당뇨병 + 일반 루테인); D+SL (당뇨병 + 가용성 루테인).
결론
커큐민의 공급은 P23H 로돕신 돌연변이 유전자삽입 쥐들에서 광수용기 퇴행을 구제하였다. 식이 항산화제 커큐민의 공급은 주로 이의 항산화 특성에 의해 쥐에서 스트렙토조신(STZ)-유도된 당뇨성 백내장의 지연에 효과적이었다. 추가로, 커큐민은 쥐 망막에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 당뇨병-유도된 발현 및 수정체 알도스 환원효소(AR)를 억제하였다.
가용성 루테인은 식이에서 0.5% 용량으로 일반 루테인에 비하여 당뇨성 백내장을 지연시키는데 더 효과적이고, 이는 백내장 발생과 관련한 분자 분석에 반영된다. 가용성 루테인의 증가된 생물학적 이용가능성은 일반 루테인과 비교하여 가용성 루테인의 관측 생물학적 효과를 설명할 수 있다. 가용성 커큐민의 효능은 거의 일반 커큐민과 비교할 수 있다.
실시예 2-영양유전체학적 접근에 의한 당뇨성 망막증에서 UltraSol Lutemax2020 TM 의 효과
가용성 루테인 (UltraSol Lutemax2020TM) 의 효과가 영양유전체학적 접근에 의해 망막상에 이의 유익한 효과에 대하여 당뇨병 쥐들에서 관찰되었고, 효과가 일반 루테인(Lutemax2020®)과 비교되었다.
방법론
동물 모델: 당뇨병 스트렙토조신(STZ) 쥐 모델은 당뇨병과 관련된 인간 질병에 대하여 가장 많이 사용되는 모델들 중 하나이다. 이는 인간 당뇨병에서 관측되는 다수의 급성 및 일부 만성 합병증을 모방하는 것으로 알려진다. 이 모델은 높은 재생가능성을 갖는다는 이점이 있고, 다양한 시간대에 대하여 발전되는 합병증들이 잘 인식되고 재생가능하다. 인간 질병의 일부 구조적, 기능적 및 생화학적 이상(abnormalities)의 정립된 유사성에 의하면, 이는 당뇨병 메커니즘에 접근하고 잠재적 치료들을 평가하기에 적절한 모델인 것으로 고려된다.
실험적 설계: 120 gms의 평균 몸무게를 갖는 수컷 위스타-NIN(Wistar-NIN) 쥐들이 인도 하이데라바드 국립영양연구원 국립실험동물센터(NCLAS, NIN)로부터 얻어졌다. 동물들은 NCLAS, NIN에서 보관되었으며, 2주동안 실험실에서 순응되었다. 0.1 M 시트레이트 버퍼 내 STZ (30 mg/ kg)의 단일 복강내 주사에 의해 밤새 금식한 동물들에게 당뇨병이 유발되었다. 매개체만 수여된 다른 세트의 쥐들은 통제군(그룹-C; n=6)으로 작용하였다. 공복혈당수치는 STZ 주사 72 시간 이후에 측정되었다. 150 mg/dL 이상의 혈당 수치를 갖는 동물들은 당뇨병으로 간주하고 모든 동물들은 하기 표 3에 나타난 바와 같이 네 개의 그룹으로 나뉘었다.
표 3
Figure pct00003
연구 기간 동안 모든 동물들은 12주 동안 이들의 각각의 식이요법을 유지하며 개별 사육장에 수용되고 식수가 임의로 공급되었다. 일상식 섭취 및 주당 체중, 공복혈당수치가 기록되었다. 희생되기 전에 망막전도(electroretinogram)가 수행되고 당화헤모글로빈(glycosylated hemoglobin)(HbA1C)이 추정되었다. 12주 말에, 쥐들이 안락사되고 망막들이 조직학적 및 분자 분석(유전자 및 단백질 발현)을 위하여 수집되었다.
망막전도(ERG) 분석: 당뇨성 망막증은 망막 기능 장애로 특징지워진다. 망막 기능은 망막전도에 의해 평가될 수 있다. 당뇨병은 서로 다른 망막 세포층 내에 허혈 및 세포자멸사(apoptosis) 결과를 가져오는데, 이러한 결과들은 망막 기능을 변화시킨다. 진동 포텐셜(OPs, OP는 파동을 나타내고, ERG의 주요 성분인 진동 파동이라 칭해진다)이 a- 또는 b- 파동보다 당뇨병에서 더 효과적이라는 것이 잘 보고되어있다. OPs는 내부 망막층들, 신경절 세포층 및 내부 얼기층(plexiform layer)의 기능적인 면들을 나타낸다.
동물들은 밤새 암순응 되어 흐릿한 적색 조명하에 ERG 과정을 위해 준비되었다. 쥐들의 동공이 아트로핀(atropine) 점안액으로 팽창되었다. 접지 전극은 꼬리에서 피하 주사이고, 기준 전극은 이어 클립(ear clip) 전극이었다. 활성 접촉 수정체 전극들은 각막 상에 위치되었다. 기록은 UTAS 시각 진단 시스템으로 수행되었다. 반응들은 교류-커플링 UBA-4204 증폭기(alternating current-coupled UBA-4204 Amplifier)를 사용하여 별도로 1,000배 증폭되었다. -2 내지 8 dB의 플래쉬 자극(flash stimuli)이 BigShotTMGanzfeld System(LKC Technologies; Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 전달되었다. 진동 포텐셜은 파장 형태로 추출되고 모든 OPs의 합이 계산되었다.
정량적 실-시간 PCR: Tri 시약을 사용하여 쥐들의 망막으로부터 전체 RNA 가 추출되었다. 격리된 RNA가 RNeasy Mini Kit (Qiagen)에 의해 추가로 정제되고 ND1000 분광광도계(NanoDrop technologies, Delaware, USA)상의 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화되었다. RNA 준비의 질은 변성 아가로스 젤(denaturing agarose gel) 상에서 전기영동에 의해 평가되었다. 총 RNA의 두 개의 ㎍이 고용량 cDNA 역전사 키트(High Capacity cDNA Reverse transcription kit)를 사용하여 역전사되었다. 역전사 반응은 유전자증폭기(ABI 9700)에 의해 수행되었다. 실-시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)(ABI-7500)이 특이 유전자 프라이머(gene specific primers)의 SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR green master mix)를 사용하여 25ng cDNA 템플릿(templates)으로 3 배로 수행되었다. 데이터의 표준화 및 확인이 내부 통제로서 β-액틴(β-actin)을 사용하여 수행되었고, 데이터는 비교 문턱 주기(2-ΔΔct) 방법에 의한 샘플들 사이에서 비교되었다.
SDS-PAGE 및 면역블러팅법: 망막은 20mM Tris, 100mM NaCl을 포함하고, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)(DTT), 1mM 페닐메틸 설포닐 플루오라이드(phenylmethyl sulfonyl fluoride)(PMSF), ㎍/ml의 각각의 아프로티닌(aprotinin), 류펩틴(leupeptin), 및 펩스타틴(pepstatin)을 포함하는 1 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)(TNE 버퍼; pH7.5)를 포함하는 버퍼에서 균질화되었다. 균질액은 20분 동안 12,000xg 에서 원심분리되었다. 상청액이 수집되어 면역블로팅 분석에 사용되었다. 상청액으로부터 동일한 양의 단백질이 12% SDS-PAGE 실시되었고 단백질은 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인 상으로 전환되었다. 특이적 결합이 트윈(Tween)(PBST)과 인산완충식염수 내의 5% BLOT-QuickBlocker 시약(WB57, Calbiochem)으로 블록킹되고 인산완충식염수(PBS)로 희석된 1차 항체에 의해 4℃에서 밤새 배양되었다. PBST로 세척한 이후에, 멤브레인은 서양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase,HRP)로 컨쥬게이트된 항-토끼 IgG (1:3500) 2차 항체로 배양되었다. 면역블롯(immunoblots)은 강화 화학발광 검출 시약(RPN2232, GE Health Care, Buckinghamshire, UK)으로 전개되었고, 디지털 영상이 이미지 분석기(Syngene, G-box)에 의해 기록되었다. 밴드 강도의 정량화가 이미지 J 소프트웨어(Image J software)로 수행되었다.
조직병리학: 선택된 동물들로부터 눈알이 분리되어 라벨링된 바이알들 내의 고정액인 4% 파라포름알데히드 용액 내에 수집되었다. 조직들은 일부 베어져서 깊은 조직 내로 고정액의 투과를 용이하게 하였다. 이들은 24-48 시간 동안 실온에서 보관되고 20 mM의 인산나트륨 버퍼인 고정액에 위치되었다. 버퍼는 조직병리학 과정까지 매주 새로운 버퍼로 대체되도록 예정되었다. 조직들은 파라핀에 임베딩되고 구획들(sections)이 마이크로톰(microtome)에 취해졌다. 코팅된 슬라이드들이 면역조직화학법(immunohistochemistry) 및 면역형광법(immunofluorescence)에 사용되었고 코팅되지 않은 슬라이드들은 헤모토실린(hemotoxylin) 및 에로신(eosin)(H & E) 염색(staining)에 사용되었다.
통계적 분석: 데이터는 평균±SEM으로 표시되었다. n=6; Control (비-당뇨병 통제); D (당뇨병 통제); D+RL (당뇨병 + 일반 루테인); D+SL (당뇨병 + 가용성 루테인); *** =p<0.001, ** =P<0.01 및 *=P<0.05 Vs C; ## = P<0.01 및 # = P<0.05 Vs D.
결과들은 비교하는 모든 그룹과 통제군에 대하여 일원분산분석(ANOVA), 이어서 던네트 다중 비교 테스트(Dunnett's multiple comparison test)에 의해 통계적 유의도(statistical significance)에 대하여 분석되었다. 그룹 사이의 유의도는 양측비쌍체 t-테스트(two tailed unpaired t-test)에 의해 검사되었다.
결과들
망막전위도검사법(Electroretinograph): 정상 통제 (C) 동물들 (498.4 ㎶)과 비교하여 당뇨성 쥐에서 (D) OPs 진폭이 감소되었다 (334.2 ㎶). 또한, OPs 에 대한 내재 시간(implicit time)이 그룹-D 에서 증가된다는 것이 주목된다. 항산화 루테인의 섭취는 OP 진폭 감소를 낮추는 결과를 가져오는데, 이는 OPs; RL (442.6)과 SL (561.9)의 합에 의해 제안된다. 그룹-SL은 그룹-D와 비교하여 OPs의 합계가 상당히 다른 것을 보여주는데, 표준 정상 통제 쥐들보다 더 우수하다.
도 7: OPs의 대표적인 파장 형태가 서로 다른 그룹 및 총 진폭으로 도시된다(도 7은 명세서와 수반된 도면에서 도시된다). C, 비 당뇨병 통제; D, 당뇨병 통제; D+RL, 당뇨병+ 일반 루테인; D+SL, 당뇨병+ 가용성 루테인.
망막 모폴로지(Morphology): 통제 쥐들 C 에서, 모든 망막층들은 완전하고 최대 망막 두께를 가지며, 또한 밀집된 INL 이고, INL 및 ONL 사이에서 구별가능한 분리(OPL) 이다. 반대로, 당뇨병 망막 (D)은 상당히 감소된 망막 두께를 나타내고 또한 낮은 밀도 ONL 및 거의 융합된 INL 및 ONLs에 의해 두드러진다. 루테인 처리는 당뇨성 망막에서 상당한 정도로 총 형태학적 변화를 예방하였다. 루테인의 가용성 제제는 일반 루테인보다 더 우수한 것으로 나타났는데, 이는 밀집된 ONLs (도 8)에 의해 지시된다. 도 8은 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이, 망막 조직학을 나타낸다.
표 4: 서로 다른 그룹의 망막 층 두께(μ)
Figure pct00004
Lieca application suit, Leica, Switzerland 의 사용에 의한 망막 층 두께(μ)의 대표적 표. C, 비 당뇨병 통제; D, 당뇨병 통제; D+RL, 당뇨병+ 일반 루테인; D+SL, 당뇨병+ 가용성 루테인; GCL, 신경절세포층; IPL, 내부 얼기층; INL, 내부 핵층; OPL, 외부 얼기층; ONL, 외부 핵층; PRL, 광수용체층.
실-시간 PCR, 망막 마커들(유전자) 발현, 면역조직화학법 및 면역블러팅법에 의한망막 마커들(유전자):
로돕신(Rho): 로돕신(Rho)은 망막 광수용체 세포 내 생물학적 색소로, 1차적으로 빛을 인식한다. 실시간 PCR로 정량화된 Rho 유전자의 mRNA 수치는 당뇨병 동물들의 망막에서 감소된 수치를 나타냈다. RL 및 SL에 의한 처리는 이의 감소를 예방하지만, SL 공급은 RC와 비교하여 상당한 효과를 가지고 심지어 정상 쥐들보다 더 우수하다(도9A, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). 또한, 우리는 면역형광법에 의해 Rho 단백질 수치를 정량화하였는데, 이는 mRNA 수치과 일치한다. Rho 단백질의 면역형광 영상은 정상 통제 쥐 망막과 비교하여 당뇨병 쥐 망막에서 감소된 발현을 나타냈다. RL 및 SL에 의한 처리는 당뇨병 망막에서 Rho 단백질 발현의 손실을 예방하는데, 이는 강한 Rho 양성 형광에 의해 지시된다. 또한, SL은 각각의 당뇨병 동물들의 쥐 망막에서 Rho 단백질 발현의 손실을 예방하는데 있어서 RL 보다 명백히 더 효과적인 것으로 나타났다(도 9B, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이).
신경 성장 인자(Nerve Growth Factor, NGF): NGF는 가장-특징적인 뉴로트로핀(neurotrophin)으로, 말초 및 중추 신경 시스템에서 선택 신경세포의 생존 및 분화에서 주요 역할을 하는 것으로 알려진다. 이에 대한 1950 대 연구 이래, NGF는 진행성 신경퇴행성 질환들의 치료에 가능성을 나타냈다. 동물들에서, NGF는 허혈, 정신적 외상 및 독성 손상들 이후에 신경 말단 돌기의 성장 및 신경 회복을 증진시키는 것으로 알려진다. 우리는 실시간 PCR에 의해 NGF 유전자 발현 상태를 검사하고 당뇨병 동물들의 망막들에서 하향 조절(down regulation)을 발견하였다. RL 에 의한 치료는 이의 감소를 예방할 수 없지만, SL은 이의 하향 조절을 예방한다(도 10A, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). 면역형광법에 의해 추정되는 NGF 단백질 수치는 유사한 결과를 나타냈다. NGF 단백질의 면역형광 영상은 정상 통제 쥐 망막과 비교하여 당뇨병 쥐 망막에서 감소된 발현을 나타냈다(도 10B, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). SL 처리는 당뇨성 망막에서 NGF 단백질의 손실을 예방하는데, 이는 강한 NGF 양성 형광에 의해 지시된다. RL은 당뇨병 쥐 망막에서 NGF 단백질의 손실을 효과적으로 예방하지 못했다.
혈관 내피 성장 인자(Vaseular endothelial growth factor,VEGF): 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관형성(vasculogenesis) 및 혈관신생(angiogenesis)을 촉진하는 세포에 의해 생성되는 신호 단백질이다. 이는 혈액 순환이 불충분할 때, 조직에 산소 공급을 복구하는 시스템의 일부이다. VEGF가 과발현되면, 질병에 영향을 줄 수 있다. VEGF는 광범위한 망막 혈관확장의 원인이 되고, 혈액망막장벽을 파괴하며, 눈신생혈관(cular neovascularization)의 원인이 된다. VEGF에 대한 웨스턴 블로팅은 당뇨성 망막에서 VEGF 발현의 상향 조절을 지시한다(도 11, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). RL 및 SL 모두의 처리는 VEGF 과발현 유도된 당뇨병을 억제한다.
혈소판유래성장인자(Platelet-derived growth factor,PDGF): PDGF는 혈관형성에 중요한 역할을 하는 성장 인자로, 이미-존재하는 혈관 조직으로부터의 혈관이 성장한다. 몇몇의 연구들은 당뇨성 망막증을 갖는 환자들로부터의 유리체 표본에서 상승된 PDGF 농도를 나타냈다. VEGF와 같이 PDGF는 당뇨성 망막증에서 이상 혈관신생을 촉진하는 혈관신생촉진(proangiogenic) 성장 인자이다. 또한, PDGF는 당뇨성 망막증을 갖는 환자 내에서 망막앞막(epiretinal membranes)의 형성 및 수축(traction)을 촉진하여 견인 망막 박리(tractional retinal detachment)를 유도할 수 있다. 실제, 병리학적 망막 혈관신생에서 PDGF 신호에 대항하는 억제제의 개발은 안구 의약 개발의 활동 영역을 남긴다. PDGF에 대한 면역조직화학은 당뇨성 망막에서 단백질의 상향 조절을 지시한다(도 12, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). RL 및 SL 모두의 처리는 PDGF 과발현 유도된 당뇨병을 억제한다.
혈장 루테인: 생물학적 이용가능성에 대한 가용성 루테인 투여 효과를 이해하기 위하여, 카로테노이드의 혈장 수치가 HPLC 방법에 의해 측정되었다. 데이터는 정상 식이(AIN-93)로 공급된 쥐들의 혈장에서 검출불가능한 루테인 수치를 나타냈다. 혈장 루테인 수치는 일반 루테인과 가용성 루테인이 혼합된 AIN-93 식이가 공급된 쥐들에서 검출가능한 범위였다. 더욱 흥미로운 것은, SL 식이가 공급된 쥐들은 RL 식이 공급된 쥐들과 비교하여 7배 더 높은 루테인 수치를 포함하는 것을 나타났다. 이는 루테인의 생물학적 이용가능성을 증가시키는데 있어서 이 제형이 성공적이라는 것을 특히 확인시킨다.
도 13은 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이 역상 (RP)-HPLC에 의해 측정된 혈청 루테인 수치를 나타낸다. 값들은 평균±SEM으로 표시되었다. (n=6)., $$$<0.001 D+SL Vs. D+RL.
결론
쥐에게 루테인을 투여하는 것은 망막에서 당뇨병 유도된 이상증을 예방하였다. 루테인은 ERG에 의해 확인된 바와 같이 당뇨병 쥐들에서 상실되는 쥐의 망막 기능을 유지한다. 이는 또한 H & E 염색에 의해 행해지는 바와 같이 망막의 형태학적 연구에 의한 증거이다. 루테인은 로돕신 발현 및 망막 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하는 신경 성장 인자(NGF)가 감소하는 것을 예방하였다. 루테인은 스트레스 및 신생혈관형성에 관계되는 VEGF 및 PDGF의 과발현을 예방하였다. 흥미롭게, 가용성 루테인 처리된 쥐들은 일반 루테인과 비교하여 상당한 이점을 나타내었고, 증가된 혈장 수치에 의해 증가된 생물학적 이용가능성이 나타났다. 또한, 루테인의 항산화 및 항-염증성 포텐셜은 이의 유익한 효과에 기여한다. 따라서, 가용성 루테인은 당뇨성 망막증을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
실시예 3
영양유전체학(Nutrigenomics) 접근에 의한 당뇨성 망막증에서 UltraSol CurcuWin TM 효과
영양유전체학 접근에 의해 가용성 커큐민 (UltraSol CurcuWinTM) 의 효과가 망막상에의 이의 유익한 효과와 관련하여 당뇨병 쥐에서 관찰되었고 효과가 일반 커큐민과 비교되었다.
방법론
실시예 2에 언급된 것과 동일한다. 모든 동물들은 하기와 같이 네 개의 그룹으로 나뉘었다.
표 5
Figure pct00005
망막전위도검사법(Electroretinograph): 정상 통제 (C) 동물들과 비교하여 당뇨성 쥐에서 (D) OPs 진폭이 감소되었다 (334.2 ㎶). 또한, OPs 에 대한 내재 시간이 그룹-D 에서 증가된다는 것이 주목된다. 항산화 커큐민의 섭취는 OP 진폭 감소를 낮추는 결과를 가져오는데, 이는 OPs; RC (445.7), SC (455.3)의 합에 의해 제안된다. SC는 OPs의 합의 감소를 낮출 뿐 아니라 내재 시간을 정상화한다.
도 14는 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이 서로 다른 그룹들 및 총 진폭의 개별적인 동물들로부터 OPs의 파형을 나타낸다. C, 비 당뇨병 통제; D, 당뇨병 통제; D+RC, 당뇨병+ 일반커큐민; D+SC, 당뇨병+가용성 커큐민.
망막 모폴로지: 통제 쥐들 C 에서, 모든 망막층들은 완전하고 최대 망막 두께를 가지며, 또한 밀집된 INL 이고, INL 및 ONL 사이에서 구별가능한 분리(OPL) 이다. 반대로, 당뇨병 쥐 망막 (D)은 상당히 감소된 전체 망막 두께를 나타내고 또한 낮은 밀도 ONL 및 거의 융합된 INL 및 ONLs에 의해 두드러진다. 커큐민 처리는 당뇨성 망막에서 상당한 정도로 총 형태학적 변화를 예방하였다. 이 유효 성분의 가용성 제제는 일반 유효 성분보다 더 우수한 것으로 나타났는데, 이는 밀집된 ONLs에 의해 지시된다. 도 15는 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이, 망막 조직학을 나타낸다.
표 6: 서로 다른 그룹의 망막 층 두께(μ)
Figure pct00006
Lieca application suit, Leica, Switzerland 의 사용에 의해 측정된 망막 층 두께(μ)의 대표적 표. C, 비 당뇨병 통제; D, 당뇨병 통제; D+RC, 당뇨병+ 일반 커큐민; D+SC, 당뇨병+가용성 커큐민. GCL, 신경절세포층; IPL, 내부 얼기층; INL, 내부 핵층; OPL, 외부 얼기층; ONL, 외부 핵층; PRL, 광수용체층.
실-시간 PCR, 면역조직화학법 및 면역블러팅법에 의한 망막 마커들(유전자) 발현:
로돕신(Rho): 로돕신(Rho)은 망막 광수용체 세포 내 생물학적 색소로, 1차적으로 빛을 인식한다. 실시간 PCR로 정량화된 Rho 유전자의 mRNA 수치는 당뇨병 동물들의 망막에서 감소된 수치를 나타냈다. RL 및 SL에 의한 처리는 이의 감소를 예방하지만, SL 처리는 RC와 비교하여 더 이로운 효과를 가진다(도16A, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). 면역형광법에 의해 Rho 단백질 수치가 정량화되었는데, 이는 mRNA 수치과 일치한다. Rho 단백질의 면역형광 영상은 정상 통제 쥐 망막과 비교하여 당뇨병 쥐 망막에서 감소된 발현을 나타냈다. RL 및 SL에 의한 처리는 당뇨병 망막에서 Rho 단백질 발현의 손실을 예방하는데, 이는 강한 Rho 양성 형광에 의해 지시된다. 또한, SL은 각각의 당뇨병 동물들의 쥐 망막에서 Rho 단백질 발현의 손실을 예방하는데 있어서 RL 보다 명백히 더 효과적인 것으로 나타났다(도 16B, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이).
신경 성장 인자(NGF): NGF는 가장-특징적인 뉴로트로핀으로, 말초 및 중추 신경 시스템에서 선택 신경세포의 생존 및 분화에서 주요 역할을 하는 것으로 알려진다. 이에 대한 1950 대 연구 이래, NGF는 진행성 신경퇴행성 질환들의 치료에 가능성을 나타냈다. 동물들에서, NGF는 허혈, 정신적 외상 및 독성 손상들 이후에 신경 말단 돌기의 성장 및 신경 회복을 증진시키는 것으로 알려진다. 우리는 실시간 PCR에 의해 NGF 유전자 발현 상태를 검사하고 당뇨병 동물들의 망막들에서 하향 조절을 발견하였다. 일반 및 가용성 커큐민 모두에 의한 처리는 당뇨병 조건에서 NGF 유전자의 하향 조절을 예방하는데 동일한 이로운 효과를 나타냈다(도 17A, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). 면역형광법에 의해 추정되는 NGF 단백질 수치는 유사한 결과를 나타냈다. NGF 단백질의 면역형광 영상은 정상 통제 쥐 망막과 비교하여 당뇨병 쥐 망막에서 감소된 발현을 나타냈다(도 17B, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). RC 및 SC 처리는 당뇨성 망막에서 NGF 단백질의 손실을 예방하는데, 이는 강한 NGF 양성 형광에 의해 지시된다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF): 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관형성 및 혈관신생을 촉진하는 세포에 의해 생성되는 신호 단백질이다. 이는 혈액 순환이 불충분할 때, 조직에 산소 공급을 복구하는 시스템의 일부이다. VEGF가 과발현되면, 질병에 영향을 줄 수 있다. VEGF는 광범위한 망막 혈관확장의 원인이 되고, 혈액망막장벽을 파괴하며, 눈신생혈관의 원인이 된다. VEGF에 대한 웨스턴 블로팅은 당뇨성 망막에서 VEGF 발현의 상향 조절을 지시한다(도 18, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). RL 및 SL 모두의 처리는 VEGF 과발현 유도된 당뇨병을 억제한다.
혈소판유래성장인자(PDGF): PDGF는 세포 성장 및 분화를 조절하는 성장 인자이다. 특히, 이는 혈관형성(angiogenesis)에 중요한 역할을 하는 성장 인자로, 이미-존재하는 혈관 조직으로부터의 혈관이 성장한다. 몇몇의 연구들은 당뇨성 망막증을 갖는 환자들로부터의 유리체 표본에서 상승된 PDGF 농도를 나타냈다. VEGF와 같이 PDGF는 당뇨성 망막증에서 이상 혈관신생을 촉진하는 혈관신생촉진(proangiogenic) 성장 인자이다. 또한, PDGF는 당뇨성 망막증을 갖는 환자 내에서 망막앞막의 형성 및 수축을 촉진하여 견인 망막 박리를 유도할 수 있다. 실제, 병리학적 망막 혈관신생에서 PDGF 신호에 대항하는 억제제의 개발은 안구 의약 개발의 활동 영역을 남긴다. PDGF에 대한 면역조직화학은 당뇨성 망막에서 단백질의 상향 조절을 지시한다(도 19, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이). RC 및 SC 모두에 의한 처리는 PDGF 과발현 유도된 당뇨병을 억제한다. 가용성 커큐민은 일반 커큐민보다 더 효과적이었다(도 19, 명세서와 수반된 도면에서 도시되는 바와 같이)
결론
쥐에게 커큐민을 투여하는 것은 망막에서 당뇨병 유도된 이상증을 예방하였다. 커큐민은 ERG에 의해 검사된 바와 같이 당뇨병 쥐들에서 상실되는 쥐의 망막 기능을 유지한다. 이는 또한 망막의 다양한 층들의 두께가 측정되는, H & E 염색에 의해 평가되는 바와 같이 망막의 형태학적 연구에 의한 증거이다. 커큐민은 로돕신 발현 및 중요한 역할을 하는 신경 성장 인자(NGF)가 감소하는 것을 예방하였다. 커큐민은 스트레스 및 신생혈관형성에 관계되는 VEGF 및 PDGF의 과발현을 예방하였다. 흥미롭게, 가용성 커큐민 처리된 쥐들은 일반 커큐민과 비교하여 상당한 이점을 나타내었고, 이는 증가된 생물학적 이용가능성에 기인한 것으로 생각된다. 따라서, 가용성 커큐민은 당뇨성 망막증을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
이점들
1. 건조한 자유 유동성, 수용성/혼화성 형태의 친지질성 영양소의 제공.
2. 입자, 분말, 정제, 연고, 페이스트, 구강청결제, 가글, 샤셋, 캡슐의 형태 또는 음료 내에 낮은 수용성, 유성의, 친지질성 영양소를 전달하는 적절한 방법의 제공
3. 높은 생물학적 이용가능성을 갖는 낮은 수용성, 유성의, 친지질성 영양소의 제형(dosage form)을 제공
4. 본원의 조성물들은 혈당수치를 조절하는데 효과적이다.
5. 친지질성 영양소를 포함하는 본원의 조성물 및 방법은 당뇨성 망막증에서 무축삭세포(amacrine cells) 기능장애를 조절하는데 효과적이다.
6. 본원의 조성물은 당뇨성 망막증에서 망막층, 로돕신 수치 및 NGF 단백질 수치의 손실을 예방하는데 효과적이다.
7. 본원의 조성물은 당뇨성 망막증에서 당뇨병 유도된 PDGF 과발현을 억제하는데 효과적이다.
8. 본원의 조성물은 당뇨성 백내장에서 비-가용성 수정체 단백질의 축적을 예방하는데 효과적이다.
9. 본원의 조성물은 당뇨성 백내장의 수정체에서 소르비톨 수치의 축적을 예방하는데 효과적이다.
10. 본원의 조성물은 당뇨성 백내장에서 단백질 응집을 감소시키고 총 가용성 단백질의 프로파일을 정상화하는데 효과적이다.

Claims (17)

  1. 사람 소비에 안정하고, 영양 및 건강 증진 이점들을 위한 식이 보충제로서 특히 유용한 친지질성 영양소를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 눈 관련 당뇨 합병증은 백내장 및 망막증인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
    .
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 친지질성 영양소는 루테인 및 이의 이성질체들, 루테인 에스테르, 제아잔틴 이성질체들, 강황 추출물, 커큐민, 생강, 및 이의 유사체들 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 혈당수치를 조절하는데 효과적인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 당화헤모글로빈(glycosylated hemoglobin)(HbA1C) 수치를 조절하는데 효과적인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨성 망막증에서 무축삭세포(amacrine cells) 기능장애를 조절하는데 효과적인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  7. 제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨성 망막증에서 망막층, 로돕신 수치 및 NGF 단백질 수치의 손실을 예방하는데 효과적인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨성 망막증에서 당뇨병 유도된 PDGF 과발현을 억제하는데 효과적인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  9. 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨병 백내장에서 비-가용성 수정체 단백질의 축적을 예방하는데 효과적인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  10. 제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨성 백내장의 수정체에서 소르비톨 수치의 축적을 예방하는데 효과적인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  11. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨성 백내장에서 단백질 응집을 감소시키고 총 가용성 단백질의 프로파일을 정상화하는데 효과적인 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  12. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 친지질성 영양소; 안정제; 수용성 친수성 담체 및 선택적으로 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  13. 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 중량으로 적어도 80%의 전체 크산토필을 포함하고, 이 중에 트랜스-루테인 함량 80-95% w/w; (R,R)-제아잔틴 14-20% w/w; (R,S)-제아잔틴 0.01-1% w/w, 또는 트랜스-루테인 함량 80-95% w/w; (R,R)-제아잔틴 14-20% w/w, 및 크산토필/크산토필 에스테르; 또는 5-95% 커큐미노이드를 포함하는 커큐민을 포함하는 식물 추출물들/올레오레진으로부터 유래된 미량의 다른 카로테노이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  14. 제1항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 안정제는 아스코르브산(ascorbic acid), BHA, BHT, 팔미트산아스코빌(ascorbyl palmitate), 로즈마리(rosemary) 추출물, 혼합된 천연 토코페롤(mixed natural tocopherols), 알파 토코페릴아세테이트(alpha tocopheryl acetate), 소듐아스코베이트(sodium ascorbate), 카스터 오일 유도체(castor oil derivatives), 소듐라우릴설페이트(sodium lauryl sulfate) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 담체는 폴리에틸렌 글리콜 200(polyethylene glycol 200), 폴리에틸렌 글리콜 400(polyethylene glycol 400), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(propylene glycol), 글리세롤(glycerol), 소르비톨(sorbitol), 글루코스 시럽(glucose syrup), 콘 스티프 리쿼(corn steep liquor), 마니톨(mannitol), 폴리에틸렌 글리콜 6000(polyethylene glycol 6000), 폴리에틸렌 글리콜 10000(polyethylene glycol 10000), 폴리에틸렌 글리콜 20000(Polyethylene glycol 20000), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 하이드록시프로필메틸셀룰로스 (hydroxyl propyl methyl cellulose), 수크로스(sucrose), 글루코스(glucose), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 하이드록시프로필셀룰로스 (hydroxyl propyl cellulose), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 가용성 녹말, 가수분해 녹말(hydrolyzed starch) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  16. 제1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20(polysorbate 20), 폴리소르베이트 60(polysorbate 60), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 레시틴(lecithin), 수크로스 지방산 에스테르(sucrose fatty acid esters), 글리세릴 지방산 에스테르(glyceryl fatty acid esters), 소듐라우릴설페이트(sodium lauryl sulfate) 및 이들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.
  17. 제1항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 정제, 캡슐, 샤셋(sachets), 비들렛(beadlets), 미세캡슐화된 분말, 오일 서스펜션(oil suspensions), 액상 분산액, 펠렛(pellets), 연질 젤 캡슐, 츄어블 정제(chewable tablets) 또는 액상 제제(liquid preparations)의 형태인 친지질성 영양소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 눈 관련 당뇨 합병증의 발달 및 성숙을 지연시키는 방법.










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