CN103520515B - 鼓槌石斛提取物及其医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药学领域,特别是涉及一种治疗视网膜新生血管性疾病的鼓槌石斛提取物,它包含0.1~10wt%的毛兰素。本发明还涉及所述鼓槌石斛提取物的医药用途。
Description
技术领域
本发明涉及医药保健品领域,特别是涉及一种中药植物提取物及其医药用途。
背景技术
视网膜新生血管性疾病是指由于新生血管生长伴随出血、渗出、增生等病理性改变造成的致盲性玻璃体视网膜疾病,是世界范围内最严重的致盲性眼病之一,包括糖尿病性视网膜病变(Diabeticretinopathy,DR)、早产儿视网膜病变(Retinopathyofprematurity,ROP)、年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)、视网膜血管阻塞性疾病、视网膜静脉周围炎等。研究证实,血管内皮细胞的分化、增殖、迁移、微血管形成等活动是视网膜新生血管性疾病整个病理过程的中心环节,故而抑制血管内皮细胞增殖和新生血管生长是治疗这类疾病的关键。
糖尿病性视网膜病变(Diabeticretinopathy,DR)是糖尿病性微血管病变中最重要的表现之一,是一种具有特异性改变的眼底病变,是糖尿病的严重并发症之一。临床上根据是否出现视网膜新生血管为标志,将没有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为非增殖性糖尿病性视网膜病变(nonproliferativediabeticretinopathy,NPDR)(或称单纯型或背景型),而将有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy,PDR)。
石斛(Dendrobium)为兰科石斛属植物,其作为一种名贵中药在《本草纲目》中已有收载,在《神农本草经》中更是被列为上品,其具有滋阴清热、生津养胃、明目的功效。鼓槌石斛(DendrobiumchrysotoxumLindl.)是石斛一个重要品种,收载于中华人民共和国药典(2010版),具有益胃生津,滋阴清热的药效。鼓槌石斛提取物中含有的毛兰素(Erianin)是药典中鼓槌石斛之鉴别及含量测定的指标成分。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种治疗视网膜新生血管性疾病的鼓槌石斛提取物及其用途。
具体地说,本发明的第一方面是提供了一种治疗视网膜新生血管性疾病的鼓槌石斛提取物,它包含0.1~10wt%的毛兰素。
在一优选例中,其中所述的毛兰素的含量为0.6~1wt%。
在另一优选例中,其中所述的视网膜新生血管性疾病为增殖性糖尿病性视网膜病变。
本发明的第二方面是提供了所述的鼓槌石斛提取物在制备预防或治疗视网膜新生血管性疾病的药物或食品中的应用。
在一优选例中,其中所述的视网膜新生血管性疾病为增殖性糖尿病性视网膜病变。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述,本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1为视网膜局部放大图(100×),体现了CD31检测本发明的鼓槌石斛75%醇提物对STZ诱导DR大鼠及正常大鼠视网膜中新生血管的作用;
a.正常对照组;b.糖尿病视网膜病模型组;c.石斛75%醇提物30mg/kg;d.石斛75%醇提物100mg/kg;e.石斛75%醇提物300mg/kg;f.血管密度统计柱状图;
(Data=Mean±SEM,n=3-5,与Control组比较***P<0.001,与DRModel组比较###P<0.001);
图2为病理切片的H&E染色结果
a.正常对照组;b.糖尿病视网膜病模型组;c.鼓槌石斛75%醇提物(30mg/kg);d.鼓槌石斛75%醇提物(100mg/kg);e.鼓槌石斛75%醇提物(300mg/kg);
图3为视网膜局部放大图(100×),体现了CD31检测用不同溶剂提取的本发明的鼓槌石斛提取物对STZ诱导DR大鼠及正常大鼠视网膜中新生血管的作用;
a.正常对照组;b.糖尿病视网膜病模型组;c.75%乙醇提取物300mg/kg;d.50%乙醇提取物300mg/kg;e.20%乙醇提取物300mg/kg;f.乙酸乙酯提取物300mg/kg;g.丙酮提取物300mg/kg;h.石油醚:乙酸乙酯(1:1)提取物300mg/kg;i.血管密度统计柱状图;
Ext1:75%醇提取物300mg/kg组;Ext2:50%醇提物300mg/kg组;Ext3:20%醇提物300mg/kg组;Ext4:乙酸乙酯提取物300mg/kg组;Ext5:丙酮提取物300mg/kg组;Ext6:石油醚:乙酸乙酯(1:1)提取物300mg/kg组
(Data=Mean±SEM,n=3-5,与Control组比较***P<0.001,与DRModel组比较###P<0.001)。
具体实施方式
本发明的问世部分是基于这样一个意外发现:中药鼓槌石斛提取物可以显著抑制增殖性糖尿病性视网膜病变大鼠的视网膜血管新生。因此,该植物提取物可有望开发成为一种预防或者治疗视网膜新生血管性疾病的药物,这些疾病包括但不限于:糖尿病视网膜病变(Diabeticretinopathy,DR)、早产儿视网膜病变(Retinopathyofprematurity,ROP)、年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)、视网膜血管阻塞性疾病、视网膜静脉周围炎等。
进而,本发明的第一方面是提供了一种治疗视网膜新生血管性疾病的鼓槌石斛提取物,它包含0.1~10wt%的毛兰素。
较优选地,其中所述的毛兰素的含量为0.6~1wt%。
较优选地,其中所述的视网膜新生血管性疾病为增殖性糖尿病性视网膜病变。
本发明的第二方面是提供了所述的鼓槌石斛提取物在制备预防或治疗视网膜新生血管性疾病的药物或食品中的应用。
较优选地,其中所述的视网膜新生血管性疾病为增殖性糖尿病性视网膜病变。
如本领域的技术人员所知,作为药典中鼓槌石斛之鉴别及含量测定的指标成分,毛兰素(Erianin)具有如下结构式:
其中
本发明的鼓槌石斛提取物可通过商业途径从Sigma化学公司、成都曼斯特生物科技有限公司等处购买获得,亦用本领域的常规方法从鼓槌石斛中提取获得,例如:将鼓槌石斛药材打粉,用50%乙醇、75%乙醇、丙酮、乙酸乙酯或石油醚:乙酸乙酯(1:1)等回流提取制得。本发明的鼓锥石斛提取物中毛兰素的含量为0.1~10wt%,优选的含量为0.6~1wt%。
本发明的鼓槌石斛提取物可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的鼓槌石斛提取物及可药用载体。较佳地,本发明的药物组合物含有0.1-99.9%重量百分比的作为活性成分的本发明的鼓槌石斛提取物。“可药用载体”不会破坏本发明的鼓槌石斛提取物的药学活性,同时其有效用量,即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。
所述可药用载体包括但不限于:软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
本发明的鼓槌石斛提取物以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等;非肠道给药制剂包括注射液等;局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。
本发明的鼓槌石斛提取物以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。
除了制成药剂之外,亦可在本发明的鼓槌石斛提取物中加入抗氧化剂、色素、酶制剂等各种食品添加剂,按本领域的常规方法制成保健食品。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1鼓槌石斛75%乙醇提取物中毛兰素(Erianin)含量的测定
1.1实验材料和方法
鼓槌石斛75%醇提物的制备:取鼓槌石斛药材1000g,加10倍量75%乙醇,加热回流提取3次,每次3小时,合并提取液,减压浓缩除去溶剂,得到浸膏。称重。
供试品溶液的制备:精密称取石斛提取物浸膏容量瓶中,加入80%甲醇,超声溶解,过0.22μm微孔滤膜制成50μg/ml的溶液。
Erianin含量测定:
色谱条件:WatersBEHC18(100mm×2.1mm,1.7μm),流动相A水,流动相B乙腈,柱温45℃,进样量5μl
质谱条件:
离子源:电喷雾离子源(ESI),正离子模式;
毛细管电压:3.20kV;
锥孔电压:30V;
离子源温度:150℃;
去溶剂化温度:400℃;
去溶剂化气流(氮气):500L/h;
锥孔气流(氮气):50L/h
1.2实验结果
表1.鼓槌石斛75%醇提物中Erianin的百分含量
从实验结果可见,鼓槌石斛75%醇提物中还有较多毛兰素(Erianin)。
实施例2:鼓槌石斛75%醇提物改善糖尿病视网膜病的药效活性
2.1实验材料
动物:SPF级SD大鼠,雄性,体重180~220g,购自中国科学院上海实验动物中心。动物合格证编号:SCXK(沪)2012-0002。饲养于上海中医药大学SPF级动物房,饲养一周后使用。饲养条件为:温度22±1℃,湿度55±5%,12小时光暗循环,饲料与水消毒后自由摄取。实验严格按照国家和上海中医药大学动物中心动物使用管理条例进行。
鼓槌石斛75%醇提物的制备:取鼓槌石斛药材1000g,加10倍量75%乙醇,加热回流提取3次,每次3小时,合并提取液,减压浓缩除去溶剂,得到浸膏。称重。(同实施例1)
药物的配制:取适量石斛75%醇提物浸膏,放于研钵内,加0.5%CMC-Na,分别配制成高剂量溶液:30mg/ml、中剂量溶液:10mg/ml、低剂量溶液:3mg/ml。
动物实验:
(1)将0.1M柠檬酸溶液与柠檬酸三钠溶液以14:11的比例混匀,调混合液PH至4.3-4.5,待用。称取适量STZ粉末,避光溶解,使之成为65mg/ml的溶液,立即给予已禁食12h的大鼠腹腔注射,0.1ml/100g,最终给予STZ的剂量为65mg/kg。
(2)i.p一周后用割尾法测大鼠血糖浓度,血糖值≥16.7mmol/L(250mg/dl)视为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为4组:DR模型组(DRmodel组)、石斛75%醇提物30mg/kg组、石斛75%醇提物100mg/kg组、石斛75%醇提物300mg/kg组,每组12只。另外未i.pSTZ的12只正常SD大鼠作为正常组(Control组)。每两周检测体重变化,每月检测血糖变化。
(3)造模成功2.5个月后开始给药,灌胃,1ml/100g,石斛75%醇提物30mg/kg组、石斛75%醇提物100mg/kg组、石斛75%醇提物300mg/kg组分别给予不同浓度的石斛75%醇提物0.5%CMC-Na溶液,终剂量分别为:30mg/kg、100mg/kg、300mg/kg,Model组给予同体积的0.5%CMC-Na,给药1.5个月后处死,取视网膜观察视网膜新生血管情况,视网膜病理切片H&E染色观察,并取血清进行Elisa实验,检测细胞因子的变化。
视网膜铺片CD31免疫荧光检测鼓槌石斛75%醇提物对糖尿病视网膜病大鼠视网膜血管新生治疗情况:
(1)视网膜分离:将处死后大鼠的眼球取下,固定于4%多聚甲醛(inPBS)中,4℃过夜。在解剖镜下将视网膜剥离,PBS中略漂洗3-4次。
(2)封闭:将漂洗后的视网膜放入装有BlockingBuffer(5%BSA,0.5%TrixtonX-100inPBS)的1.5mlEpp管中,常温摇床慢摇孵育3h。
(3)一抗孵育:将封闭好的视网膜放于CD31一抗反应液中(抗体1:200稀释,抗体稀释液为1%BSA,0.5%TrixtonX-100inPBS),4℃摇床慢摇孵育1~2天。
(4)洗涤一抗:以WashBuffer(0.5%TrixtonX-100inPBS)在室温下摇床上清洗6次,每次20min。
(5)二抗孵育:将视网膜封入含FITCconjugatedanti-RatIgG的二抗反应液中(1:200稀释),室温避光孵育2h。
(6)洗涤二抗:以WashBuffer(0.5%TrixtonX-100inPBS)在室温下摇床上避光清洗6次,每次20min。
(7)封片:在解剖镜下将视网膜铺于载玻片上,剪开成花瓣状,滴加数滴抗荧光猝灭剂,以Gelatinmoutinsolution(2g/mlGelatin)封片,盖上盖玻片。
(8)拍照:将视网膜免疫荧光铺片稍晾干后于荧光显微镜下拍照,观察视网膜中血管新生情况。
(9)血管密度计数:选取CD31免疫荧光照片(200×),每个组选3-5张照片,计算照片中心点横竖对称轴上的血管数目作为血管密度。
2.2实验结果
2.2.1鼓槌石斛75%醇提物对糖尿病大鼠血糖和体重的影响
从表2可见,鼓槌石斛75%醇提物各剂量组均不能改善糖尿病大鼠体重的减轻,而高剂量和低剂量可以轻微减弱升高的血糖,但不是很明显。说明鼓槌石斛75%醇提物没有明显改善糖尿病的药效活性。
表2鼓槌石斛75%醇提物对糖尿病大鼠血糖和体重的影响
aP<0.001与正常相比,bP<0.05,cP<0.01,dP<0.001与模型相比
2.2.2鼓槌石斛75%醇提物对糖尿病大鼠视网膜血管新生的影响
从图1可见:糖尿病大鼠视网膜中血管明显新生,而鼓槌石斛75%醇提物各剂量组可以明显抑制视网膜的血管新生,同时石斛夜光丸对此也有一定的抑制作用。
2.2.3病理切片染色结果
从病理切片染色结果(图2)可见:糖尿病视网膜病模型组可见明显的血管新生,而各剂量组鼓槌石斛75%醇提物均可以抑制视网膜中的血管新生。
实施例3鼓槌石斛50%乙醇提取物中毛兰素(Erianin)含量的测定
3.1实验材料和方法
鼓槌石斛50%醇提物的制备:取鼓槌石斛药材1000g,加10倍量50%乙醇,加热回流提取3次,每次3小时,合并提取液,减压浓缩除去溶剂乙醇,得到浸膏。称重。
其它材料和方法同实施例1.1
3.2实验结果
表3.鼓槌石斛50%乙醇提取物中Erianin的百分含量
实施例4鼓槌石斛20%乙醇提取物中毛兰素(Erianin)含量的测定
4.1实验材料和方法
鼓槌石斛20%醇提物的制备:取鼓槌石斛药材1000g,加10倍量20%乙醇,加热回流提取3次,每次3小时,合并提取液,减压浓缩除去溶剂乙醇,得到浸膏。称重。
其它材料和方法同实施例1.1
4.2实验结果
表4.鼓槌石斛20%乙醇提取物中Erianin的百分含量
实施例5鼓槌石斛丙酮提取物中毛兰素(Erianin)含量的测定
5.1实验材料和方法
鼓槌石斛丙酮提取物的制备:取鼓槌石斛药材1000g,加10倍量丙酮,加热回流提取3次,每次3小时,合并提取液,减压浓缩除去溶剂丙酮,得到浸膏。称重。
其它实验材料和方法同实施例1.1
5.2实验结果
表5.鼓槌石斛丙酮提取物中Erianin的百分含量
实施例6鼓槌石斛乙酸乙酯提取物中毛兰素(Erianin)含量的测定
6.1实验材料和方法
鼓槌石斛乙酸乙酯提取物的制备:将实施例1中的鼓槌石斛醇提物用乙酸乙酯等体积萃取8次,合并萃取液,减压浓缩除去溶剂乙酸乙酯,得到浸膏。称重。
其它实验材料和方法同实施例1.1
6.2实验结果
表6.鼓槌石斛乙酸乙酯提取物中Erianin的百分含量
实施例7鼓槌石斛石油醚:乙酸乙酯(1:1)提取物中毛兰素(Erianin)含量的测定
7.1实验材料和方法
鼓槌石斛石油醚:乙酸乙酯(1:1)提取物的制备:将实施例1中的鼓槌石斛醇提物用石油醚:乙酸乙酯(1:1)等体积萃取8次,合并萃取液,减压浓缩除去溶剂石油醚和乙酸乙酯,得到浸膏。称重。
7.2实验结果
表7.鼓槌石斛石油醚:乙酸乙酯(1:1)提取物中Erianin的百分含量
实施例8不同溶剂提取的鼓槌石斛提取物改善糖尿病视网膜病的药效活性
8.1实验材料
动物:同实施例1。
不同溶剂提取的鼓槌石斛提取物的制备:同实施例1、实施例3~7。
药物的配制:取适量提取物浸膏,放于研钵内,加0.5%CMC-Na,分别配制成30mg/ml。
动物实验:
(1)将0.1M柠檬酸溶液与柠檬酸三钠溶液以14:11的比例混匀,调混合液PH至4.3-4.5,待用。称取适量STZ粉末,避光溶解,使之成为65mg/ml的溶液,立即给予已禁食12h的大鼠腹腔注射,0.1ml/100g,最终给予STZ的剂量为65mg/kg。
(2)i.p一周后用割尾法测大鼠血糖浓度,血糖值≥16.7mmol/L(250mg/dl)视为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为5组:DR模型组(DRmodel组)、75%醇提取物(Ext1)300mg/kg组、20%醇提物(Ext2)300mg/kg组、乙酸乙酯提取物(Ext3)300mg/kg组、丙酮提取物(Ext4)300mg/kg组,石油醚:乙酸乙酯(1:1)提取物(Ext5)300mg/kg组,每组12只。另外未i.pSTZ的12只正常SD大鼠作为正常组(Control组)。
(3)造模成功2.5个月后开始给药,灌胃不同溶剂提取的石斛提取物(300mg/kg)的0.5%CMC-Na溶液,Model组给予同体积的0.5%CMC-Na,给药1.5个月后处死,取视网膜观察视网膜新生血管情况。
视网膜铺片CD31免疫荧光检测鼓槌石斛提取物对糖尿病视网膜病大鼠视网膜血管新生治疗情况:同实施例1。
8.2实验结果
从图3可见:糖尿病大鼠视网膜中血管明显新生,而鼓槌石斛的75%乙醇提取物、50%乙醇提取物、石油醚:乙酸乙酯(1:1)提取物、乙酸乙酯提取物以及丙酮提取物均能不同程度明显降低视网膜的血管新生,而20%乙醇提取物则没有明显的抑制活性。其中各提取物抑制糖尿病大鼠视网膜血管新生的药效活性从高至低排序如下:石油醚:乙酸乙酯(1:1)提取物>乙酸乙酯提取物>丙酮提取物>75%乙醇提取物>50%乙醇提取物。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而,应理解的是,在不偏离本发明精神之前提下,本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰,所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
Claims (2)
1.鼓槌石斛提取物在制备治疗视网膜新生血管性疾病的药物或食品中的应用,所述鼓槌石斛提取物包含0.1~10wt%毛兰素。
2.如权利要求1所述的鼓槌石斛提取物的用途,其中所述的视网膜新生血管性疾病为增殖性糖尿病性视网膜病变。
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石斛中联苄类化合物抗血管新生活性研究;沈凯凯等;《时珍国医国药》;20111231;第22卷(第4期);919-921 * |
鼓槌石斛中抗癌成分毛兰素的含量测定研究;夏克中等;《中国现代应用药学杂志》;20080228;第25卷(第1期);63-67 * |
鼓槌石斛生长发育规律研究;唐德英等;《中草药》;20061031;第37卷(第10期);1572-1574 * |
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