CN113749965A - 一种细胞修复透皮梯度肽SMRgp对面部紫外损伤和光老化修复及其护肤品、清洁品生产工艺技术 - Google Patents
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Abstract
SMRgp梯度肽由胶原蛋白大分子、18KDa、0.5KDa和寡聚氨基酸、氨基酸等一系列梯度分子组成,甘氨酸、脯氨酸含量较高,都超过了20%,具有明显的透皮功能。SMRgp梯度肽具有保护细胞膜结构功能,稳定细胞膜系统,保护细胞器的完整性,防止细胞涨亡,延长细胞的寿命;尤其是能够保护和修复细胞的紫外损伤。公开了SMRgp制备修护水、精华液、面膜、面霜和眼霜等护肤品、洗液、香皂等制备技术和生产工艺,应用这类产品有利于修复紫外损伤,预防光老化,消除褐斑和预防皮肤癌变,SMRgp护肤使肌肤增加了弹性和亮洁,减少了皱纹,减少了褐斑,从根本上抗衰形成了肌肤水嫩健康,凸显了SMRgp延长细胞、组织寿命的功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种富含脯氨酸、甘氨酸的透皮梯度肽SMRgp,能够对细胞的紫外损伤进行修复,也能对面部紫外损伤和光老化进行修复,可减少皮肤干纹细纹法令纹,提高肌肤透明度,增强皮肤蕴水、紧致增弹等,并公开了用其制备护肤品、清洁品的生产工艺技术,属于应用生物技术领域。
背景技术
紫外线广泛存在,尤其高原地区紫外线是广谱性的,辐射非常强,驻守高原的英雄解放军战士皮肤晒伤、开裂、黝黑极为常见。即便防晒霜标准达到SPF50+PA+++,即防晒伤SPF50值持续500分钟效果;PA指防晒黑,3+为最高标准,但防晒效果并不明显。即便各种优良的军需的利用,紫外线辐射也是非常难以解决的问题!战术头套影响到战士、居民的听力也会造成呼吸困难,这在高原地区是非常致命的。我们进行了紫外线危害缓解功能肽与皮肤健康的深入研究。本研究发现一种细胞修复透皮梯度肽SMRgp对面部紫外损伤和光老化修复有功能,通过护肤品的制备技术,对面部紫外损伤有修复作用,并能够进行紫外线下细胞保护和抗光衰老。
目前对人类皮肤紫外损伤、光老化及衰老的研究还处于初级阶段,对细胞衰老、修复和在衰老中细胞的动态变化不甚清楚。胶原蛋白COL17A1驱动的干细胞间竞争对于维持小鼠的“年轻态”皮肤至关重要,但是随着时间的推移,这种竞争也会导致皮肤老化[1]。紫外线(UV)直接照射可使细胞损伤、死亡,并导致皮肤光老化或皮肤肿瘤。UVC与DMBA诱导的皮肤癌经常作为模型用来检测抗癌物质的功效[2]。除紫外线外空气中还有其他的有害物质会对人体皮肤组织和细胞造成伤害[3]。多个信号通路如Nrf2-Keap1-ARE、核因子κB、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶-西罗莫司靶蛋白(PI3K-AKt-mTOR)信号通路等参与皮肤光老化和(或)皮肤肿瘤的发病[4]。
但是在同样的环境中,有些人看起来拥有比预期年龄更年轻的皮肤外观,因为他们有模仿年轻皮肤生物特性的特殊基因表达[6],这些基因表达产生了某些天然生物相容性物质使皮肤看起来更年轻。基因表达的产物——肽类不仅是生命最基础营养物质,还能影响生物体代谢合成导致产生抵抗逆境的能力[7-11]。对肽的功能及其作用的研究已经在治病方面得到应用[12],包括抗氧化和免疫调节[13-15]。胶原蛋白COL17A1驱动的干细胞间竞争,在一定时间内能够维持小鼠的“年轻态”皮肤[1]。这应该与干细胞有很大的分化潜力有关,可以完成表皮细胞、组织的更新和修复[16],直接诱导分化干细胞可再生皮肤组织[17]。成体干细胞对于补充组织中被清除的细胞至关重要,但是随着年龄的增长、干细胞的耗竭以及衰老细胞的积累,成体干细胞的能力也会逐渐下降[1],形成皮肤变薄、脆弱、失去弹性、伤口愈合延迟以及角化细胞含量减少,同时还伴有成体干细胞减少等皮肤衰老的特征[1]。在美容和重建病例中,脂肪干细胞的再生能力及其在改善伤口愈合和疤痕方面因细胞因子和生长因子的功效而起作用[18],体外培养表皮干细胞可在临床应用[19-20]。
SMRgp是天然产物生物相容性材料(Natural biocompatible materials,NBM)。洋葱表皮细胞是最常用的细胞模型,广泛应用于生物学教学科研实验中,它的每一个细胞都被细胞壁整齐地间隔,能直接观察到天然生物相容性材料对单细胞的细胞寿命、细胞膜、细胞结构、细胞核及膜系统包括细胞器的影响,是验证天然生物相容性材料功能的单细胞反馈最佳模型,能直观地“看到”对细胞抗衰、延寿和损伤修复等的生物学效果。任何与干预衰老、延长细胞寿命、保护细胞结构、保护膜系统天然产物生物相容性材料,都有可能在皮肤抗衰、再生、制药和化妆品行业中发挥重要作用[20]。对SMRgp的研究开发有望为皮肤老化、细胞延寿提供新的途径。
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发明内容
1、一种细胞修复透皮梯度肽SMRgp对面部紫外损伤和光老化修复及其护肤品的制备技术;
2、细胞修复透皮梯度肽SMRgp其特征是高含甘氨酸、脯氨酸;
3、SMRgp具有延长细胞寿命的功能;
4、SMRgp有能力保护和修复细胞紫外损伤,保持细胞结构稳定;
5、SMRgp梯度肽制备护肤品、清洁品修复紫外损伤,预防光老化;
6、SMRgp梯度肽制备修护水、精华、面膜液、面乳、面霜、眼霜等护肤品配方及工艺生产的工艺流程;
7、SMRgp梯度肽制备洗衣液的配方和成分配比;
8、SMRgp梯度肽可以用于制备洗面奶、沐浴露、洁面膏、洁面乳、香波、沐浴露、洗手液、香皂等,成分配比;
9、SMRgp梯度肽护肤品减少皱纹、褐斑、眼袋、抵抗面部紫外损伤、光老化、增加弹性、光洁平滑的应用。
本发明的技术方案如下:
1.一种细胞修复透皮梯度肽SMRgp对面部紫外损伤和光老化修复及其护肤品的制备技术。
抽提自海参、动物胶原蛋白、玉米蛋白、水稻蛋白,在食用益生菌发酵后,形成不同分子大小的梯度分子量的梯度肽(gradient peptide,gp),能够对皮肤保养修复(skinmaintain repair,SMR),简称梯度肽SMRgp,它具有明显的透皮功能,能够修复细胞的紫外损伤,可形成对面部紫外损伤和光老化有修复作用的护肤品及其制备技术。
物料比为水∶物料=1∶0.5-50,在高压或非高压情况下煮沸,或者微波抽提8分钟-10小时,最后保温自然凉,食用益生菌发酵,由胶原蛋白大分子到18KDa左右的胶原蛋白梯度分子汇集为指标,也可以加入生物酶辅助,所有的蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、羧基蛋白酶和碱性蛋白酶等等都可以被利用。由标志分子18KDa左右的胶原蛋白分子到小于3KDa的梯度胶原多肽分子,为比较多的分子量,如图1。分子量小于3KDa的胶原肽,以及小于1.5KDa至0.3KDa的胶原多肽分子和寡聚氨基酸、氨基酸也是很多,图1SDS蛋白凝胶电泳中梯度肽SMRgp是包括从大分子到小分子的梯度分子在电泳图中呈现蓝色的拖尾,标志分子为18KDa的蛋白分子,小于3KDa小肽分子比较多,以及小于1.5KDa至0.3KDa的多肽分子和寡聚氨基酸、氨基酸也是很多。显示从大分子及各个分子梯度形成蓝色的拖尾,中间蓝带就是18KDa分子,其下面是的比较均匀的小肽梯度分子拖尾,直到到1.5KDa胶原小肽分子和寡聚氨基酸、氨基酸。具有细胞修复、透皮功能,利用本梯度肽SMRgp对面部紫外损伤和光老化修复,并将其进行护肤品的制备。
2.细胞修复透皮梯度肽SMRgp其特征是高含甘氨酸、脯氨酸
通过硅烷化将氨基酸衍生后,利用气相色谱质谱联用(GC-MS)对SMRgp梯度肽的氨基酸进行了氨基酸成分测定表明,甘氨酸、脯氨酸含量较高,都超过了20%,谷氨酸、丙氨酸都超过或接近10%,这四种氨基酸平均占66.5628%,见表1。
表1 SMRgp酶解产物GC-MS氨基酸组成一览表
3.SMRgp具有延长细胞寿命的功能
利用单细胞实验方法,洋葱表皮是每一个细胞都被细胞壁间隔起来的单层细胞,可以直接通过显微镜观察细胞的状态。能最直接地反映出SMRgp梯度肽对细胞结构稳定性、膜系统及寿命影响的生物学效应。将新鲜的白色洋葱的第3片鳞片外表皮轻轻揭下后,放置于常用固体培养基上,处理组加1ml的稀释100倍的120mg/ml的SMRgp肽,对照组加1ml标准MS液体培养基,48h后利用10x10倍,和10x40倍光学显微镜观察醋酸洋红染色的洋葱表皮细胞,检测延长细胞寿命情况。
SMRgp梯度肽处理组观察统计了2460个细胞,100%的细胞都处在质壁分离的状态,说明细胞膜具有功能结构,膜结构完整能起到保护隔离作用,没有细胞涨亡(见图2a)。97.3%的细胞核醋酸洋红染色后呈现鲜红色和正常大小,见图2洋葱表皮细胞离体48h对比观察,a使用SMRgp肽的细胞状态紧缩,细胞膜结构功能完整,细胞核大小和色彩均一,体现细胞具有活性。b在没有SMRgp肽的作用下,细胞溃解,细胞核解体,在醋酸洋红染色的情况下呈现核质降解扩散至细胞质,并有空泡出现。SMRgp延长了细胞寿命。说明与对照相组相比SMRgp梯度肽保护了膜系统,保护了细胞、细胞器的结构功能和完整性。
1.22%的细胞核小于正常细胞核1/3,发生了细胞核固缩现象,醋酸洋红染色后细胞核呈褐色,但是,细胞不膨大而是收缩,呈现离体后细胞有序凋亡状态。1.75%的细胞表现细胞核增大,染色变深(见图2b),但是核边界分明。SMRgp梯度肽处理组没有发现细胞核中DNA降解向细胞质扩散迹象,也没有核膜崩溃破裂DNA外泄至细胞质的细胞。更没有细胞裂解崩溃,内容物流出的细胞以及空胞的细胞。说明SMRgp梯度肽保护了细胞膜结构功能,稳定了细胞膜系统,保护了细胞器的完整性和功能,防止了细胞涨亡,延长了细胞的寿命。
4.SMRgp有能力保护和修复细胞紫外损伤,保持细胞结构稳定性
紫外线穿透力强与光老化、褐斑和皮肤癌变有直接的关系,SMRgp能够保护和修复细胞的紫外损伤。将洋葱第3鳞片外表皮单细胞膜置于标准MS固体培养基上并分成两组,对照组在培养基上滴加SM植物培养液,处理组滴加SMRgp梯度肽。紫外照射2小时剂量至少达到504000uW.s/cm2,双盲对比实验观察培养48小时后的细胞见图3,紫外线照射细胞2h,培养48小时的洋葱表皮细胞,ab是没有SmrPemix处理的细胞,a:染色质、细胞膜系统已经被破坏,细胞周围充满了红色核酸;b:细胞核接近透明,DNA降解外泄;cd SmrPemix处理的细胞,c:细胞结构完整,膜功能完善,细胞核居于中央没有降解DNA外泄;d:细胞核膜完整并且具有功能,在醋酸洋红染色的情况下,边界清楚,体现膜系统结构功能完整。
两组一共观察统计了5900个细胞,实验结果表明,紫外线透射2小时,细胞离体培养48小时对照组(见图3ab)观察了2100个细胞,它们被紫外损伤严重,100%细胞壁纵向两端充满被醋酸洋红染色呈现红色的核质,即100%的细胞核破裂,DNA降解并外溢到细胞外周的细胞壁处(见图3a)。93.00%细胞核染色接近透明,膜系统崩塌,100%细胞涨亡。观察不到凋亡的细胞。
SMRgp处理组细胞得到了修复和保护。紫外线透射2小时离体培养48小时,双盲对比观察3800个细胞实验结果表明,100%细胞膜紧缩(见图3cd),都呈质壁分离状态,表明细胞膜结构功能完整。在醋酸洋红染色的情况下,0个细胞壁纵向两端有现红色的核质,0个细胞DNA降解,没有细胞涨亡。细胞核色彩鲜明边界清晰居于细胞中央(见图3cd),体现100%的细胞核膜结构功能完整,膜系统结构功能完整,细胞器受到了保护。5.26%细胞核变小,细胞核呈固缩状态,3.16%呈现凋亡状态,当紫外损伤到无法修复时,这些细胞还有活性,能够自我清除启动程序性死亡,具有有效地防卫和修复机制,避免损伤不断积累从而引起异常增生的发生。8.68%细胞核变大,但核边界清晰没有DNA降解。说明SMRgp能够修复紫外线对细胞的损伤,保护了细胞、核以及细胞膜系统,稳定了细胞结构,保护了细胞的活性,延长了细胞寿命。
5.SMRgp梯度肽制备护肤品、清洁品修复紫外损伤,预防光老化
公开了SMRgp梯度肽制备护肤、清洁用品的配方和生产工艺技术,包括:制备修护水、精华、面膜液、面乳、面霜、眼霜等护肤品配方及生产的工艺流程;制备洗衣液的配方和成分配比;制备洗面奶、沐浴露、洁面膏、洁面乳、香波、沐浴露、洗手液、香皂等,成分配比及工艺生产的流程等。
紫外线穿透力强与光老化、褐斑和皮肤癌变有直接的关系,SMRgp光细胞水能够保护和修复细胞的紫外损伤。利用SMRgp的修护功能,形成修护水、精华液、面膜、面霜和眼霜等喷施、涂抹于面部皮肤,修复紫外损伤,预防光老化,消除褐斑和皮肤癌变的可能性。
6.SMRgp梯度肽制备修护水、精华、面膜液、面乳、面霜、眼霜等护肤品配方及工艺生产的工艺流程
A相升温至85℃溶解完全,保温20分钟降温至40℃备用;B相称好搅拌溶解完全备用;将B相加入A相搅拌均匀即可;取样,对版,初检;初检无异常过滤出料,贴好标签入库;静置24小时检验合格后分装。
所述SMRgp梯度肽质量比为1∶(1-1000),一般比例不超过10%,最佳为总量的1-4%,见表2。
表2 SMRgp梯度肽在各种护肤品中的质量比。
表3 经实验通常应用成本与效果最佳比例
7.SMRgp梯度肽制备洗衣液的配方和成分配比
所述SMRgp梯度肽质量比为1∶(1-1000),一般为25kg加0.5-2kg,相对而言应用3%的SMRgp梯度肽进行产品生产,成本与效果最佳比例,见表4。
表4 SMRgp梯度肽制备洗衣液的配方和成分配比:
8.SMRgp梯度肽可以用于制备洗面奶、沐浴露、洁面膏、洁面乳、香波、沐浴露、洗手液、香皂等,成分配比
所述SMRgp梯度肽质量比为1∶(1-1000),一般为总量的2-8%,见表5。
表5用SMRgp梯度肽制备洗面奶、沐浴露、洁面膏、洁面乳、香波、沐浴露、洗手液、香皂等的成分配比:
9.SMRgp梯度肽护肤品减少皱纹、褐斑、眼袋、抵抗面部紫外损伤、光老化、增加弹性、光洁平滑等的应用
紫外线穿透力强与光老化、褐斑和皮肤癌变有直接的关系,SMRgp能够对面部光老化、褐斑起到修复作用。以50-520mg/ml的SMRgp为主,形成液体喷施、覆膜面部,并加入油脂中形成面部、眼部乳液,观察短时间15分钟和长时间的使用效果,使用前后照相对比。以50-54岁期间为例,这期间是女性皮肤最容易出现松弛、下垂、弹性弱、有皱纹、暗黄等衰老现象的时期。见图4a(50岁)左侧人字纹深邃细长直到嘴角,右侧的人字纹鼻翼侧很深,上唇纵向唇纹多,木偶纹很深重,有眼袋和泪沟,眉间5条眉间纹,左眉头皱纹长达2.5CM。经过使用8个月的SMRgp后,在2016年5月(51岁)面部皱纹明显减少,其中左眉头皱纹缩小到1.2CM,并且变浅;左侧人字纹变浅,右侧的人字纹鼻翼侧也变浅,上唇纵向唇纹变浅。2017年5月(52岁)皮肤皱纹进一步减少,眉头皱纹已经基本消除,只留下很难观察到的浅印,鼻旁的人字纹也在变浅甚至消除,上唇纵向唇纹变浅。2019年5月(54)皮肤富有弹性、光洁平滑、皱纹较少,褐斑明显减少。图5表明SMRgp缓解了褐斑,使肌肤增加了弹性和亮洁,减少了皱纹,从根本上延缓皮肤老化,形成了肌肤健康,凸显了SMRgp肽延长细胞、组织寿命的功能。
用SMRgp后,细长直到嘴角的人字纹(a)几乎消失(e),眉间纹(a)变浅,50-54岁5年间皮肤并没有老化(a-e)反而变得富有弹性、光洁平滑、皱纹变少(见图4)。
表6 SMRgp对皮肤5年(50-54岁)的影响
将皮肤光滑、光洁、皱纹、眼袋、褐斑分十个等级,如:皮肤凸凹不平:1(不好),非常干滑:10(非常好)。图5.以右眼下色斑为例,a:15年色斑较深,b-e:16年至19年褐斑明显变淡,皮肤逐年变得光滑自细。
本发明的优点在于:
SMRgp梯度肽由18KDa、0.5KDa和寡聚氨基酸、氨基酸,并含有一定的胶原蛋白大分子等一系列梯度分子组成,具有明显的透皮功能,其中甘氨酸、脯氨酸含量较高,都超过了20%。甘氨酸有益于激活干细胞生长,它提高了新生仔猪小肠上皮细胞的生长及抗氧化应激的能力。脯氨酸是生物体内理想的渗透调节物质,可作为膜和酶的保护物质及自由基清除剂。SMRgp梯度肽具有保护细胞膜结构功能,稳定细胞膜系统,保护细胞器的完整性,防止细胞涨亡,延长细胞的寿命;尤其是能够保护和修复细胞的紫外损伤。公开了SMRgp制备修护水、精华液、面膜、面霜和眼霜等护肤品、洗液、香皂等制备技术和生产工艺,应用这类产品有利于修复紫外损伤,预防光老化,消除褐斑和预防皮肤癌变,SMRgp护肤使肌肤增加了弹性和亮洁,减少了皱纹,减少了褐斑,从根本上抗衰形成了肌肤水嫩健康,凸显了SMRgp延长细胞、组织寿命的功能。
附图说明:
图1梯度肽SMRgp是包括从大分子到小分子的梯度分子在电泳图中呈现蓝色的拖尾,标志分子为18KDa的蛋白分子,小于3KDa小肽分子比较多,以及小于1.5KDa至0.3KDa的多肽分子和寡聚氨基酸、氨基酸也是很多。
图2洋葱表皮细胞离体48h对比观察,a使用SMRgp肽的细胞状态紧缩,细胞膜结构功能完整,细胞核大小和色彩均一,体现细胞具有活性。b在没有SMRgp肽的作用下,细胞溃解,细胞核解体,在醋酸洋红染色的情况下呈现核质降解扩散至细胞质,并有空泡出现。SMRgp延长了细胞寿命。
图3紫外线照射细胞2h,培养48小时的洋葱表皮细胞,ab是没有SmrPemix处理的细胞,a:染色质、细胞膜系统已经被破坏,细胞周围充满了红色核酸;b:细胞核接近透明,DNA降解外泄;cd SmrPemix处理的细胞,c:细胞结构完整,膜功能完善,细胞核居于中央没有降解DNA外泄;d:细胞核膜完整并且具有功能,在醋酸洋红染色的情况下,边界清楚,体现膜系统结构功能完整。
图4用SMRGP后,细长直到嘴角的人字纹(a)几乎消失(e),眉间纹(a)变浅,50-54岁5年间皮肤并没有老化(a-e)反而变得富有弹性、光洁平滑、皱纹变少。
图5以右眼下色斑为例,a:15年色斑较深,b-e:16年至19年褐斑明显变淡,皮肤逐年变得光滑白细。
图6通过硅烷化将氨基酸衍生后,利用气相色谱质谱联用(GC-MS)对SMRgp梯度肽的氨基酸进行了氨基酸成分测定表明,甘氨酸、脯氨酸含量较高,都超过了20%,谷氨酸、丙氨酸都超过或接近10%,这四种氨基酸平均占66.5628%。
具体实施方式
实施例1、含有SMRgp梯度肽护肤品对面部皮肤紫外损伤的作用
紫外损伤皮肤发红、痛痒、黝黑、干裂,身体造成了很大损害。尤其对长期做室外植物种植人员,她(他)们经常在烈日下进行植物养护、授粉、统计、除草以及收获工作,广谱性的紫外线辐射非常强。含有SMRgp梯度肽护肤品对预防面部紫外损伤和光老化非常有帮助。外出前洁面后,喷施含有SMRgp梯度肽的修护水,涂抹含有SMRgp梯度肽精华液之后,涂抹含有SMRgp梯度肽的面霜,如食妙蓉系类,在室外皮肤会得到很好的保护,晚间面部清洗后敷上食妙蓉面膜做20-30分钟冷敷后,免洗,直接涂食妙蓉面霜养护,即可修护紫外损伤。
实施例2、一种细胞修复透皮梯度肽SMRgp的制备技术
抽提自海参、动物胶原蛋白、玉米蛋白、水稻蛋白,物料比为水∶物料=1∶0.5-50。当物料比为水∶物料=1∶0.5时,产物的目标物质浓度较低,优点是不用稀释;当物料比为水∶物料=1∶50时,目标物质浓度太高。最佳为重量比1∶6,在高压或非高压情况下煮沸,或者微波抽提8分钟-10小时,最后保温自然凉,食用益生菌发酵,由胶原蛋白大分子到18KDa左右的胶原蛋白梯度分子汇集为指标,也可以加入生物酶辅助,所有的蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、羧基蛋白酶和碱性蛋白酶等等都可以被利用。在食用益生菌发酵后,形成不同分子大小的梯度分子量的梯度肽(gradient peptide,gp)由18KDa左右的胶原蛋白分子到小于3KDa的梯度胶原多肽分子,为比较多的分子量,如图1。分子量小于3KDa的胶原肽,以及小于1.5KDa至0.3KDa的胶原多肽分子和寡聚氨基酸、氨基酸也是很多,涂中可见由大分子到小分子的拖尾,形成梯度肽SMRgp。图1SDS蛋白胶中呈现蓝色的是梯度分子,显示从大分子及各个分子梯度形成蓝色的拖尾,中间蓝带就是18KDa分子,其下面是的比较均匀的小肽梯度分子拖尾,直到到1.5KDa胶原小肽分子和寡聚氨基酸、氨基酸。具有明显的皮肤保养、修复功能和透皮功能,能够修复细胞的紫外损伤,可形成对面部紫外损伤和光老化有修复作用。
实施例3、利用气相色谱质谱联用(GC-MS)检测细胞修复透皮梯度肽SMRgp其特征是高含甘氨酸、脯氨酸
通过硅烷化将氨基酸衍生后,利用气相色谱质谱联用(GC-MS)对SMRgp梯度肽的氨基酸进行了氨基酸成分测定表明,甘氨酸、脯氨酸含量较高,都超过了20%,谷氨酸、丙氨酸都超过或接近10%,这四种氨基酸平均占66.5628%,见图6。
实施例4、SMRgp能够起到延长细胞寿命的作用
将新鲜的白色洋葱的第3片鳞片外表皮轻轻揭下后,放置于标准MS固体培养基上,处理组加1ml的稀释100倍的120mg/ml的SMRgp肽,对照组加1ml标准MS液体培养基,48h后利用10x10倍,和10x40倍光学显微镜观察醋酸洋红染色的洋葱表皮细胞。
当细胞离体时因为环境的变化引起细胞结构不稳定和死亡,及时的SMRgp修复会延长细胞的寿命。将洋葱表皮剥离后放置于SM培养基上,分为对照组和SMRgp肽处理组在离体培养48小时后双盲实验,两组观察统计了4910个细胞。对照组洋葱表皮细胞,观察统计了2450个细胞,实验结果表明100%的细胞都呈现出涨亡状态,21.63%的细胞核小于正常细胞核1/3,78.37%的细胞表现为细胞核增大DNA降解溢出,其中包括14.29%的细胞呈现细胞核周边有降解的DNA向外扩散到细胞质,细胞质蛋白质颗粒明显增多,呈现出膜的完整性降低(见图2b)。8.16%的细胞醋酸洋红染色细胞质部分区段已经呈现红色(见表7),表现核膜崩溃破裂DNA外泄至细胞质使醋酸洋红染红部分细胞。2.04%的细胞全部被醋酸洋红染成红色,表明膜系统裂解崩溃,DNA降解物分散到整个细胞。11.02%的细胞空胞,细胞消失(见图2b)。
表7. 48h细胞衰老、死亡统计一览表
表7中48h细胞衰老、死亡统计表明,SMRgp能够起到延长细胞寿命的作用。
实施例5、SMRgp能够保护和修复细胞紫外损伤,保持细胞结构稳定性
取新鲜的洋葱表皮,放置于标准MS固体培养基上,一部分加1ml的120mg/ml的SMRgp肽,另一部分加标准MS培养液作为对照组。在超净工作台中紫外线直接照射细胞2小时后,在25°组织培养,48h后利用10x10倍,和10x40倍光学显微镜观察醋酸洋红染色的洋葱表皮细胞。超净工作台国家生产标准要求是紫外灯的紫外线辐射强度值(Z)≥70-100uw/Cm2,185-315nm有杀菌效果,通常超净工作台应用254nm的紫外杀菌,实验证实了正常情况下本超净工作台开启20分钟后,即可杀灭表面的细菌和真菌。
剂量(pW.scm2)=强度(uw/cm2)×时间(s)
按最小值Z≥70u/cm时,30分钟,照射剂量达到126000uW.s/cm2,远远大于杀灭大肠杆菌的照射剂量为20000pW.s/cm2,杀灭枯草杆菌黑色变种芽胞的照射剂量为100000Ws/cm2。利用洋葱第3片鳞片外表皮单细胞分成两组,在相同外界条件下放置于超净工作台的紫外灭菌灯下2小时,紫外照射剂量至少达到504000uW.s/cm2,对单细胞产生了足够的紫外损伤。
两组一共观察统计了5900个细胞,实验结果表明,紫外线透射2小时,细胞离体培养48小时对照组(见图3ab)观察了2100个细胞,它们被紫外损伤严重,100%细胞壁纵向两端充满被醋酸洋红染色呈现红色的核质,即100%的细胞核破裂,DNA降解并外溢到细胞外周的细胞壁处(见图3a)。93.00%细胞核染色接近透明,膜系统崩塌,100%细胞涨亡。观察不到凋亡的细胞。
SMRgp处理组细胞得到了修复和保护。紫外线透射2小时离体培养48小时,双盲对比观察3800个细胞实验结果表明,100%细胞膜紧缩(见图3cd),都呈质壁分离状态,表明细胞膜结构功能完整。在醋酸洋红染色的情况下,0个细胞壁纵向两端有现红色的核质,0个细胞DNA降解,没有细胞涨亡。细胞核色彩鲜明边界清晰居于细胞中央(见图3cd),体现100%的细胞核膜结构功能完整,膜系统结构功能完整,细胞器受到了保护。5.26%细胞核变小,细胞核呈固缩状态,3.16%呈现凋亡状态,当紫外损伤到无法修复时,这些细胞还有活性,能够自我清除启动程序性死亡,具有有效地防卫和修复机制,避免损伤不断积累从而引起异常增生的发生。8.68%细胞核变大,但核边界清晰没有DNA降解。说明SMRgp能够修复紫外线对细胞的损伤,保护了细胞、核以及细胞膜系统,稳定了细胞结构,保护了细胞的活性,延长了细胞寿命。
表8.紫外线处理2h后,48h双盲对比观察
实施例6、SMRgp梯度肽制备护肤品的工艺技术
紫外线穿透力强与光老化、褐斑和皮肤癌变有直接的关系,SMRgp光细胞水能够保护和修复细胞的紫外损伤。
利用SMRgp的修护功能,形成修护水、精华液、面膜、面霜和眼霜等喷施、涂抹于面部皮肤,观察皮肤皱纹、色斑和弹性的变化,及其对皮肤抗衰的生物学效应。制备修护水、精华、面膜液、面乳、面霜、眼霜等护肤品配方因成本要求,物料比不一样。
在低成本的要求的情况下,应用表2中物料添加范围的最低物料值,进行修护水、精华、面膜液、面乳、面霜、眼霜等护肤品等护肤品生产;在成本预算充盈的情况下,应用表2中物料添加范围的最高物料值,进行修护水、精华、面膜液、面乳、面霜、眼霜等护肤品等护肤品生产;相对而言应用成本与效果最佳比例(表3)制备生产的护肤品效果也很好。
实施例7、SMRgp梯度肽制备洗衣液、洗面奶、沐浴露、洁面膏、香波、沐浴露、洗手液等等清洁用品
利用SMRgp梯度肽制备洗面奶、沐浴露、洁面膏、香波、沐浴露、洗手液等等清洁用品护理肌肤,结合硬脂基二甲基甘氨酸钠和月桂基氨丙基甘氨酸按特定的比例混合的阴离子型表面活性剂。它不仅遗留了胶原蛋白、多肽的保湿、温和性能,而且具有优秀的发泡性能——即使在硬水中使用也能产生丰富、细腻的泡沫。低脱脂力、非常低的皮肤和眼睛刺激性等特点,在皮肤清洁产品中使用不会刺激皮肤,非常容易冲净,
并且用后皮肤感觉干净、清爽、自然。更引人注意的是,高温下为透明液体,低温在表活体系中能产生亮丽的珠光膏体。膏体容易铺展,而且受温度影响的变化很小,耐硬水、具有良好的钙皂分散力;拥有卓越的高低温稳定性,毫不受温度(4℃-50℃)的影响。
在低成本的要求的情况下,应用表4、表5中物料添加范围的最低物料值,进行产品生产;在成本预算充盈的情况下,应用表4、表5中物料添加范围的最高物料值,进行产品生产;相对而言应用3%的SMRgp梯度肽成本与效果最佳比例。
实施例8、SMRgp梯度肽的护肤品的有增强皮肤弹性、丰满皮下组织、减少抚平皱纹,使皮肤显得细嫩光滑去皱功能
皮肤真皮层75%由胶原蛋白组成,用含有SMRgp梯度肽的非油脂精华涂抹皮肤,大分子胶原蛋白形成网状结构,提供皮肤的张力和弹性;同时,胶原蛋白还是表皮层和表皮附属器官(毛发)的营养供应站,并为表皮输送水分。SMRgp梯度肽食材精华保湿防皱精华的保湿、去皱效果好,面部皱纹明显变少变淡。
本专利技术产品对表皮的角化细胞、扁平透明细胞、扁平梭形细胞、棘细胞、基底圆柱细胞的养护。大分子形成网联使面部紧致,小分子被吸收利用,改变面部皮肤松弛下垂状态,延缓肌肤老化,补充了面部胶原蛋白、结构糖类的流失,恢复面部组织结构,皮肤的弹性和紧致,松弛的面部皮肤提拉紧致。
面膜成分和工艺见表2、3得到面膜液,浸泡面膜、眼膜贴片,常常敷面能够祛黄淡斑润面,对皮肤角质层有良好的滋养作用,可以增强皮肤弹性、丰满皮下组织、减少抚平皱纹,使皮肤显得细嫩光滑。实验表明本品面膜比透明质酸钠的面膜用后更具有弹性,具有防皱、美白、补水功能。SMRgp有超越于透明质酸的保湿作用,主要是通过无数个的末端羟基与水分子结合形成氢键,来结合接近500倍的水分子。
本品对暗黄、干燥、细纹等有所改观,能起到快速补充养分并修补受损细胞的功效,并促进血液循环、淡化黑眼圈,细纹,加速代谢产物的排出,从而达到祛黄、修纹、紧致、淡化黑眼圈的效果。
表2列出护面霜的配方,用食材精华护面霜保湿、去皱效果好,面部皱纹明显变少变淡。本品改善肤感,季节转换或其他原因,感觉面部皮肤硬硬的,面部容易起大型褶皱和过敏。食材精华分子调节血管壁的通透性,促进新陈代谢和创伤愈合,改善皮肤营养代谢,使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老,并能抗过敏,使皮肤光洁润玉,起到改善肤感的效果。
眼霜的应用,其特征在于,所述化妆品为保护眼部皮肤,保湿防皱、祛黄淡斑、防晒抗氧化、修复受损、过敏的化妆品。其特征在于:所述牛耳或者鱼皮骨提取胶原蛋白和胶原多肽的添加量为0-10mg/100mL,所述胶原蛋白提取A液与胶原多肽提取B液的质量比为1∶1,表2种给出一种眼霜的配方,还可依据其他功能添加必要物质,各成分的比例可根据功能进行调整。本品对黑眼圈、干燥、细纹等有所改观,本品含有天然营养因子胶原蛋白I型、III型和V型等珍贵的天然食材分子,能起到快速补充养分并修补受损细胞的功效,并促进血液循环、淡化黑眼圈,细纹,加速代谢产物的排出,从而达到祛黄、修纹、紧致、淡化黑眼圈的效果。
实施例9、SMRgp梯度肽护肤品对面部过敏皮肤、光老化、褐斑皮肤的作用
目前对人类过敏皮肤、皮肤光老化、褐斑的研究尚无可用的实验模型,检验生物活性物质功能的手段是直接试用,以检测SMRgp能够对面部光老化、褐斑起到修复作用。
以50-520mg/ml的SMRgp,实验表明最佳值为120mg/ml的SMRgp为主,形成液体喷施、覆膜面部,并加入油脂中形成面部、眼部乳液,观察短时间15分钟和长时间的使用效果,使用前后照相对比。本实验试用者300人左右的各个年龄层的女性,众所周知女性35岁以后容易出现皮肤松弛、产生皱纹、弹性减少、肤色暗黄等现象,试用者试用后皮肤都有改善。以50-54岁期间为例,这期间是女性皮肤最容易出现松弛、下垂、弹性弱、有皱纹、暗黄等衰老现象的时期。见图4a(50岁)左侧人字纹深邃细长直到嘴角,右侧的人字纹鼻翼侧很深,上唇纵向唇纹多,木偶纹很深重,有眼袋和泪沟,眉间5条眉间纹,左眉头皱纹长达2.5CM。经过使用8个月的SMRgp后,在2016年5月(51岁)面部皱纹明显减少,其中左眉头皱纹缩小到1.2CM,并且变浅;左侧人字纹变浅,右侧的人字纹鼻翼侧也变浅,上唇纵向唇纹变浅。2017年5月(52岁)皮肤皱纹进一步减少,眉头皱纹已经基本消除,只留下很难观察到的浅印,鼻旁的人字纹也在变浅甚至消除,上唇纵向唇纹变浅。2019年5月(54)皮肤富有弹性、光洁平滑、皱纹较少,褐斑明显减少。SMRgp使肌肤增加了弹性和亮洁,减少了皱纹,缓解了褐斑,从根本上延缓皮肤老化,形成了肌肤健康,凸显了SMRgp肽延长细胞、组织寿命的功能。
图4.用SMRgp后,细长直到嘴角的人字纹(a)几乎消失(e),眉间纹(a)变浅,50-54岁5年间皮肤并没有老化(a-e)反而变得富有弹性、光洁平滑、皱纹变少。
表5 SMRgp对皮肤5年(50-54岁)的影响
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种细胞修复透皮梯度肽SMRgp对面部紫外损伤和光老化修复及其护肤品的制备技术。梯度肽SMRgp富含脯氨酸、甘氨酸,能够对细胞的紫外损伤进行修复,也能对面部紫外损伤和光老化进行修复,用梯度肽SMRgp制备的护肤品、清洁品可减少皮肤干纹细纹法令纹,提高肌肤透明度,增强皮肤蕴水、紧致增弹等。公开了用梯度肽SMRgp制备护肤品、清洁品的生产工艺技术。
2.根据权利要求1所述细胞修复透皮梯度肽SMRgp其特征是高含甘氨酸、脯氨酸。
3.根据权利要求1所述SMRgp具有延长细胞寿命的功能。
4.根据权利要求1所述SMRgp有能力保护和修复细胞紫外损伤,保持细胞结构稳定。
5.根据权利要求1所述SMRgp梯度肽制备护肤品、清洁品修复紫外损伤,预防光老化。
6.根据权利要求1所述SMRgp梯度肽制备修护水、精华、面膜液、面乳、面霜、眼霜等护肤品配方及工艺生产的工艺流程。
7.根据权利要求1所述SMRgp梯度肽制备洗衣液的配方和成分配比。
8.根据权利要求1所述SMRgp梯度肽可以用于制备洗面奶、沐浴露、洁面膏、洁面乳、香波、沐浴露、洗手液、香皂等,成分配比。
9.根据权利要求1所述SMR梯度肽护肤品减少皱纹、褐斑、眼袋、抵抗面部光老化、增加弹性、光洁平滑等的应用。
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