KR102243502B1 - 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체의 안정화 방법 - Google Patents

탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체의 안정화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 활성 물질의 안정성 및 효능을 높이기 위해 탈분화 식물 프로토플라스트(protoplast) 내에 활성 물질이 인입된 구조체가 오일 제형 및 계면활성제가 고함량으로 존재하는 유화 제형에서도 안정화할 수 있도록 한 방법에 관한 것이다.

Description

탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체의 안정화 방법 {Stabilization Method of Dedifferentiated Plant Protoplast Complex With Active Material Insertion}
본 발명은 활성 물질의 안정성 및 효능을 높이기 위해 탈분화 식물 프로토플라스트(protoplast) 내에 활성 물질이 인입된 구조체가 오일 제형 및 계면활성제가 고함량으로 존재하는 유화 제형에서도 안정성을 유지할 수 있도록 한 안정화 방법에 관한 것이다.
천연에 존재하는 식물에는 각기 다른 수많은 활성 물질(phytochemical)이 내재되어 있으며, 그 종류 또한 테르페노이드, 플라보노이드, 플라보놀, 폴리페놀, 아미노산, 리그난, 알칼로이드, 비타민, 카테킨 화합물 등 무수한 종류로 이루어져 있다.
이에 식물에서 특정 성분만을 추출하거나 식물 세포를 이용한 화장료 조성물이 활발히 제시되고 있다.
일 예로, 국제특허 WO2013-180526호에서는 에델바이스 추출물이 피부 재생을 촉진시켜 화장료로서 이용 가능하고, 국제특허 WO2012-102456호에서는 비단풀 추출물이 주름 개선에 효과적이어서 다양한 화장료로 사용될 수 있음을 언급하고 있다.
또한, 일본 공개특허 제2012-102136호는 피부 탈색 및 라이트닝을 위해 크리스테마린(Criste Marine)과 같은 호염성 식물의 탈분화 식물 세포의 동결 건조물을 포함하는 화장품 조성을 제시하고 있다.
한편, 레티놀 등과 같은 유효 활성 물질은 인체 내 생리학적 특성에 있어서 유용한 기능을 가짐에도 안정성 면에서 자유롭지 못해, 이의 안정성을 높이기 위해 다양한 방법이 제시되고 있다.
일 예로, 활성 물질에 인지질 혹은 계면활성제를 이용한 리포좀, 세라마이드를 이용한 안정화된 세라좀, 액정구조로 안정화시킨 액정좀, 모노글리세라이드를 이용한 입방상 큐보좀 적용 등 많은 시도가 이루어지고 있다.
이와 더불어 식물 세포를 화장료 조성물에 적용하고자 하는 연구 또한 진행되고 있다.
국제특허 WO2012-173458호는 내부에 갈릭산(Gallic acid), 아미노산 등의 활성물질이 안정화된 식물 세포를 함유하는 화장료 조성물을 제시하고 있으며, 이때 상기 식물 세포는 세포벽으로서, 세포벽 내에 활성 물질을 인입시키는 경우 활성 물질의 안정성이 높아질 수 있음을 제시하였다.
식물 세포의 세포벽은 과량의 셀룰로오스를 포함하는데, 이로 인해 다른 물질의 침투가 용이하지 않아 활성 물질의 인입을 위해선 제거가 필요하고, 세포벽과 세포막을 모두 제거할 경우 인입된 활성 물질의 안정성이 오히려 저하될 수 있다.
이에 본 발명자들은 기 출원된 특허출원 제10-2013-0164701호를 통해 식물 세포의 세포벽을 제거하고 세포막 및 세포소로 이루어진 프로토플라스트(protoplast) 내에 활성 물질이 인입된 구조체를 제안한 바 있다.
그러나, 상기 특허의 구조체는 수용성 제품 혹은 제형의 수상에는 사용이 용이하나 오일 성분의 함량이 높은 제품과 계면활성제의 함량이 높은 유화제품에서는 안정도가 떨어지는 단점이 있다.
WO2013-180526 WO2012-102456 일본 공개특허 제2012-102136호 WO2012-173458
이에 본 발명자들은 오일 제형 및 계면활성제가 고함량으로 존재하는 유화 제형 에서도 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체를 안정화할 수 있도록 다각적으로 연구를 수행한 결과, 상기 구조체를 식물성 오일에 가압 교반 및 혼합하는 과정을 통해 구조체를 안정화할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 과제는 탈분화 식물 프로토플라스트(protoplast) 내에 활성 물질이 인입된 구조체의 안정화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
식물의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매 및 씨앗에서 식물의 세포를 수득하는 단계;
상기 수득된 식물 세포를 옥신을 이용하여 탈분화하여 탈분화된 식물 세포를 얻는 단계;
상기 얻어진 탈분화 식물 세포를 대량으로 배양하는 단계;
상기 대량 배양된 탈분화 식물 세포의 세포벽을 효소 반응을 이용하여 제거하여 프로토플라스트를 얻는 단계;
상기 얻어진 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 가압 삼투 공정으로 활성 물질을 인입하는 단계;
1차 후처리하는 단계;
1차 후처리된 구조체를 제1식물성 오일과 혼합하고 가압과 동시에 교반하는 단계;
2차 후처리하는 단계; 및
2차 후처리된 구조체를 제2식물성 오일과 혼합하는 단계
를 포함하는 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체의 안정화 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법으로 안정화된 구조체는 오일 제형 및 계면활성제가 고함량으로 존재하는 유화 제형에서도 안정성을 유지할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체의 안정화 방법을 보여주는 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 안정화 방법으로 얻은 구조체 혼합물과 글리세린에 분산된 구조체 혼합물의 식물성 오일 중 안정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 안정화 방법으로 얻은 구조체 혼합물과 글리세린에 분산된 구조체 혼합물의 5 중량% 계면활성제를 포함하는 에멀젼 제형 중 안정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 안정화 방법으로 얻은 구조체 혼합물과 글리세린에 분산된 구조체 혼합물의 15 중량% 계면활성제를 포함하는 에멀젼 제형 중 안정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서는 탈분화 식물 프로토플라스트(protoplast) 내에 활성 물질이 인입된 구조체가 오일 제형 및 계면활성제가 고함량으로 존재하는 유화 제형 에서도 안정도를 유지할 수 있도록 구조체를 안정화 하는 방법을 제시한다.
프로토플라스트(protoplast)는 세포의 세포벽은 제거되고 세포막이 존재하는 원형질체로, 상기 세포막이 내부에 화장료 조성으로 사용 가능한 다양한 활성 물질이 인입이 가능하다. 상기 세포벽은 과량의 셀룰로오스를 포함하는데, 이로 인해 다른 물질의 침투가 용이하지 않아 활성 물질의 인입을 위해선 제거가 필요하고, 세포벽과 세포막을 모두 제거할 경우 인입된 활성 물질의 안정성이 오히려 저하될 수 있으므로, 세포막이 존재하는 프로토플라스트가 바람직하다.
활성 물질은 친수성 물질 또는 소수성 물질일 수 있으며, 본 발명에서 특별히 한정하지 않는다. 대표적으로, 활성 물질로는 유기산, 비타민, 알부틴, 아데노신, 나이아신아마이드, 폴리페놀, 플라보노이드, 레티놀, 사이클로헥산다이올 비스에틸헥사노에이트, 비스레틴아미도 메틸펜탄, 베타라파촌, 성장인자, 성장인자 복합 펩타이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다.
이러한 활성 물질은 그 자체로서 화장료 조성물의 유효 성분으로 사용되나, 안정성이 낮아 그 활성을 충분히 발현할 수 없었으나 프로토플라스트 내에 인입되어 활성 안정성이 높아지고, 상기 프로토플라스트로 인해 생체 적합성 또한 크게 향상되는 이점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체의 안정화 방법을 보여주는 순서도로, 이하 도 1을 참조하여 각 단계별로 상세히 설명한다:
단계 (a): 식물 세포 수득 단계
단계 (a)에서는 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매 및 씨앗에서 식물의 세포를 수득한다.
식물 세포 수득은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 공지의 방법이 사용될 수 있다. 일례로, 본 발명의 실시예에서는 멸균 후 계면활성제가 첨가된 염소산나트륨 수용액에 담근 후 세척하여 식물 세포를 얻을 수 있었다.
사용 가능한 식물로는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 모든 식물이 가능하다. 대표적으로, 커리플랜트(curry plant, Helichrysum italicum), 구갈(Commiphora wightii, Commiphora myrrha), 부채 선인장(Opuntia Ficus indica), 작약(Paeonia lactiflora), 석화(Adenium obesum), 님파이아 오도라타(Nymphaea coerulea), 유칼리투스(Eucalyptus punctata), 은행나무(Ginkgo biloba), 나리꽃(Lilium candidum), 감람나무(Olea europaea), 파피루스(Cyperus papyrus), 연꽃(Nelumbo nucifera), 레드우드(Sequoia sempervirens), 가리카 로즈(Rosa gallica officinalis), 커피나무(Coffea arabica), 플루메리아(Plumeria obtusa), 치자나무(Gardenia jasminoides), 부겐베리아(Bougainvillea spectabilis), 자스민(Jasminum sambac), 로사 센티폴리아(Rosa centifolia), 페퍼 민트(Mentha piperita), 로사 다마스케나(Rosa damascena), 붓꽃(Iris pallida), 포도나무(Vitis vinifera), 백장미(Rosa alba), 일랑일랑(Cananga odorata), 아몬
드 나무(Prunus amygdalus dulcis), 사과나무(Malus domestica), 살구나무(Prunus
armeniaca), 인삼(Panax ginseng), 블랙베리(Rubus fruticosus), 금영화(Eschscholtzia californica), 병풀(Centella asiatica), 신양벚나무(Prunus
cerasus), 하와이 무궁화(Hibiscus rosa sinensis), 주니퍼베리(Juniperus communis), 목화(Gossypium arboreum), 대추야자(Phoenix dactylifera), 생강(Zingiber officinale), 무궁화(Hibiscus syriacus), 푸에라리아투베로사(Pueraria tuberosa), 석류나무(Punica granatum), 붐박스 코스타튬(Bombax costatum), 사프란(Crocus sativus), 살비아(Salvia officinalis), 수련(Nymphaea alba) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하며, 바람직하기로 커리플랜트(curryplant, Helichrysum italicum), 구갈(Commiphora wightii, Commiphora myrrha), 부채 선인장(Opuntia Ficus indica) 등을 사용한다.
단계 (b): 탈분화 단계
단계 (b)에서는 상기 수득된 식물 세포를 옥신을 이용하여 탈분화하여 탈분화된 식물 세포를 얻는다.
탈분화(dedifferentiation)에 사용하는 옥신(auxin)은 식물의 생장 조절 물질의 하나로, 저농도에서는 세포 신장을 촉진하나 고농도에서는 생장을 억제한다. 이에 옥신으로는 알파-나프탈렌 아세트산(α-Naphtalene acetic acid), 2,4-디클로로페녹시 아세트산, 인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하며, 이들을 1∼5㎎/ℓ의 농도로 포함하는 배지에 식물 세포를 배양하여 상기 식물 세포의 탈분화를 유도할 수 있다.
상기 배지는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 식물 세포 배양에 사용되는 모든 배지가 사용될 수 있다.
단계 (c): 탈분화 식물 세포의 배양 단계
단계 (c)에서는 상기 단계 (b)에서 얻어진 탈분화 식물 세포를 대량으로 배양한다.
탈분화 식물 세포의 대량 배양은 다양한 배지 내에서 이루어지며, 이때 배지로는 MS 배지, B5 배지, WHITE 배지, N6 배지, SH 배지, Anderson 배지 등 공지된 바의 배지가 사용될 수 있으며, 바람직하기로 MS 배지를 사용한다.
또한, 배양 조건 및 기간은 본 발명에서 특별히 언급하지 않으며, 공지된 바의 조건 하에서 수행할 수 있다.
단계 (d): 효소 반응을 통한 세포벽 제거 단계
단계 (d)에서는 대량으로 배양된 탈분화 식물 세포의 세포벽을 효소 반응을 이용하여 제거하여 세포막과 세포소 기관만 남은 프로토플라스트를 얻는다.
상기 효소는 셀룰라아제(EC 3.2.1.4), 펙티나아제(EC 3.2.1.15), 크실라나아제(EC 3.2.1.8), 키티나아제(EC 3.2.1.14), 헤미셀룰라아제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다.
이들 효소는 0.01∼10 중량%의 다양한 농도로 사용될 수 있으며, 바람직하기로 셀룰라아제 0.1∼5 중량%, 펙티나아제 0.01∼2.5 중량%, 헤미셀룰라아제 0.1∼5 중량%로 사용하고, 더욱 바람직하기로 셀룰라아제 1 중량%, 헤미셀룰라아제 2 중량% 및 펙티나아제 0.5 중량%의 다성분 효소 혼합물을 사용한다.
상기 효소 반응은 4℃∼40℃의 온도 범위에서 (더 적절하게는 10℃∼25℃) 15시간∼24시간 동안 10∼50rpm의 속도로 반응시켜 이루어지며, 이러한 효소 반응에 의해 탈분화 식물 세포의 세포벽만이 제거되고 세포막은 안정하게 보존된 프로토플라스트를 얻을 수 있다.
단계 (e): 가압 삼투 공정에 의한 활성 물질 인입 단계
단계 (e)에서는 상기 얻어진 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 가압 삼투 공정으로 활성 물질을 인입한다.
구체적으로, 탈분화 식물 프로토플라스트를 저급 알코올(C1~C4 알코올)에 용해시키고, 이를 활성 물질 및 물과 혼합한 후 염화나트륨을 첨가하게 되면, 삼투화에 의해 상기 활성 물질이 프로토플라스트 내부로 인입된다.
이러한 공정은 가압 삼투 공정으로 진행되며, 구체적으로는 0.01∼10MPa, 바람직하게는 0.05∼1MPa, 가장 바람직하게는 0.05∼0.5MPa에서 수행하며, 이때 염화나트륨의 첨가에 의해 농도를 1 중량% 이상, 바람직하기로 1∼50 중량%가 되도록 한다. 만약, 상기 압력 및 농도가 상기 범위 미만이면 활성 물질의 인입이 효과적으로 일어나지 않으며, 반대로 상기 범위를 초과하면 프로토플라스트가 파괴될 우려가 있으므로, 상기 범위 내에서 적절히 사용한다.
상기 인입은 활성 물질의 효능이 충분히 발휘될 수 있는 농도가 되도록 수행하며, 이는 활성 물질에 따라 달라질 수 있으나, 0.001∼20%의 인입률(중량% 기준)을 갖는다. 추가로, 상기 인입은 인입률을 높이기 위해 탈수 반응을 더욱 수행할 수 있다.
단계 (f): 1차 후처리 단계
단계 (f)에서는 1차 후처리를 통해 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체를 얻는다.
이러한 1차 후처리는 통상의 후처리 공정으로, 원심 분리 및 세척을 통해 미반응 물질(인입이 되지 않은 활성 물질) 및 염을 제거한다.
상기 단계를 거쳐 얻어진 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체는 기존에 식물 세포가 갖고 있는 활성 성분의 안정성이 그대로 유지되고 추가적으로 세포 내 인입된 활성 물질의 안정성이 높으며, 이에 따라 상기 활성 물질에 의한 효능 또한 향상되어 화장료의 유효 성분 조성으로 바람직하게 사용 가능하다.
단계 (g): 제1식물성 오일과 혼합 후 가압 교반하는 단계
단계 (g)에서는 1차 후처리를 통해 얻어진 구조체를 제1식물성 오일과 혼합 후 가압과 동시에 교반하여 안정화 한다.
이와 같은 가압 교반 공정을 통해 인지질, 세라마이드, 콜레스테롤 등으로 대부분 이루어진 프로토플라스트 구조체 외벽이 제1식물성 오일에 함침되어 가압되면서 용해도 변화가 유도되어 안정화될 수 있다.
상기 제1식물성 오일은 올리브 오일, 해바라기씨 오일, 메도우폼씨 오일 또는 아르간 오일이 가능하다. 바람직하기로 올리브 오일로 리파인드 올리브오일 또는 엑스트라버진 올리브오일을 사용한다.
이때 구조체와 제1식물성 오일은 1:1의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다.
이러한 가압 교반 공정은, 구체적으로는 0.01∼10MPa, 바람직하게는 0.05∼1MPa, 가장 바람직하게는 0.05∼0.5MPa에서 수행한다. 만약, 압력이 상기 범위 미만이면, 구조체의 안정화 효과가 미미하고, 반대로 상기 범위를 초과하면 프로토플라스트가 파괴될 우려가 있으므로, 상기 범위 내에서 적절히 수행한다.
단계 (h): 2차 후처리 단계
단계 (h)에서는 2차 후처리를 통해 제1식물성 오일과 함께 가압 교반되어 안정화된 구조체를 얻는다.
이러한 2차 후처리는 원심 분리 및 세척을 통해 제1식물성 오일을 제거한다.
단계 (i): 제2식물성 오일과 혼합
단계 (i)에서는 2차 후처리를 통해 얻은 안정화된 구조체를 다시 제2식물성 오일과 혼합하여 혼합물을 얻는다.
이때 상기 제2식물성 오일로는 제1식물성 오일로 사용된 올리브 오일, 해바라기씨 오일, 메도우폼씨 오일 또는 아르간 오일 이외에 아보카도 오일, 밀배아오일, 로즈힙 오일, 아몬드 오일, 피마자유, 동백오일, 옥수수오일, 잇꽃 오일, 대두오일, 유채꽃 오일, 마카나디아넛츠 오일, 호호바 오일, 팜오일, 팜핵오일, 코코넛 오일, 망고버터 오일, 쉐어버터 오일, 코코아수씨드 버터 오일, 정제포도씨 오일, 로즈힙 오일, 사플라워 오일 또는 복숭아씨 오일 가능하다.
상기 2차 후처리를 통해 얻은 안정화된 구조체와 제2식물성 오일은 1:9 내지 5:5의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다.
이렇게 제2식물성 오일과 혼합하여 얻은 구조체 혼합물은 전체 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 99.0 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10.0 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 3 중량%로 포함한다.
또한, 화장료 조성물은 공지된 바의 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 오일, 파운데이션, 왁스 또는 스프레이형태로 제형화할 수 있다.
또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 세포 이외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 또한, 각 제형의 조성들은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 포함하여 제조된다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 탈분화 식물 원형질체 세포 제조
(1) 탈분화 식물 세포의 수득
커리플랜트(curry plant, Helichrysum italicum), 구갈(Commiphora wightii), 부채 선인장(Opuntia Ficus indica)의 줄기, 잎 등에서 조직 절편 (최소 3㎝)을 절단하였다.
본 조작 단계에서, 모든 작업은 무균 조건하에 무균 작업대에서 수행하였다.
식물 재료를 멸균하기 위하여, 조직은 70% 에탄올(Ethanol, Sigma, USA)에 60초, 30% 과산화수소(Hydrogen peroxide, LG Chemical, Korea)에 15분 담그고 용제를 제거하며, 이후 이들 조직은 무균 H2O로 3∼5회 씻어내고 몇 방울의 Tween 20이 첨가된 염소산나트륨(Sodium hydrochlorite, Sigma, USA)에 15분간 담그고 무균 H2O로 3∼5회 씻어냈다.
조직 배양을 위하여, 이들 조직 단편은 무균 페트리 접시(125㎜)에 집어넣고 절단하며 (2∼3㎜) 표백된 부분을 조심스럽게 제거하고, 이렇게 수득된 시료는 가늘게 절개하여 고형 배양 배지(하기 표 1)에 도말하고 반쯤 묻었다.
원료 함량(mg/L)
KNO3 2,500
(NH4)2SO4 134
CaCl2·2H2O 120
NaH2PO4·2H2O 150
MgSO4·7H2O 200
MnSO4·4H2O 15
ZnSO4·7H2O 5
H3BO3 4
KI 0.8
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
FeSO4·7H2O 32.8
미요이노시톨(Myo-inositol) 200
니코틴산(Nicotinic acid) 2
아스코브산(L-ascorbic acid) 30
시트르산(Citric acid) 50
비오틴((+)-Biotin) 0.01
염화피리독신(Pyridoxine-HCl) 2
염화티아민(Thiamine-HCl) 10
수크로오스(Sucrose) 20,000
알파-나프탈렌 아세트산(α-Naphtalene acetic acid) 2
2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-dichlorophenoxy acetic
acid)		 0.5
키네틴(Kinetin) 0.5
아가(Agar) 9,000
정제수 잔량

(2) 탈분화 식물세포의 재식(Replanting)
압설자(Spatula)로 2∼3개의 세포 클러스터(1∼2cm)를 채취한 후, 새로운 배지에 도말하고 분산시켰다. 이 모든 과정은 무균 조건하에 무균 작업대에서 수행하였다.
(3) 액상 배양 배지에서 탈분화 식물 세포의 증식
상기의 탈분화된 식물 세포를 하기 표 2의 액상 배양 배지로 이전한 다음, 25℃, 암조건 하에서 50∼150rpm의 회전 교반기에서 배양하였으며, 이때 이들의 계대 배양 주기는 매10일로 고정하였다.
원료 함량(mg/L)
NH4NO3 400
Ca(NO3)2 500
CaCl2·2H2O 100
KH2PO4 200
MgSO4·7H2O 150
MnSO4·4H2O 20
ZnSO4·7H2O 5
H3BO3 5
K2SO4 1,000
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.25
FeSO4·7H2O 32.8
미요이노시톨(Myo-inositol) 200
니코틴산(Nicotinic acid) 2
아스코브산(L-ascorbic acid) 30
시트르산(Citric acid) 50
비오틴((+)-Biotin) 0.01
염화피리독신(Pyridoxine-HCl) 2
염화티아민(Thiamine-HCl) 10
수크로오스(Sucrose) 30,000
알파-나프탈렌 아세트산(α-Naphtalene acetic acid) 2
2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-dichlorophenoxy acetic
acid)		 0.5
키네틴(Kinetin) 0.5
정제수 잔량

(4) 탈분화 식물세포의 세포벽을 제거한 프로토플라스트 수득
상기 얻어진 탈분화 식물세포가 증식된 액상 배양 배지에 다성분 효소 혼합물(셀룰라아제 1%, 헤미셀룰라아제 2% 및 펙티나아제 0.5%)을 첨가하고 25℃의 온도 범위에서 20시간 동안 50rpm의 속도로 반응시켜 세포벽을 제거하였다.
이어, 배양액 중의 원형질체를 200xg 하에서 15분간 원심분리하여 수득한 후, 다시 5,000xg 하에서 15분간 원심분리하여 추가로 정제하였다.
(5) 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 성장인자 복합 펩타이드(growth factor mimic peptides)가 인입된 구조체의 제조
올리고펩타이드-34(Oligopeptide-34, Caregen, Korea), 올리고펩타이드-24(Oligopeptide-24, Caregen, Korea), 데카펩타이드-4(Decapeptide-4, Caregen, Korea), 아세틸 데카펩타이드-3(Acetyl Decapeptide-3, Caregen, Korea) 및 rh-폴리펩타이드-4(rh-Polypeptide-4, Bio-FD＆C, Korea)를 3차 증류수에 각각 4,000 ppm(총 20,000ppm)으로 가하여 30분간 교반하였다.
얻어진 펩타이드 혼합물 용액 20 중량%에, 상기 제조예 1에서 제조한 프로토플라스트 20 중량%, 및 증류수 60 중량%에 넣고, 패들믹서(PL-S10, Poonglim, Korea)를 이용하여 500rpm, 25℃ 조건으로 1시간 동안 교반하였다.
이어, 펩타이드 혼합물 용액, 프로토플라스트 및 증류수의 혼합액에 염화나트륨(NaCl, Sigma, USA)을 2 중량% 넣고 고압반응기(Miniclave, Buchi AG,Switzerland)를 이용하여 0.5MPa, 25℃ 1시간 조건으로 역삼투, 탈수 및 펩타이드의 인입 반응을 유도했다. 그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 5,000xg 하에서 20분간 원심분리하여 프로토플라스트 내에 펩타이드가 인입된 구조체를 수득하였다.
실시예 1 : 식물성 오일에 안정화된 구조체 혼합물 제조
상기 제조예 1에서 얻어진 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 성장인자 복합 펩타이드가 인입된 구조체를 엑스트라버진 올리브오일과 1:1의 중량비로 혼합하였다. 이 혼합물을 0.5MPa으로 가압하면서 24시간 동안 교반하였다.
그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 5,000xg 하에서 20분간 원심분리 하여 식물성 오일에 안정화 된 구조체를 수득하고 이를 식물성 오일에 안정화된 구조체: 엑스트라버진 올리브오일이 2:8의 중량비를 갖도록 다시 재분산하였다. 이렇게 얻은 구조체 혼합물은 약 5,000,000 구조체/mL의 농도를 갖는다.
비교예 1 : 글리세린에 분산된 구조체 혼합물 제조
상기 제조예 1에서 얻어진 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 성장인자 복합 펩타이드가 인입된 구조체를 보존을 위해 구조체 20 중량%에 글리세린 80 중량%를 가하여 분산하였다.
실험예 1: 식물성 오일 중 구조체의 안정도 측정
식물성 오일에 안정화된 구조체 혼합물(실시예 1)과 글리세린에 분산된 구조체 혼합물(비교예 1)을 아래 표 3과 같이 올리브 오일에 500,000 구조체/mL의 농도로 균일 분산하였다.
성분 함량 (중량%)
실험군 1 비교군 1
올리브오일 90.00 90.00
실시예 1의 구조체 혼합물 10.00 -
비교예 1의 구조체 혼합물 - 10.00
합계 100.00 100.00

45℃, 5% CO2조건에서 보관하고 각 1주, 2주, 3주, 4주의 시점에 샘플링 하여 Cell Counter(TC20 Automated Cell Counter, BMS)로 파괴되지 않은 상태의 식물 프로토플라스트 세포의 수를 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 식물성 오일에 안정화된 구조체의 경우 가혹조건에서도 안정한 반면 글리세린에 재분산된 구조체의 경우 가혹조건에서 그 안정도가 낮음을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 5 중량% 계면활성제 함유 에멀젼 내 안정도 측정
식물성 오일에 안정화된 구조체 혼합물(실시예 1)과 글리세린에 분산된 구조체 혼합물 (비교예 1)을 이용하여 아래 표 4와 같이 5 중량% 계면활성제를 함유하는 에멀젼 제형을 제조하였다.
성분 함량 (중량%)
실험군2 대조군2
친유형 모노스테아린산 글리세린 1.80 1.80
PEG-100 스테아레이트 1.80 1.80
폴리솔베이트 60 1.00 1.00
솔비탄스테아레이트 0.40 0.40
세테아릴알콜 1.50 1.50
스쿠알란 10.00 10.00
이소스테아릴 이소스테레이트 5.00 5.00
디메치콘 0.50 0.50
글리세린 6.00 6.00
1,3-부틸렌글리콜 3.00 3.00
카보머 0.20 0.20
트리에탄올아민 0.20 0.20
실시예 1 혼합물 10.00 -
비교예 1 혼합물 - 10.00
향 적량 적량
방부제 적량 적량
색소 적량 적량
증류수 잔량 잔량
합계 100.00 100.00
45℃, 5% CO2조건에서 보관하고 각 1주, 2주, 3주, 4주의 시점에 샘플링 하여 Cell Counter(TC20 Automated Cell Counter, BMS)로 파괴되지 않은 상태의 식물 프로토플라스트 세포의 수를 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 글리세린에 분산된 프로토플라스트 구조체는 시간이 갈수록 그 수가 줄어든 반면, 본 발명의 방법으로 안정화된 구조체는 5 중량%의 계면활성제가 함유된 에멀젼 내에서 세포의 수가 4주 시점까지 변화가 거의 없었다.
실험예 2: 1 5 중량% 계면활성제 함유 에멀젼 내 안정도 측정
45℃, 5% CO2조건에서 보관하고 각 1주, 2주, 3주, 4주의 시점에 샘플링 하여 Cell Counter(TC20 Automated Cell Counter, BMS)로 파괴되지 않은 상태의 식물 프로토플라스트 세포의 수를 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 글리세린에 분산된 프로토플라스트 구조체는 시간이 갈수록 그 수가 줄어든 반면, 본 발명의 방법으로 안정화된 구조체는 5 중량%의 계면활성제가 함유된 에멀젼 내에서 세포의 수가 4주 시점까지 변화가 거의 없었다.
실험예 2: 1 5 중량% 계면활성제 함유 에멀젼 내 안정도 측정
식물성 오일에 안정화된 구조체 혼합물(실시예 1)과 글리세린에 분산된 구조체 혼합물(비교예 1)을 이용하여 아래 표 5와 같이 15 중량% 계면활성제를 함유하는 에멀젼 제형을 제조하였다.
성분 함량 (중량%)
실험군3 대조군3
친유형 모노스테아린산 글리세린 5.00 5.00
PEG-100 스테아레이트 5.00 5.00
폴리솔베이트 60 3.50 3.50
솔비탄스테아레이트 1.50 1.50
세테아릴알콜 2.00 2.00
스쿠알란 15.00 15.00
이소스테아릴 이소스테레이트 5.00 5.00
디메치콘 1.00 1.00
글리세린 6.00 6.00
1,3-부틸렌글리콜 3.00 3.00
카보머 0.40 0.40
트리에탄올아민 0.40 0.40
실시예 1 혼합물 10.00 -
비교예 1 혼합물 - 10.00
향 적량 적량
방부제 적량 적량
색소 적량 적량
증류수 잔량 잔량
합계 100.00 100.00
45℃, 5% CO2조건에서 보관하고 각 1주, 2주, 3주, 4주의 시점에 샘플링 하여 Cell Counter(TC20 Automated Cell Counter, BMS)로 파괴되지 않은 상태의 식물 프로토플라스트 세포의 수를 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 글리세린에 분산된 프로토플라스트 구조체는 시간이 갈수록 그 수가 줄어든 반면, 본 발명의 방법으로 안정화된 구조체는 15 중량%의 계면활성제가 함유된 에멀젼 내에서 세포의 수가 4주 시점까지 변화가 거의 없었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제형예를 제시한다. 그러나 하기의 제형예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제형예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제형예 1: 영양 크림의 제조
하기의 표 6과 같은 조성을 갖도록 공지 방법을 이용하여 영양 크림을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 구조체 혼합물 0.5
친유형 모노스테아린산글리세린 2.0
세테아릴알콜 2.0
스테아린산 1.5
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄스테아레이트 0.6
하이드로제네이티드 폴리이소부텐 1.0
스쿠알란 3.0
광물유 5.0
사이클로메치콘 5.0
디메치콘 1.0
초산토코페롤 0.5
글리세린 5.0
베타인 3.0
트리에탄올아민 1.0
산탄검 0.05
향 적량
방부제 적량
색소 적량
증류수 잔량
합계 100.00

제형예 2: 유연 화장수(스킨로션)의 제조
하기의 표 7과와 같은 조성을 갖도록 공지 방법을 이용하여 유연 화장수를 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 구조체 혼합물 0.3
글리세린 5.0
1,3-부틸렌글리콜 3.0
베타인 1.0
알란토인 0.1
DL-판테놀 0.3
EDTA-2Na 0.02
소듐 히아루로네이트 파우더 0.05
에탄올 5.0
옥틸도데세스-16 0.2
폴리옥시에칠렌경화피마자유 0.2
향 적량
방부제 적량
색소 적량
정제수 잔량
합계 100.00

제형예 3 : 영양 화장수
하기의 표 8과 같은 조성을 갖도록 공지 방법을 이용하여 영양 화장수를 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 구조체 혼합물 0.5
글리세릴 스테아레이트 SE 1.5
세테아릴알콜 1.0
쉐어버터 1.5
폴리솔베이트 60 1.3
솔비탄스테아레이트 0.5
경화식물유 1.0
광물유 5.0
스쿠알란 3.0
사이클로메치콘 2.0
디메치콘 0.8
초산 토코페롤 0.5
카보머 0.12
글리세린 5.0
1,3-부틸렌글리콜 3.0
소듐 히아루로네이트 파우더 0.05
트리에탄올아민 0.12
향 적량
방부제 적량
색소 적량
증류수 잔량
합계 100.00

제형예 4 : 맛사지 크림
하기의 표 9와 같은 조성을 갖도록 공지 방법을 이용하여 맛사지 크림을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 구조체 혼합물 0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린 1.5
세테아릴알콜 1.5
스테아린산 1.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄스테아레이트 0.6
이소스테아릴 이소스테레이트 5.0
스쿠알란 5.0
광물유 35
디메치콘 0.5
히드록시에틸셀룰로오스 0.12
글리세린 6.0
1,3-부틸렌글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.3
향 적량
방부제 적량
색소 적량
증류수 잔량
합계 100.00

제형예 4 : 에센스
하기의 표 10과 같은 조성을 갖도록 공지 방법을 이용하여 에센스를 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 구조체 혼합물 0.5
글리세린 6.0
베타인 5.0
PEG 1500 2.0
알란토인 0.1
DL-판테놀 0.3
EDTA-2Na 0.02
하이드로제네이티드 레시친 0.6
히드록시에틸 셀룰로오스 0.1
소듐 히아루로네이트 파우더 0.08
카르복시비닐폴리머 0.2
트리에탄올아민 0.2
세라마이드 0.2
옥틸도데칸올 3.0
스쿠알란 3.0
폴리소르베이트 60 0.4
글리세릴 스테아레이트 SE 1.5
향 적량
방부제 적량
색소 적량
증류수 잔량
합계 100.00

제형예 5 : 팩
하기의 표 11과 같은 조성을 갖도록 공지 방법을 이용하여 팩을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 구조체 혼합물 0.5
폴리비닐알콜 15
셀룰로오스 검 0.15
글리세린 3.0
PEG 1500 2.0
베타인 2.0
DL-판테놀 0.4
알란토인 0.1
트리에탄올아민 0.2
니코틴아미드 0.5
에탄올 6.0
PEG 40 경화피마자유 0.3
향 적량
방부제 적량
색소 적량
증류수 잔량
합계 100.00

Claims (16)

  1. 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매 및 씨앗에서 식물의 세포를 수득하는 단계;
    상기 수득된 식물 세포를 옥신을 이용하여 탈분화하여 탈분화된 식물 세포를 얻는 단계;
    상기 얻어진 탈분화 식물 세포를 대량으로 배양하는 단계;
    상기 대량 배양된 탈분화 식물 세포의 세포벽을 효소 반응을 이용하여 제거하여 프로토플라스트를 얻는 단계;
    상기 프로토플라스트 내에 가압 삼투 공정으로 활성 물질을 인입하는 단계;
    원심 분리 및 세척을 수행하는 1차 후처리 단계;
    1차 후처리된 구조체를 제1식물성 오일과 혼합하고 가압과 동시에 교반하는 단계;
    원심 분리를 수행하는 2차 후처리 단계; 및
    2차 후처리된 구조체를 제2식물성 오일과 혼합하는 단계
    를 포함하는 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체의 안정화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물은
    커리플랜트(curry plant, Helichrysum italicum), 구갈(Commiphora wightii, Commiphora myrrha), 부채 선인장(Opuntia Ficus indica), 작약(Paeonia lactiflora), 석화(Adenium obesum), 님파이아 오도라타(Nymphaea coerulea), 유칼리투스(Eucalyptus punctata), 은행나무(Ginkgo biloba), 나리꽃(Lilium candidum), 감람나무(Olea europaea), 파피루스(Cyperus papyrus), 연꽃(Nelumbo nucifera), 레드우드(Sequoia sempervirens), 가리카 로즈(Rosa gallica officinalis), 커피나무(Coffea arabica), 플루메리아(Plumeria obtusa), 치자나무(Gardenia jasminoides), 부겐베리아(Bougainvillea spectabilis), 자스민(Jasminum sambac), 로사 센티폴리아(Rosa centifolia), 페퍼민트(Mentha piperita), 로사 다마스케나(Rosa damascena), 붓꽃(Iris pallida), 포도나무(Vitis vinifera), 백장미(Rosa alba), 일랑일랑(Cananga odorata), 아몬드 나무(Prunus amygdalus dulcis), 사과나무(Malus domestica), 살구나무(Prunus armeniaca), 인삼(Panax ginseng), 블랙베리(Rubus fruticosus), 금영화(Eschscholtzia californica), 병풀(Centella asiatica), 신양벚나무(Prunus cerasus), 하와이 무궁화(Hibiscus rosa sinensis), 주니퍼베리(Juniperus communis), 목화(Gossypium arboreum), 대추야자(Phoenix dactylifera), 생강(Zingiber officinale), 무궁화(Hibiscus syriacus), 푸에라리아투베로사(Pueraria tuberosa), 석류나무(Punica granatum), 붐박스 코스타튬(Bombax costatum), 사프란(Crocus sativus), 살비아(Salvia officinalis), 수련(Nymphaea alba) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 활성 물질은 친수성 물질 및 소수성 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 활성 물질은 유기산, 비타민, 알부틴, 아데노신, 나이아신아마이드, 폴리페놀, 플라보노이드, 레티놀, 사이클로헥산다이올 비스에틸헥사노에이트, 비스레틴아미도 메틸펜탄, 베타라파촌, 성장인자, 성장인자 복합 펩타이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 활성 물질의 인입률은 0.001∼20 중량%인 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 옥신은 알파-나프탈렌 아세트산(α-Naphtalene acetic acid), 2,4-디클로로페녹시 아세트산, 인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종으로 1∼5㎎/ℓ의 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 효소 반응은 셀룰라아제(EC 3.2.1.4), 펙티나아제(EC 3.2.1.15), 크실라나아제(EC 3.2.1.8), 키티나아제(EC 3.2.1.14), 헤미셀룰라아제
    및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 효소와 혼합하여 4℃∼40℃의
    온도에서 15시간∼24시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 가압 삼투 공정은 0.01∼10MPa의 압력 하에 염화나트륨을 1∼50 중량%로 첨가하는 조건인 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 활성 물질 인입 후 1차 후처리 단계 이전에 탈수 반응을 더욱 수행하는 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 제1식물성 오일은
    올리브 오일, 해바라기씨 오일, 메도우폼씨 오일 또는 아르간 오일인 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제2식물성 오일은 올리브 오일, 해바라기씨 오일, 메도우폼씨 오일 또는 아르간 오일, 아보카도 오일, 밀배아오일, 로즈힙 오일, 아몬드 오일, 피마자유, 동백오일, 옥수수오일, 잇꽃 오일, 대두오일, 유채꽃 오일, 마카나디아넛츠 오일, 호호바 오일, 팜오일, 팜핵오일, 코코넛 오일, 망고버터 오일, 쉐어버터 오일, 코코아수씨드 버터 오일, 정제포도씨 오일, 로즈힙 오일, 사플라워 오일 또는 복숭아씨 오일인 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 1차 후처리된 구조체와 제1식물성 오일은 1:1의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 가압은 0.01 내지 10 MPa의 압력이 인가되는 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 2차 후처리된 구조체와 제2식물성 오일은 1:9 내지 5:5의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 안정화 방법.
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