CN117815127A - 丝聚蛋白基因flg的表达促进剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂，其中，所述表达促进剂是垫状卷柏提取物，所述垫状卷柏提取物中总糖含量≥5.72wt％，总多酚含量≥0.3wt％，和/或总黄酮含量≥1.12wt％。本发明还涉及垫状卷柏提取物作为角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂在皮肤外用剂中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品原料功效研究领域，具体涉及一种来源于中药垫状卷柏的具有上调皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG表达的垫状卷柏挥发油(未脱色)，可以作为化妆品功效活性物原料和皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG表达的促进剂。
背景技术
皮肤作为机体的第一道屏障，使机体免受机械损伤、微生物、化学物质和过敏原的侵害，起到抵御环境的作用。作为皮肤最外层的角质层(SC)在皮肤屏障的形成中起着主要作用。皮肤表皮的角质层由几层具有角化包膜(CE)的角质细胞和细胞间脂质片层组成。
表皮屏障的结构和功能损伤会使刺激物和过敏原穿透角质层，从而导致各种皮肤疾病，包括特应性皮炎、刺激性接触性皮炎和过敏性接触性皮肤炎。基于临床发现和/或用于皮肤刺激性评估的非侵入性参数，已经证明了表皮屏障破坏在这些皮肤疾病的发展和进展中的作用。
丝聚蛋白(Filaggrin，FLG)蛋白作为主要的角蛋白结合蛋白，以角蛋白-丝聚蛋白原(Profilaggrin)复合体的形式储存在角质透明颗粒中。在皮肤表皮角质形成细胞角化过程中，丝聚蛋白原被几种酶切割成丝聚蛋白单体。除了与角质细胞内的角蛋白细丝结合外，丝聚蛋白还与角化包膜连接。另外，丝聚蛋白单体还能降解形成尿刊酸和吡咯烷羧酸，从而提高皮肤的酸性酸度和保水能力。如果丝聚蛋白基因FLG由于发生基因突变或异常调节等原因导致蛋白质表达降低，引起皮肤功能紊乱，导致一系列皮肤病。因此，丝聚蛋白在皮肤表皮屏障和保水能力上具有重要的生理意义。
由于丝聚蛋白在皮肤表皮屏障中具有重要作用，因此如果皮肤表皮角质层受损，可以通过促进角质形成细胞的分化和提升丝聚蛋白在皮肤表皮角质形成细胞内的表达，促进受损皮肤表皮角质层功能的重建，以及恢复皮肤表皮角质层正常屏障功能。
垫状卷柏(Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim)为蕨类卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属(Selaginella)植物卷柏的干燥全草，属多年生草本植物。2020年版药典已经将垫状卷柏作为卷柏的规定品种收录其中。垫状卷柏及其同属植物分布广泛，品种繁多，全国约有70余种。
目前，卷柏属植物的化学成分研究较多，主要化学成分是黄酮类，其次包括炔酚类、木脂素类、甾体类、生物碱类、蒽醌类等成分。现代药理及临床研究表明卷柏属植物具有消炎、解毒、抗菌、抗病毒等作用。但关于垫状卷柏挥发油提取物的功效研究还未见报道。
发明人在研究垫状卷柏提取物功效的过程中，意外地发现，采用CO2超临界萃取技术提取的垫状卷柏挥发油(未脱色)可以调控角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达，具有促进表皮角质形成细胞分化和改善表皮屏障功能的作用。
发明内容
一方面，本发明提供了一种角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂，其中，所述表达促进剂是垫状卷柏提取物，所述垫状卷柏提取物中总糖含量≥5.72wt％，总多酚含量≥0.3wt％，和/或总黄酮含量≥1.12wt％。
在优选的实施方式中，所述垫状卷柏提取物通过超临界流体萃取法提取得到，所述方法包括以下步骤：
(a)提供垫状卷柏，机械粉碎；
(b)加入乙醇进行拌料；
(c)进行超临界流体萃取，萃取压力20-25MPa，萃取温度为40-45℃；
(d)收集萃取物，低温静置；
(e)离心，收集上层液体，过滤；
(f)滤液浓缩至浸膏状态，得到垫状卷柏提取物。
在优选的实施方式中，所述步骤(a)包括机械粉碎至20-40目。在优选的实施方式中，所述步骤(b)采用95体积％的乙醇。在优选的实施方式中，所述步骤(c)还包括：CO2流量为75-85L/h，超临界萃取时间约60-120min。在优选的实施方式中，所述步骤(c)还包括：分离釜I压力8-9MPa，分离釜I温度40-45℃；分离釜II压力6-7MPa，分离釜II温度30-35℃；分离釜III压力6-7MPa，分离釜III温度30-35℃。在优选的实施方式中，所述步骤(d)中所述低温静置为在0-6℃下静置12-24小时。
在优选的实施方式中，所述表达促进剂的使用浓度至少为0.002mg/ml，优选地为0.01-0.2mg/mL。
在优选的实施方式中，所述表达促进剂的促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的相对表达量≥240％，优选地为240-435％。
在优选的实施方式中，所述垫状卷柏提取物的HPLC分析图谱的主要峰的保留时间(峰面积％)为：UV＝254nm：峰1：10.023(2.07)；峰2：13.843(5.25)；峰3：15.361(4.19)；峰4：27.702(6.4)；峰5：31.597(41.2)；峰6：33.802(4.68)；峰7：34.709(15.23)；峰8：34.935(1.4)；峰9：36.619(3.95)；峰10：36.908(7.16)；峰11：37.939(2.49)；峰12：39.707(3.49)；峰13：49.636(2.49)。
另一方面，本发明还涉及所述表达促进剂在皮肤外用剂中的应用，用于促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的表达。
在优选的实施方式中，所述皮肤外用剂选自：面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾清洁泡、喷雾、沐浴露、或洗面奶。
附图说明
图1显示了垫状卷柏挥发油(未脱色)实物图。
图2显示了垫状卷柏挥发油(未脱色)的HPLC分析图谱。
图3显示了垫状卷柏挥发油(未脱色)的HPLC分析图谱主要峰信息。
图4显示了垫状卷柏挥发油(脱色)实物图。
图5显示了垫状卷柏挥发油(脱色)的HPLC分析图谱。
图6显示了垫状卷柏挥发油(脱色)的HPLC分析图谱主要峰信息。
发明详述
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但本文描述的是优选的方法和材料。对于本发明的目的，下面定义了以下术语。
本文所用术语“约”指与参比品的数量、水平、数值、维度、大小或用量相比，差异可高达30％、20％或10％的数量、水平、数值、维度、大小或用量。本文所使用的百分含量，除非另有说明，均以重量计。
在全篇说明书和权利要求书中，除非另有要求，以下词语“包含”和其变体“含有”和“包括”应理解为意指包括所述的整体或步骤，或一组整体或步骤，但不排除任何其它整体或步骤，或其它一组整体或步骤。
本发明是基于以下意外发现：垫状卷柏挥发油(未脱色)有上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的作用，具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效。
本发明的有益效果在于，发现一种丝聚蛋白基因表达的促进剂，该促进剂是采用CO2超临界萃取技术提取的天然来源的垫状柏卷挥发油(未脱色)，能够上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达，具有促进表皮角质形成细胞分化和改善表皮屏障功能的作用。垫状柏卷挥发油(未脱色)可添加于皮肤调理剂及化妆品产品配方中，使配方具有皮肤调理功能和维持皮肤稳态的功效，具有较高的应用价值。
垫状卷柏挥发油
本发明所述垫状卷柏挥发油，也可描述为垫状卷柏提取物。在一些实施方式中，垫状卷柏挥发油也可描述为垫状卷柏油，也可描述为垫状卷柏超临界提取物，也可描述为垫状卷柏CO2超临界提取物。
本发明意外地发现，垫状卷柏挥发油(未脱色)具有上调皮肤表皮细胞丝聚蛋白基因FLG表达的作用。因此，垫状卷柏挥发油(未脱色)可以作为皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂应用于多种化妆品产品的开发和应用，赋予化妆品产品具有皮肤表皮功能重建及恢复皮肤表皮正常生理功能的功效和作用。
本申请首次研究发现，垫状卷柏挥发油(未脱色)具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效，可以用作一种角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂。而且，该丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂易获得、成本低，具有重要的应用价值。
本发明采用超临界流体萃取法提取垫状卷柏挥发油。优选地，本发明采用CO2超临界萃取法获得垫状卷柏的有效成分，并通过过滤、浓缩获得垫状卷柏挥发油(未脱色)。
本发明提供了超临界流体萃取法提取垫状卷柏挥发油的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供垫状卷柏，机械粉碎；
(b)加入乙醇进行拌料；
(c)进行超临界流体萃取，萃取压力20-25MPa，萃取温度为40-45℃；
(d)收集萃取得到的油；
(e)离心，收集上层液体，过滤；
(f)滤液浓缩至浸膏状态，得到垫状卷柏挥发油(未脱色)。
在一些实施方式中，提取方法包括将药材粉碎为20-40目的步骤。在一些实施方式中，提取方法包括采用乙醇拌料的步骤。在优选的实施方式中，采用75-95体积％的乙醇拌料。在一些实施方式中，提取方法包括萃取压力为20-25MPa。在一些实施方式中，提取方法包括萃取温度为40-45℃。在一些实施方式中，提取方法包括CO2流量为75-85L/h，例如80L/h。在一些实施方式中，提取方法包括萃取时间为60-120min，例如约90min。
在优选的实施方式中，超临界流体萃取的工艺参数如下：药材粉碎为20目，萃取压力为20-25MPa，萃取温度为40-45℃，CO2流量为80 -85L/h，超临界萃取时间约90-120min。
在优选的实施方式中，超临界流体萃取的工艺参数包括：分离釜I压力8-9MPa，分离釜I温度40-45℃；分离釜II压力6-7MPa，分离釜II温度30-35℃；分离釜III压力6-7MPa，分离釜III温度30-35℃。
本发明制备得到的垫状卷柏挥发油(未脱色)为黑色半固体半液体油状物质。
本发明中采用的生药垫状卷柏于2023年5月购买于四川荷花池中药材市场兴智药行，其为卷柏科植物垫状卷柏垫状卷柏(Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim)的干燥全草。
在优选的实施方式中，垫状卷柏挥发油(未脱色)中总糖含量≥5.72wt％，总多酚含量≥0.3wt％，和/或总黄酮含量≥1.12wt％。
在一些实施方式中，丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂的使用浓度至少为0.01mg/ml。
在一些实施方式中，丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂的使用浓度为0.01-0.2mg/ml，更优选0.025-0.2mg/ml。
在一些实施方式中，丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂的使用浓度优选小于0.4786mg/ml，更优选小于0.4mg/ml。
皮肤外用剂
在一些实施方式中，垫状卷柏挥发油(未脱色)可用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，包括但不限于面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾(清洁泡)、喷雾、沐浴露和洗面奶等剂型的产品。
垫状卷柏挥发油(未脱色)在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-10％(w/w)，优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)，更优选的重量百分比为0.05％-3％(w/w)，最优选的重量百分比为0.1％-2％(w/w)。
在具体的实施方式中，垫状卷柏挥发油(未脱色)可用于个人护理清洁类产品的制备。所述个人清洁护理品优选为洗去型清洁产品组合物，包括但不限于婴幼儿的沐浴露、洗发露、洗发沐浴露、儿童洗手液及成人的沐浴露、洗发露、洗手液以及洁面乳等剂型的产品的制备。如果在产品形态改变，如做成粉体、块状、糊状、条状、片状等，或者中间体等，也纳入本申请的植物提取物的应用范畴之内。
垫状卷柏挥发油(未脱色)在个人清洁护理品中的重量百分比为0.01％-10％(w/w)，优选的重量百分比为0.02％-5％(w/w)，更优选的重量百分比为0.05％-2％(w/w)，最优选的重量百分比为0.1％-2％(w/w)。
皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆品组合物。所述化妆品组合物中可以是基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品、头发护理用化妆品等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。所述化妆品组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
包含垫状卷柏挥发油(未脱色)的皮肤外用剂可局部施用至人皮肤和/或毛发。该皮肤外用剂还可包含美容上可接受的局部用载体，该局部用载体可为皮肤外用剂的约50重量％至约99.99重量％(如皮肤外用剂的约80重量％至约99重量％)。在本发明的一个优选的实施例中，美容上可接受的局部用载体包括水。美容上可接受的局部用载体可包括一种或多种选自润湿剂、润肤剂、油脂、湿润剂以及相似物质。在一个实施例中，美容上可接受的局部用载体包括诸如无纺布或膜材料之类的基材。
可将皮肤外用剂制备成多种产品类型，包括但不限于洗剂、霜剂、凝胶剂、棒剂、喷雾剂、油膏剂、清洁液体洗剂和固体皂剂、洗发剂和毛发调理剂、毛发固定剂、糊剂、泡沫剂、粉末剂、摩丝、剃须膏、擦拭物、贴剂、水凝胶、成膜产品、面膜和皮肤膜剂、膜剂和化妆品如粉底以及睫毛膏。这些产品类型可含有几种类型的美容上可接受的局部用载体，包括但不限于溶液、悬浮液、乳液(例如微乳液和纳米乳液)、凝胶、固体和脂质体。
包含垫状卷柏挥发油(未脱色)的皮肤外用剂可配制成溶液剂。溶液剂通常包含水性溶剂或有机溶剂(例如，约50％至约99.99％或约90％至约99％的美容上可接受的水性溶剂或有机溶剂)。合适的有机溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、1,2,4-丁三醇、山梨醇酯、1,2,6-己三醇、乙醇以及它们的混合物。
皮肤外用剂可配制成包含润肤剂的溶液。此类皮肤外用剂优选包含约2％至约50％的一种或多种润肤剂。如本发明所用，“润肤剂”指用于预防或减轻干燥，例如通过防止皮肤水分经皮肤损失的物质。润肤剂的例子包括但不限于植物油、矿物油、脂族酯等。
洗剂可由这种溶液制备。洗剂通常含有约1％至约20％(例如，约5％至约10％)的一种或多种润肤剂和约50％至约90％(例如，约60％至约80％)的水分。
可以由溶液配制的另一类型的产品是霜剂。霜剂通常含有约5％至约50％(例如，约10％至约20％)的一种或多种润肤剂和约45％至约85％(例如，约50％至约75％)的水分。
尽管优选的是包含垫状卷柏挥发油(未脱色)的皮肤外用剂包含水，但作为另一种选择该皮肤外用剂可以是无水的或为不包含水而是有机和/或有机硅溶剂、油脂、类脂和蜡的油膏剂。油膏剂可含有动物或植物油或半固体烃的简单基料。油膏剂可含有约2％至约10％的一种或多种润肤剂和约0.1％至约2％的一种或多种增稠剂。
可将该皮肤外用剂配制为乳剂。如果局部用载体是乳液，则约1％至约10％(如约2％至约5％)的该局部用载体含有一种或多种乳化剂。乳化剂可以为非离子型、阴离子型或阳离子型。合适的乳化剂的例子包括个人护理和化妆品配方领域中通常鉴定为合适乳化剂的那些。
洗剂和霜剂可配制成乳剂。通常这类洗剂含有0.5％至约5％的一种或多种乳化剂。这种霜剂通常含有约1％至约20％(如约5％至约10％)的一种或多种润肤剂；约20％至约80％(如30％至约70％)的水；以及约1％至约10％(如约2％至约5％)的一种或多种乳化剂。
水包油和油包水型单乳液护肤制剂，例如洗剂和霜剂是化妆品领域所熟知的，并且可用于本发明。多相乳状液皮肤外用剂(例如水包油包水型和油包水包油型)也可用于本发明。通常，此类单相乳状液或多相乳状液含有水分、润肤剂和乳化剂作为其基本成分。
包含垫状卷柏挥发油(未脱色)的皮肤外用剂还可配制成凝胶剂(例如，使用合适的胶凝剂的水性凝胶、醇类凝胶、醇/水型凝胶或油性凝胶)。用于水性凝胶和/或醇类凝胶的适当胶凝剂包括但不限于天然树胶、丙烯酸和丙烯酸酯聚合物和共聚物以及纤维素衍生物(例如羟甲基纤维素和羟丙基纤维素)。用于油(例如矿物油)的适当胶凝剂包括但不限于氢化丁烯/乙烯/苯乙烯共聚物和氢化乙烯/丙烯/苯乙烯共聚物。这种凝胶剂通常含有约0.1重量％和5重量％之间的这类胶凝剂。
包含垫状卷柏挥发油(未脱色)的皮肤外用剂也可配制成固体制剂(例如蜡基棒剂、条皂、粉剂或含有粉剂的擦拭物)。
除了上述组分外，可用于本发明的皮肤外用剂还可含有多种在常规上以其技术领域确定的水平用于在皮肤和毛发上使用的皮肤外用剂中的其他油溶性物质和/或水溶性物质。
本发明的皮肤外用剂可以包含在皮肤护理组合物中通常能找到的附加组分，例如润肤剂、皮肤调节剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、螯合剂等，只要它们与皮肤外用剂中其他的组分在物理上和化学上相容、且不影响本发明的垫状卷柏挥发油(未脱色)的效果即可。
在本发明的皮肤外用剂的一些实施方式中，可使用一种或多种防腐剂。适宜的防腐剂包括对羟基苯乙酮、C1-C4对羟基苯甲酸烷基酯和苯氧基乙醇。基于组合物总重量，防腐剂的用量为大约0.5至大约2重量％，优选大约0.5至1重量％。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种抗氧化剂。适宜的抗氧化剂包括丁化羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸棕榈酸酯(BHA)、丁羟茴醚、苯基-α-萘基胺、氢醌、没食子丙酯、去甲二氢愈创木酸、维生素E或维生素E的衍生物、维生素C及其衍生物、泛酸钙、绿茶提取物和混合的多酚，以及上面所述的物质的混合物。所使用的抗氧化剂是组合物总重量的大约0.02至0.5重量％，更最优选的是从大约0.002至0.1重量％的用量范围。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种润肤剂，通过其保持在皮肤表面上或在角质层中的能力，起到润滑剂的作用，以减少剥落，改善皮肤的外观。典型的润肤剂包括脂肪酯、脂肪醇、矿物油、聚醚硅氧烷共聚物等等。适宜的润肤剂的例子非限定地包括，聚丙二醇(“PPG”)-15十八烷基醚，PPG-10十六烷基醚，Steareth-10，Oleth-8，PPG－4十二烷基醚，维生素E醋酸酯，羊毛脂，鲸蜡醇，鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，十六十八醇，甘油硬脂酸酯，羟基硬脂酸辛脂，二甲基聚硅氧烷，以及它们的组合。鲸蜡醇，鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，十六十八醇，甘油硬脂酸酯以及它们的组合是优选的。使用时，润肤剂是基于组合物总重量的大约0.1至大约30重量％，优选大约1至大约30重量％的用量范围。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种保湿剂。保湿剂也称为湿润剂，其有助于提高润肤剂的效果，减少剥落，刺激组成的鳞皮的去除和提高皮肤触感。可使用多元醇作为保湿剂，包括但并不限于，甘油，聚亚烷基二醇，亚烷基多元醇及其衍生物，包含丁二醇、丙二醇、双丙二醇，聚丙三醇，聚乙二醇及其衍生物，山梨醇，羟丙基山梨醇，己二醇，1,3－二丁二醇，1,2,6-己三醇，乙氧基化甘油，丙氧基化甘油，以及它们的组合。使用时，基于组合物的总重量，保湿剂的用量为大约0.1至大约20重量％，优选是大约1至大约15重量％。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种乳化剂。乳化剂可在有效稳定量的范围内使用。优选地，在组合物总重量的基础上，以大约1.0至大约10.0重量％，更优选的是大约3.0至大约6.0重量％的用量来使用乳化剂。可以使用任何与组合物中的组分相容的乳化剂。适宜的乳化剂包括硬脂酸，鲸蜡醇，甘油硬脂酸酯，卵磷脂，十八烷醇，Steareth-2，Steareth-20，丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，以及它们的组合。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种pH调节剂。本发明的皮肤外用剂中有益的pH调节剂包括氨丁三醇。使用时，基于组合物的总重量pH调节剂的用量为大约0.1至大约2重量％，优选是大约0.1至大约1重量％。
在本发明的一个具体实施方式中，皮肤外用剂包含丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、甘油、对羟基苯乙酮、甘油硬脂酸酯和卵磷脂、十六/十八醇、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、氨丁三醇或它们的组合。
具体实施方式
下面结合具体的实施例和比较例进一步阐述本发明。但是，这些实施例和比较例仅用于说明本发明，而不构成对本发明范围的限制。下列实施例和比较例中未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按照重量计。
实施例1：垫状卷柏挥发油(未脱色)制备
本发明采用CO2超临界萃取法获得垫状卷柏的有效成分，并通过过滤、浓缩获得垫状卷柏挥发油(未脱色)。
1.药材、仪器与试剂
药材：生药垫状卷柏于2023年5月购买于四川荷花池中药材市场兴智药行，其为卷柏科植物垫状卷柏垫状卷柏(Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim)的干燥全草。
实验仪器：样品粉碎机(DFY-600C)购自温岭市大德药机公司，立式(双层)小型全温振荡器(摇床)(ZWY-2102C)购自上海智城分析仪器制造有限公司，冷冻离心机(DL-5M)购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司，加强型旋转蒸发仪(R-200)购自瑞士Buchi公司，超临界萃取设备(RZSCF230-50-10L)购自南通睿智超临界科技发展有限公司。
试剂：乙醇购自安徽安特食品股份有限公司，新星牌定性滤纸(60cm*60cm)购自杭州特种纸业有限公司，筛网购自上海宜昌仪器纱筛厂。
2.垫状卷柏挥发油(未脱色)制备
1)卷柏全草晒干后，用粉碎机进行机械粉碎，并过20目筛。
2)称取1000.02g的卷柏粉末样品，加入1L 95％乙醇拌料，放入CO2超临界萃取装置的萃取釜中。
3)进行CO2超临界萃取，萃取条件为：萃取釜压力25MPa，萃取釜温度45℃，CO2流量为80L/h，超临界萃取时间约90min；分离釜Ⅰ压力8MPa，分离釜Ⅰ温度45℃；分离釜Ⅱ压力6MPa，分离釜Ⅱ温度30℃；分离釜Ⅲ压力6MPa，分离釜Ⅲ温度30℃。
4)萃取至无样品出，收集分离釜I和II样品，置于4℃静置过夜。
5)在3℃条件下离心15min，转速3500rpm，离心结束后，滤纸过滤上层液体；
6)滤液加入旋转蒸发仪，温度45-55℃，滤液浓缩至浸膏状态，得到垫状卷柏挥发油(未脱色)(见表1)。
垫状卷柏挥发油(未脱色)为黑色半固体半液体油状物质(实物见图片1)。
表1：垫状卷柏挥发油(未脱色)提取的生药投入量、得量和提取得率
实施例2：垫状卷柏挥发油(未脱色)HPLC分析
本发明采用HPLC方法对实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)进行化学成分表征。
高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。HPLC具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、稳定性和重现性好、流动相选择性广、色谱柱可反复使用等特点，而且不受样品挥发度和热稳定性的限制，适用范围广，随着高效液相色谱仪的普及，应用越来越广泛，目前己成为植物成分分析的常用方法。
1.仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪(Acquity Arc)、二极管阵列检测器(Waters2998)购自美国沃特世公司，电子天平(SQP)购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
试剂：甲酸(色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自上海星可高纯溶剂有限公司。
2.测定方法
1)样品溶液的制备：精密称取垫状卷柏挥发油(未脱色)样品0.2g，加入甲醇溶解，超声20min，甲醇定容至10mL，配置成20mg/mL的溶液，0.22μm滤膜过滤。
2)色谱条件：
色谱柱：Agilent SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：流动相A：甲醇，流动相B：0.1％甲酸水溶液；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
进样体积：10μL；
溶剂：甲醇(色谱级)；
梯度洗脱程序：0-40min，5-100％A；40-50min，保持100％A；50-53min，0-95％B；53-60min，保持95％B。
3.测试结果
实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)的HPLC分析图谱结果见图2，HPLC分析图谱主要峰信息见图3。HPLC分析图谱主要峰用保留时间(峰面积％)来表示，保留时间以分钟计算。垫状卷柏挥发油(未脱色)样品的HPLC分析图谱的主要峰的保留时间(峰面积％)为：UV＝254nm：峰1：10.023(2.07)；峰2：13.843(5.25)；峰3：15.361(4.19)；峰4：27.702(6.4)；峰5：31.597(41.2)；峰6：33.802(4.68)；峰7：34.709(15.23)；峰8：34.935(1.4)；峰9：36.619(3.95)；峰10：36.908(7.16)；峰11：37.939(2.49)；峰12：39.707(3.49)；峰13：49.636(2.49)。
实施例3：垫状卷柏挥发油(未脱色)成分分析
本发明主要对实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)的总糖、总多酚和总黄酮的含量进行分析。
植物提取物中所含的成分种类繁多，其所含化合物分为许多不同的类型，如糖类、酚类、黄酮类、萜类化合物、生物碱等等。通过对植物中不同化学成分的研究，可以初步了解其潜在的应用价值。
1.总糖含量分析
总糖含量的测定(苯酚-硫酸法)参考《GB/T 15672-2009食用菌中总糖含量的测定》。
1.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：葡萄糖标准品购自美国Fluka公司，苯酚、浓硫酸(分析纯)购自国药集团药业股份有限公司。
5％苯酚溶液：称取5g苯酚，用水溶解于100mL容量瓶中，定容后摇匀，转至棕色瓶，置4℃冰箱中避光贮存。
1.2测定方法及计算分析
1)葡萄糖储备液的制备：精确称取10mg葡萄糖于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL，即得100mg/L的葡萄糖储备溶液。
2)葡萄糖标准液的制备：精确移取葡萄糖储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分别置于5支具塞试管中，用蒸馏水补至1mL。配制成的溶液浓度分别为20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液1mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的葡萄糖标准液及样品溶液中分别加入5％苯酚溶液1mL，盖上塞子摇匀，同时将试管置于冰浴中冷却，并立即缓慢滴加浓硫酸5mL，摇匀后置于冰浴中冷却10min。然后置于沸水浴中加热15min，取出后用流动水冷却至室温。同时作一空白参比，即另以1mL蒸馏水重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中，在489nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以葡萄糖标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总糖含量，每个样品平行测定二次。
1.3结果计算
式中：
c──待测样品中总糖含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
2.总多酚含量分析
总多酚含量的测定(福林酚法)参考《T/AHFIA 005-2018植物提取物及其制品中总多酚含量的测定分光光度法》。
2.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：没食子酸标准品(CAS号：149-91-7)购自美国Sigma公司，福林酚试剂购自上海麦克林生化科技股份有限公司、碳酸钠购自国药集团药业股份有限公司。
15％碳酸钠溶液：精确称取15g无水碳酸钠，用水溶解定容至100mL。
0.25N福林酚试剂：取25mL福林酚试剂，用水定容至100mL。
2.2测定方法及计算分析
1)没食子酸储备液的制备：精确称取20mg没食子酸于1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容到1000mL，即得20mg/L的没食子酸储备溶液。
2)没食子酸标准液的制备：精确移取没食子酸储备液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL分别置于5支具塞试管中，用蒸馏水补至2.5ml。配制成的溶液浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液2.5mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的没食子酸标准液及样品溶液中分别加入0.25N福林酚试剂2.5mL，盖上塞子摇匀，再加入15％碳酸钠溶液2.5mL，摇匀后置于40℃水浴中放置60min，取出恢复至室温。同时作一空白参比，即另以2.5mL蒸馏水重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中，在756nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以没食子酸标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总多酚含量，每个样品平行测定二次。
2.3结果计算
式中：
c──待测样品中总多酚含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
3.总黄酮含量分析
总黄酮含量的测定(硝酸铝法)参考《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则(2020年版)》中《十五、保健食品中总黄酮的测定》的第二法。
3.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：芦丁标准品购自上海源叶生物科技有限公司，亚硝酸钠、九水硝酸铝、氢氧化钠购自国药集团药业股份有限公司。
5％亚硝酸钠溶液：称取5.0g亚硝酸钠，加水溶解成100mL。
10％硝酸铝溶液：称取硝酸铝17.6g，加水溶解成100mL。
1mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4.0g，加水溶解成100mL。
3.2测定方法及计算分析
1)芦丁储备液的制备：精确称取10mg芦丁于50mL容量瓶中，用甲醇定容到50mL，即得200mg/L的芦丁储备溶液。
2)芦丁标准液的制备：精确移取芦丁储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分别置于5支具塞试管中，用甲醇补至1mL。配制成的溶液浓度分别为40μg/mL，80μg/mL，120μg/mL，160μg/mL，200μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液1mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的芦丁标准液及样品溶液中分别加入5％亚硝酸钠溶液0.2mL，盖上塞子摇匀，室温放置6min；再加入10％硝酸铝溶液0.2mL，摇匀后室温放置6min；再加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL，摇匀；加水补至5mL，摇匀，室温放置15min。同时作一空白参比，即另以1mL甲醇重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中(必要时样品溶液可过滤后使用)，在500nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以芦丁标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总黄酮含量，每个样品平行测定二次。
3.3结果计算
式中：
c──待测样品中总黄酮含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
3.4垫状卷柏挥发油(未脱色)成分含量测试结果
采用3.1、3.2、3.3中的方法进行测试，结果显示实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)中总糖含量为5.72％；总多酚含量为2998mg/kg，质量分数约为0.30％；总黄酮含量为11175mg/kg，质量分数约为1.12％。结果汇总见表2。
表2：垫状卷柏挥发油(未脱色)成分分析结果汇总
实施例4：细胞毒性测试
本发明采用MTT方法对实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)样品进行细胞毒性测试，分析垫状卷柏挥发油(未脱色)在角质形成细胞培养体系中的最大无毒剂量。
细胞毒性检测，是指利用细胞培养技术，采用细胞毒性试验评价测试样品引起的细胞死亡、细胞生长抑制或者细胞方面其他的影响。在本发明中，通过细胞毒性测试分析计算出样品在测试细胞体系中的最大无毒剂量，为样品在进行其它功效测试时的浓度提供指导，保证后续测试的可行性和数据的有效性。本发明中细胞毒性测试采用的是MTT方法。
MTT方法是常用的一种测试样品细胞毒性和细胞存活和增殖的方法。MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。其主要原理为利用细胞线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐进行转化，然后通过酶标仪进行检测。具体的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，沉积在细胞中，而死细胞没有此功能。二甲基亚砜(DMSO)能够将沉积在细胞中的甲瓒溶解，形成紫色溶液，然后在酶联免疫检测仪中检测570nm波长处的OD值(也可用490nm)，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
1.细胞、仪器与试剂
细胞：角质形成细胞来源于广东博溪生物科技有限公司。
主要仪器：CO2培养箱(150I)购自美国Thermo公司，超净工作台(SW-CJ-1F)购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，酶标仪(Epoch)购自美国BioTek公司、倒置显微镜(CKX53)日本Olympus公司。
主要试剂：KcGrowth培养液(货号：08030021)购自广东博溪生物科技有限公司，MTT(货号：M5655)购自美国Sigma公司，DMSO(货号：D4540-1L)购自美国Sigma公司，PBS(货号：P1010)购自北京索莱宝科技有限公司。
2.测试方法
1)细胞接种：复苏细胞后，待铺板率达到60％左右时，接种细胞至96孔板，CO2培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2)试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
3)配液：按测试浓度设定表(表3)配制不同浓度的样品工作液。若样品不溶于水时，需用DMSO配置相应浓度的100倍母液，再用培养基进行稀释至所需浓度。
表3：垫状卷柏挥发油(未脱色)配置浓度情况
4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。
5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。
3.计算分析
1)细胞相对活力计算：根据公式计算，
2)样品最大无毒剂量计算：根据公式计算，
式中：
AL──细胞活力值高于70％的最大样品浓度对应的细胞活力值(％)；
AH──细胞活力值低于70％的最小样品浓度对应的细胞活力值(％)；
CH──细胞活力值低于70％的最小样品浓度(mg/mL)；
CL──细胞活力值高于70％的最大样品浓度(mg/mL)。
4.细胞毒性测试结果
细胞毒性测试结果见表4。
按照细胞活力值为70％时为最大无毒剂量进行计算分析，垫状卷柏挥发油(未脱色)在角质形成细胞处理中的最大无毒剂量为0.4786mg/mL。
表4：垫状卷柏挥发油(未脱色)细胞毒性测试结果
比较例1：垫状卷柏挥发油(脱色)制备
本发明采用CO2超临界萃取法提取垫状卷柏的有效成分，并通过过滤、脱色、浓缩等过程获得垫状卷柏挥发油(脱色)。
1.药材、仪器与试剂
药材：生药垫状卷柏于2023年5月购买于四川荷花池中药材市场兴智药行，其为垫状卷柏科植物垫状卷柏(Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim)的干燥全草。
实验仪器：样品粉碎机(DFY-600C)购自温岭市大德药机公司，立式(双层)小型全温振荡器(摇床)(ZWY-2102C)购自上海智城分析仪器制造有限公司，冷冻离心机(DL-5M)购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司，加强型旋转蒸发仪(R-200)购自瑞士Buchi公司，超临界萃取设备(RZSCF230-50-10L)购自南通睿智超临界科技发展有限公司。
试剂：乙醇购自安徽安特食品股份有限公司，活性炭购自国药集团化学试剂有限公司，新星牌定性滤纸(60cm*60cm)购自杭州特种纸业有限公司，筛网购自上海宜昌仪器纱筛厂。
2.垫状卷柏挥发油(脱色)制备
1)垫状卷柏全草晒干后，用粉碎机进行机械粉碎，并过20目筛。
2)称取978.37g的垫状卷柏粉末样品，加入1L 95％乙醇拌料，放入CO2超临界萃取装置的萃取釜中。
3)进行CO2超临界萃取，萃取条件为：萃取釜压力25MPa，萃取釜温度45℃，CO2流量为80L/h，超临界萃取时间约90min；分离釜Ⅰ压力8MPa，分离釜Ⅰ温度45℃；分离釜Ⅱ压力6MPa，分离釜Ⅱ温度30℃；分离釜Ⅲ压力6MPa，分离釜Ⅲ温度30℃。
4)萃取至无样品出，收集分离釜I和II样品，置于4℃静置过夜。
5)在3℃条件下离心15min，转速3500rpm，离心结束后，滤纸过滤上层液体；
6)滤液称重，计算并加入相当于1.5％滤液重量的活性炭，于50℃、200rpm条件下摇床1h，3℃、3500rpm条件下离心15min，滤纸过滤。
7)滤液加入旋转蒸发仪，温度45-55℃，滤液浓缩至浸膏状态，得到垫状卷柏挥发油(脱色)(见表5)。
垫状卷柏挥发油(脱色)为深黄色半固体半液体油脂类物质(实物见图4)。
表5：垫状卷柏挥发油(脱色)提取的生药投入量、得量和提取得率
对比例2：垫状卷柏挥发油(脱色)HPLC分析
本发明采用HPLC方法对对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)进行化学成分表征。
高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。HPLC具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、稳定性和重现性好、流动相选择性广、色谱柱可反复使用等特点，而且不受样品挥发度和热稳定性的限制，适用范围广，随着高效液相色谱仪的普及，应用越来越广泛，目前己成为植物成分分析的常用方法。
1.仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪(Acquity Arc)、二极管阵列检测器(Waters2998)购自美国沃特世公司，电子天平(SQP)购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
试剂：甲酸(色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自上海星可高纯溶剂有限公司。
2.测定方法
1)样品溶液的制备：精密称取垫状卷柏挥发油(脱色)样品0.2g，加入甲醇溶解，超声20min，甲醇定容至10mL，配置成20mg/mL的溶液，0.22μm滤膜过滤。
2)色谱条件：
色谱柱：Agilent SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：流动相A：甲醇，流动相B：0.1％甲酸水溶液；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
进样体积：10μL；
溶剂：甲醇(色谱级)；
梯度洗脱程序：0-40min，5-100％A；40-50min，保持100％A；50-53min，0-95％B；53-60min，保持95％B。
3.测试结果
对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)的HPLC分析图谱结果见图5，HPLC分析图谱主要峰信息见图6。HPLC分析图谱主要峰用保留时间(峰面积％)来表示，保留时间以分钟计算。垫状卷柏挥发油(脱色)样品的HPLC分析图谱的主要峰的保留时间(峰面积％)为：UV＝254nm：峰1：13.847(11.94)；峰2：15.369(7.73)；峰3：27.71(16.95)；峰4：31.619(23.8)；峰5：34.912(10.03)；峰6：36.909(21.65)；峰7：37.944(7.89)。
对比例3：垫状卷柏挥发油(脱色)成分分析
本发明主要对对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)的总糖、总多酚和总黄酮的含量进行分析。
植物提取物中所含的成分种类繁多，其所含化合物分为许多不同的类型，如糖类、酚类、黄酮类、萜类化合物、生物碱等等。通过对植物中不同化学成分的研究，可以初步了解其潜在的应用价值。
1.总糖含量分析
总糖含量的测定(苯酚-硫酸法)参考《GB/T 15672-2009食用菌中总糖含量的测定》。
1.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：葡萄糖标准品购自美国Fluka公司，苯酚、浓硫酸(分析纯)购自国药集团药业股份有限公司。
5％苯酚溶液：称取5g苯酚，用水溶解于100mL容量瓶中，定容后摇匀，转至棕色瓶，置4℃冰箱中避光贮存。
1.2测定方法及计算分析
1)葡萄糖储备液的制备：精确称取10mg葡萄糖于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL，即得100mg/L的葡萄糖储备溶液。
2)葡萄糖标准液的制备：精确移取葡萄糖储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分别置于5支具塞试管中，用蒸馏水补至1mL。配制成的溶液浓度分别为20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液1mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的葡萄糖标准液及样品溶液中分别加入5％苯酚溶液1mL，盖上塞子摇匀，同时将试管置于冰浴中冷却，并立即缓慢滴加浓硫酸5mL，摇匀后置于冰浴中冷却10min。然后置于沸水浴中加热15min，取出后用流动水冷却至室温。同时作一空白参比，即另以1mL蒸馏水重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中，在489nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以葡萄糖标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总糖含量，每个样品平行测定二次。
1.3结果计算
式中：
c──待测样品中总糖含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
2.总多酚含量分析
总多酚含量的测定(福林酚法)参考《T/AHFIA 005-2018植物提取物及其制品中总多酚含量的测定分光光度法》。
2.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：没食子酸标准品(CAS号：149-91-7)购自美国Sigma公司，福林酚试剂购自上海麦克林生化科技股份有限公司、碳酸钠购自国药集团药业股份有限公司。
15％碳酸钠溶液：精确称取15g无水碳酸钠，用水溶解定容至100mL。
0.25N福林酚试剂：取25mL福林酚试剂，用水定容至100mL。
2.2测定方法及计算分析
1)没食子酸储备液的制备：精确称取20mg没食子酸于1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容到1000mL，即得20mg/L的没食子酸储备溶液。
2)没食子酸标准液的制备：精确移取没食子酸储备液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL分别置于5支具塞试管中，用蒸馏水补至2.5ml。配制成的溶液浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液2.5mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的没食子酸标准液及样品溶液中分别加入0.25N福林酚试剂2.5mL，盖上塞子摇匀，再加入15％碳酸钠溶液2.5mL，摇匀后置于40℃水浴中放置60min，取出恢复至室温。同时作一空白参比，即另以2.5mL蒸馏水重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中，在756nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以没食子酸标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总多酚含量，每个样品平行测定二次。
2.3结果计算
式中：
c──待测样品中总多酚含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
3.总黄酮含量分析
总黄酮含量的测定(硝酸铝法)参考《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则(2020年版)》中《十五、保健食品中总黄酮的测定》的第二法。
3.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：芦丁标准品购自上海源叶生物科技有限公司，亚硝酸钠、九水硝酸铝、氢氧化钠购自国药集团药业股份有限公司。
5％亚硝酸钠溶液：称取5.0g亚硝酸钠，加水溶解成100mL。
10％硝酸铝溶液：称取硝酸铝17.6g，加水溶解成100mL。
1mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4.0g，加水溶解成100mL。
3.2测定方法及计算分析
1)芦丁储备液的制备：精确称取10mg芦丁于50mL容量瓶中，用甲醇定容到50mL，即得200mg/L的芦丁储备溶液。
2)芦丁标准液的制备：精确移取芦丁储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分别置于5支具塞试管中，用甲醇补至1mL。配制成的溶液浓度分别为40μg/mL，80μg/mL，120μg/mL，160μg/mL，200μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液1mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的芦丁标准液及样品溶液中分别加入5％亚硝酸钠溶液0.2mL，盖上塞子摇匀，室温放置6min；再加入10％硝酸铝溶液0.2mL，摇匀后室温放置6min；再加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL，摇匀；加水补至5mL，摇匀，室温放置15min。同时作一空白参比，即另以1mL甲醇重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中(必要时样品溶液可过滤后使用)，在500nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以芦丁标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总黄酮含量，每个样品平行测定二次。
3.3结果计算
式中：
c──待测样品中总黄酮含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
3.4垫状卷柏挥发油(脱色)成分含量测试结果
采用3.1、3.2、3.3中的方法进行测试，结果显示对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)中总糖含量为4.06％；总多酚含量为1755mg/kg，质量分数约为0.18％；总黄酮含量为4700mg/kg，质量分数约为0.47％。结果汇总见表2。
表6：垫状卷柏挥发油(脱色)成分分析结果汇总
对比例4：细胞毒性测试
本发明采用MTT方法对对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)样品进行细胞毒性测试，分析垫状卷柏挥发油(脱色)在角质形成细胞培养体系中的最大无毒剂量。
细胞毒性检测，是指利用细胞培养技术，采用细胞毒性试验评价测试样品引起的细胞死亡、细胞生长抑制或者细胞方面其他的影响。在本发明中，通过细胞毒性测试分析计算出样品在测试细胞体系中的最大无毒剂量，为样品在进行其它功效测试时的浓度提供指导，保证后续测试的可行性和数据的有效性。本发明中细胞毒性测试采用的是MTT方法。
MTT方法是常用的一种测试样品细胞毒性和细胞存活和增殖的方法。MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。其主要原理为利用细胞线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐进行转化，然后通过酶标仪进行检测。具体的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，沉积在细胞中，而死细胞没有此功能。二甲基亚砜(DMSO)能够将沉积在细胞中的甲瓒溶解，形成紫色溶液，然后在酶联免疫检测仪中检测570nm波长处的OD值(也可用490nm)，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
1.细胞、仪器与试剂
细胞：角质形成细胞来源于广东博溪生物科技有限公司。
主要仪器：CO2培养箱(150I)购自美国Thermo公司，超净工作台(SW-CJ-1F)购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，酶标仪(Epoch)购自美国BioTek公司、倒置显微镜(CKX53)日本Olympus公司。
主要试剂：KcGrowth培养液(货号：08030021)购自广东博溪生物科技有限公司，MTT(货号：M5655)购自美国Sigma公司，DMSO(货号：D4540-1L)购自美国Sigma公司，PBS(货号：P1010)购自北京索莱宝科技有限公司。
2.测试方法
1)细胞接种：复苏细胞后，待铺板率达到60％左右时，接种细胞至96孔板，CO2培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2)试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
3)配液：按测试浓度设定表(表7)配制不同浓度的样品工作液。若样品不溶于水时，需用DMSO配置相应浓度的100倍母液，再用培养基进行稀释至所需浓度。
表7：垫状卷柏挥发油(脱色)配置浓度情况
4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。
5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。
3.计算分析
1)细胞相对活力计算：根据公式计算，
2)样品最大无毒剂量计算：根据公式计算，
式中：
AL──细胞活力值高于70％的最大样品浓度对应的细胞活力值(％)；
AH──细胞活力值低于70％的最小样品浓度对应的细胞活力值(％)；
CH──细胞活力值低于70％的最小样品浓度(mg/mL)；
CL──细胞活力值高于70％的最大样品浓度(mg/mL)。
4.细胞毒性测试结果
细胞毒性测试结果见表8。
按照细胞活力值为70％时为最大无毒剂量进行计算分析，垫状卷柏挥发油(脱色)在角质形成细胞处理中的最大无毒剂量为0.7048mg/mL。
表8：垫状卷柏挥发油(脱色)细胞毒性测试结果
本发明测试例采用基因表达定量检测方法比较实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)和对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)对角质形成细胞FLG基因的调控情况。
测试例1：不同挥发油调控FLG基因测试
HaCaT细胞是由角质形成细胞培育而来的人类永生化表皮细胞，是非肿瘤来源的人正常皮肤永生化角质形成细胞株，与正常人角质形成细胞分化特性相似。HaCaT细胞系常用于研究皮肤表皮的增殖、迁移和分化机制，以及研究活性物对角质形成细胞的影响。本研究通过将含有多个浓度样品的培养液处理HaCaT细胞24小时，然后收集细胞总核糖核酸(RNA)，采用RNA反转录技术和基因表达定量检测方法对丝聚蛋白基因FLG相对表达量进行检测，进而评估样品是否具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效。
1.细胞、试剂耗材与仪器
主要细胞株：人永生化角质形成细胞株HaCaT来源于广东博溪生物科技有限公司。
主要试剂耗材：胎牛血清、细胞培养基高糖DMEM、抗生素混合物(PSN)、0.25％胰酶-EDTA购自美国ThermoFisher公司；总RNA抽提试剂TRIzol购自美国ThermoFisher公司；反转录试剂盒iScript cDNA Synthesis Kit、荧光实时定量PCR试剂iTaqTMUniversalGreen Supermix购自美国Bio-rad公司；六孔板购自美国Corning公司。
主要仪器：超微量紫外分光光度NanoDrop ONE购自美国ThermoFisher公司，基因扩增仪C1000 Touch、实时定量PCR仪CFX Connect购自美国Bio-rad公司。
2.测试方法
1)细胞接种：将HaCaT细胞接种在六孔板中，每孔接种3-5×105个细胞，放入CO2培养箱(37℃、5％CO2)中继续培养24h。
2)样品配置：用细胞培养基配置不同浓度的样品工作液，配置浓度小于最大无毒剂量。若样品不溶于培养基时，需用DMSO配置相应浓度的100倍母液，再用培养基进行稀释至所需浓度。
3)给药孵育：吸去旧培养液，在空白对照孔中加入2mL培养液，样品组每孔加入2mL含有相应浓度样品的培养液，给药完成后，将六孔板放入CO2培养箱(37℃、5％CO2)中继续培养24h。
4)提取总RNA：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，吸去缓冲液；加入1mL TRIzol试剂，吹打裂解，转移到1.5mL无RNA酶离心管；在离心管中加入0.2mL氯仿，剧烈振荡，静置10min后，低温高速离心15min；用无RNA酶的移液器吸嘴取上层水相500μL，然后加入等体积的预冷异丙醇颠倒混匀，低温高速离心10min，离心后的RNA在离心管底部形成白色片状沉淀；用75％乙醇漂洗两次，用离心机和吸嘴去掉残留乙醇，开盖室温晾干至透明状；用40μL无RNA酶的H2O溶解，并用微量分光光度计测RNA浓度。
5)反转录：取1μg总RNA进行反转录，采用反转录试剂盒iScript cDNA SynthesisKit反转录得到cDNA，反转录体系见表9。
表9：反转录体系
反转录程序如下：25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min。
6)基因表达定量检测：用荧光实时定量聚合酶链式反应(PCR)试剂iTaqTMUniversalGreen Supermix进行基因表达定量检测，分析检测基因表达变化情况。荧光实时定量聚合酶链式反应体系见表10，定量检测所用引物见表11。
表10：荧光实时定量聚合酶链式反应体系
反应程序如下：95℃，30s；95℃，15s，60℃，30s，40个循环；65-95℃，每次降低0.5℃(熔解曲线)。
表11：基因表达定量检测所用引物序列
3.统计分析
以肌动蛋白ACTB基因为内参，采用2-△△Ct法分析样品组中丝聚蛋白基因FLG相对于空白对照组的相对表达变化情况。分析结果表示为平均值Mean±标准差SD，各组间比较采用t-test统计分析，统计分析均为双尾，p值<0.05认为具有显著差异，p值<0.01认为具有极显著差异。
4.测试结果
实施例1制备的样品垫状卷柏挥发油(未脱色)对皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG表达有上调作用，基因测试结果见表12。
表12：基因表达定量测试结果
测试结果具体情况如下：
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.01mg/mL组中FLG基因相对表达量为240±5％，p值＜0.01，差异具有极显著性，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.01mg/mL具有上调FLG基因表达的作用；
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.025mg/mL组中FLG基因相对表达量为325±5％，p值＜0.01，差异具有极显著性，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.025mg/mL具有上调FLG基因表达的作用；
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.05mg/mL组中FLG基因相对表达量为370±7％，p值＜0.01，差异具有极显著性，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.05mg/mL具有上调FLG基因表达的作用；
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.1mg/mL组中FLG基因相对表达量为382±11％，p值＜0.01，差异具有极显著性，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.1mg/mL具有上调FLG基因表达的作用；
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.2mg/mL组中FLG基因相对表达量为435±21％，p值＜0.01，差异具有极显著性，垫状卷柏挥发油(未脱色)-0.2mg/mL具有上调FLG基因表达的作用。
综上，基因表达定量测试结果显示实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)在0.01-0.2mg/mL范围内具有上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的作用，具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效。
对比例1制备的样品垫状卷柏挥发油(脱色)对皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG表达无上调作用，基因测试结果见表13。
表13：基因表达定量测试结果
测试结果具体情况如下：
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.02mg/mL组中FLG基因相对表达量为97±5％，p值＝0.5771，差异不具有显著性，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.02mg/mL不具有上调FLG基因表达的作用；
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.05mg/mL组中FLG基因相对表达量为87±2％，p值＝0.0789，差异不具有显著性，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.05mg/mL不具有上调FLG基因表达的作用；
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.1mg/mL组中FLG基因相对表达量为83±2％，p值＝0.0687，差异不具有显著性，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.1mg/mL不具有上调FLG基因表达的作用；
垫状卷柏挥发油(脱色)-0.02mg/mL组中FLG基因相对表达量为90±1％，p值＝0.1699，差异不具有显著性，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.02mg/mL不具有上调FLG基因表达的作用；
与空白对照组相比，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.4mg/mL组中FLG基因相对表达量为117±20％，p值＝0.0957，差异不具有显著性，垫状卷柏挥发油(脱色)-0.4mg/mL不具有上调FLG基因表达的作用。
综上，基因表达定量测试结果显示对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)在0.02-0.4mg/mL范围内不具有上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的作用。
通过比较表12和表13的可以看出，本发明通过采用基因表达定量检测方法分析实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)和对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)对角质形成细胞FLG基因的调控情况，结果表明实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)在0.01-0.2mg/mL范围内具有上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的作用，具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效，而对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)在0.02-0.4mg/mL范围内不具有上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的作用。在上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达功效方面，实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)优于对比例1制备的垫状卷柏挥发油(脱色)。
应用例
本发明所述实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)可以作为活性物用于皮肤外用剂的制备，所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、面霜、乳液、眼霜、面膜、精华液等。
所述实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)，在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-10％(w/w)，优选的重量百分比为0.005％-5％(w/w)，更优选的重量百分比为0.01％-2％(w/w)，最优选的重量百分比为0.02％-1％(w/w)。
实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)在皮肤外用剂中的具体应用，以及这些剂型的配方和制备方法，见应用例1-3。
本发明所述实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)还可以作为活性物用于个人护理清洁类产品，所述个人清洁护理品优选为洗去型清洁产品组合物，包括但不限于婴幼儿的沐浴露、洗发露、洗发沐浴露、儿童洗手液及成人的沐浴露、洗发露、洗手液以及洁面乳等剂型的产品的制备。如果在产品形态改变，如做成粉体、块状、糊状、条状、片状等，或者中间体等，也纳入本专利的植物提取物的应用范畴之内。
所述实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)，在个人清洁护理品中的重量百分比为0.001％-10％(w/w)，优选的重量百分比为0.005％-5％(w/w)，更优选的重量百分比为0.01％-2％(w/w)，最优选的重量百分比为0.02％-1％(w/w)。
实施例1制备的垫状卷柏挥发油(未脱色)在个人清洁护理品中的具体应用，以及这些剂型的配方和制备方法，见应用例4-12。
具体应用例如下：
应用例1：化妆水的制备
/>
应用例2：面霜的制备
/>
应用例3：乳液的制备
应用例4：沐浴露的制备
/>
应用例5：洁面乳的制备
/>
应用例6：婴童沐浴露的制备
/>
应用例7：婴童洗发水的制备
应用例8：婴童洗发沐浴露的制备
/>
应用例9：洗发水的制备
/>
应用例10：洗手液的制备
应用例11：头皮护理精华液的制备
/>
应用例12：气雾(清洁泡)的制备
/>
Claims (14)
1.一种角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂，其中，所述表达促进剂是垫状卷柏提取物，所述垫状卷柏提取物中总糖含量≥5.72wt％，总多酚含量≥0.3wt％，和/或总黄酮含量≥1.12wt％。
2.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述垫状卷柏提取物通过超临界流体萃取法提取得到，所述方法包括以下步骤：
(a)提供垫状卷柏，机械粉碎；
(b)加入乙醇进行拌料；
(c)进行超临界流体萃取，萃取压力20-25MPa，萃取温度为40-45℃；
(d)收集萃取物，低温静置；
(e)离心，收集上层液体，过滤；
(f)滤液浓缩至浸膏状态，得到垫状卷柏提取物。
3.如权利要求2所述的表达促进剂，其中，所述步骤(a)包括机械粉碎至20-40目。
4.如权利要求2所述的表达促进剂，其中，所述步骤(b)采用95体积％的乙醇。
5.如权利要求2所述的表达促进剂，其中，所述步骤(c)还包括：CO2流量为75-85L/h，超临界萃取时间约60-120min。
6.如权利要求2所述的表达促进剂，其中，所述步骤(c)还包括：分离釜I压力8-9MPa，分离釜I温度40-45℃；分离釜II压力6-7MPa，分离釜II温度30-35℃；分离釜III压力6-7MPa，分离釜III温度30-35℃。
7.如权利要求2所述的表达促进剂，其中，步骤(d)中所述低温静置为在0-6℃下静置12-24小时。
8.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述表达促进剂的使用浓度至少为0.002mg/ml。
9.如权利要求8所述的表达促进剂，其中，所述表达促进剂的使用浓度为0.01-0.2mg/mL。
10.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述表达促进剂的促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的相对表达量≥240％。
11.如权利要求10所述的表达促进剂，其中，所述表达促进剂的促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的相对表达量为240-435％。
12.如权利要求11所述的表达促进剂，其中所述垫状卷柏提取物的HPLC分析图谱的主要峰的保留时间和峰面积％包括：UV＝254nm：峰1：10.023，2.07；峰2：13.843，5.25；峰3：15.361，4.19；峰4：27.702，6.4；峰5：31.597，41.2；峰6：33.802，4.68；峰7：34.709，15.23；峰8：34.935，1.4；峰9：36.619，3.95；峰10：36.908，7.16；峰11：37.939，2.49；峰12：39.707，3.49；峰13：49.636，2.49。
13.如权利要求1-12中任一项所述的表达促进剂在皮肤外用剂中的应用，用于促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的表达。
14.如权利要求13所述的应用，其中，所述皮肤外用剂选自：面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾清洁泡、喷雾、沐浴露、或洗面奶。
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