KR101122786B1

KR101122786B1 - 마데카소시드 및 터미놀로시드가 풍부한 센텔라 아시아티카추출물의 제조 방법

Info

Publication number: KR101122786B1
Application number: KR1020057010638A
Authority: KR
Inventors: 알라인 로이소우; 게라르드 세느; 에릭 테론
Original assignee: 바이엘 컨수머 케어 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2003-12-10
Publication date: 2012-04-12
Also published as: ATE439852T1; US20120178706A1; JP2006516962A; US20060106206A1; US8486900B2; CA2509421A1; JP4643275B2; US7402669B2; US8163706B2; KR20110132629A; DE60328912D1; AU2003296799A1; WO2004062678A1; ES2329568T3; EP1569672A1; EP1569672B1; KR20060069349A; CA2509421C; FR2848117A1; US20080118581A1

Abstract

본 발명은 마데카소시드, 터미놀로시드 및 선택적으로 아시아티코시드의 혼합물을 포함하는 추출물의 제조 방법, 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물을 추출물의 총중량에 상대적인 양으로 75 중량% 이상을 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물, 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 추출물의 총중량에 상대적인 양으로 95 중량% 이상을 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물, 이들을 염증 메커니즘의 조절용으로 사용하는 용도에 관한 것이다.

Description

마데카소시드 및 터미놀로시드가 풍부한 센텔라 아시아티카 추출물의 제조 방법 {Method for preparing a Centella asiatica extract rich in madecassoside and in terminoloside}

본 발명은 마데카소시드, 터미놀로시드 및 적합한 경우에는 아시아티코시드의 혼합물을 포함하는 추출물; 그 추출물의 총중량에 상대적인 양으로 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물을 75 중량% 이상 포함하는 센텔라 아시아티카 추출물; 및 그 추출물의 총중량에 상대적인 양으로 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물을 95 중량% 이상 포함하는 센텔라 아시아티카 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 염증 메카니즘의 조절에 사용하는 용도에 관한 것이다.

센텔라 아시아티카 (Centella asiatica)는 또한 바이올렛 마로네 (리유니온 아일랜드)로, 고투 콜라 (Gotu Kola) 또는 인도 페니워트 (인도)로, 또는 센텔라 리팬더 (북아메리카)로 및 탈라페트라카 (마다가스카르)로 알려진 것으로서, 600 미터의 이상적인 고도에 있는 습지 및 음지의 야생에서 자라는 다형태성 초목이다.

센텔라 아시아티카는 산형과 (Umbelliferae/Apiaceae), 특히 히드로코틸 (Hydrocotyle)과에 속한다. 센텔라는 식물의 속명에 해당하는 반면, 아시아티카는 그 종명에 해당한다. 센텔라 아시아티카는 티피카 (Typica), 아비시니카 (Abyssinica) 및 플로리다나 (Floridana)로 불리는 3개의 변종을 포함한다. 센텔라 아시아티카는 3,000년 이상 동안 알려져 왔다, 마다가스카르, 인도, 중국, 아메리카 인도 또는 인도네시아 의약에 사용되어 왔다. 센텔라 아시아티카는 국가에 따라 다양한 용도를 가졌다. 그것은 특히 치료, 진정작용성, 진통성, 항우울성, 항바이러스성 및 항균성에 유용하다. 센텔라 아시아티카는 국부적으로 또는 경구적으로 사용하는 것이 일반적이다. 역설적으로, 현대 서양 의약에 센텔라 아시아티카의 출현은 지연되었는데, 1884년에 코덱스에만 도입되었고, 1941년에 최초의 건성 추출물이 제조되었다.

센텔라 아시아티카의 활성 제제는 제닌 형태의 펜타시클릭 트리테르펜이다; 상기 제제는 아시아트산 (화학식 I) 및 마데카스산 (화학식 II) 및 그 헤테로시드이며; 상기 제제는 또한 아시아티코시드 (화학식 III) 및 마데카소시드 (화학식 IV)이다.

아시아티코시드, 마데카소시드, 아시아트산 및 마데카스산 분자는 식물의 자연 방어 작용에 기여한다. 센텔라 아시아티카 활성 제제를 산업적으로 충분히 이용할 수 있기 위해서는, 식물을 야생 상태로 수집하는 것이 필수적이며, 이러한 내한성 식물이 높은 트리테르펜 함량을 갖는 데에는 환경적 긴장이 필요하다.

센텔라 아시아티카 헤테로시드, 마데카소시드 및 아시아티코시드는 본질적으로 우기에 합성되는 식물의 마데카스산 및 아시아트산의 저장 형태를 이루는 당-함유 복합체이다. 박테리아, 효모 또는 진균류의 식물에 대한 공격은 제닌 방출성 히드롤라제를 활성화한다. 트리테르펜 분자가 콜라겐 합성에 대한 그 조절적 및 활성적 작용으로 인해 특히 유용하다. 센텔라 아시아티카로부터 추출한 제닌 및 헤테로시드는 구체적으로 콜라겐 1 및 3의 합성을 촉진한다. 이들 활성 제제는 주로 치료를 용이하게 하기 위한 약학 분야에 및 정맥 부전의 치료에 사용된다. 이들은 주름살 제거제 및 안티셀룰라이트제로서 화장품 분야에 사용된다. 종래 기술에 가장 흔희 사용된 센텔라 아시아티카의 활성 제제는 아시아트산 및 마데카스산 및 아시아티코시드이다. 마데카소시드는 수용성이 높기 때문에, 가장 통상적으로 지용성 활성 제제의 추출을 위한 통상적인 방법에서 세척수에 흡수된다.

종래 기술의 방법은 아시아티코시드 및 마데카소시드의 혼합물을 얻을 수 있게 한다. 상기 혼합물은 그 총중량에 상대적인 양으로 약 25 중량%의 아시아티코시드, 60 중량%의 마데카소시드 및 주로 지방산 및 오시드로 구성되는 15 중량%의 부산물을 포함한다. 종래 기술의 다른 방법은 추출물의 총중량에 상대적인 양으로 81 중량% 순도의 마데카소시드를 얻을 수 있게 하는데, 상기 추출물은 또한 마데카소시드의 유사 이성질체, 지방산, 주로 리놀레산, 리놀렌산, 팔미틴산 또는 올레인산, 및 오시드와 같은 당을 포함한다.

놀랍게도, 본 출원인은 마데카소시드, 아시아티코시드와, 터미놀로시드로 불 려져 왔던 신규의 분자의 혼합물로서 그 총중량에 상대적인 양으로 75 중량% 이상의 순도를 가진 혼합물과, 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물로서 그 총중량에 상대적인 양으로 95 중량% 이상의 순도를 가진 혼합물을 얻을 수 있게 하는 추출물의 신규한 방법을 개발하였다. 이와 유사하게, 본 출원인은 마데카소시드, 터미놀로시드 및 적절한 경우에는 아시아티코시드의 혼합물을 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물을 발견하였다.

놀랍게도, 본 출원인은 또한 센텔라 아시아티카의 땅 위 부분으로부터 추출되는 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 염증 메카니즘의 조절용 약제에 사용할 수 있음을 발견하였다.

또한, 센텔라 아시아티카의 땅 위 부분으로부터 추출되는 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물을 피부의 조기 노화의 방지 및 지연용 화장품 조성물에 사용할 수 있다.

본 발명에서, "터미놀로시드 (terminoloside)"란 용어는 하기 화학식 V의 일반 명칭인 1-[O-α-L-람노피라노실-(1-4)-O-β-글루코피라노졸-(1-6)]-O-β-D-글루코피라노즈 2α,3β,6β,23-테트라히드록시올레아-12-엔-28-오에이트의 화학 분자이다:

상기 분자는 마데카소시드와 동일한 당 시리즈, 즉 글루코스-글루코스-람노스 시리즈를 가진다. 터미놀로시드의 테르펜 고리의 구조는 하기 화학식 VI의 터미놀산의 테르펜 고리의 구조에 해당한다:

따라서, 터미놀로시드는 마데카소시드의 위치 이성질체이다. 이 분자는 종래 기술에서는 분리된 적이 없다. 또한, 터미놀로시드는 센텔라 아시아티카의 가능한 추출물로서 언급된 바 없으며, 결국 센텔라 아시아티카로부터 터미놀로시드를 추출하는 방법은 알려진 바 없다.

아시아티코시드의 미검출된 이성질체가 존재하는 것도 추정할 수 있다. 따라서, 본 발명에서, "아시아티코시드 (asiaticoside)"란 용어는 화학식 III의 화학 분자, 가능하게는 그것이 존재하는 경우 그 올렌산 이성질체 중 하나와의 혼합물로 서의 그것을 의미하고자 하는 것이다.

본 발명의 명세서에서, "2종 혼합물 (binary mixture)"이란 표현은 주로 마데카소시드 및 터미놀로시드를 포함하는 혼합물을 의미하고, 이 혼합물은 실제로 아시아티코시드를 포함하지 않으며, "3종 혼합물 (ternary mixture)"이란 표현은 주로 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드를 포함하는 혼합물을 의미한다.

따라서, 본 발명의 주제는 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물을 포함하는 추출물을 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법이다:

a) 알콜 용매에 의해 센텔라 아시아티카의 땅 위 부분을 추출하는 단계;

b) 단계 a)에서 얻은 알콜 용액을 음이온성 수지 상으로 통과시키는 단계;

c) 단계 b)에서 얻은 용출액을 액체/액체 추출법에 의해 선택적으로 탈지시키는 단계;

d) 탈지된 수성-알콜 상을 연속 여과에 의해 수성 상으로 농축시키는 단계;

e) 단계 d)에서 얻은 수성 상을 양이온성 수지 상으로 및 이어서 음이온성 수지 상으로 연속 통과시키는 단계; 및

f) 단계 e)에서 얻은 수성상을 알콜의 첨가에 의해 안정화시켜 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계.

본 발명의 주제는 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 포함하는 추출물을 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법이다:

e) 단계 d)에서 얻은 수성 상을 양이온성 수지 상으로 및 이어서 음이온성 수지 상으로 연속 통과시키는 단계;

f) 단계 e)에서 얻은 수성상을 알콜의 첨가에 의해 안정화시키는 단계;

g) 단계 f)에서 얻은 예비 정제된 수성-알콜 상을 선택적으로 크로마토그래피하는 단계; 및

h) 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 그 최종 형태로 회수하는 단계.

센텔라 아시아티카 식물의 활성 성분 (active principle)의 추출은 식물의 땅 위 부분을 사용하여 수행하는 것이 유리한데, 그 주요한 목적은 그 뿌리를 손상시키지 않고, 따라서 이러한 내한성 식물의 자연적 재생을 가능하게 하는 것이다.

본 발명에 따른 방법의 유용한 변형예에서는, 땅 위 부분을 추출 단계 전에 알콜 용매에서 연화시킨다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 알콜 용매는 에탄올 및 특히 70% 에탄올과 같이 당업자가 통상 사용하는 것들이다. 이렇게 얻은 알콜 용액은 음이온성 수지 상으로 통과시켜서 정제한다 (단계 b). 본 발명에 따른 방법에 사용되는 음이온성 수지로는 4차 암모늄 형태의 작용기를 가진 강 음이온성 수지가 유용하다. 음이온성 수지 상으로 상기 알콜 용액을 통과시킴으로써, 음이온성 부산물, 특히 페놀성 물질을 포집할 수 있다.

본 발명의 방법이 유용한 변형예에 따르면, 단계 a) 이후에 얻은 알콜 용액은 음이온성 수지 상으로 통과시키기 전에 정화시킨다. 이러한 유용한 정화 (clarification) 단계는 상기 알콜 용액 외에도 수산화나트륨 용액 및 활성탄과 같은 강염기 용액을 포함한다. 강염기의 첨가로 침전이 일어나며, 따라서 금속과, 상기 강염기와 반응할 수 있는 기타 물질이 여과에 의해 제거된다. 또한, 활성탄의 첨가로, 알콜 용액을 정제에 의해 탈색시키고, 지방산 또는 산화 산물을 고정시킨다.

정화 단계가 선행하는 것이 유리한, 수지 상으로 통과시키는 것으로 이루어진 단계 b)에 이어서, 얻어진 용출액을 상기 지방 분획과 관련하여 정제한다. 이를 위해 액체/액체 추출을 수행한다. 사용된 추출 용매는 헵탄과 같은 알칸이 유용한 비극성 용매이다. 당업자에게 공지된 임의의 액체/액체 추출 방법을 본 발명에 따른 방법에 적용할 수 있다. 구체적으로, 상기 추출법은 원심분리일 수 있다. 마데카소시드는 수용성이기 때문에, 수성-알콜 상이 회수된다.

이렇게 얻은 수성-알콜 상을 농축하여 수성 상으로 만들고, 연속적으로, 유용하게는 일렬로 수차례 여과하여 수성 상에서 불용성인 화합물을 침전시킨다.

본 발명에 따른 방법의 상기 제1 단계에 이어서, 센텔라 아시아티카의 두개의 공지된 헤테로시드, 즉 아시아티코시드 및 마데카소시드와 터미놀로시드가 가용성인 수성 상이 얻어진다. 이 수성 상을 양이온성 수지 상에서 및 이어서 음이온성 수지 상에서 연속 통과시켜 정제한다. 양이온성 수지 상에서 및 이어서 음이온성 수지 상에서의 연속 통과로 구성되는 상기 단계는 본 발명에 따른 방법의 필수 단계이다. 사용된 양이온성 수지로는 설포네이트 형태의 작용기를 가진 강 양이온성 수지가 유용하다. 사용된 음이온성 수지로는 4차 암모늄 형태의 작용기를 가진 강 음이온성 수지가 유용하다. 본 발명에 따른 방법에서, 이온 교환 수지의 종류가 잔류 산 분획의 결합을 향상시키기 위해서 중요하다.

본 발명의 유용한 변형예에 따르면, 단계 e)의 양이온성 및 이어서 음이온성 수지 상에서의 연속 통과에 이어서 단계 f) 이전에, 얻어진 수성 상은 활성탄을 통과시키기도 한다. 따라서, 활성탄은 용액의 착색 작용을 하는 2차 페놀성 화합물을 흡수할 수 있게 한다.

본 발명의 또 다른 유용한 변형예에 따르면, 단계 e)에 이어서 단계 f) 이전에 그리고 선택적으로 활성탄 상으로의 통과로 이루어진 단계에 이어서 얻어지는 수성 상은 하나 이상의 농축 단계를 진행한다.

단계 e)에 이어서, 선택적으로 활성탄 상으로의 통과 및/또는 탈색 후에 얻어진 수성 상은 알콜의 첨가에 의해 안정화시킨다 (단계 f)). 이어서, 예비 정제된 수성-알콜 상이 얻어지는데, 이것은 센텔라 아시아티카 및 터미놀로시드의 두 개의 공지된 헤테로시드가 가용성인 것이다. 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물은 그 총중량에 상대적인 양으로 75 중량% 이상의 순도로 얻어지는 것이 유용하다.

다음에 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드를 포함하는 단계 f)에서 얻어진 예비 정제된 수성-알콜 상은 선택적인 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 선택적 크로마토그래피 기법은 당업자에게는 널리 알려져 있다. 이것은 그 친화도에 따라 분자를 정지상과 분리하는 것이 가능하게 한다. 이러한 선택적 크로마토그래피는 마데카소시드 및 터미놀로시드로 구성되는 혼합물로부터 아시아티코시드를 분리할 수 있게 한다.

본 발명에서, 선택적 크로마토그래피 중에 사용된 용리액은 극성 용매이다. 이 용매는 물/에탄올 비율이 50/50 내지 90/10 부피/부피이고, 통상 75/25 부피/부피인 물과 에탄올의 혼합물인 것이 유용하다.

본 발명에서, 선택적 크로마토그래피 중에 사용된 정지상은 비극성 정지상이다. 정지상은 그래프트된 비극성 실리카로 구성되는 것이 유용하다. 비극성 그래프트는 탄소수가 2 내지 18개인 것이 유용하고, 12 내지 18개인 것이 더 유용하다.

상기 방법의 상기 단계들, 즉 단계 h)까지 이후에, 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물이 얻어진다. 이 혼합물은 마데카소시드: 터미놀로시드의 비가 30 내지 70 중량%인 것이 유용하고, 40 내지 60 중량%인 것이 더 유용하다. 상기 혼합물은 그 총중량에 상대적인 양으로 95 중량% 이상의 순도로 얻어지는 것이 유용하다. 상기 2종 혼합물은 실제로 아시아티코시드를 더 이상 포함하지 않는다 (단지 거의 미량으로만 존재할 수 있음).

본 발명의 주제는 또한 상기한 바와 같은 방법에 의해 얻을 수 있고 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 95 중량% 이상 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물이다. 존재하는 불순물은 구체적으로 지방산이다. 본 발명의 유용한 변형예에 따르면, 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물은 총중량비와 관련하여 마데카소시드의 질량비가 30 내지 70 중량%, 유용하게는 40 내지 60 중량%의 마데카소시드를 가진다. 본 발명에 따른 추출물로는 항염증제 및 면역조절제가 유용하다.

본 발명의 또 다른 유용한 변형예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 또한 본 발명에 따른 센텔라 아시아티카의 초순도 추출물, 즉 단계 h)에 이어서 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 순도 95% 이상의 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물 (2종 혼합물)의 적당량의 첨가에 의해, 단계 f)에 이어서 얻은 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물 (3종 혼합물)을 표준화하여 이렇게 얻어진 최종 추출물이 그 총중량에 상대적인 양으로 순도 90 내지 98 중량%가 되도록 하는 것으로 이루어진 대등 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 3종 혼합물은 2종 혼합물의 첨가에 의해 표준화하여 이렇게 얻어진 최종 추출물을 그 총중량에 상대적인 양으로 순도 90 내지 98 중량%의 범위 내에 고정시킨다. 예컨대, 순도 90%의 최종 추출물을 얻기 위해서는 2종 혼합물 1부를 3종 혼합물 1부와 혼합시키고; 98%의 최종 순도를 얻기 위해서는 2종 혼합물 9부를 3종 혼합물 1부와 혼합시킬 수 있다.

본 발명의 주제는 또한 본 발명에 따른 방법의 표준화 단계 이후에 얻을 수 있고 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물 (표준화된 3종 혼합물)을 75 중량% 이상, 유용하게는 85 중량% 이상 포함하는 표준화된 센텔라 아시아티카 추출물이다. 센텔라 아시아티카의 이러한 표준화된 추출물에서, 아시아티코시드: (마데카소시드 + 터미놀로시드)의 질량비는 5:95 내지 25:75 사이인 것이 유용하다. 아시아티코시드의 질량%가 너무 크면, 상 분리의 위험이 있다. 마데카소시드 및 터미놀로시드로 구성되는 혼합물은 약 25 중량의 아시아티코시드까지 용해시킬 수 있는 수용성이다. 센텔라 아시아티카의 이러한 표준화된 추출물에서, 마데카소시드: 터미놀로시드)의 질량비는 30:70 내지 70:30 사이인 것이 유용하다.

본 발명의 주제는 또한 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 95 중량% 이상 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물 또는 전술한 센텔라 아시아티카의 표준화된 추출물과, 약학적으로 허용 가능한 지지체를 포함하는 약물이다. 실제적인 약리학적 이유로, 3종 혼합물보다는 2종 혼합물이 약제로서 바람직하게 사용된다.

마데카소시드 및 터미놀로시드는 구체적으로 피부의 플로라 (flora)와 접촉시에 가수분해되어 마데카스산 및 터미놀산이 될 수 있다. 그러나, 이들 각각의 산은 면역조절적 활성을 나타내지 않는다.

박테리아 또는 바이러스와 같은 외래 원인체가 우리의 몸으로 들어가면, 우리 몸은 면역계로 불리는 방어계를 개시하여 그 원인체와 싸운다. 면역계는 그 자신의 유기체는 파괴하지 않으면서 외래 원인체를 제거하여야 한다. 자가면역 질병에서는, 면역계가 더 이상 유기체의 자신의 특정 "자기 (self)" 구조를 인지하지 못하고; 면역계가 조절 이상이 되어 상기 "자기" 구조를 공격할 수 있게 된다.

건선의 특정 경우에는, 면역 방어가 회피된 유기체의 항원은 개인의 피부를 공격하여 염증을 향해 표류하게 된다. 조절계의 과잉 반응은 각질형성세포의 과다 증식을 초래하고, 따라서, 각질형성세포 및 각질세포의 매우 비후하고 비동질성인 플라크의 형성을 초래한다. 본 발명에 따른 약물은 면역 방어의 병리학적 생성을 저해하는 것을 목적으로 한다. 상기 약물은 염증 메카니즘을 조절하는 것을 목적으로 하는 것이 유용하다. 더욱 유용하게는, 상기 약물이 자가면역 질병, 만성 염증 질병, 아토피성 염증 질병 또는 장 질병의 치료를 목적으로 하는 것이다. 상기 약물이 건선, 백반증, 비강진 (pityriasis), 경피증 (scleroderma), 수포성 피부병 (bullous dermatoses), 습진, 아토피성 피부염, 알레르기 또는 류머티스성 관절염의 치료를 목적으로 하는 것이 유용하다.

피부과 분야에서, 본 발명에 따른 약물은 또한 노화와 관련된 만성 염증 및 그 결과를 향해 표류하는 증상의 예방 및 치료를 목적으로 한다. 상기 약물은 과민성 감작 (anaphylactic sensitizations), 피부의 색소 이상, 피부의 과다 혈관 형성 및 염증성 균열로부터 선택된 질병의 예방 및 치료를 목적으로 한다. 상기 약물은 또한 진피-표피 상호작용에 기여하는 세포외 매트릭스의 증가를 초래하는 세포 보호 및 자극을 통해 진피 조직 항상성을 조절하는 것을 목적으로 하는 것이 유용하다.

본 발명의 주제는 또한 전술한 센텔라 아시아티카의 표준화된 추출물 및 화장품에 허용 가능한 지지체를 포함하는 화장품 조성물이다. 이러한 화장품 조성물은 피부의 자연 노화에서 기인할 수 있는 자가 면역을 향한 모든 병리학적 표류 작용을 예방하는 데 사용하는 것이 유용하다. 상기 화장품 조성물은 또한 세포 기능성의 증가 레벨에서 자연 노화를 지연시키는 데 사용하는 것이 유용하다. 상기 화장품 조성물은 외부 공격에 노출된 피부의 촉진 노화의 예방에, 특히 피부의 광유도 노화의 보호에 사용하는 것이 훨씬 더 유용하다.

외부 환경은 자외선이나, 또는 방전 램프가 방출하는 광, 또는 다양한 자연 대기 항원 또는 인간 활동으로 인해 존재하는 대기 항원, 도시 공해 등을 통해 피부를 영구적으로 공격하는데, 이는 자연 노화를 촉진하는 생물학적 과정을 개시한다. 따라서, 항염증계는 영구적으로 작용하여 피부에서의 각질형성세포의 재생 촉진, 또는 심지어 과다 증식, 특이 단백질의 과발현을 통한 조직 엔트로피의 악화, 및 결국, 기능성의 상실을 초래한다. 그 결과는 피부의 조기 노화를 초래하는 각질형성세포의 자연 저장분을 고갈시키는 재생이다. 본 발명에 따른 조성물의 화장품에의 사용은 염증 질환의 저해 및 따라서, 피부 노화의 방지를 가능하게 할 수 있다는 것이 유용하다.

상기 약물 또는 화장품 조성물은 고형, 페이스트형 또는 액형인 것이 유용하다. 본 발명에 따르면, 약물 또는 화장품 조성물은 국부적으로, 경구적으로, 피하로, 주입으로, 직장으로 및 생식기를 통해 투여할 수 있도록 제형화하는 것이 유용하다. 본 발명에 따르면, 약물 또는 화장품 조성물을 국부적으로 투여할 수 있도록 제형화하는 경우, 상기 약물 또는 조성물은 수용액, 백색 또는 유색 크림, 연고, 밀크, 로션, 젤, 연고, 유액 (serum), 페이스트, 포움, 에어로졸, 샴프 또는 스틱의 형태인 것이 유용하다. 본 발명에 따르면, 약물 또는 화장품 조성물을 경구적으로 투여할 수 있도록 제형화하는 경우, 상기 약물 또는 조성물은 수용액, 에멀젼, 정제, 젤라틴 캡슐, 파우더, 그래뉼, 용액 또는 경구 현탁액의 형태일 수 있다. 본 발명에 따르면, 약물 또는 화장품 조성물을 피하로 투여할 수 있도록 제형화하는 경우, 상기 약물 또는 조성물은 멸균 주사가능한 앰풀 형태일 수 있다. 본 발명에 따르면, 약물 또는 화장품 조성물을 직장으로 투여할 수 있도록 제형화하는 경우, 상기 약물 또는 조성물은 좌약 형태일 수 있다. 본 발명에 따르면, 약물 또는 화장품 조성물을 생식기를 통해 투여할 수 있도록 제형화하는 경우, 상기 약물 또는 조성물은 소란 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 약물의 투여할 양은 치료되는 증상의 심각성 및 치료되는 증상이 얼마나 장기간 존재하였는 지에 따라 좌우된다. 당연히, 의사가 환자에 따라 투약량을 조정할 수도 있다. 자가면역 질병을 앓고 있는 환자를 혼합물의 총중량과 관련하여 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물 95 중량% 이상을 함유하는 센텔라 아시아티카의 추출물로 치료하는 것은 경피성 담체 중의 상기 추출물의 부형제의 부피와 비교하여 1 내지 3 중량%의 비율로 하루에 한번 또는 두번 상기 약물을 국소 투여하는 것으로 이루어진다. 특히 유용하게는 상기 정의된 투약량으로 상기 약물을 투여하는 것을 1 내지 3일간의 투여로 나누는 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 예시하는 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 크림 조성물

성분: INCI	중량%
본 발명에 따른 마데카소시드/터미놀로시드 추출물 (순도>95%)	1.0%
베헤네스-10	1.5%
베헤네스-25	1.5%
디카프릴릴 카르보네이트	5.0%
헥실 라우레이트	5.0%
이소헥사데칸	5.0%
세테아릴 이소노나오에이트	5.0%
디메티콘	1.0%
베헤닐 알콜	2.0%
수소화된 식물성 글리세라이드	2.0%
페녹시에탄올 & 파라벤	0.5%
토코페릴 아세테이트	0.5%
탈광물화된 물	qs 100
글리세롤	3.0%
부틸렌 글리콜	2.0%
크산탄 검	0.1%
카르보머	0.2%

실시예 2: 본 발명에 따른 크림 조성물

성분: INCI	중량%
본 발명에 따른 마데카소시드/터미놀로시드 추출물 (순도>95%)	1.0%
세테아릴 글루코시드 및 세테아릴 알콜	5.0%
카프릴산/카프린산 트리글리세라이드	5.0%
스쿠알렌	5.0%
세테아릴 이소노나오에이트	3.0%
디메티콘 가교중합체	2.0%
스테아릴 알콜	1.5%
디카프릴릴 카르보네이트	5.0%
파라벤	0.1%
탈광물화된 물	qs 100
페녹시에탄올 및 파라벤	0.5%
글리세롤	2.0%
카르보머	0.3%
PEG 32	2.0%
크산탄 검	0.2%
알루미늄 전분 옥테닐 숙시네이트	2.0%

실시예 3: 추출물의 총중량에 상대적인 양으로 95 중량% 이상의 순도인 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 추출하는 방법

a) 칼럼 상에서 초기 알콜액의 화학적 배출 및 정제

본 실시예에서 사용되는 센텔라 아시아티카의 땅 위 부분은 약 2 내지 3 ㎝의 줄기를 가진 잎을 포함한다. 땅 위 부분인 센텔라 아시아티카 부분 250 ㎏을 동일한 양의 3개 배치로 분리하였다. 센텔라 아시아티카의 활성 성분을 역류 추출의 원리에 따라 땅 위 부분으로부터 추출하였다. 땅 위 부분인 센텔라 아시아티카의 새 부분, 즉 연화나 여과를 진행하지 않고, 따라서 활성 성분이 매우 풍부한 부분의 배치를 제2 추출액, 즉 활성 성분으로 거의 포화된 고갈된 용매로 1회 추출하였다. 이렇게 얻은 액체는 최종액으로 지칭하며, 화학적 배출 탱크로 직접 보내졌다. 그 후, 상기 배치는 제1 연화액, 이미 사용된 액체보다 낮은 하중을 가져서 더 많은 활성 성분을 용해시킬 수 있는 액체로 제2 추출을 실시하였다. 제2 추출액으로 사용되는 것이 이 액체이다. 상기 배치는 배치 중에 여전히 존재하는 활성 성분의 최종 비율을 용해시킬 수 있는 새로운 용매로 최종적으로 제3의 추출을 실시하였다. 제1 추출액으로 사용되는 것이 이 액체이다.

본 실시예에서, 사용된 연화 및 여과 용매는 70% 에탄올이다. 땅 위 부분인 센텔라 아시아티카 250 ㎏에 대해 70% 에탄올 1600ℓ을 사용하였다.

선행하는 추출 단계가 정적 탱크 또는 동적 탱크 어느 것에서 수행하느냐에 따라, 활성 성분으로 다소간 포화된 70% 에탄올 중에서 땅 위 부분의 센텔라 아시아티카에 대한 연화 시간은 하루 내지 수시간의 범위를 가진다. 60℃의 온도로 가열된 동적 탱크의 특정 경우에, 연화 시간은 2 시간이다. 그 후, 30% 수산화나트륨 용액 10ℓ를 최종액에 첨가하고, 이어서 10 ㎏의 활성탄을 첨가하였는데, 이는 교반에 의해 용액을 탈색시킬 수 있게 한다. 용액을 40분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 여과액을 유속 300ℓ/h로 4차 암모늄 형태의 작용기를 가진 강 음이온성 수지를 통과시켰다.

이렇게 얻은 수성-알콜 용출액을 수산화나트륨으로 겉보기 pH 5.3 내지 6.9로 중화시킨 다음, 헵탄으로 원심분리하는 것이 유용한 액체/액체 추출법을 실시하였다.

이렇게 얻은 탈지된 상을 70℃를 초과하지않는 온도에서 감압하에 연속 기화에 의해 농축시켰다. 이러한 농축은 탈지된 상에 함유된 아시아티코시드를 제거할 수 있게 한다. 생성물을 탈지된 상의 초기 부피의 약 90 부피%에 상응하는 에탄올의 부피가 회수될 때까지 및 아시아티코시드가 탈지된 상으로부터 침전될 때까지 농축시켰다. 이 상을 여과하고, 모액을 회수하였다. 마데카소시드는 매우 수용성이커서 선행 농축 단계 중에 침전되는 아시아티코시드의 약 20 중량%을 용해시킨다.

b) 예비 정제된 수성-알콜 상의 정제로 구성되는 단계

회수된 농축된 수성 상은 양이온성 수지 및 이어서 음이온성 수지 상으로 통과시켜서 정제하였다. 양이온성 수지는 설포네이트 형태의 작용기를 가진 강 양이온성 수지이다. 음이온성 수지는 4차 암모늄 형태의 작용기를 가진 강 음이온성 수지이다. 이렇게 얻은 용출액은 수성-알콜 상으로서, 이것은 염산으로 pH 6.75 +/- 0.25로 중화시키고, 활성탄 상으로 통과시켜 탈색시킨다.

이렇게 얻은 용액을 여과한 다음 감압하에 반응기에서 농축하여 선행 농축 단계와 동일한 원리에 따라 수성 상을 얻는다. 그 후, 에탄올을 첨가하여 재조정하여1 리터당 200g +/- 20의 고체 함량 및 35% +/-3.5% 부피/부피의 알콜 비율을 가진 안정화된 수성-알콜 용액을 얻었다. 그 후,마데카소시드 및 터미놀로시드가 풍부하고 여전히 아시아티코시드를 함유하는 예비 정제된 상을 얻었다.

c) 정제 단계

이렇게 얻은 예비 정제된 수성-알콜 상을 선택적 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이러한 선택적 크로마토그래피 중에 사용된 정지상은 그래프트된 비극성 실리카, 즉 탄소수 18개이고 10 ㎛인 비극성 그래프트로 이루어진 상이다. 사용된 용매는 혼합물의 총부피와 비교하여 65 부피%의 물 및 35 부피%의 에탄올의 혼합물이다. 이렇게 얻는 용출액을 농축하고, 건조시키고, 분쇄시켰다. 이러한 다양한 단계들이 센텔라 아시아티카의 건성 추출물을 얻을 수 있게 한다.

건성 추출물은 마데카소시드 및 터미놀로시드의 질량비 51:49 혼합물 (2종 혼합물)을 추출물의 총중량에 상대적인 양으로 99.8 중량% 함유한다.

실시예 4: 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 표준화된 혼합물을 추출 및 제조하는 방법

추출 방법은 마데카소시드 및 터미놀로시드가 풍부하고 여전히 아시아티코시드를 함유하는 (정단 단계 전에) 예비 정제된 상 (3종 혼합물)을 얻는 것으로 이루어진 단계까지 실시예 3에 기재된 것과 동일하였다.

이러한 예비 정제된 상은 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 면에서 80 중량%의 순도를 가졌다. 존재하는 불순물은 특히 지방산이다. 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 양을 다시 100%와 관련시키면, 혼합물은 약 39 중량%의 마데카소시드, 39 중량%의 터미놀로시드 및 22 중량%의 아시아티코시드를 포함한다.

상기 추출물은 실시예 3에서 얻은 2종 혼합물 100 중량%를 첨가하여 표준화하였다 (즉, 2종 혼합물만큼 많은 3종 혼합물).

그 후, 순도 90 중량%인 센텔라 아시아티카의 표준화된 추출물을 얻었다. 이 추출물은 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 양을 다시 100%로 관련시키면, 45.7 중량%의 마데카소시드, 44.5 중량%의 터미놀로시드 및 9.8 중량%의 아시아티코시드를 포함하였다.

실시예 5: 두 마데카소시드 및 터미놀로시드 이성질체의 분리

마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물 300㎎을 30℃에서 81:19 v/v의 물:아세토니트릴 이동상을 가진 제조용 칼럼 (상표 하이퓨리티 C18 (250 × 4.6)) 상에서 크로마토그래피하였다. 검출은 파장 210 ㎚에서 수행하였다. 이렇게 하여 95㎎의 터미놀로시드 및 85㎎의 마데카소시드를 얻었다.

마데카소시드 및 터미놀로시드의 화학적 구조는 분광분석법 (¹HNMR, ¹³C NMR 및 질량 분광법)으로 확인하였다.

실시예 6: 과증식 인간 각질형성세포에서 세포 증식과 관련하여 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물의 조절 효과의 평가

본 실시예 및 후속 실시예들에서, 추출물은 그 총중량에 상대적인 양으로 본 발명에 따른 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물 99.8 중량%를 함유하며, 이 혼합물은 그 총중량에 상대적인 양으로 51 중량%의 마데카소시드 및 49 중량%의 터미놀로시드를 함유하였다.

본 발명에 따른 추출물이 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 함유하기 때문에, 상기 추출물은 본 실시예 및 하기 실시예들에서 "마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물" 또는 "본 발명에 따른 혼합물"이란 표현으로 구별없이 언급된다.

본 실시예의 과제는 과증식 인간 각질형성세포에서의 세포 증식과 관련하여 마데카소시드 및 터미놀로시드의 조절 효과의 평가이다. 본 실시예는 각질형성세포 성장인자 (이하, KGF로 지칭됨) 및/또는 인간 백혈구 엘라스타제 (이하, HLE로 지칭됨)로 자극된 인간 각질형성세포 HaCaT 상에서 수행하였다.

a) 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물의 세포독성의 연구

이 세포독성 연구는 세포 독성을 초래하지 않는 생성물의 최대 투약량을 측정하는 것으로 이루어진다. 세포독성은 광범위인 웰당 20 ×10³ 세포, 및 한정된 범위인 10 ×10³ 세포의 비율로 96-웰 평판 내로 파종된 HaCaT 인간 각질형성세포 상에서 연구하였다. 세포 생존성은 뉴트럴 레드를 사용한 비색 분석에 의해 평가하였다. 뉴트럴 레드는 비이온성 확산 현상에 의해 세포막을 침투하고 세포내로 리소좀 매트릭스의 포스페이트 및/또는 카르복실기에 결합하는 약 양이온성 염료이다. 세포막이 손상될 때는 뉴트럴 레드의 축적 및 보유에서의 변형이 관찰되었다. 그러므로, 뉴트럴 레드의 존재 하에 세포의 항온처리 후에 얻어진 용액의 광학 밀도는 생세포의 수에 비례한다.

0.001 내지 1 ㎎/㎖의 광범위한 9개 농도를 초기에 시험하였다. 다양한 시험 용액은 10 부피%의 FCS (소태아혈청)로 보충된 DMEM 배지, 둘베코의 변형 기본 배지에서 제조하였다. 접촉 24 시간 후에, 1 ㎎/㎖와 동일 또는 그 미만의 농도는 뉴트럴 레드와 관련하여 세포 반응의 상당한 변형을 유도하지 않았다. 10% 저해에 해당하는 뉴트럴 레드의 매우 작은 감소는 시험한 최고 농도인 1 ㎎/㎖에서만 관찰되었다. 이러한 결과에 기초하여, 0.05 내지 5 ㎎/㎖의 제한된 범위가 최대 비세포독성 투약량을 특정하기 위해서 설정되었다. 세포 생존능은 항온처리 72 시간 후에 뉴트럴 레드 비색 분석법에 의해 평가하였다. 그 결과는 1 ㎎/㎖과 동일하거나 그 미만인 농도의 비독성을 확인하는 것이다. 1 ㎎/㎖로부터는 약한 투약량-의존성 세포독성 효과가 관찰되었다. 5 ㎎/㎖의 시험한 최고 농도는 뉴트럴 레드와 관련하여 세포 반응을 43%까지 저해하였다.

0.075 내지 5 ㎎/㎖의 제2의 제한된 범위를 시험하였다. 분석은 1%의 농도의 디메틸 설폭시드 (이하, DMSO로 언급함)에서 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 용해시킨 후에 HaCaT 세포 상에서 수행하였다. 세포 생존능은 항온처리 72 시간 후에 뉴트럴 레드 비색 분석법으로 평가하였다. 얻어진 결과는 DMSO의 부재 시에 기록된 것들과 유사하였다.

표 3은 모든 결과를 함께 분류한 것이며; 세포 생존성은 대조군 분석의 비율로서 표현하였다.

농도(㎎/㎖)	0.05	0.075	0.1	0.25	0.5	0.75	1	2.5	5
광범위(24h)	102%	n.t.	105%	n.t.	100%	n.t.	90%	n.t.	n.t.
한정범위 1 (72h)	99%	100%	98%	99%	97%	96%	91%	80%	57%
한정범위 2 (72)	n.t.	102%	101%	99%	97%	94%	91%	78%	55%
약어 n.t.는 시험하지 않은 것을 의미한다 (not tested).

이러한 결과에 따르면, 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물의 항증식 활성의 시험을 위해 최대 투약량으로서 300 ㎍/㎖의 농도를 선택하는 것으로 결정되었다.

b) 세포 증식에의 효과

분석의 원리는 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물의 존재 및 부재 하에 과증식 인간 각질형성세포의 증식의 평가에 기초한다. 그 방법은 KGF 또는 HLE로 자극된 배양물에서 세포 밀도를 측정하는 것에 기초한다. 세포 밀도는 뉴트럴 레드를 사용한 비색 분석법에 의해 평가하였다. 용액의 흡광도는 미량평판 판독기를 사용하여 540 ㎚에서 판독하였다.

마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물의 4개 농도를 시험하였다:

C₁= 10 ㎍/㎖ C₂= 30 ㎍/㎖ C₃= 100 ㎍/㎖ C₄= 300 ㎍/㎖

b.1) KGF를 사용한 자극

6개의 시험 배치를 제조하였다: 대조군 배치 (비자극된 세포), KGF 대조군 배치 (100 ng/㎖의 농도의 KGF로 자극된 세포) 및 4개의 처리된 배치 (KGF로 자극되고, 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물로 처리된 세포). 광학밀도는 t=0일, t=2일 및 t=5일에서 측정하였다. 광학밀도 (O.D.)의 평균은 회귀선을 사용하여 세포 밀도 (세포/웰)로 전환시켰다: O.D. = 0.00355 ×(10³ 세포/웰) + 0.0018.

표 4는 세포를 KGF로 활성화시킨 후 2일 및 5일 째에 기록된 세포 밀도를 함께 분류한 것이다.

	처리 2일째		처리 5일째
KGF로 자극	세포/웰	세포 증식	세포/웰	세포 증식
KGF 없는 대조군	56465+/-2486		115802+/-988
KGF 있는 대조군	85833+/-1742	100%	157616+/-6359	100%
C₁ 및 KGF	84388+/-2616	98% n.s.	161354+/-5165	102% n.s.
C₂ 및 KGF	85304+/-1312	99% n.s.	161248+/-4232	102% n.s.
C₃ 및 KGF	84317+/-1444	98% n.s.	152081+/-2536	96% n.s.
C₄ 및 KGF	83259+/-1960	97% n.s.	150071+/-7087	95% n.s.
약어 n.s.는 결과가 통계적으로 유의 수준이 아님을 의미한다.

얻어진 결과는 본 발명에 따른 혼합물의 존재하에 배양 2일 또는 5일 후에 KGF로 자극된 HaCaT 세포의 증식의 중요한 변형은 없었음을 나타낸다.

b.2. HLE를 사용한 자극

6개의 시험 배치를 제조하였다: 대조군 배치 (비자극된 세포), HLE 대조군 배치 (3 nM, 즉 90 ng/㎖의 농도의 HLE로 자극된 세포) 및 4개의 처리된 배치 (HLE로 자극되고, 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물로 처리된 세포). 광학밀도는 t=0일, t=2일 및 t=5일에서 측정하였다. 광학밀도 (O.D.)의 평균은 회귀선을 사용하여 세포 밀도 (세포/웰)로 전환시켰다: O.D. = 0.00458 ×(10³ 세포/웰) + 0.041.

표 5는 세포를 HLE로 활성화시킨 후 2일 및 5일 째에 기록된 세포 밀도를 함께 분류한 것이다.

	처리 2일째		처리 5일째
HLE로 자극	세포/웰	세포 증식	세포/웰	세포 증식
HLE 없는 대조군	66668+/-1380		89180+/-2202
HLE 있는 대조군	875973+/-1400	100%	157616+/-6359	100%
C₁ 및 HLE	76764+/-799	101% n.s.	114584+/-2463	100% n.s.
C₂ 및 HLE	75891+/-1190	100% n.s.	115539+/-1261	101% n.s.
C₃ 및 HLE	73408+/-1690	97%(p≤0.05)	112428+/-1548	98%(p≤0.05)
C₄ 및 HLE	72016+/-1597	95%(p≤0.05)	93355+/-1429	82%(p≤0.05)
-약어 n.s.는 결과가 통계적으로 유의 수준이 아님을 의미한다. -p≤0.05는 결과가 0.05%의 오차와 함께 통계적으로 유의 수준임을 의미한다.

얻어진 결과는 본 발명에 따른 혼합물의 존재하에 배양 2일 또는 5일 후에 HLE로 자극된 HaCaT 세포의 증식에 있어 약간의 감소를 나타낸다. 이러한 약간의 저해 효과는 고농도에서만 나타난다. 300 ㎍/㎖에서 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물은 치료 5일 후에 HLE로 활성화된 세포의 증식을 대조군과 비교하여 18%만큼 감소시켰다.

c) 결론

결론적으로, 100 ng/㎖의 KGF 및 90 ng/㎖의 HLE가 HaCaT 세포의 증식을 자극하였다.

마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물은 시험한 농도 범위 내에서 KGF로 자극한 HaCaT 세포의 증식을 조절할 수 없다. 본 발명에 다른 혼합물은 HLE로 자극된 HaCaT 세포의 증식을 투약량 의존 방법으로 조절할 수 있다. 300 ㎍/㎖의 투약량의 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물은 HLE로 자극된 HaCaT 세포의 증식을 18%만큼 감소시킬 수 있다.

실시예 7: 배양물내 인간 각질형성세포 상의 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물의 항염증 활성의 측정

본 실시예의 주제는 자극성 스트레스에 적용된 배양물내 인간의 각질형성세포에 의한 전염증 표피 시토킨, IL-1α 및 PGE-2의 생성 및 방출에 미치는 본 발명에 따른 혼합물의 항염증 활성의 평가이다.

본 세포독성 연구는 실시예 4와 동일한 방식으로 수행하여 동일한 결과를 얻었다. 또한, 시험한 농도들이 표적 세포에 비독성인 지를 확인하기 위해 인간 각질형성세포인 K_02-1H₄ 스트레인에 관한 분석을 세포독성 연구에 추가하였다.

0.075 내지 5 ㎎/㎖의 8개 농도 범위를 연구하였다. DMSO 중에서 미리 용해시킨 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 선택된 농도로 배양 배지에 첨가하였다; DMSO의 최종 농도는 1%였다. 세포 생존능은 뉴트럴 레드 분석에 의해 측정하였다.

그 결과는 항온처리 72 시간 후에 2.5 ㎎/㎖과 동일하거나 그 미만의 농도의 비독성을 확인한다. 시험한 최고 농도인 5 ㎎/㎖는 뉴트럴 레드의 흡수의 30% 저해를 초래하였다.

표 6은 그 결과를 함께 분류한 것이다. 세포 생존능은 대조군 분석의 비율로서 표현하였다.

농도 ㎎/㎖	0.075	0.1	0.25	0.5	0.75	1	2.5	5
생존능 (72h)	98%	96%	102%	96%	93%	98%	95%	70%

이러한 결과에 따르면, 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물의 항염증 활성의 시험을 위해 최대 투약량으로서 1 ㎎/㎖의 농도를 선택하는 것으로 결정되었다.

b) 항염증 활성

분석의 원리는 자극성 스트레스에 반응하는 인간 각질형성세포에 의한 전염증 시토킨의 생성을 평가하는 것에 기초한다. 그 방법은 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물이 존재 또는 부재 하에 배양되고, PMA, 즉 포르볼-1,2-미리스테이트-13-아세테이트로 자극된 각질형성세포에 의해 세포외 배지로 방출되는 PGE-2의 양 및 IL-1α의 세포내 양을 측정하는 것에 기초한다.

연구는 어린 아이의 K_02-1H₄ 스트레인의 포피로부터 분리된 각질형성세포 상에서 수행하였다. 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물의 3개 농도를 시험하였다:

C₁= 0.1 ㎎/㎖ C₃= 0.5 ㎎/㎖ C₃= 1.0 ㎎/㎖

b.1) PGE-2의 방출

하기 표 7은 세포의 활성화 후에 얻어진, pg/단백질 ㎍으로 표현되는 PGE-2의 양 및 기본 양을 함께 분류한 것이다. PMA에 의해 유도된 PGE-2의 생성 및 항염증 활성(이하, AIA로 언급함)은 각각의 농도에 대해 다음과 같이 계산하였다:

PGE-2 생성 = PGE-2_{PMA 존재} - PGE-2_{PMA 부재} 및

AIA = [(PGE-2 생성_{대조군 세포} - PGE-2 생성_{처리 세포})/PGE-2 생성_{대조군 세포}] ×100

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물	대조군 배양물 0 ㎎/㎖	0.1 ㎎/㎖	0.5 ㎎/㎖	1 ㎎/㎖
PMA 부재시의 PGE-2	4.96+/-0.52	4.96+/-0.52	4.96+/-0.52	4.96+/-0.52
PMA 존재시의 PGE-2	39.34+/-2.64	18.73+/-0.67	10.69+/-0.50	6.60+/-0.44
PGE-2 생성	34.38+/-2.64	13.77+/-0.67	5.73+/-0.50	1.64+/-0.44
항염증 활성 (%)		60%	83%	95%

각질형성세포를 PMA에 노출시키면, PGE-2가 매우 상당한 양으로 생성되어 대조군 배양물의 배양 배지 내로 방출된다. 구체적으로, 비자극된 배양물에서 기록된 기본 양은 PMA로 자극 후에 8배로 증가되었다. 이러한 결과는 PGE-2가 발현, 생성 및 방출이 PMA와 같은 염증제를 사용하여 유도될 수 있는 시토킨임을 확인하는 것이다.

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물로 처리한 배양물에서 PMA로 자극 후에 기록된 PGE-2의 양은 대조군 배양물에 관찰된 것보다 명확히 더 낮다. PGE-2의 PMA-유도 방출과 관련하여 본 발명에 따른 혼합물의 이러한 저해 효과는 투약량 의존적이다. 배치 C₁, C₂ 및 C₃에서 기록된 차이는 통계적으로 유의 수준 (p ≤ 0.01, 스튜던트의 t 테스트)인 것으로 확인되었다. 시험한 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 최고 농도인 1 ㎎/㎖는 PGE-2의 PMA-유도 생성을 완전히 저해할 수 있다.

b.2) 세포내 IL-1α 생산

하기 표 8은 세포의 활성화 후에 얻어진, pg/단백질 ㎍으로 표현되는 IL-1α의 세포내 양 및 기본 레벨을 함께 분류한 것이다. PMA에 의해 유도된 IL-1α의 생성 및 항염증 활성(이하, AIA로 언급함)은 각각의 농도에 대해 다음과 같이 계산하였다:

IL-1α 생성 = IL-1α_{PMA 존재} - IL-1α_{PMA 부재} 및

AIA = [(IL-1α 생성_{대조군 세포} - IL-1α_{처리 세포})/IL-1α 생성_{대조군 세포}] ×100

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물	대조군 배양물 0 ㎎/㎖	0.1 ㎎/㎖	0.5 ㎎/㎖	1 ㎎/㎖
PMA 부재시의 IL-1α	2.88+/-0.23	2.88+/-0.23	2.88+/-0.23	2.88+/-0.23
PMA 존재시의 IL-1α	12.11+/-0.41	8.94+/-0.11	6.86+/-0.47	4.70+/-0.30
IL-1α 생성	9.23+/-0.41	6.06+/-0.11	3.98+/-0.47	1.82+/-0.30
항염증 활성 (%)		34%	57%	80%

각질형성세포를 PMA에 노출시키면, IL-1α가 매우 상당한 양으로 생성되어 대조군 배양물의 배양 배지 내로 방출된다. 구체적으로, 비자극된 배양물에서 기록된 기본 양은 PMA로 자극 후에 4배로 증가되었다. 이러한 결과는 IL-1α가 발현, 생성 및 방출이 PMA와 같은 염증제를 사용하여 유도될 수 있는 시토킨임을 확인하는 것이다.

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물로 처리한 배양물에서 PMA로 자극 후에 기록된 IL-1α의 양은 대조군 배양물에 관찰된 것보다 명확히 더 낮다. IL-1α의 PMA-유도 생성 및 축적과 관련하여 본 발명에 따른 혼합물의 이러한 저해 효과는 투약량 의존적이다. 배치 C₁, C₂ 및 C₃에서 기록된 차이는 통계적으로 유의 수준 (p ≤ 0.01, 스튜던트의 t 테스트)인 것으로 확인되었다. 시험한 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 최고 농도인 1 ㎎/㎖는 IL-1α의 PMA-유도 생성을 80%만큼 감소시킬 수 있다.

c) 결론

염증 과정의 단계들에서 중요한 역할을 하는 2종의 표피 시토킨인 PGE-2 및 IL-1α의 생성을 조절하는 능력을 통해 생체외 모델에 관해 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항염증 활성을 평가하였다. 이 연구는 자극제인 PMA로 자극한 정상 인간 각질형성세포의 배양물 상에서 수행하였다. 본 실시예는 비독성 투약량인 10 ng/㎖의 PMA가 먼저 세포내 IL-1α의 양의 매우 명백한 증가를 유도하고, 이어서 PGE-2의 생성 및 배양 배지 내로의 방출을 일으킨다는 것을 나타낸다.

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물은 PGE-2의 PMA-유도 방출을 매우 명백히 감소시킬 수 있다. 1 ㎎/㎖의 투약량의 혼합물은 PGE-2의 방출을 완전히 저해할 수 있다. 본 발명에 따른 혼합물은 투약량 의존적인 방식으로 IL-1α의 PMA-유도 생성 및 세포내 축적을 조절할 수 있다.

염증 과정에서 상기 두 시토킨의 중요한 역할에 따르면, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물에 의해 나타나는, 생체외에서 자극된 각질형성세포에 의한 PGE-2의 발현 및 방출과, IL-1α의 생성을 조절하는 능력이 항염증 활성인 것으로 간주할 수 있다.

실시예 8: 배양물내 인간 각질형성세포에 관한 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항염증 활성의 평가

본 실시예의 주제는 인터페론-γ에 의한 TNF-α 및 IL-8의 생성에 관한 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항염증 활성의 평가이다.

a) 세포독성 연구

본 세포독성 연구는 실시예 4와 동일한 방식으로 수행하여 동일한 결과를 얻었다.

b) 표피 시토킨의 생성에 미치는 인터페론-γ의 효과

본 연구는 정상 인간 각질형성세포 상에서 수행하였다. 세포들은 먼저 4개 농도의 인터페론-감마 (IFN-γ)로 24 시간 동안 처리하였다.

다음, 배양 상청액에서 IL-8 및 TNF-α를 분석하고, 세포 단백질을 분석함으로써, 염증 매개체를 대조군 배양물 및 IFN-γ로 처리한 배양물에서 측정하였다. 사용된 측정 방법은 쿠마시 블루 테스트이고; 이것은 표준화된 방법이다. 그 결과는 하기 표 9 및 표 10에 제시한다.

IL-8 (pg/단백질 ㎍)	대조군	인터페론-γ (U/㎖)
	0	100	500	1000	2000
평균 표준편차	0.077 0.060	0.980 0.119	1.301 0.102	1.991 0.113	2.917 0.138

TNF-α (pg/단백질 ㎍)	대조군	인터페론-γ (U/㎖)
	0	100	500	1000	2000
평균 표준편차	3.260 0.519	3.198 0.744	8.605 1.195	10.773 1.673	14.545 1.256

얻어진 결과는 시험한 농도 범위인 100 내지 2000 U/㎖에서 인터페론-γ가 TNF-α 및 IL-8의 생성의 명백한 자극을 투약량 의존적인 방식으로 유도함을 나타낸다. 문자 U는 단위 (unit)의 약어이고; 1 U는 인터페론-γ의 1 단위에 해당한다.

표피 시토킨 TNF-α의 경우, 비자극된 배양물에서 기록된 기본 양이 1000 U/㎖ 및 2000 U/㎖의 인터페론으로 자극 후에 각각 3.3배 및 4.5배 증가하였다. 표피 시토킨 IL-8의 경우, 비자극된 배양물에서 기록된 기본 양이 1000 U/㎖ 및 2000 U/㎖의 인터페론으로 자극 후에 각각 26배 및 38배 증가하였다.

상기 결과는 인터페론이 상기 두 종류의 표피 시토킨의 발현, 생성 및 방출을 자극할 수 있음을 확인하는 것이다. 상기 결과를 고려하여, 각질형성세포의 자극을 위해서는 1000 U/㎖ 농도를 선택하도록 결정되었다.

c) 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항염증 활성

본 연구는 정상 인간 각질형성세포 상에서 수행하였다. 세포들은 자즉성 스트레서의 유도 전에 먼저 연구 대상인 생성물로 48 시간 동안 처리하였다. 다음에, 인터페론-γ (IFN-γ) 용액을 첨가하여 자극성 스트레스를 유도하였다. 이렇게 활성화된 세포들을 연구 대상인 생성물의 존재하에 24 시간 동안 항온배양하였다. 최종적으로, 배양 상청액 중의 IL-8 및 TNF-α의 양을 분석하고, 세포 단백질 역시 분석하였다.

c.1) 시토킨 IL-8과 관련한 결과

하기 표는 세포의 활성화 후에 얻어진, pg/단백질 ㎍으로 표현되는 IL-8의 양 및 기본 양을 함께 분류한 것이다. 항염증 활성(AIA)은 각각의 농도에 대해 다음과 같이 계산하였다:

AIA = [(IL-8_{(대조군 세포 + IFN)} - IL-8_{(처리 세포 + IFN)})/IL-8_{(대조군 세포 + IFN)}] ×100

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물로 처리한 각질형성세포의 샘플들의 결과는 하기 표 11에 제시한다.

	IFN 부재하의 대조군	IFN 존재하의 대조군	IFN 및 (마데카소시드 + 터미놀로시드)의 혼합물
		0 ㎎/㎖	0.1 ㎎/㎖	0.25 ㎎/㎖	0.5 ㎎/㎖	1 ㎎/㎖
IL-8(pg/단백질㎍)	0.06+/-0.01	1.03+/-0.04	0.72+/-0.09	0.53+/-0.06	0.39+/-0.03	0.39+/-0.02
항염증 활성			31%	49%	62%	63%

얻어진 결과는 100 U/㎖ 농도의 인터페론-γ로 자극 후에 IL-8의 매우 상당한 생성 및 대조군 배양 배지 내로의 방출이 있었음을 나타낸다. 비자극된 배양물에서 기록된 기본 양은 IFN-γ로 자극 후에 18배 증가되었다. 또한, 상기 결과는 또한 IFN-γ로 자극된 처리 배양물에서 IL-8의 양에서 투약량 의존적인 매우 실질적인 감소가 있었음을 나타낸다. IL-8의 인터페론 유도 생성량은 대조군 배치의 배양물에서 관찰된 것보다 명백히 더 적다. 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 최고 농도는 IL-8의 IFN-γ-유도 방출을 63%만큼 저해할 수 있다. 배치 C1, C2, C3 및 C4에 기록된 차이는 대조군 배치와 비교하여 통계적으로 유의 수준 (p ≤ 0.01, 스튜던트의 t 테스트)인 것으로 확인되었다.

c.2) 시토킨 TNF-α와 관련한 결과

하기 표는 세포의 활성화 후에 얻어진, pg/단백질 ㎍으로 표현되는 TNF-α의 양 및 기본 양을 함께 분류한 것이다. 항염증 활성(AIA)은 각각의 농도에 대해 다음과 같이 계산하였다:

AIA = [(TNF-α_{(대조군 세포 + IFN)} - TNF-α_{(처리 세포 + IFN)})/TNF-α_{(대조군 세포 + IFN)}] ×100

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물로 처리한 각질형성세포의 샘플들의 결과는 하기 표 12에 제시한다.

	IFN 부재하의 대조군	IFN 존재하의 대조군	IFN 및 (마데카소시드 + 터미놀로시드)의 혼합물
		0 ㎎/㎖	0.1 ㎎/㎖	0.25 ㎎/㎖	0.5 ㎎/㎖	1 ㎎/㎖
TNF-α(pg/단백질㎍)	2.39+/-0.16	5.26+/-0.31	4.95+/-0.22	4.97+/-0.24	4.67+/-0.15	3.92+/-0.10
항염증 활성			6%	6%	11%	26%

얻어진 결과는 100 U/㎖ 농도의 인터페론-γ로 자극 후에 TNF-α의 상당한 생성 및 대조군 배양 배지 내로의 방출이 있었음을 나타낸다. 비자극된 배양물에서 기록된 기본 양은 IFN-γ로 자극 후에 2.2배 증가되었다. 또한, 상기 결과는 또한 IFN-γ로 자극된 처리 배양물에서 TNF-α의 양에서 투약량 의존적인 약간의 감소가 있었음을 나타낸다. 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 최고 농도는 TNF-α의 IFN-γ-유도 방출을 26%만큼 저해할 수 있다.

d) 결론

염증 과정의 단계들에서 중요한 역할을 하는 2종의 표피 시토킨인 IL-8 및 TNF-α의 생성을 조절하는 능력을 통해 생체외 모델에 관해 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항염증 활성을 평가하였다. 이 연구는 자극제인 IFN-γ로 자극한 정상 인간 각질형성세포의 배양물 상에서 수행하였다.

본 실시예는 비독성 투약량인 1000 U/㎖의 IFN-γ가 먼저 IL-8의 양의 매우 명백한 증가를 유도하고, 이어서 TNF-α의 생성 및 배양 배지 내로의 방출을 일으킨다는 것을 나타낸다. 본 발명에 따른 혼합물은 투약량 의존적인 방식으로 IL-8의 IFN-γ-유도 생성 및 세포내 축적을 조절할 수 있다. 1 ㎎/㎖의 투약량의 혼합물은 IL-8의 방출을 63%만큼 저해할 수 있다.

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물은 TNF-α의 IFN-γ-유도 방출을 감소시킬 수 있다. 1 ㎎/㎖의 투약량의 혼합물은 TNF-α의 방출을 26%만큼 저해할 수 있다.

폐쇄계, 즉 생체외에서 수행된 분석에서 얻어진 결과를 생체내에서 효과적인 화학 활성의 메카니즘에 대한 가설로 외삽하면, 다음과 같은 관찰을 구체화할 수 있다: TNF-α는 각질형성세포에서 뿐만 아니라 대식세포 및 B 림프구에서 IL-8 생성의 활성화인자 중의 하나이다.

상기 혼합물이 먼저 TNF-α의 발현을 부분적으로만 감소시킨다는 사실은 염증 신호의 발현의 조절을 넘어서 억압되지 않은 면역계의 활성의 조절의 징후인데, 이는 TNF-α가 특히 아폽토시스 (apoptotic) 단계에서의 세포 제어 및 피부의 모니터링에서 주요한 역할을 수행하기 때문이다. 둘째, 상기 혼합물은 IL-8의 발현을 감소시켜 호중구 및 호염기구 다형핵 세포의 화학주성의 약화를 초래하고, 단백질 분해의 "압력"의 감소와 관련한 결과를 감소시켜 염증 신호의 전파 및 또한 혈관 투과성의 감소의 조절을 초래한다. 또 다른 결과는 다시 IL8에 의한 피부의 T 림프구의 활성화가 감소된다는 것이다.

실시예 9: 인간 각질형성세포에 의한 SKALP의 생성과 관련하여 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 효과

본 실시예의 주제는 분화 상태의 각질형성세포에 의해 시토케라틴 10, 특히 엘라핀 (이하 CK10 또는 SKALP로 약칭함)의 발현에 대한 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항건선 활성의 평가이다.

a) 세포독성 연구

본 세포독성 연구는 실시예 4와 동일한 방식으로 수행하여 동일한 결과를 얻었다. 이들 결과에 따르면, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항건선 활성을 시험하기 위해서는 최대 투약량으로 1 ㎎/㎖의 농도를 선택하는 것으로 결정하였다.

b) SKALP의 발현 및 각질형성세포의 분화

본 연구는 정상적인 인간 각질형성세포에 대해 수행하였다. 상기 세포들은 3가지 상이한 배지 내의 배양물에 위치시켰다:

- "증식" 배지 : gf(성장 인자)가 존재하는 KGM 배지, 즉 성장 인자들로 보충된 배지;

- "정상 분화" 배지 : gf가 존재하지 않는 KGM 배지, 즉 성장 인자들이 결손된 배지;

- "건선형 분화" 배지 : FCS가 존재하는 KGM 배지, 즉 태아 송아지 혈청(이하, FCS라 칭함) 5%로 보충된 배지.

이어서, 이들 여러 가지 배지 내에서 72 시간 동안 배양된 세포를 위한 항온처리 배지 내에서 SKALP의 양을 측정하였다. 측정 분석은 문헌[참조: Skin pharmacology and applied skin physiology, 2002; 15:152-261]에 기재된 ELISA 분석법을 이용하였다.

결과는 다음과 같다:

1. gf가 존재하는 KGM 배지 SKALP = 1.17+/-0.18 ng/㎍ 단백질 100

2. gf가 존재하지 않는 KGM 배지 SKALP = 1.34+/-0.20 ng/㎍ 단백질 115

3. FCS가 존재하는 KGM 배지 SKALP = 2.76+/-0.08 ng/㎍ 단백질 236

상기 결과로부터 SKALP의 발현은 세포의 분화 상태에 따라 달라지는 것을 확인하였다. SKALP의 생성은, 세포가 FCS를 함유하는 배지 내에서 배양되는 경우, 명백히 증가하였다. "건선형" 분화 배지에서 SKALP의 양은 증식 배지에서 기록된 SKALP 양의 2.4배였다.

c) 연구된 생성물의 "항건선" 효과

분석 조건은 다음과 같다: 세포는 "정상" 분화 배지, 즉 gf가 존재하지 않는 배지 및 "건선형" 분화 배지, 즉 FCS가 존재하는 배지 내의 배양물에 대조군 배치에 상응하는 본 발명에 따른 혼합물의 부재 또는 존재 하에서 72 시간 동안 위치시켰다. 이어서, 배양 상청액내의 SKALP의 양을 측정하였다. 또한, 세포 단백질도 분석하였다. 하기 표 13 및 14에는 gf가 존재하지 않는 KGM 배지 및 FCS가 존재하는 KGM 배지 내에서 세포를 배양한 후 얻은 SKALP의 양을 ng/mg 단백질로 기재하였다.

α) "정상" 분화 배지 내에서의 배양: gf가 존재하지 않는 KGM 배지

	gf가 존재하는 KGM	gf가 존재하지 않는 KGM	gf가 존재하지 않는 KGM + 본 발명에 따른 혼합물
		0 mg/ml	0.1　mg/ml	0.25　mg/ml	0.5　mg/ml	1 mg/ml
SKALP (ng/㎍ 단백질)	1.17+/- 0.18	1.34+/- 0.20	1.01+/- 0.24	1.15+/- 0.16	1.05+/- 0.18	0.53+/- 0.14
SKALP 생성률		100%	75%	86%	78%	40%

상기 결과로부터 본 발명에 따른 혼합물로 처리한 배양물 내 SKALP의 양이 감소하였음을 확인하였다. 단지 배치 C4에서 기록된 차이만이 "gf가 존재하지 않는 KGM 배지"에 비해 통계학적으로 유의적인 것으로 확인되었다(p ≤ 0.01, 스튜던트 t 테스트). 최고 농도의 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물은 정상 분화 배지 내에서 SKALP의 분비를 60%까지 억제시킬 수 있었다.

β) "건선형" 분화 배지 내에서의 배양: FCS 존재하의 KGM 배지

	gf가 존재하는 KGM	FCS 존재하의 KGM	FCS 존재하의 KGM + 본 발명에 따른 혼합물
		0 mg/ml	0.1　mg/ml	0.25　mg/ml	0.5　mg/ml	1 mg/ml
SKALP (ng/㎍ 단백질)	1.13+/- 0.19	2.76+/- 0.08	2.22+/- 0.24	2.34+/- 0.12	2.06+/- 0.15	1.64+/- 0.10
SKALP 생성률		100%	80%	85%	75%	60%

상기 결과로부터, 본 발명에 따른 혼합물로 처리한 배양물에서 SKALP 양의 투여량 의존성 감소를 확인하였다. 배치 C1, C2, C3 및 C4에서 기록된 차이는 "FCS가 존재하는 KGM" 대조군에 비해 통계학적으로 유의적인 것으로 확인되었다(p ≤ 0.01, 스튜던트 t 테스트). 최고 농도의 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물은 건선형 분화 배지 내에서 SKALP의 분비를 40%까지 억제시킬 수 있었다.

d) 결론

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항건선 활성은 건선형 질병에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각되는 SKALP의 분비를 조절할 수 있는 그의 능력을 통해 시험관 내 모델에서 평가하였다. 본 연구는 여러 가지 배지에서 정상적인 인간 각질형성세포의 배양물에 대해 수행하였다.

본 실시예를 통해 SKALP의 발현은 세포의 분화 상태에 따라 달라지며, 건선형 배지, 즉 FCS를 함유하는 "건선형" 배지에서 매우 명백하게 증가하였음을 확인하였다.

본 발명에 따른 혼합물은 "정상" 분화 배지 및 "건선형" 배지에서 투여량 의존 방식으로 SKALP의 분비를 억제시킬 수 있었다. 1 mg/ml의 투여량으로 상기 혼합물은 "정상" 분화 배지에서 SKALP의 분비를 60%까지 억제시킬 수 있었으며, "건선형" 분화 배지에서 SKALP의 분비를 40%까지 억제시킬 수 있었다. 건선에서 SKALP 분비의 중요한 역할을 고려하면, 시험관 내 여러 가지 분화 배지에서 각질형성세포에 의해 SKALP의 분비를 투여량 의존 방식으로 조절할 수 있는 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 능력은 항건선 활성으로 고려될 수 있다. 상기 결과는 염증성 과형성 반응과 연계하여 세포성 탈감작화 방법에 따라 건선형 모델의 특성을 규명하는 단백질 분해 정황에서 상피 세포에 대한 본 발명에 따른 혼합물의 보호 효과를 입증한다.

실시예 10: 섬유아세포 배양물 내에서 NFκB의 활성화에 대한 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 효과

핵 인자-κB(NFκB)는 시토킨, 케모킨, 성장 인자, 세포 부착 분자 및 특정의 수명이 짧은 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 관장하는 전사인자이다. NFκB는 시토킨, 자유 라디칼, 흡입된 분자, 자외선 조사 및 박테리아 또는 바이러스를 포함하는 몇몇 제제에 의해 활성화된다.

TNF-α와 같은 염증성 제제는 활성화, 특히 NFκB 전사 인자의 활성화에 의해 전염증성 유전자의 전사를 유도한다. 자극되지 않은 조건하에서, 전사 인자 NFκB는 세포질 내에서 억제성 단백질 IκB에 결합한다. 그의 수용체에 대한 TNF-α의 결합은 이 복합체의 인산화를 초래하며, 상기 억제제로부터 NFκB의 해리를 초래한다. 이어서, 활성화된 NFκB는 핵 내로 이동하여 NFκB에 의해 트랜스 활성화된 유전자에 특이적인 NFκB 컨센서스 서열이라 칭하는 프로모터 서열에 결합한다. 이 서열은 표적 유전자의 전사를 초래한다. 따라서, NFκB의 활성화는 자극된 또는 자극되지 않은 핵 추출물을 지지체 상에 고정화된 NFκB 컨센서스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 결합된 NFκB를 면역효소법, 예를 들어 항-NFκB 항체를 이용하는 ELISA를 이용하여 정량함으로써 측정할 수 있다.

본 연구는 플라스틱 지지체 상에 고정화된 상기 컨센서스 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 전사 인자 NFκB의 활성화에 대한 본 발명에 따른 혼합물의 효과를 평가하는 것을 가능하게 해준다. 결합된 NFκB는 특이적인 항-NFκB 항체에 의해 2차적으로 인식된다.

상기 분석은 정상적인 인간 섬유아세포에 대해 수행하였다.

배양 배지는 DMEM이며,

- 2 mM L-글루타민;

- 50 IU/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신;

- 예비배양을 위한 10% (v/v) 태아 송아지 혈청, 이어서 무혈청 배지로의 교체

를 포함한다.

분석된 생성물	스톡 용액	희석물	테스트한 최종 농도
본 발명에 따른 혼합물	배양 배지내 10%	배양 배지	0.01%

참조 물질	스톡 용액	희석물	테스트한 최종 농도
덱사메타손 (시그마 D1756)	DMSO 중의 10^-2 M	배양 배지	0.1 μM
설파살라진 (시그마 S0883, MW 398.4)	DMSO 중의 1 M	배양 배지	5 mM

a) 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 세포독성 연구

본 세포독성 연구는 실시예 4와 동일한 방식으로 수행하였으며, 동일한 결과를 얻었다. 이들 결과를 고려하여, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물의 항건선 활성을 테스트하기 위해 최대 투여량으로서 0.01%의 농도를 선택하는 것으로 결정되었다.

b) 처리, 추출 및 분석

상기 섬유아세포는 175 cm² 플라스크 내의 10 부피%의 FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 융합이 일어날 때까지 예비배양하였으며, 이어서 배양 배지는 무혈청 DMEM 배지로 교체하였다. 이어서, 상기 세포는 분석하려는 생성물 또는 참조용 생성물의 존재하에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 전염증성 제제 전환 성장 인자 알파(TNF-α, 최종 농도 25 ng/ml; 시그마 T0157)를 배양 배지에 첨가하고, 세포는 다시 37℃ 및 5% CO₂에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 상기 세포들을 얼음 상에 수집하고, 여러 가지 샘플들의 세포 핵은 공급업자가 추천하는 프로토콜에 따라 시그마 NUC-101 키트를 이용하여 분리하였다. 각각의 핵 추출물의 단백질 양은 바이오라드 500-0116 분석 키트를 이용하여 측정하였다. 특이적인 올리고뉴클레오티드에 결합된 활성화된 NFκB의 양은 각 샘플의 핵 추출물의 동일한 양, 즉 특이적인 항-NFκB 항체를 이용하는 시각화후 50 ml, 희석된 50/50에 대해 측정하였다. 본 분석은 공급업자의 프로토콜에 따라 머큐리 트랜스팩터 NFκB 분석 키트, BD 바이오사이언시즈 K2058-1을 이용하여 수행하였다.

c) NFκB 분석

결과는 하기 표 17에 나타냈다:

처리	NFκB (AU)	평균	% 대조군	P
처리하지 않은 대조군	10.71 8.39 8.90 10.19	9.55	100	-
TNF-α부재하의 대조군	0.00 0.62 0.62 -0.21	0.26	3	p<0.01
5 mM 설파살라진	4.93 4.01 2.88 4.93	4.19	44	p<0.01
0.1 μM 덱사메타손	10.94 7.3 9.90 9.67	9.46	99	p<0.05
본 발명에 따른 0.01% 혼합물	10.16 6.79 9.63 9.63	9.05	95	p<0.05

AU는 추출물 내 NFκB의 임의 단위를 의미한다; 이는 측정값과 바탕 노이즈 사이의 차이이다.

섬유아세포 핵 내 NFκB의 기본량은 매우 낮다. 25 ng/ml의 TNF-α를 이용하는 처리는 TNF-α가 존재하지 않는 대조군에 비해 약 37배 정도로 전사 인자 NFκB를 크게 활성화시켰다. 과량의 올리고뉴클레오티드를 이용하는 대조군을 통해 실질적으로 관찰된 전체적인 반응이 NFκB의 결합에 특이적임을 확인할 수 있었다. 5 mM 설파살라진, NFκB 전위에 대한 참조용 억제제는 TNF-α에 의해 유도된 전사 인자 NFκB의 활성화를 명백히 감소시켰다; TNF-α로 대조군의 44%, p < 0.01.

0.1 μM 덱사메타손은 TNF-α에 의해 유도된 NFκB의 핵 전위를 억제하지 않았다. 실제로, 덱사메타손은 NFκB-유도된 유전자의 트랜스활성화를 억제하였으나, NFκB의 활성화 또는 그의 핵으로의 전위를 억제하지 않았다. 따라서, 전사에 대한 억제 효과는 존재하나, NFκB의 전위에 대한 효과는 없었으며; 덱사메타손의 작용은 핵 수준에서 글루티코코르티코이드에 의해 일어나며, 따라서 설파살라진의 작용에 대해 후속적이다.

0.01%에서 테스트된 본 발명에 따른 생성물은 TNF-α에 의해 유도된 NFκB의 활성화를 현저히 변경시키지 않았다. 대조군의 95%였다. 이 결과는 다른 메카니즘에 의한 항염증 활성을 배제하지 않는다.

d) 결론

NFκB의 활성에서 마데카소시드 또는 그의 이성질체의 불간섭은 리간드, 예를 들어 병원성 항원 공격의 경우 세포 작동을 허용하는 염증성 시토킨 및 케모킨의 전사를 초래한다.

마데카소시드 및 그의 이성질체는 섬유아세포에 의해 생성된 NFκB의 활성화와, 또는 이 활성화에 대해 상호작용하지 않는다. 자가면역 해제에서 염증성 리간드, IL1, IL8, TNF-α, 막의 PGE2의 완화는 마데카소시드 및 그의 이성질체가 오히려 번역 수준에서 작용하며(염증을 향한 표류 현상에서 더 양호한 내성), 단백질, 펩티드 또는 리간드의 발현 및/또는 합성을 위한 시스템의 수준에서 작용한다(ILs의 더 적은 세포내 발현).

실시예 11: 피부염 균등 모델에서 배양된 인간 섬유아세포에 의한 세포외 매트릭스 메탈로프로테이나제에 대한 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물(50/50 w/w) 및 아시아티코시드의 조절 효과의 시험관 내 평가

본 실시예의 목적은 진피 균등물(콜라겐 격자)에서 배양된 인간 피부 섬유아세포에 의한 메탈로프로테이나제(MMPs) 및 그들의 특이적인 억제제(TIMPs)의 보호에 대한 아시아티코시드 및 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물(50/50 w/w)의 효과를 평가하기 위한 것이다. 상기 생성물의 부재 또는 존재 하에서 배양되고 TNF-α로 자극된 인간 섬유아세포에 의해 배양 배지 내로 방출된 MMP-1 및 TIMP-1의 양을 측정하는 것에 기초한 시험관 내 실험 방법이 제안되었다. 본 연구는 체외배양법에 따라 피부 생검으로부터 확립된 인간 섬유아세포에 대해 수행하였다. 상기 섬유아세포는 실험실에서 사용되는 기법에 태아 송아지 혈청(10% FCS) 및 항생제로 보충된 DMEM 배지(라이프 테크놀로지스에서 인비트로겐(등록상표)으로 시판됨) 내에서 습도 37%의 공기-CO₂ (95%-5%) 분위기 중에서 배양하였다.

a) 세포독성

본 세포독성 연구는 실시예 6과 동일한 방식으로 수행하였다.

아시아티코시드:

상기 생성물의 스톡 용액은 DMSO 중에서 미리 제조하고, 이어서, 배양 배지 내에서 희석하여 여러 가지 테스트 용액을 얻었다(DMSO의 최종 농도: 1%). 초기에 광범위한 8가지의 농도[5 내지 1000 ㎍/ml]를 연구하여 최대 비독성 투여량(NCD)을 결정하였다. 24시간 동안 접촉시킨 후, 테스트한 농도 범위 내에서는 현저한 세포독성 효과가 기록되지 않았다. 이들 결과에 기초하여, 48시간 동안 접촉시킨 후 최대 비독성 투여량(NCD)을 구체화하기 위해 10 내지 1000 ㎍/ml의 제한된 범위를 확립하였다. 결과(표 18)를 통해, 48시간 항온처리후 1 mg/ml 농도의 비독성을 확인하였다. 세포를 1 mg/ml의 상기 활성제의 존재하에서 항온처리하는 경우, 세포 생존률은 단지 12%까지만 감소되었다.

아시아티코시드 (pg/ml)	10	25	50	75	100	250	500	750	1000
생존률 (24 h)	98%	101%	101%	n.t.	101%	101%	97%	n.t.	93%
생존률 (48 h)	108%	107%	106%	104%	102%	99%	93%	90%	88%

n.t. 테스트하지 않음

마데카소시드-터미놀로시드 혼합물:

상기 생성물의 스톡 용액은 DMSO 중에서 미리 제조하고, 이어서, 배양 배지 내에서 희석하여 여러 가지 테스트 용액을 얻었다(DMSO의 최종 농도: 1%). 초기에 광범위한 8가지의 농도[0.005 내지 100 mg/ml]를 연구하여 최대 비독성 투여량(NCD)을 결정하였다. 24시간 동안 접촉시킨 후, 1 mg/ml와 동일한 농도는 뉴트럴 레드 흡수의 현저한 변경을 유도하지 않았다. 상기 범위를 초과하는 경우, 투여량 의존성 세포 독성 효과가 기록되었다. 이들 결과에 기초하여, 최대 비독성 투여량(NCD)을 구체화하기 위해 0.1 내지 10 mg/ml의 제한된 범위를 확립하였다.

결과(표 19)로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 접종 48시간 후, 상기 농도의 비독성은 1 mg/ml과 동일하였다.

마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물 (mg/ml)	0.05	0.1	0.25	0.5	0.75	1	2.5	5	7.5	10
생존률 (24 h)	98%	98%	n.t.	96%	n.t.	94%	n.t.	68%	n.t.	60%
생존률 (48 h)	n.t.	101%	96%	97%	99%	99%	99%	86%	71%	47%

n.t. 테스트하지 않음

세포독성 결과에 기초하여 "1 mg/ml" 농도가 MMPs의 생성에 대해 아시아티코시드 및 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 활성제를 테스트하기 위해 최대 비독성 투여량(NCD)으로 선택되었다.

b) 메탈로프로테이나제의 생성

단층으로 배양된 인간 진피 섬유아세포는 트립신 처리에 의해 그들의 지지체로부터 분리하였으며, 완전 배지 내에 현탁시켰다. 계수 후, 상기 세포 현탁액은 배양 배지 내에서 희석하고, 한정된 비율로 농축 배양 배지(1.76x DMEM), 태아 송아지 혈청(FCS)과 I형 콜라겐(래트 꼬리 건 유래의 아세트산 추출물)의 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 상기 혼합물을 냉 조건 하에서 1 ml/웰의 비율로 일제히 첨가하였다. 이어서, 진피 균등물은 37℃에서 위치시키고, 공기-CO₂ (95%/5%) 분위기에서 72시간 동안 항온처리하였다. 상기 겔은 점진적으로 섬유아세포의 작용하에 두었다.

시딩후 72시간에, 배양 배지를 제거하고 연구하려는 여러 가지 생성물을 함유하는 새로운 배지로 대체하였다("예방" 처리). 상기 겔은 37℃의 항온처리기에 복귀시키고, 공기-CO₂ (95%/5%) 분위기에서 24시간 동안 항온처리하였다.

항온처리 후, 상기 플레이트를 비웠다. 배양물은 세정하고, 이어서 연구하려는 각각의 생성물을 여러 가지 농도로 함유하거나 함유하고 있지 않은 상태의 TNF-α (10　ng/ml) 용액에 노출시켰다. TNF-α의 첨가 후, 배양물은 37℃의 항온처리기에 복귀시키고, 24시간 동안 유지하였다. 항온처리의 말미에 배지를 제거하고, 원심분리하고, MMP-1 및 TIMP-1을 분석하기 위해 분취하였다.

본 연구는 콜라겐의 3차원 겔(진피 균등물) 내에서 배양된 인간 섬유아세포에 대해 수행하였다.

조작 조건:

1. TNF-α를 이용하는 MMP-1의 유도 이전에 24시간 동안 세포의 TNF-α 처리.

2.　TNF-α (10　ng/ml)의 첨가에 의한 MMP-1의 유도. 24시간 동안 접종.

3.　대조군 및 처리된 배양 상청액에서 세포 생존률 및 MMP-1의 양 측정

아시아티코시드:

아시아티코시드는 3가지 농도에서 테스트하였다:

C₁= 0.2 mg/ml C₂= 0.5 mg/ml C₃= 1.0 mg/ml

세포 생존률 (뉴트럴 레드 분석)

10 ng/ml의 TNF-α를 이용한 세포 처리는 세포 생존률을 변경시키지 않았다. TNF-α에 대한 노출 후 뉴트럴 레드 흡수의 감소는 관찰되지 않았다. 유사하게, 아시아티코시드로 처리한 배양물의 생존률은 TNF-α를 이용하는 처리 후에도 변경되지 않았다.

MMP-1의 생성

하기 표 20에는 세포의 활성화 후 배양 상청액에서 얻은 MMP-1의 양(ng/ml)(+TNF)과 기본량(-TNF)을 함께 나타냈다.

	MMP-1의 생성 (ng MMP-1/ml)
	(-) TNF-α		(+) TNF-α
～으로 처리된 콜라겐 겔	평균	표준 편차	평균	표준 편차
대조군	2.24	0.54	12.11	1.03
아시아티코시드 (0.2 mg/ml)	측정되지 않음		9.96	0.47
아시아티코시드 (0.5 mg/ml)	측정되지 않음		6.18	0.15
아시아티코시드(1.0 mg/ml)	측정되지 않음		3.40	0.21

대조군 세포에서, 얻은 결과로부터 TNF-α는 MMP-1 생성의 명백한 자극을 유도하는 것을 확인하였다. 자극되지 않은 세포에서 기록된 기본량은 TNF-α를 이용하는 자극 후 503배였다.

처리된 세포에서, 아시아티코시드로 처리한 배양물 내에서 TNF-α를 이용하는 자극 후 기록된 MMP-1의 양은 (+)TNF-α 대조군에서 관찰된 것보다 적었다.

TNF-α-유도된 MMP-1의 생성에 관한 이사아티코시드의 효과는 투여량 의존적이다. 배치 C₁(p ≤　0.05), C₂(p ≤　0.01) 및 C₃(p ≤　0.01)에서 기록된 차이는 (+)TNF-α 대조군에 비해 통계학적으로 유의적인 것으로 확인되었다(스튜던트 t 테스트).

C₁: MMP-1 양에서 18% 감소

C₂: MMP-1 양에서 49% 감소

C₃: MMP-1 양에서 72% 감소

마데카소시드-터미놀로시드 혼합물

마데카소시드-터미놀로시드 혼합물은 3가지 농도에서 테스트하였다:

C₁ = 0.2 mg/ml C₂ = 0.5 mg/ml C₃ = 1.0 mg/ml

세포 생존률(뉴트럴 레드 분석)

마데카소시드-터미놀로시드 혼합물을 이용하여 처리한 배양물의 생존률은 TNF-α를 이용하는 처리 후 변경되지 않았다.

MMP-1의 생성

상기 결과는 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물로 처리되고 TNF-α로 자극된 배양물의 상청액에서 MMP-1의 양이 투여량 의존적으로 감소됨을 나타낸다. 단지 처리된 배치 C₂ 및 C₃ 에서 기록된 차이만이 통계학적으로 유의적이었다(p　≤ 0.01, 스튜던트 t 테스트):

C₁: MMP-1 양에서 3% 감소

C₂: MMP-1 양에서 39% 감소

C₃: MMP-1 양에서 61% 감소.

하기 표 21에는 세포의 활성화 후 배양 상청액에서 얻은 MMP-1의 양(ng/ml)(+TNF)과 기본량(-TNF)을 함께 나타냈다.

	MMP-1의 생성 (ng MMP-1/ml)
	(-) TNF-α		(+) TNF-α
～로 처리된 콜라겐 겔	평균	표준 편차	평균	표준 편차
대조군	2.24	0.54	12.11	1.03
마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 (0.2 mg/ml)	측정되지 않음		11.78	0.83
마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 (0.5 mg/ml)	측정되지 않음		7.37	0.76
마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 (1.0 mg/ml)	측정되지 않음		4.76	0.52

c) TIMP-1의 생성

또한, MMP-1에 특이적인 억제제인 TIMP-1의 양은 아시아티코시드 또는 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물로 처리한 배양물의 상청액 내에서 측정하였다. 각각의 활성제는 3가지 농도에서 테스트하였다:

C1 = 0.2 mg/ml C2 = 0.5 mg/ml 및 C3 = 1.0　mg/ml

하기 표 22에는 세포의 활성화 후 배양 상청액에서 얻은 TIMP-1의 양(ng/ml)(+TNF)과 기본량(-TNF)을 함께 나타냈다.

	TIMP-1의 생성 (ng TIMP-1/ml)
	(-) TNF-α		(+) TNF-α
～으로 처리된 콜라겐 겔	평균	표준편차	평균	표준편차
대조군	51.20	1.22	48.90	2.16
아시아티코시드 (0.2 mg/ml)	측정되지 않음		51.01	1.51
아시아티코시드 (0.5 mg/ml)	측정되지 않음		50.36	1.67
아시아티코시드 (1.0 mg/ml)	측정되지 않음		48.82	2.22
마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 (0.2 mg/ml)	측정되지 않음		48.63	1.18
마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 (0.5 mg/ml)	측정되지 않음		46.98	2.02
마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 (1.0 mg/ml)	측정되지 않음		48.76	0.92

상기 결과로부터 다음과 같은 사실을 확인할 수 있다:

- 콜라겐 겔 내에서 배양된 섬유아세포에 의한 TIMP-1의 생성은 TNF-α에 의해 변경되지 않는다;

- 아시아티코시드 및 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물로 구성되는 활성제는 테스트된 농도 범위 내에서 TIMP-1의 생성에 대해 효과가 없었다.

d) 결론

메타로프로테이나제(MMPs) 및 그들의 특이적인 억제제(TIMPs)에 대한 아시아티코시드 및 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물로 이루어지는 활성제의 조절 효과는 인간 진피 모델을 이용하여 시험관 내에서 평가하였다. 본 연구는 3차원 콜라겐 매트릭스에서 배양된 정상적인 인간 섬유아세포에 대해 수행하였다. 상기 활성제의 효과는 TNF-α를 이용하는 세포 활성화 후 배양 상청액 내의 MMP-1 및 TIMP-1의 양을 측정함으로써 평가하였다.

선택된 실험 조건 하에서, 본 연구 결과를 통해 다음과 같은 사실을 확인할 수 있다:

- 비세포독성 투여량(10 ng/ml)에서 TNF-α는 MMP-1의 생성에서 상당한 증가를 유도하였다. 한편, TIMP-1의 생성은 TNF-α를 이용하는 처리 후 변경되지 않았다;

- 아시아티코시드 및 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물로 구성되는 활성제는 투여량 의존 방식으로 TNF-α-유도된 MMP-1의 생성을 감소시킬 수 있었다. 테스트된 가장 높은 농도(1 mg/ml)에서, 이들 2개의 활성제는 각각 TNF-α에 의해 유도된 MMP-1의 양을 각각 72% 및 61% 감소시킬 수 있었다;

- 아시아티코시드 및 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물은 테스트된 농도 범위 내에서 TIMP-1의 생성에 대해 효과가 없었다.

인간 섬유아세포에 대해 수행된 본 연구는 TNF-α의 염증성 자극 하에서 배양 배지 내로의 MMP-1(콜라게나제)의 방출을 상당하게 증가(530%)시키는 것을 관찰할 수 있게 해주었다. 아시아티코시드와 같이 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물은 투여량 의존 방식으로 MMP-1의 농도를 현저히 감소시켰다(500　마이크로그램/kg에서 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 = -39% 및 아시아티코시드 = -49%). MMP1 억제제인 TIMPs 및 구체적으로 TIMP1의 방출은 변경되지 않았다. 이 결과는 SKALPs에 대해 수행된 연구 결과(실시예 9)와 비교할 수 있는데, 그 이유는 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물의 존재 하에서, 고농도의 루코프로테아제는 억제제의 분비를 증가시키지 않으나, 각질형성세포에 의한 전염증성 리간드의 분비는 크게 감소시켰다.

이는 또한 마데카소시드-터미놀로시드 혼합물 및 아시아티코시드가 2개의 피부 구획, 즉 상피와 진피에 대한 활성제임을 암시한다.

실시예 12: 터미놀로시드, 마데카소시드 및 헤테로시드(마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드)의 혼합물의 항염증 활성:

본 실시예에서, 헤테로시드의 혼합물은 혼합물의 총 중량을 기준으로 터미놀로시드 40 wt%, 마데카소시드 40 wt% 및 아시아티코시드 20 wt%로 구성된다.

터미놀로시드, 마데카소시드 및 헤테로시드의 혼합물의 항염증 활성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 인터페론-감마(IFN-γ) 또는 PMA에 의해 유도된 자극성 스트레스에 노출된 배양물 내의 인간 각질형성세포에 의한 전염증성 상피세포 시토킨(IL-1α, IL-8, PGE-2)의 생성 및 방출에 대한 이들 3가지 활성제의 조절 효과를 연구하였다. 인간 각질형성세포는 인간 피부로부터 분리하였다. 상기 세포는 실험실에서 사용되는 통상적인 기법에 따라 무혈청 KGM 배지(클론틱스(등록상표)에서 시판되는 각질형성세포 성장 배지) 중에서, 37℃ 및 습한 공기-CO₂ (95%-5%) 분위기 하에서 배양하였다. 상기 세포는 25 cm² 플라스크에 시딩하고, 융합에 이를 때까지 규칙적으로 계대배양하였다. 분석 원리는 자극성 스트레스에 반응하여 인간 각질형성세포에 의한 전염증성 시토킨의 생성을 평가하는 것에 기초한다. 상기 방법은 IL-1α의 세포내 양 및 연구하려는 생성물의 부재 또는 존재 하에서 배양되고 인터페론-감마(IFN-γ) 또는 PMA(포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트)로 자극된 각질형성세포에 의해 세포외 배지 내로 방출된 IL-8 및 PGE-2의 양을 측정하는 것에 기초한다.

a) 세포독성

본 세포독성 연구는 실시예 6과 동일한 방식으로 HaCaT 인간 각질형성세포 및 정상 인간 각질형성세포에 대해 수행하였다.

터미놀로시드:

* HaCaT 인간 각질형성세포에 대한 세포독성

하기 표 23은 모든 결과를 함께 나타냈다(대조군의 %로서 세포 생존률)

농도 (mg/ml)	0.05	0.1	0.25	0.5	0.75	1	2.5	5	7.5	10
생존률 (24 h)	105%	104%	105%	105%	n.t.	104%	100%	81%	n.t.	73%
생존률 (72 h)	n.t.	100%	101%	101%	103%	102%	103%	93%	86%	69%

n.t.: 테스트하지 않음

24시간 동안 접촉 후, ≤ 2.5 mg/ml의 농도는 RN에 관해 세포 반응의 현저한 변경을 유도하지 않았다. 2.5 mg/ml를 초과하는 농도에서는 약간의 투여량 의존성 세포독성 효과가 기록되었다.

* 인간 각질형성세포에 대한 세포독성

세포독성 연구 이외에, 표적 세포에 대해 상기 농도의 비독성을 확인하기 위해 인간 각질형성세포(균주 K_02-1H₄)에 대해 분석을 수행하였다.

하기 표 24에는 모든 결과를 함께 나타냈다(대조군의 %로서 세포 생존률).

농도 (mg/ml)	0.25	0.5	0.75	1.0	2.5	5	10
생존률 (72 h)	101%	103%	103%	102%	99%	96%	69%

상기 결과로부터 72시간 동안 항온처리 후 2.5 mg/ml 이하 농도의 세포독성을 확인하였다.

마데카소시드:

* HaCaT 인간 각질형성세포에 대한 세포독성

하기 표 25에는 모든 결과를 함께 나타냈다:

농도 (mg/ml)	0.05	0.1	0.25	0.5	0.75	1	2.5	5	7.5	10
생존률 (24 h)	105%	102%	103%	99%	n.t.	100%	85%	75%	n.t.	63%
생존률 (72 h)	n.t.	101%	102%	102%	101%	101%	92%	76%	71%	56%

24시간 동안 접촉 후, 1.0　mg/ml 미만의 농도는 RN에 대해 세포 반응의 현저한 변경을 유도하지 않았다. 1.0 mg/ml을 초과하는 농도에서는 약간의 투여량 의존성 세포독성 효과가 기록되었다.

* 인간 각질형성세포에 대한 세포독성

하기 표 26에는 모든 결과를 함께 나타냈다(대조군의 %로서 세포 생존률).

농도 (mg/ml)	0.25	0.5	0.75	1.0	2.5	5	10
생존률 (72 h)	102%	101%	102%	101%	97%	88%	72%

상기 결과로부터 2.5 mg/ml 미만의 농도의 비세포독성을 확인하였다. 이 농도를 초과하는 경우, 약간의 투여량 의존성 세포독성 효과가 기록되었다.

헤테로시드:

* HaCaT 인간 각질형성세포에 대한 세포독성

하기 표 27에는 모든 결과를 함께 나타냈다(대조군의 %로서 세포 생존률).

농도 (mg/ml)	0.1	0.25	0.5	0.75	1	2.5	5	7.5	10
생존률 (24 h)	102%	103%	99%	100%	85%	85%	75%	n.t.	63%
생존률 (72 h)	100%	101%	97%	95%	97%	90%	80%	74%	38%

* 인간 각질형성세포 대한 세포독성

하기 표 28에는 모든 결과를 함께 나타냈다(대조군의 %로서 세포 생존률).

농도 (mg/ml)	0.1	0.25	0.5	0.75	1.0	2.5	5	10
생존률 (72 h)	97%	97%	99%	93%	88%	64%	34%	12%

상기 결과로부터 0.75 mg/ml 미만 농도의 비세포독성을 확인하였다. 상기 농도 범위를 초과하는 경우, 약간의 투여량 의존성 세포독성 효과가 기록되었다. 이들 결과에 기초하여, 1　mg/ml의 농도를 상기 3개의 활성제의 항염증 활성을 테스트하기 위한 최대 투여량으로 선택하였다.

b) 인터페론-γ의 효과:

상피세포 시토킨의 생성 및 방출에 대한 인터페론-감마(IFN-γ)의 효과는 정상적인 인간 각질형성세포(균주 K_02-1H₄)에 대해 연구하였다. 4가지 농도의 IFN-γ를 테스트하였다:

C₁ = 100 U/ml C₂ = 500 U/ml C₃ = 1000 U/ml C₄ = 2000　U/ml

세포내 IL-1α의 생성:

결과는 하기 표 29에 나타냈다:

IL-1α (pg/㎍ 단백질)	대조군	인터페론-γ (U/ml)
	0	100	500	1000	2000
평균	3.25	6.80	8.29	11.21	12.48
표준 편차	0.05	0.12	0.12	0.73	0.80

획득된 결과로부터, 테스트된 농도 범위 내의에서 인터페론-γ는 투여량 의존 방식으로 세포내 IL-1α 생성을 명백히 자극하는 것을 확인하였다. 자극되지 않은 세포에서 기록된 기본량(3.25 +/- 0.05 pg/㎍ 단백질)은 각각 1000 및 2000 pg/ml에서 IFN-γ를 이용하는 자극 후 각각 2.6배 및 3.8배였다.

IL-8의 방출:

IL-8의 생성 및 방출에 대한 IFN-γ의 효과는 동일한 실험 조건 하에서 연구하였다. 결과는 하기 표 30에 나타냈다:

IL-8 (pg/㎍ 단백질)	대조군	인터페론-γ (U/ml)
	0	100	500	1000	2000
평균	0.093	0.252	0.350	0.516	0.671
표준편차	0.013	0.042	0.009	0.004	0.048

IFN-γ를 이용하여 자극하지 않은 배양물(-IFN-γ)에서 획득한 결과로부터 기본 상태에서 각질형성세포를 위한 항온처리 배지 내에 극소량의 IL-8의 존재 또는 부재를 확인하였다. 한편, IFN-γ를 이용하는 자극 후 IL-8의 생성 및 방출의 명백한 자극이 기록되었다. 배양물(+IFN-γ)에서 세포내 IL-8의 양의 이러한 투여량 의존성 증가로부터 IL-8의 생성 및 방출에 대한 상기 전염증성 시토킨의 역할을 확인하였다.

PGE-2의 방출:

PGE-2의 생성 및 방출에 대한 IFN-γ의 효과는 전술한 것과 동일한 실험 조건 하에서 연구하였다(표 31).

세포외 PGE-2 (pg/㎍ 단백질)	대조군	인터페론-γ (U/ml)
	0	100	500	1000	2000
평균	10.49	3.60	3.45	3.48	3.80
표준편차	3.16	0.61	0.32	0.74	0.13

상기 결과로부터 IFN-γ는 테스트된 농도 범위 내에서 PGE-2의 생성 및 방출을 자극시킬 수 없음을 확인하였다.

c) 항염증 활성:

본 연구는 아동의 포피로부터 분리한 각질형성세포(균주 K_02-1H₆)에 대해 수행하였다.

각각의 활성제, 터미놀로시드, 마데카소시드 및 헤테로시드는 4가지 농도에서 테스트하였다:

C₁= 0.01 mg/ml C₂= 0.25 mg/ml C₃= 0.50 mg/ml C₄= 1.00　mg/ml

분석 조건:

1. 자극성 스트레스의 유도 이전에 연구하려는 생성물을 이용하여 48시간 동안 세포의 처리;

2. 자극성 스트레스의 유도: IFN-γ (1000 U/ml);

3. 연구하려는 생성물의 존재 하에서 24시간 동안 활성화된 세포의 항온처리;

4. 분석: IL-8 (세포외) 및 IL-1α (세포내). 세포성 단백질 분석.

IL-8의 방출:

하기 표 32 내지 표 34에는 세포의 활성화 후 얻은 IL-8의 양(+IFN-γ) 및 기본량(-IFN-γ)을 함께 나타냈다. IL-8의 IFN-γ-유도된 생성 및 항염증성 활성(AIA)은 하기 수학식 1에 따라 각각의 활성제 농도에 대해 계산하였다:

AIA = [(IL-8_{(대조군 세포 + IFN)} - IL-8_{(처리된 세포 - IFN)} / IL-8_{(대조군 세포 + IFN)}] x 100

터미놀로시드:

	대조군 (-IFN-γ)	대조군 (+IFN-γ)	IFN-γ + 터미놀로시드
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
IL-8 (pg/㎍ 단백질)	0.099+/- 0.005	0.843+/- 0.026	0.862+/- 0.076	0.762+/- 0.052	0.708+/- 0.030	0.492+/- 0.014
항염증 활성(%)			0%	9%	15%	42%

IFN-γ를 이용하는 자극 후 대조군 배양물에서 매우 상당한 양의 IL-8 방출이 관찰되었다. 자극되지 않은 배양물에서 기록된 매우 작은 기본량은 IL-8이 기본 상태에서 존재하지 않으나, 그의 발현 및 그의 방출은 IFN-γ에 의해 유도될 수 있음을 나타낸다. 기본량은 IFN-γ을 이용하는 자극 후 8.5배였다. 활성제 터미놀로시드로 처리한 배양물에서 IFN-γ를 이용하는 자극 후 기록된 IL-8의 양은 (+)IFN-γ 대조군의 양보다 적었다.

IFN-γ-유도된 IL-8의 방출에 대한 활성제 터미놀로시드의 효과는 투여량 의존성이었다. C₂(p ≤ 0.05), C₃ (p ≤　0.01) 및 C₄ (p ≤ 0.01)에서 기록된 차이는 (+)IFN-γ 대조군에 비해 통계학적으로 유의적인 것으로 확인되었다(스튜던트 t 테스트). 테스트된 최고 농도(1 mg/ml)는 IFN-γ-유도된 IL-8의 생성을 최고 42%까지 감소시킬 수 있었다.

마데카소시드:

	대조군 (-IFN-γ)	대조군 (+IFN-γ)	IFN-γ + 마데카소시드
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
IL-8 (pg/㎍ 단백질)	0.099+/- 0.005	0.843+/- 0.026	0.656+/- 0.043	0.643+/- 0.047	0.614+/- 0.039	0.368+/- 0.019
항염증 활성(%)			21%	24%	27%	56%

상기 결과로부터 마데카소시드로 처리되고 IFN-γ로 자극된 배치에서 IL-8의 투여량 의존성 감소를 확인하였다. 배치 C₁, C₂, C₃ 및 C₄ 에서의 차이는 통계학적으로 유의적이었다(p ≤ 0.01, 스튜던트 t 테스트). 1 mg/ml의 농도는 IL-8의 생성을 56%까지 감소시킬 수 있었다.

헤테로시드:

	대조군 (-IFN-γ)	대조군 (+IFN-γ)	IFN-γ + 헤테로시드
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
IL-8 (pg/㎍ 단백질)	0.099+/- 0.005	0.843+/- 0.026	0.83+/- 0.04	0.63+/- 0.1	0.47+/- 0.06	0.36+/- 0.01
항염증 활성(%)			1%	25%	44%	57%

상기 결과로부터 헤테로시드(마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드)의 혼합물로 처리하고 IFN-γ로 자극된 배치에서 IL-8의 투여량 의존성 감소를 확인하였다. C₁, C₂, C₃ 및 C₄ 에서의 차이는 통계학적으로 유의적이었다(p ≤ 0.01, 스튜던트 t 테스트). 1 mg/ml의 농도는 IL-8의 생성을 57%까지 감소시킬 수 있었다.

세포내 IL-1α의 생성:

하기 표 34 내지 36은 세포의 활성화 후 IL-1α의 양(+IFN-γ) 및 기본량(-IFN-γ)을 함께 나타냈다. IL-1α의 IFN-γ-유도된 생성 및 항염증 활성(AIA)은 하기 화학식 2에 따라 각각의 농도에 대해 계산하였다:

IL-1α 생성 = IL-1α_(+IFN)- IL-1α_(-IFN)

AIA=[(IL-1α 생성_{(대조군 세포)}- IL-1α 생성_{(처리된 세포)} / IL-1α 생성_{(대조군 세포)}] x 100

터미놀로시드:

	대조군 (-IFN-γ)	대조군 (+IFN-γ)	IFN-γ + 터미놀로시드
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
IL-1α (pg/㎍ 단백질)	2.71+/- 0.09	10.04+/- 0.44	8.78+/- 0.77	8.08+/- 0.43	7.31+/- 0.38	5.02+/- 0.13
IL-1α 생성		7.33	6.07	5.37	4.60	2.31
항염증 활성(%)			17%	27%	37%	68%

(+IFN-γ) 대조군 배치에서, IL-1α의 기본량은 IFN-γ로 처리한 후 3.7배였는데, 이로부터 IL-1α가 세포내 생성이 IFN-γ로 유도될 수 있는 시토킨임을 확인하였다. IL-1α 양의 명백한 감소는 활성제 터미놀로시드로 처리한 배양물에서 기록되었다. 상기 억제 효과는 투여량 의존성이었다. C₁(p ≤　0.05), C₂ (p ≤　0.01), C₃(p ≤　0.01) 및 C₄(p ≤　0.01)에서의 차이는 (+IFN-γ) 대조군에 비해 통계학적으로 유의적이었다(스튜던트 t 테스트).

1 mg/ml의 활성제는 IL-1α의 IFN-γ-유도된 생성을 68%까지 감소시킬 수 있었다.

마데카소시드:

	대조군 (-IFN-γ)	대조군 (+IFN-γ)	IFN-γ + 마데카소시드
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
IL-1α (pg/㎍ 단백질)	2.71+/- 0.09	10.04+/- 0.44	8.23+/- 0.57	8.23+/- 0.64	8.07+/- 0.69	6.05+/- 0.37
IL-1α 생성		7.33	5.52	5.52	5.36	3.34
항염증 활성 (%)			25%	25%	27%	54%

상기 결과로부터 활성제 마데카소시드 1 mg/ml로 처리한 배양물 내에서 IL-1α의 양이 54% 감소(p ≤ 0.01)됨을 확인하였다. 한편, C₁, C₂ 및 C₃ 농도는 균등한 것으로 나타났다: IL-1α 양의 25% 감소(p ≤ 0.01)가 관찰되었다.

헤테로시드:

	대조군 (-IFN-γ)	대조군 (+IFN-γ)	IFN-γ + 헤테로시드
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
IL-1α (pg/㎍ 단백질)	2.71+/- 0.09	10.04+/- 0.44	8.78+/- 0.13	9.03+/- 0.83	7.52+/- 0.38	5.56+/- 0.39
IL-1α 생성		7.33	6.07	6.32	4.81	2.85
항염증 활성 (%)			17%	14%	34%	61%

상기 결과로부터, 헤테로시드의 혼합물 1 mg/ml로 처리한 배양물에서 IL-1α 양의 61% 감소(p ≤ 0.01)를 확인하였다.

d) 항염증 활성-PMA 스트레스:

PGE-2의 생성 및 방출에 대한 IFN-γ의 효과가 결핍되는 경우를 고려하여, 활성제의 항염증 활성을 PMA로 자극된 정상적인 인간 각질형성세포(균주 K_02-1H₆)에 대해 연구하였다. 각각의 활성제는 4가지 농도에서 테스트하였다:

C1 = 0.10 mg/ml C2 = 0.25 mg/ml C3 = 0.50 mg/ml C4 = 1.00　mg/ml

분석 조건:

1. 자극성 스트레스의 유도 이전에 연구하려는 생성물을 이용하는 48시간 동안 세포의 처리;

2. 자극성 스트레스의 유도: PMA (10 ng/ml);

4. 분석: PGE-2 (세포외) 및 세포성 단백질 분석.

PGE-2의 방출:

하기 표 37 내지 39에는 세포의 활성화 후 얻은 PGE-2의 양(pg/㎍ 단백질)(+PMA) 및 기본량(-PMA)을 함께 나타냈다. PGE-2의 PMA-유도된 생성 및 항염증 활성(AIA)은 하기 수학식 3에 따라 각각의 농도에서 계산하였다:

PGE-2 생성 = [(PGE-2_(+PMA)- PGE-2_(-PMA))]

AIA=[(PGE-2 생성_{(대조군 세포)}- PGE-2 생성_{(처리된 세포)}) / PGE-2 생성_{(대조군 세포)}] x 100

터미놀로시드:

	대조군 (-PMA)	대조군 (+PMA)	PMA + 활성제 "터미놀로시드"
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
PGE-2 (pg/㎍ 단백질)	165.8+/- 19.8	660.0+/- 51.6	660.0+/- 29.9	606.80+/-63.6	445.7+/- 16.7	321.0+/- 21.1
PGE-2 생성		494.2	494.2	441.0	279.9	115.2
항염증 활성 (%)			0%	10.8%	43.4%	68.6%

대조군 (+ PMA) 배치에서, PMA에 대한 각질형성세포의 노출은 대조군 배양 배지 내로 PGE-2의 매우 상당한 생성 및 방출을 초래하였다. 자극되지 않은 배양물에서 기록된 기본량은 PMA 자극 후 4배였는데, 이로부터 PGE-2가 발현, 생성 및 방출이 PMA에 의해 유도될 수 있는 시토킨임을 확인하였다. 상기 결과로부터, 터미놀로시드로 처리되고 PMA로 자극된 배치에서 PGE-2의 투여량 의존성 감소를 확인하였다. 배치 C₃ 및 C₄ 에서의 차이는 통계학적으로 유의적이었다(p ≤ 0.01, 스튜던트 t 테스트). 1　mg/ml의 농도는 PGE-2의 방출을 69%까지 감소시킬 수 있었다.

마데카소시드:

	대조군 (-PMA)	대조군 (+PMA)	PMA + 마데카소시드
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
PGE-2 (pg/㎍ 단백질)	165.8+/- 19.8	660.0+/- 51.6	622.7+/- 18.9	618.1+/- 20.7	436.3+/- 32.1	348.3+/- 17.8
PGE-2 생성		494.2	456.9	452.3	270.5	182.5
항염증 활성 (%)			7.5%	8.5%	45.3%	63.1%

PGE-2 양의 명백한 감소는 활성제 마데카소시드로 처리한 배양물에서 기록되었다. 상기 억제 활성은 투여량 의존성이었다. 단지 C₃ 및 C₄ 에서의 차이만 (+)PMA 대조군에 비해 통계학적으로 유의적이었다(p ≤ 0.01, 스튜던트 t 테스트). 활성제 마데카소시드는 1 mg/ml의 농도에서 PGE-2의 PMA-유도된 생성을 63%까지 감소시킬 수 있었다.

헤테로시드:

	대조군 (-PMA)	대조군 (+PMA)	PMA + 헤테로시드
	-	0 mg/ml	0.1 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	1 mg/ml
PGE-2 (pg/㎍ 단백질)	165.8+/- 19.8	660.0+/- 51.6	646.5+/- 33.8	515.1+/- 48.4	326.8+/- 15.5	142.1+/- 6.6
PGE-2 생성		494.2	480.7	349.3	161.0	0
항염증 활성 (%)			2.7%	29.3%	67.4%	100%

상기 억제 효과는 투여량 의존성이었다. 헤테로시드의 혼합물은 1 mg/ml의 농도에서 PGE-2의 PMA-유도된 생성을 완전히 억제할 수 있었다.

e) 결론:

활성제 터미놀로시드, 마데카소시드 및 헤테로시드의 항염증 활성은 염증 과정의 단계에서 중요한 역할을 수행하는 상피세포 시토킨(IL-8, IL-1α 및 PGE-2)의 생성을 조절할 수 있는 그들의 능력을 통해 시험관 내 모델에서 평가하였다. 상기 연구는 인터페론-γ(IFN-γ) 또는 PMA로 자극된 정상적인 인간 각질형성세포에 대해 수행하였다.

연구된 활성제의 항염증 활성은 하기 량을 측정함으로써 평가하였다:

IFN-γ를 이용하는 활성화 후 IL-8 및 IL-1α.

PMA를 이용하는 자극 후 PGE-2.

선택된 실험 조건 하에서, 상기 연구를 통해 다음과 같은 사실을 확인하였다:

- 테스트된 농도 범위(100 내지 2000 U/ml) 내에서 IFN-γ는 투여량 의존 방식으로 IL-1α(세포내) 생성의 명백한 자극을 유도하였으며, IL-8의 생성 및 배양 배지 내로의 방출을 초래하였다. 한편, 동일한 농도의 IFN-γ는 PGE-2의 방출을 자극할 수 없었다.

- 비독성 투여량(10 ng/ml)의 PMA는 배양 배지 내로의 PGE-2의 방출을 초래하였다.

- 활성제 터미놀로시드, 마데카소시드 및 헤테로시드는 인터루킨 IL-8 및 IL-1α의 생성을 조절할 수 있었으며, 또한 염증성 스트레스에 반응하여 프로스타글란딘-2의 생성도 조절할 수 있었다. 시토킨 양의 비교는 연구된 생성물에 따라 가변적인 항염증성 효과, 고려하는 시토킨의 유형 및 관찰된 변화를 입증하였다:

IL-8에 대하여

테스트된 3가지 활성제는 투여량 의존 방식으로 상기 시토킨의 생성 및 세포외 방출을 조절할 수 있었다.

최고 농도로 세포를 처리한 후 기록된 시토킨의 양을 고려하는 경우, 테스트된 3가지 생성물은 그들의 항염증성의 크기에 따라 다음과 같이 분류할 수 있다:

헤테로시드 > 마데카소시드 > 터미놀로시드

IL-1α에 대하여

테스트된 3가지 활성제 또한 IL-1α의 IFN-γ-유도된 생성 및 세포내 축적을 감소시킬 수 있었다. 테스트된 3가지 생성물은 최대 항염증 효과에 따라 다음과 같이 분류할 수 있다:

터미놀로시드 ≥ 헤테로시드 ≥ 마데카소시드

PGE-2에 대하여

2가지 활성제 마데카소시드 및 터미놀로시드는 PGE-2의 PMA-유도된 방출을 매우 명백하게 감소시킬 수 있었다. 헤테로시드의 혼합물은 PMA-유도된 생성을 완전히 억제시킬 수 있었다. 이들 결과를 이용하여 생성물을 다음과 같이 분류할 수 있다:

헤테로시드 > 마데카소시드 ≒ 터미놀로시드

염증 과정에서 이들 시토킨의 중요한 역할을 고려하면, 인터류킨 IL-8 및 IL-1α의 생성 및 헤테로시드의 능력 및 시험관 내에서 자극된 각질형성세포에 의한 프로스타글란딘-2의 생성을 실질적으로 조절할 수 있는 활성제 터미놀로시드, 마데카소시드의 능력은 소정의 "항염증 활성"에 매우 적합한 요소로서 고려될 수 있다.

Claims

마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물을 포함하는 센텔라 아시아티카 (Centella asiatica)의 추출물을 제조하는 방법으로서,

a) 알콜 용매에 의해 센텔라 아시아티카의 땅 위 부분을 추출하는 단계;

b) 단계 a)에서 얻은 알콜 용액을 음이온성 수지 상으로 통과시키는 단계;

c) 단계 b)에서 얻은 용출액을 액체/액체 추출법에 의해 선택적으로 탈지시키는 단계;

d) 탈지된 수성-알콜 상을 연속 여과에 의해 수성 상으로 농축시키는 단계;

e) 단계 d)에서 얻은 수성 상을 양이온성 수지 상으로 및 이어서 음이온성 수지 상으로 연속 통과시키는 단계; 및

f) 단계 e)에서 얻은 수성상을 알콜의 첨가에 의해 안정화시켜 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법으로서,

a) 알콜 용매에 의해 센텔라 아시아티카의 땅 위 부분을 추출하는 단계;

b) 단계 a)에서 얻은 알콜 용액을 음이온성 수지 상으로 통과시키는 단계;

c) 단계 b)에서 얻은 용출액을 액체/액체 추출법에 의해 선택적으로 탈지시키는 단계;

d) 탈지된 수성-알콜 상을 연속 여과에 의해 수성 상으로 농축시키는 단계;

e) 단계 d)에서 얻은 수성 상을 양이온성 수지 상으로 및 이어서 음이온성 수지 상으로 연속 통과시키는 단계;

f) 단계 e)에서 얻은 수성상을 알콜의 첨가에 의해 안정화시키고, 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코사이드를 포함하는 혼합물을 얻는 단계;

g) 단계 f)에서 얻은 예비 정제된 수성-알콜 상을 선택적으로 크로마토그래피하는 단계; 및

h) 마데카소시드 및 터미놀로시드의 혼합물을 그 최종 형태로 회수하는 단계를 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)에 사용된 음이온성 수지가 4차 암모늄 형태의 작용기를 가진 강 음이온성 수지인 것인 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 e)에 사용된 양이온성 수지가 설포네이트 형태의 작용기를 가진 강 양이온성 수지인 것인 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 e)에 사용된 음이온성 수지가 4차 암모늄 형태의 작용기를 가진 강 음이온성 수지인 것인 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 단계 g)의 선택적 크로마토그래피 중에 사용된 용매가 물/에탄올 비율이 50/50 내지 90/10 부피/부피인 물과 에탄올의 혼합물인 것인 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 선택적 크로마토그래피 중에 사용된 정지상이 비극성 정지상인 것인 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물이 추출물의 총중량에 상대적인 양으로 95 중량% 이상의 순도로 얻어지는 것인 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
삭제
삭제
제1항, 제2항, 및 제6항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이에 병행하여( in parallel),

제2항에 따른 방법으로 얻을 수 있고, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물을 95 중량% 이상 포함하는, 또는, 이에 부가하여, 상기 혼합물이 총중량에 대한 마데카소시드의 비가 30 중량% 내지 70 중량%인 센텔라 아시아티카의 추출물을 소정량 첨가함에 의해,

제1항 또는 제2항의 단계 f)에서 얻어진 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코사이드를 포함하는 혼합물을 표준화하고,

이렇게 얻어진 최종 추출물이, 그 최종 추출물의 총중량에 대하여 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코사이드를 포함하는 혼합물이 90 중량% 내지 98 중량%의 순도가 되도록 하는 것으로 이루어진 단계를 추가로 포함하는 센텔라 아시아티카의 추출물을 제조하는 방법.
삭제
삭제
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제2항에 따른 방법으로 얻을 수 있고, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물을 95 중량% 이상 포함하는, 또는, 이에 부가하여, 상기 혼합물이 총중량에 대한 마데카소시드의 비가 30 중량% 내지 70 중량%인 센텔라 아시아티카의 추출물을 포함하는 항염증용 약학적 조성물.
제2항에 따른 방법으로 얻을 수 있고, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물을 95 중량% 이상 포함하는, 또는, 이에 부가하여, 상기 혼합물이 총중량에 대한 마데카소시드의 비가 30 중량% 내지 70 중량%인 센텔라 아시아티카의 추출물을 포함하는, 자가면역 질병, 만성 염증 질병, 아토피성 염증 질병 또는 장 질병의 치료를 위한 약학적 조성물.
제2항에 따른 방법으로 얻을 수 있고, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물을 95 중량% 이상 포함하는, 또는, 이에 부가하여, 상기 혼합물이 총중량에 대한 마데카소시드의 비가 30 중량% 내지 70 중량%인 센텔라 아시아티카의 추출물을 포함하는, 건선, 백반증, 비강진 (pityriasis), 경피증 (scleroderma), 수포성 피부병 (bullous dermatoses), 습진, 아토피성 피부염, 알레르기 또는 류머티스성 관절염의 치료를 위한 약학적 조성물.
제2항에 따른 방법으로 얻을 수 있고, 마데카소시드와 터미놀로시드의 혼합물을 95 중량% 이상 포함하는, 또는, 이에 부가하여, 상기 혼합물이 총중량에 대한 마데카소시드의 비가 30 중량% 내지 70 중량%인 센텔라 아시아티카의 추출물을 포함하는, 노화와 관련된 만성 염증의 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물.
제18항에 있어서, 과민성 감각 (anaphylactic sensitizations), 피부의 색소 이상, 피부의 과다 혈관 형성 및 염증성 균열 노화로부터 선택되는 질병의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물.
제18항에 있어서,피부 조직 항상성 조절제인 약학적 조성물.
제11항의 방법으로 얻을 수 있고, 마데카소시드, 터미놀로시드 및 아시아티코시드의 혼합물을 전체 중량과 비교하여 75 중량% 이상 포함하는 센텔라 아시아티카의 표준화된 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
제21항에 있어서, 피부의 노화로부터 유발가능한 모든 병리학적 자가면역의 예방, 피부의 자연 노화의 지연, 및 외부 공격에 의한 피부노화 촉진의 예방을 위한 화장료 조성물.
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