KR20150000668A

KR20150000668A - 등골나물 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20150000668A
Application number: KR20130073061A
Authority: KR
Inventors: 김보윤; 박성하; 박병준; 김진준
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2015-01-05

Abstract

본 발명은 등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 미백 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 등골나물 추출물을 유효 성분으로 포함하는 미백 화장료 조성물은 멜라닌 생성 기작에 중요한 효소인 티로시나제 효소를 억제하고, 멜라닌 생성을 억제하여 현저한 미백 효과를 나타내며, 상기 화장료 조성물을 화장료 베이스에 첨가하였을 때 미백 효과를 월등히 나타내는 미백 화장료 조성물을 제공한다.

Description

등골나물 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물 {Cosmetic Composition Comprising Eupatorium japonicum Thunb. ex Murray Extract for Skin Whitening}

본 발명은 등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 멜라닌 생성 기작에 중요한 효소인 티로시나제(tyrosinase)의 활성을 억제하고 멜라닌 생성을 억제하며, 상기 화장료 조성물을 화장료 베이스에 첨가하였을 때 미백 효과를 월등히 나타내는 등골나물 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 들어 사회적으로 미(美)에 대한 사회적 관심이 지속적으로 높아지고 있고 생활수준의 향상, 소득수준 증가 및 여성들의 사회진출 증가로 미적 요소가 중요한 사회적 경쟁력으로 인식되고 있으며, 좀 더 젊고 아름다운 모습을 유지하려는 욕구 또한 강해져 화장품에 대한 수요와 관심이 계속 증가하고 있는 실정이다.

기능성 화장품의 사용실태를 보면 자외선 차단, 주름 개선과 미백 복합제품인 복합기능성화장품을 많이 사용하였고, 특히 설문조사에서 우리나라 여성들이 가장 먼저 해결하고 싶은 피부 고민 중 1위로 피부의 색소 침착을 꼽고 있음을 볼 때 미백 화장품에 대한 여성들의 관심이 얼마나 높은지를 잘 알 수 있다. 이러한 동양 여성들의 흰 피부 선호경향에 의해서도 국내 미백 화장품시장은 앞으로 더욱 증가할 것으로 예상되고 있다. (임현, The Developmental Trend & Future Prospect of the Function Cosmetics Maket, 중앙대학교 의약식품대학원 석사학위 논문, pp.25, 2004)

한편, 사람의 피부색은 크게 멜라닌의 양, 헤모글로빈, 카로틴 등에 의해 결정되는데 이 중에서 표피의 기저 세포층에 존재하는 멜라닌 형성 세포에 의해 합성되는 멜라닌이라는 퀴논복합체가 가장 중요한 역할을 한다. 멜라닌은 사람의 피부색을 결정할 뿐만 아니라 피부 보호 작용의 역할을 하지만 피부 내에 과다하게 생성되면 피부 내에서 색소침착 현상이 일어나게 되어 피부색이 검게 되거나 기미 주근깨 등이 생기게 된다. 멜라닌 생성의 원인으로는 자외선 노출, 대기오염 물질, 복용 약물, 자극성 피부 외용제, 스트레스 등의 외부의 환경변화와 호르몬 불균형, 염증 반응 인자, 싸이토카인 등의 내적요인들이 복합적으로 작용하지만, 그 중에서도 가장 중요한 것은 자외선에 대한 노출이다.

멜라닌(melanin)은 유멜라닌(eumelanin)과 페오멜라닌(pheomelanin)으로 나뉠 수 있다. 유멜라닌(eumelanin)은 입자형 색소로 색깔이 더 진하고 어두운 흑갈색이며, 크기가 크고 동양인이나 흑인의 피부에 많다. 페오멜라닌(pheomelanin)은 분사형 색소로 적갈색(노란색)의 연한 색이고, 크기가 작으며 백인의 피부에 많다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 세포에서 티로신(tyrosine)이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성된다.

멜라닌 생성 메커니즘은 세포 내의 티로신(tyrosine)을 기질로 하여 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 도파퀴논(DOPAquinone)을 생성시키며, 도파퀴논으로부터 자동산화 반응과 효소 반응을 거쳐 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀이라는 주머니를 통해 케라티노사이트(keratinocyte)로 옮겨지게 되고 케라티노사이트에서 28일간의 각화 과정을 거치면서 피부표면으로 나오게 된다. 그러나, 이 과정에서 멜라닌 생성을 촉진하는 요인에 의해서 멜라닌이 과량 생성되고 각화에 의해 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소침착(pigmentation) 현상이 나타나게 된다. 따라서 이러한 색소 침착 현상을 막아주기 위해서는 멜라닌 생성 과정에서의 일부 과정을 조절해 줌으로써 억제할 수가 있다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protain 1, TRP1), 도파크롬 타우토메라제(dopachrome tautomerase) 등이 있으나, 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나제이다.

멜라닌 생성의 원인과 기작이 밝혀지면서, 멜라닌 생성 과정에 관여하는 효소인 티로시나제(tyrosinase)의 활성 저해효과를 갖는 물질들을 화장료에 배합하거나, 멜라닌 생성과정 중의 일부 반응을 저해함으로써 멜라닌의 생성을 감소시키는 방법이 일반적으로 사용되고 있다. 이러한 목적으로 사용되고 있는 대표적인 물질로는 아스코르빈산, 코직산, 히드로퀴논 및 상백피 추출물, 감초 추출물 등의 식물추출물이 있다. 그러나 코직산의 경우, 우수한 티로시나제 활성 저해 작용을 갖는 반면 화장품에 배합 시 변색 및 경시 변화에 따른 역가 저하 등 안정성에 문제점이 있으며, 피부 자극이 커 사용상 한계가 있다. 아스코르빈산은 티로시나제 활성 저해 효과가 낮을 뿐더러 분자 자체의 안정성이 낮아 멜라닌 생성 억제제로 적합하지 않으며, 히드로퀴논은 피부에 대한 자극이 높아 안전성 문제로 현재 화장품 배합 시에 그 사용성이 제한되고 있다. 식물 추출물로부터 티로시나제 활성 억제 및 멜라닌 생성 저해 효과를 확인하여 이를 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물에 관한 기술로는 선행특허 1(KR 10-1109620 B1)은 단삼소납을 함유하는 피부 미백 화장료 조성물, 선행특허 2(KR 10-2005-0025056 A)는 청자목 추출물을 함유하는 미백 화장료 조성물 및 청자목 추출방법, 선행특허 3(KR 10-2001-0038100 A) 생약재 추출물을 함유하는 미백 화장료 조성물을 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

KR 10-1109620 B1 KR 10-2005-0025056 A KR 10-2001-0038100 A

본 발명자들은 천연 식물 추출물을 이용하여 미백 효과가 우수한 미백 화장료를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 추출물을 사용하는 경우 저농도에서도 멜라닌 생성 기작에 중요한 효소인 티로시나제 효소를 억제하고, 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과를 나타낸다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 미백 효과를 나타내는 등골나물 추출물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상술한 등골나물 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 화장료 조성물을 제공한다.

상기 등골나물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 등골나물 추출물은 물 또는 알코올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들의 혼합 용매 중에서 선택된 용매로 추출하여 얻어진 추출물인 것일 수 있다.

상기 등골나물 추출물은 45~120℃에서 30분~24시간 가열하여 열수 추출하거나, 5~40℃에서 30분~15일간 침지하여 진탕 추출하는 방법 중에서 선택된 적어도 하나의 추출 방법을 사용하여 추출된 것일 수 있다.

상기 등골나물 추출물은 미백 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01~30중량% 포함하는 것일 수 있다.

상기 등골나물 추출물은 티로시나제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생합성 억제 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 추출물은 멜라닌 생성 기작에 중요한 효소인 티로시나제(tyrosinase)의 활성을 억제하고 멜라닌 생성을 억제하여 현저한 미백 효과를 나타내며, 상기 등골나물 추출물을 유효 성분으로 화장료 베이스에 포함하였을 때 미백 효과를 나타내어 미백 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

도 1은 등골나물 추출물의 세포생존율 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 등골나물 추출물의 티로시나제 활성 억제율 결과를 나타낸 그래프다.
도 3은 등골나물 추출물의 멜라닌 합성율의 결과를 나타낸 그래프이다.

등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray)은 우리나라 각처의 산과 들에서 자라는 숙근성 다년생 초본이다. 생육환경은 토양의 비옥도에 관계없으며, 반그늘인 곳과 양지에서 자란다. 키는 70~150㎝이고, 잎은 달걀 모양을 한 긴 타원형 또는 타원형으로 마주나고 끝이 뾰족한데 길이는 10~18㎝, 폭은 3~8㎝이고, 밑부분 잎은 작으며 꽃이 필 때 없어진다. 꽃은 원줄기 끝에 편평하게 무리지어 작은 꽃들이 핀다. 열매는 10~11월에 익으며 종자는 흰색 갓털을 달고 있다. 관상용으로 쓰이며, 어린순은 식용, 뿌리를 포함한 전초는 약용으로 쓰인다. 등골나물의 알려진 효능으로 잎줄기는 이뇨제로 부종을 빼주고, 목욕제로 피로회복에 좋다. 또한, 항바이러스작용, 유행성 바이러스에 대한 직접적인 억제작용, 소화 불량, 복통 등에 효험이 있다.

등골나물 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 기술로는 등골나물속 추출물을 유효성분으로 하는 비만 및 골대사질환 예방 및 치료용 조성물(KR 10-2012-0043936 A), 등골나물 추출물을 포함하는 항암 조성물(KR 10-1185901 B1)및 등골나물 추출물을 포함하는 항염증제 (KR 10-1185903 B1)가 있다. 상기와 같이 등골나물은 비만 및 골대사질환 예방 및 치료에 효능이 있고, 항암 및 항염증 효과에 도움이 될 수 있으나, 미백 효능을 입증하여 미백용 화장품으로서 사용될 수 있음을 보고한 사례가 없다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 등골나물은 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 등골나물의 잎, 줄기, 꽃을 사용하는 것이 다른 부위를 사용하는 것에 비해 티로시나아제 억제 활성 및 멜라닌 생성 억제 활성이 뛰어나다는 측면에서 바람직하다.

상기 등골나물 추출물은 등골나물을 물, 알코올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들의 혼합용매 중에서 선택된 추출용매에 넣어 45~120℃에서 30분~24시간 가열하여 열수 추출하거나, 5~40℃에서 30분~15일간 침지하여 진탕 추출하는 방법 중에서 선택된 적어도 하나의 추출 방법을 사용하는 것이 추출물의 수율을 향상시킬 수 있는 측면에서 바람직하다. 상기 추출용매의 중량은 각별히 한정이 있는 것은 아니나, 등골나물 식물 대비 과소량을 사용하면 추출물이 충분히 추출될 수 없고, 과다량을 사용하면 추출용매를 제거하고 건조 추출물을 얻는 데 시간과 비용이 많이 들게 된다. 이때, 열수 추출 할 경우 등골나물 시료가 충분히 포함되도록 하고, 추출 효율을 높이기 위해 가온된 상태로 추출을 행하는 것이 필요하며, 온도가 너무 낮으면 가온의 이점을 충분히 살리기 어렵고 많은 시간을 추출해야 하며, 온도가 너무 높으면 유용물질의 분해가 생길 수 있다. 또한, 진탕 추출 할 경우 상온에서 추출할 수 있으며, 분말 상태의 시료를 충분한 시간, 가령 3일 정도의 시간 동안 충분한 추출용매에 침지하여 추출이 충분히 이루어지도록 하며, 추출이 충분하지 못한 경우 반복 공정을 통하거나 추출 시간을 증가시켜 추출량을 늘릴 수도 있다.

상기와 같은 방법으로부터 추출된 등골나물 추출물은 미백 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01~30중량%를 포함할 수 있다. 상기 등골나물 추출물이 미백 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01중량% 미만일 경우에는 미백 활성 효과를 충분히 얻을 수 없기 때문에 피부 미백 화장료로서의 기능이 떨어지고, 30중량%를 초과하는 경우에는 세포 독성에 의한 안전성의 문제점이 있다.

상기와 같은 방법으로부터 제조된 등골나물 추출물은 현저한 티로시나제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생합성 억제 효과를 나타내어 미백 효과가 우수한 미백 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 물을 추출용매로 이용한 등골나물 추출물의 제조

등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 잎, 줄기, 꽃을 각각 1:1:1의 비율로 혼합한 시료 0.1 kg를 준비하고, 등골나물 시료를 중량 대비 5배의 정제수에 넣고 105℃에서 5시간 열수 추출하였다. 추출공정이 종료되면 거름종이(Whatman paper No. 1)로 거르고, 0.45㎛의 멤브레인 필터(TF-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과한 후 다음으로 물을 제거하기 위해 우선 회전 진공 증발기(Rotary vacuum evaporator)로 농축하고 이어서 동결 건조하는 방법을 사용하였다. 이로써, 등골나물의 물 추출물 17.88g(건조중량)을 수득하였다.

실시예 2: 메탄올을 추출용매로 이용한 등골나물 추출물의 제조

등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 잎, 줄기, 꽃을 각각 1:1:1의 비율로 혼합한 시료 0.1kg를 준비하고, 등골나물 시료 0.1kg에 대한 3배의 추출용매(80% 메탄올)를 가하여 25℃에서 72시간 동안 진탕 추출하는 공정을 3회 진행한 뒤 추출액을 거름종이로 여과하고 0.45㎛의 멤브레인 필터(Supor®-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과한 후, 회전 진공 증발기(rotary vacuum evaporator)로 농축하고 동결 건조하여 등골나물의 메탄올 추출물 25.02g(건조중량)을 수득하였다.

실시예 3: 에탄올을 추출용매로 이용한 등골나물 추출물의 제조

등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 잎, 줄기, 꽃을 각각 1:1:1의 비율로 혼합한 시료 0.1kg를 준비하고, 등골나물 시료 0.1kg에 대한 3배의 추출용매(70% 에탄올)를 가하여 25℃에서 72시간 동안 진탕 추출하는 공정을 3회 진행한 뒤 추출액을 거름종이로 여과하고 0.45㎛의 멤브레인 필터(Supor®-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과한 후, 회전 진공 증발기(rotary vacuum evaporator)로 농축하고 동결 건조하여 등골나물의 에탄올 추출물 6.78g(건조중량)을 수득하였다.

실시예 4: 부틸렌글리콜을 추출용매로 이용한 등골나물 추출물의 제조

등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 잎, 줄기, 꽃을 각각 1:1:1의 비율로 혼합한 시료 0.1kg를 준비하고, 등골나물 시료 0.1kg에 대한 50배의 추출용매(30% 부틸렌글리콜)를 가하여 25℃에서 72시간 동안 진탕 추출하는 공정을 1회 진행한 뒤 추출액을 거름종이로 여과하고 0.45㎛의 멤브레인 필터(Supor®-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과한 후, 회전 진공 증발기(rotary vacuum evaporator)로 농축하고 동결 건조하여 등골나물의 부틸렌글리콜 추출물 4.742kg을 수득하였다.

실시예 5: 프로필렌글리콜을 추출용매로 이용한 등골나물 추출물의 제조

등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 잎, 줄기, 꽃을 각각 1:1:1의 비율로 혼합한 시료 0.1kg를 준비하고, 등골나물 시료 0.1kg에 대한 50배의 추출용매(50% 프로필렌렌글리콜)를 가하여 25℃에서 72시간 동안 진탕 추출하는 공정을 1회 진행한 뒤 추출액을 거름종이로 여과하고 0.45㎛의 멤브레인 필터(Supor®-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과한 후, 회전 진공 증발기(rotary vacuum evaporator)로 농축하고 동결 건조하여 등골나물의 프로필렌글리콜 추출물 3.154kg을 수득하였다.

실험예 1: 세포 독성 시험( Neutral red assay )

상기 실시예의 중 추출공정 및 효율에 있어 가장 효과적이라 판단되는 실시예 1-3의 방법으로 얻어진 등골나물 추출물의 세포독성을 측정하였다.

본 발명에 따른 상기 추출물에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, B16F1(mouse melanoma cell)을 5x10⁴cells/㎖ 농도로 하여 96-well plate에 200㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 이때 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium, Hyclone)를 이용하였다. 배양한 후 상기 실시예 1-3의 등골나물 추출물을 농도별로 처리한 후 같은 배양 조건에서 72시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 5㎎/㎖ Neutral red 시약을 첨가한 배양액을 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 1% CaCl₂ & Formaldehyde를 처리하고 1분간 400-500rpm으로 흔들어 준 뒤 이를 다시 제거하였다. 그리고 1% Acetic acid & 50% Ethanol을 각 well에 처리하고 10분간 잘 흔들어 준 다음 마이크로 플레이트 계수기(Micro plate reader)를 이용하여 570nm/655nm의 흡광도 측정으로 결과를 측정하였으며, 그 결과는 표 1 및 도 1과 같다.

시료	실시예 1-3
농도(㎍/㎖)	100	75	50	25	10	5	1	0.1	0.01
세포생존율(%)	112	109	105	99	99	99	94	94	103

그 결과, 상기 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이 등골나물 추출물이 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.

실험예 2 : 티로시나제 ( tyrosinase ) 효소 저해 활성 효과 측정

상기 실시예 1-2의 방법으로 얻어진 등골나물 추출물의 타이로시네이즈(tyrosinase) 억제 효과를 측정하였다. 타이로시네이즈 저해 활성 측정은 타이로시네이즈의 작용 결과 생성되는 도파크롬(DOPA chrome)을 비색법에 의해 측정하는 야기(yagi) 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 반응구는 96-well plate 내 0.1M 인산완충액(phosphate buffer(pH6.5)) 100㎕에 1.5mM 엘-타이로신(L-tyrosine) 용액(in 0.1 M 인산완충액 (pH 6.5)) 60㎕ 및 시료용액 20㎕를 넣은 후, 머쉬룸 타이로시네이즈(mushroom tyrosinase) (2000 unit/㎖)를 0.1M 인산완충액으로 40배 희석하여 20㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜, 반응액 중에 생성된 도파크롬을 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 490nm에서 측정하였다. 또한 시험결과의 비교를 위해 양성대조구로 500㎍/㎖ 농도의 알부틴(arbutin)을 사용하였다. 그 결과는 하기 표 2 및 도 2와 같다.

시료	Arbutin	실시예 1-2
농도(㎍/㎖)	500	100	75	50	25	10	5	1
타이로시나제 활성 저해율(%)	45	74	66	51	25	2	-5	-8

그 결과, 상기 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이 등골나물 추출물을 농도 의존적으로 티로시나제 활성 저해율이 증가함으로써 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었으며, 그 효능 또한 유의성 있는 결과를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 비교구로 사용된 미백 성분인 알부틴(500㎍/㎖)의 경우, 45%의 활성을 나타내어 등골나물 추출물을 50㎍/㎖ 이상을 사용하였을 때와 티로시나제 활성 저해율이 유사하게 나타내어 저농도에서도 미백 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 3: 멜라닌 생합성 억제 효과 측정

상기 실시예 1-1의 방법으로 얻어진 등골나물 추출물의 멜라닌 생합성 억제 효과를 측정하였다. 마우스 유래 B16F1 멜라노마(melanoma) 내 멜라닌(melanin) 생합성을 억제하는 효과를 측정하기 위해 다음과 같이 실험을 진행하였다. B16F1(melanoma) 세포를 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium, Hyclone)에서 배양한 후, 이를 취하여 세포 농도를 5x10⁴ cells/㎖로 조정한 세포액을 조제하고, 이를 지름 60mm의 plate에 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 0.2μM α-MSH(Melanocyte-stimulating hormone)를 배지에 혼입하여 대조구를 제외한 각 well에 첨가하고 농도별 추출시료도 함께 첨가하였다. 이때 양성대조구는 500㎍/㎖ 농도의 알부틴을 사용하였다. 72시간 배양한 후 각 plate 내의 세포 내 멜라닌 생성량을 측정하기 위해 우선 plate 내 나머지 배양액을 제거하고, 1xPBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척하였다. 티로신(trypsin)을 각 well에 처리하고 5분간 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하여 세포를 떼어낸 후, 각 well에 배양액을 처리하고 2㎖ 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 이를 10,000 rpm에 10분간 원심분리한 후 튜브 안의 배양액을 제거하고 PBS를 1㎖씩 처리하고, 다시 원심분리와 제거를 통해 세척하였다. 그 후 PBS를 제거하고 70℃의 건조기에서 튜브의 뚜껑을 연 채로 1시간 보관하였다. 건조기에서 꺼낸 튜브에 각각 1 N NaOH(10% DMSO)를 400㎕씩 처리하고, 다시 70℃ 건조기에서 10분간 튜브의 뚜껑을 닫은 채 반응시켰다. 반응 후 1,000rpm에 약 10분간 흔들어주고, 96-well plate로 각각 100㎕씩 옮겨 분주한 후, 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 490㎚/655㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 3 및 도 3과 같다.

시료	α-MSH(-)	α-MSH(+)	Arbutin	실시예 1-1
농도(㎍/㎖)	α-MSH(-)	α-MSH(+)	500	100	50	25
멜라닌 합성율(%)	1	1.8	0.7	0.3	0.7	1.2

그 결과, 상기 표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이 실시예 1-1의 경우 농도의존적으로 멜라닌 합성이 저해되고 있는 것을 확인하였다. 또한, 100㎍/㎖에서 대조구인 알부틴 500㎍/㎖보다 높은 멜라닌 합성 저해 효과를 보여 미백 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

이하는 각 화장품 제형에 있어서 등골나물 추출물을 함유하여 미백 효과를 갖는 제형으로서의 화장료 조성예를 보여주며 처방예는 다음과 같다. 여기에 사용된 등골나물 추출물은 실시예 1-4의 추출물을 사용하였다.

처방예 1 : 유연화장수의 제조

등골나물 추출물(실시예 1-4))을 함유한 화장료 중 유연화장수의 처방예는 다음 표 4와 같다.

성분	함량(중량%)
등골나물 추출물(실시예 1-4)	1.0
폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.4
글리신	3.5
디포타슘글리시리제이트	0.1
1,3-부틸렌글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	0.1
에탄올	5.0
항산화제	0.1
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
정제수	잔량(to 100)

처방예 2 : 영양화장수의 제조

등골나물 추출물(실시예 1-4)을 함유한 화장료 중 영양화장수의 처방예는 다음 표 5와 같다.

성분	함량(중량%)
등골나물 추출물(실시예 1-4)	1.0
글리세린	7.0
소르비탄스테아레이트슈크로오즈코코에이트	2.0
미네랄오일	4.0
트리옥타노인	1.0
스테아릭에씨드	1.0
글리세릴스테아레이트	0.5
소르비탄모노스테아레이트	1.0
디메치콘	0.5
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
카보머	0.2
EDTA	0.1
정제수	잔량(to 100)

처방예 3 : 영양에센스의 제조

등골나물 추출물(실시예 1-4)을 함유한 화장료 중 영양에센스의 처방예는 다음 표 6과 같다.

성분	함량(중량%)
등골나물 추출물(실시예 1-4)	3.0
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
폴리에칠렌글리콜	2.0
카보머	1.0
소듐히아루로네이트	0.1
글리신	3.0
폴리아크릴아마이드	2.0
히드록시에칠셀룰로이즈	0.2
에탄올	3.0
폴리옥시에칠렌경화피마자유	1.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
정제수	잔량(to 100)

처방예 4 : 영양크림의 제조

등골나물 추출물(실시예 1-4)을 함유한 화장료 중 영양크림의 처방예는 다음 표 7과 같다.

성분	함량(중량%)
등골나물 추출물(실시예 1-4)	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	3.0
하이드로제네이티드레시친	1.0
옥틸도데카놀	3.0
트리옥타노인	2.0
스테아릭에씨드	1.5
세토스테아릴알콜	2.0
폴리솔베이트60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	2.0
디메치콘	3.0
항산화제	0.3
산탄검	0.2
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
정제수	잔량(to100)

처방예 5 : 바디크림의 제조

등골나물 추출물(실시예 1-4)을 함유한 화장료 중 바디크림의 처방예는 다음 표 8과 같다.

성분	함량(중량%)
등골나물 추출물(실시예 1-4)	3.0
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
소듐세틸설페이트	0.1
판테놀	1.0
산탄검	1.0
카보머	0.1
비스왁스	0.3
세탄올	2.5
글리세릴스테아레이트	2.5
소르비탄스테아레이트	1.5
미네랄오일	5.0
스쿠알렌	2.0
항산화제	0.3
디메치콘	1.0
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
정제수	잔량(to 100)

처방예 6 : 팩의 제조

등골나물 추출물(실시예 1-4)을 함유한 화장료 중 팩의 처방예는 다음 표 9과 같다.

성분	함량(중량%)
등골나물 추출물(실시예 1-4)	5.0
글리세린	7.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
스쿠알렌	3.0
디메치콘	3.0
소듐히아루로네이트	0.1
글리신	2.0
폴리아크릴아마이드	5.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
정제수	잔량(to 100)

실험예 4 : 피부 미백 효과 시험

상기 in vitro 실험에서 나타난 미백 효과가 실제적으로 사람의 피부 미백에 도움을 주는 지 확인하기 위하여 실시예 1-4의 등골나물 추출물이 함유된 영양크림(처방예 4)에 대하여 인체 적용시험을 실시하였다. 로보스킨 분석기(Roboskin analyser) 장비를 이용한 피부 미백 시험은 피시험자의 얼굴 부위에 시료 또는 제품을 적용하면서 주기적으로 색소 침착 및 피부톤(밝기)의 개선 효과를 평가하였다. 시험은 역시 피부 탄력 개선 시험과 동일하게 수행되었으며 따라서, 피시험자 10명(대조구 5명, 시험구 5명)으로 진행되었으며 모두 여성으로 연령은 평균 34세로 구성되었다. 역시 사용 전, 사용 후 1주, 2주, 4주, 6주의 총 5회 측정을 실시하여 평균값을 구하였으며 모든 시험은 20-24℃, 습도 45-55%인 항온항습실에서 진행되었고 세안 후 항온항습실에서 최소 1시간 이상 적응 시킨 후 측정하였다.

	사용전		1주		2주		4주		6주
	대조구	시험구	대조구	시험구	대조구	시험구	대조구	시험구	대조구	시험구
색소침착(소)	9.4	9.5	9.5	9.3	9.3	8.4	9.3	8.0	9.2	7.8
색소침착(대)	38.9	38.7	38.8	38.2	38.1	36.2	37.8	34.6	37.5	32.9
밝기	61.5	61.1	61.7	62.3	62.6	65.2	63.3	65.9	64.1	66.2

등골나물 추출물이 함유된 영양크림인 처방예 4에 대한 피부 미백 효과를 측정한 결과, 2주차부터 색소침착(대, 소)이 감소되는 경향을 나타내었으며 피부 밝기 또한 밝아지는 것을 알 수 있어 피부 미백에 도움을 주는 것을 알 수 있었다.

이상 실험예에서 확인된 바와 같이, 본 발명에 따른 등골나물 추출물은 미백 효과를 지니고 있으며, 이를 포함하여 제조한 화장료 조성물 역시 미백 효과를 가진다. 따라서 본 발명은 피부 세포 내 멜라닌의 생성을 억제하여 미백에 도움을 주는 등골나물 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물을 제공하는 효과가 있다.

Claims

등골나물(Eupatorium japonicum Thunb . ex Murray) 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
등골나물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
등골나물 추출물은 물 또는 알코올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들의 혼합 용매 중에서 선택된 용매로 추출하여 얻어진 추출물인 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
등골나물 추출물은 45~120℃에서 30분~24시간 가열하여 열수 추출하거나, 5~40℃에서 30분~15일간 침지하여 진탕 추출하는 방법 중에서 선택된 적어도 하나의 추출 방법을 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
등골나물 추출물은 미백 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01~30중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
등골나물 추출물은 티로시나제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생합성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.