KR101676607B1

KR101676607B1 - 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법

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Publication number: KR101676607B1
Application number: KR1020150190056A
Authority: KR
Inventors: 배수현; 정진아; 유지철; 서동삼; 장정호
Original assignee: 세원셀론텍(주)
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2016-11-16

Abstract

본 발명은 초고압 유화기를 사용하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 산삼 캘러스 추출물 제조방법 및 이를 함유하는 자외선 보호, 항염 및 항산화용 조성물 제조방법에 관한 것이다. 산삼 캘러스를 생물반응기를 이용하여 대량배양 생산한 뒤, 배양액을 제거하여 증류수와 혼합한 후 초고압 유화기를 사용하여 폴리페놀 추출 수율을 증가시키고, 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 갖는 산삼 캘러스 추출물을 제조하여, 인체 유래 각질형성 세포를 이용하여 산삼 캘러스 추출물이 세포독성 감소 효능, 자외선 보호 효능, 인터루킨 6 발현 억제 효능을 가지며, 초과산화물 제거효소 활성도가 농도 의존적으로 증가하는 물질로써 자외선 보호, 항염 및 항산화용 조성물에 이용될 수 있으므로 다양한 형태의 피부 외용제 화장품 소재로서 사용될 수 있다.

Description

자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법 {Manufacturing method of Panax ginseng C. A. Meyer (wild ginseng) callus extraction having UV protection, anti-inflammatory and antioxidant activity}

본 발명은 초고압 유화기를 사용하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

최근 국내 화장품 시장은 꾸준히 증가되어 시장규모가 늘어나고 있는 추세이다. 특히 천연 물질에 대한 관심 고조로 인하여 다양한 천연소재로부터 보다 안전한 화장품을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다(Park SH, et al. Terrein: a new melanogenesis inhibitor and its mechanism. Cellular and molecular life sciences. 2004;61(22):2878-85). 그 중 식물 추출물을 이용하여 개발된 화장품들은 보습 기능과 세포 재생 기능을 강화해 기존의 제품에 비해 부작용이 적을 뿐 아니라 효능의 지속성도 뛰어난 것으로 밝혀져 있다(Lee SM. The influence of the benefits sought of herbal cosmetics on brand choice. Journal of the Korean society of clothing and textiles. 2008;32(2):235-46). 따라서 식물 추출물을 이용한 화장품 원료의 지속적인 연구 및 개발이 필요하다.

인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 두릅나무과(Araliaceae) 인삼속(Panax)에 속하는 다년생의 쌍떡잎식물로써 뿌리를 식용 또는 약용으로 이용하고 있다(Gillis CN. Panax ginseng pharmacology: a nitric oxide link? Biochemical pharmacology. 1997;54(1):1-8). 인삼은 재배되는 형태에 따라 크게 자연 상태에서 자생하는 산삼과 재배를 통해 생산할 수 있는 인삼으로 구분을 하고 있다. 산삼은 일반적인 인삼에 비해 그 생장속도가 느리다. 산삼을 상품적으로 사용하기 위해서는 약 10 년에서 15 년이 된 것을 사용하며 재배인삼에 비해서 약효가 더 뛰어나다고 보고되어 있다(Wang ZH, et al. Study on the wild ginseng and cultured ginseng in northeast of china. International symposium on ginseng. 1998:109-14). 이러한 이유로 산삼은 재배인삼에 비해 고가에 거래가 되고 있으나, 그 양이 매우 적기 때문에 연구가 거의 되어있지 않은 실정이다(Yoo BS, et al. Characterization of cell cultures and ginsenoside production by cultured ginseng and wild mountain ginseng. Korean journal of biotechnology bioengineering. 2003;18:133-9). 이와 같이 희귀하고 재배하는 데 오랜 시간이 걸리는 산삼의 확보를 위해 최근 산삼 배양근과 배양세포의 형태로 대량배양하는 연구가 진행되고 있다(Son SH, et al. Multiple shoot regeneration from root organ cultures of Populus alba x P. grandidentata. Plant cell, tissue and organ culture. 1990;20(1):53-7, 8. Thanh N, et al. Methyl jasmonate elicitation enhanced synthesis of ginsenoside by cell suspension cultures of Panax ginseng in 5-l balloon type bubble bioreactors. Applied microbiology and biotechnology. 2005;67(2):197-201).

인삼에는 다양한 성분들이 존재하는데 그 중 폴리페놀(polyphenols)은 벤젠(benzene) 고리에 수산기(-OH)가 2 개 이상 붙어 있는 물질로, 식물 내에 존재하는 여러 페놀화합물을 총칭한다(Kris Etherton PM, et al. Bioactive compoundsin foods: their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer. The American journal of medicine. 2002;113(9):71-88). 페놀화합물은 항염, 항산화 효능을 가지고 있다고 알려져 있다(Surh YJ. Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected dietary and medicinal phenolic substances. Mutation research/fundamental and molecular mechanisms of mutagenesis. 1999;428(1):305-27). 이러한 식물의 페놀화합물은 세포벽 성분과 액포 등에 존재하며, 마쇄, 압착 등을 통한 세포 파쇄 시 세포벽 내의 폴리페놀이 추출될 수 있다고 보고되었다(Le Bourvellec C et al. Non-covalent interaction between procyanidins and apple cell wall material: Part I. Effect of some environmental parameters. Biochimica et biophysica acta. 2004;1672(3):192-202.).

인삼의 대표적인 유효물질로 알려진 진세노사이드는 액포에 존재한다고 알려져 있으며(Kochkin DV et al. Malonyl-ginsenoside content of a cell-suspension culture of Panax japonicus var. repens. Phytochemistry. 2013;93:18-26.), 노지 재배 시 46 년 간의 재배기간을 거친 후에 축적되기 시작한다(Thanh N, et al. Methyl jasmonate elicitation enhanced synthesis of ginsenoside by cell suspension cultures of Panax ginseng in 5-l balloon type bubble bioreactors. Applied microbiology and biotechnology. 2005;67(2):197-201). 또한 강장제, 항암, 백신, 항 스트레스, 노화방지 같은 유용활성이 보고된 바 있다(Proctor J, et al. Ginseng: industry, botany, and culture. Horticultural reviews. 1987;9:187-236, Scaglione F, et al. The standardised G115 Panax ginseng CA Meyer extract. Evidence based integrative medicine. 2005;2(4):195-206, Takahashi M, et al. Anti-stress effect of ginseng on the inhibition of the development of morphine tolerance in stressed mice. Japanese journal of pharmacology. 1992;59(3):399-404).

인삼 추출물은 폴리페놀(Choi HJ, et al. Identification of biologically active compoundsfrom Panax ginseng C.A. Meyer. Korean J.Food Sci. Technol. 34: 493-497. 2002), 진세노사이드(Han ST, et al. Analysis of ginsenoside composition of woods-grown ginseng roots. Food science and biotechnology. 2007;16(2):281-4)의 성분에 대해 분석된 바 있으며, 자외선 보호 효능(Kang TH, et al. Effects of red ginseng extract on UVB irradiation-induced skin aging in hairless mice. Journal of ethnopharmacology. 2009;123(3):446-51, Kimura Y, et al. Effects of ginseng saponins isolated from red ginseng roots on burn wound healing in mice. British journal of pharmacology. 2006;148(6):860-70, Kim S, et al. Anti-wrinkle effect by ginsenoside Rg3 derived from ginseng. Journal of the society of cosmetic scientists of Korea. 2004;30:221-5), 항염 효능(Yang CS, et al. Compound K (CK) rich fractions from Korean red ginseng inhibit toll-like receptor (TLR) 4-or TLR9-mediated mitogen-activated protein kinases activation and pro-inflammatory responses in murine macrophages. Journal of ginseng research. 2007;31(3):181-90, Shin YS. Comparisons of ginsenosides and anti-inflammatory effects of white ginseng and puffed red ginseng. Korean journal of food and cookery science. 2010;26(4):475-80)이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 항산화 활성과 관련하여 우수한 효과를 나타낸다고 보고되어 있다(Sung KS, et al. Effects of red ginseng component on the antioxidative enzymes activities and lipid peroxidation in the liver of mice. Journal of ginseng research. 2000;24(1):29-34, Kim YJ, et al. Antioxidant and inhibitory effects of Korean Panax ginseng extract on pro-inflammatory mediators in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. Journal of the Korean society of food science and nutrition. 2012;41(10):1371-7).

피부는 외부환경에 직접 노출되어 있어 다양한 외부적 요인으로부터 방어 기능을 수행하는 조직이다(Fisher GJ, et al. Mechanisms of photoaging and chronological skin aging. Archives of dermatology. 2002;138(11):1462-70). 그 중 자외선은 피부의 광노화를 유발하며 피부 표피에 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성시킨다(Castanet J, et al. Pigmentary changes in aged and photoaged skin. Archives of dermatology. 1997;133(10):1296-9). 활성산소종은 영양소가 에너지로 전환되는 과정에서 산소가 완전 연소하지 못할 때 발생하는 화합물이다.

자외선에 의하여 증가된 활성산소종은 표피의 각질형성세포에서 염증반응을 야기하는 사이토카인(cytokine) 분자를 촉진시킨다(Shephard P, et al. Myofibroblast differentiation is induced in keratinocyte-fibroblast co-cultures and is antagonistically regulated by endogenous transforming growth factor- and interleukin-1. The American journal of pathology. 2004;164(6):2055-66). 염증성 사이토카인에는 종양괴사인자 (tumor necrosis factor-, TNF-), 인터루킨 6(Interleukin-6, IL-6), 인터루킨 1(Interleukin-1, IL-1) 등이 알려져 있으며(Liang YC, et al. Suppression of inducible cyclooxygenase and inducible nitric oxide synthase by apigenin and related flavonoids in mouse macrophages. Carcinogenesis. 1999;20:1945), 이러한 염증성 사이토카인의 발현 및 기능을 억제하는 물질은 자외선에 의한 피부 손상 방지 및 재생을 위한 화장품 개발 시 유용한 원료로 사용될 가능성이 있다고 보고되었다(Lee JY, et al. Effects of curcumin on UVB-irradiated inflammation in HaCaT keratinocyte cells. Korean journal oriental physiology & pathology. 2011;25(6):1014-9)

활성산소는 반응성이 매우 커 생체분자들과 빠르게 반응하여 생체막의 지질 산화, 단백질 변성, 디옥시리보핵산(deoxyribo nucleic acid, DNA) 손상 등을 초래한다(Ames BN. Dietary carcinogens and anticarcinogens oxygen radicals and degenerative diseases. Science. 1983;221(4617):1256-64, Fridovich I. Biological effects of the superoxide radical. Archives of biochemistry and biophysics. 1986;247(1):1-11). 항산화제는 이러한 활성산소에 의한 생체 손상을 억제하거나 최소화한다(Mattson MP, et al. Mechanisms of neurotrophic factor protection against calcium-and free radical-mediated excitotoxic injury: implications for treating neurodegenerative disorders. Experimental neurology. 1993;124(1):89-95). 합성 항산화제의 경우, 발암 및 심혈관 계열에 부작용을 유발하는 것으로 알려지면서 천연물로부터 유래하는 항산화제에 관한 연구가 활발하게 수행되고 있다(Seog HM, et al. Antioxidative activity of barley polyphenol extract (BPE) separated from pearling by-products. Korean journal of food science and technology. 2002;34(5):889-92).

초과산화물 제거효소(superoxide dismutase, SOD) 유사물질은 식물화학물질(phytochemical)에 속하는 저분자 물질로, 항산화 효소 중 하나인 SOD와 유사한 역할을 한다. 이는 초과산화물(superoxide)의 산화반응을 억제하여 생체를 보호하는 역할을 한다. 따라서 SOD 유사활성을 갖는 물질은 체내에서 초과산화물을 제거함으로써, 노화억제와 함께 산화적 장애를 방어하는 것으로 알려져 있다(Kitani K, et al. Pharmacological interventions in aging and age-associated disorders. Annals of the New York academy of sciences. 2002;959(1):295-307).

공개특허 제2011-0123934호는 산삼 줄기세포 추출물을 제조하기 위하여 산삼 줄기세포를 50~70%의 발효주정으로 80℃에서 24 시간 동안 추출하였으며, 미백, 자외선 차단 및 항산화에 효과가 있는 조성물을 제조하였다.

특허등록 제0601903호는 산삼세포 추출물을 제조하기 위하여 산삼세포를 70% 에탄올 수용액으로 추출하였으며, 항산화, 항염 및 미백 효과가 향상된 조성물을 제조하였다.

상기 방법들을 포함하여, 현재 이용되는 산삼 캘러스의 추출 방법은 정유나 에탄올 및 메탄올을 사용한 경우가 대부분이며, 이러한 유기용매를 이용한 추출은 인체에 해를 줄 뿐만 아니라 화장품으로의 이용이 제한될 수 있다는 단점이 있다(Cho HY, et al. Antimicrobial activity of water-soluble extract from Artemisia princeps var. orientalis. 2006;21(2):129-32).

특허등록 제1412446호는 녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 화장료 조성물을 제조하기 위하여 녹차 캘러스와 배양액을 혼합하여 추출하였다.

배양액에는 당과 무기염류 등의 성분이 잔류하기 때문에(Gorret N et al. Bioreactor culture of oil palm (Elaeis guineensis) and effects of nitrogen source, inoculum size, and conditioned medium on biomass production. Journal of biotechnology. 2004;108(3):253-63) 캘러스와 배양액을 혼합한 추출물은 배양액을 제거한 추출물 보다 상대적으로 폴리페놀 및 진세노사이드의 순도가 낮다. 또한 동결건조 시, 캘러스와 배양액을 혼합한 추출물은 당과 같은 배양액의 잔류 성분 때문에 분말 형태가 아닌 검(gum) 형태로 건조되므로 분말 형태 보다 수율 손실이 높다.

폴리페놀과 진세노사이드는 주로 캘러스의 액포에 존재한다고 알려져 있으므로(Le Bourvellec C et al. Non-covalent interaction between procyanidins and apple cell wall material: Part I. Effect of some environmental parameters. Biochimica et biophysica acta. 2004;1672(3):192-202, Kochkin DV et al. Malonyl-ginsenoside content of a cell-suspension culture of Panax japonicus var. repens. Phytochemistry. 2013;93:18-26), 캘러스와 배양액을 분리하여 액포 내에 있는 유효성분만을 추출할 필요가 있다.

이에 본 발명은 유기용매 추출 과정 없이 초고압 유화기만으로 산삼 캘러스 추출물을 제조할 수 있는 방법을 정립하였으며, 배양액을 제거한 산삼 캘러스 추출물을 이용하여 세포수준에서의 독성, 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 평가하여 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

종래 선행기술문헌으로는 다음과 같은 것이 있다. 즉, 선행기술 1은, 공개특허 제2011-0123934호(출원번호 제2010-0043427호)(명칭 : 미백, 자외선 차단 및 항산화 효능을 가지는 산삼 줄기세포(캘러스) 및 산삼부정근 추출물)가 출원된바 있다. 또한 선행기술 2는, 특허등록 제0601903호(출원번호 제2004-0027988호)(명칭 : 산삼세포의 제조방법)가 등록된바 있다. 또한 선행기술 3은, 특허등록 제1412446호(출원번호 제2012-0100582호)(명칭 : 녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 화장료 조성물의 제조방법)가 등록된바 있다.

본 발명은 산삼 캘러스를 생물반응기를 이용하여 대량배양 생산한 뒤, 배양액을 제거한 캘러스를 증류수와 혼합하여 초고압 유화기를 사용하여 추출물을 제조하는 것이다.

본 발명자들은 산삼 캘러스를 이용하여 세포수준에서의 독성, 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 평가하여 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명은 상기 추출물을 함유하는 세포수준에서의 독성이 없으며, 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 화장료를 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 목적은 산삼 캘러스의 배양액을 제거하고 초고압 유화기를 사용하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 산삼 캘러스 추출물의 제조방법과, 이를 이용하여 제조된 추출물을 함유하는 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명을 수행하기 위해 산삼 캘러스 배양은 (1) 2,4-D (2,4-dichlorophen- oxy acetic acid) 1.0 mg/L, 나프탈렌 아세트산(α-naphthalene acetic acid, NAA) 0.1 mg/L, 키네틴(kinetin) 0.25 mg/L, 자당(sucrose) 30 g/L가 첨가된 MS (Murashige & Skoog, 1962) 고체 배지에 산삼 캘러스를 접종한 후 25±1℃ 암 상태에서 2 주간격으로 동일한 조건에서 배양하여 안정화시키는 단계; (2) 안정화 된 상기 산삼 캘러스를 2,4-D 1.0 mg/L, 나프탈렌 아세트산 0.1 mg/L, 키네틴 0.25 mg/L, 자당 30 g/L가 첨가된 MS 액체 배지에 접종한 후 25±1℃ 암실 상태에서 2 주 간격으로 현탁배양하는 단계; (3) 현탁배양 된 산삼 캘러스를 공기부양식 생물반응기내에서 상기 MS 액체 배지를 이용하여 대량배양 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명을 수행하기 위해 산삼 캘러스 추출물의 제조는 (1) 산삼 캘러스를 4 주간 MS 액체 배지에서 대량배양 생산한 뒤, 배양액을 제거하여 수확하는 단계와; (2) 상기 수확한 산삼 캘러스 300 내지 900 g (바람직하게는 600 g)에 3 차 증류수 1,000 내지 1,800 g (바람직하게는 1,400 g)을 혼합하여 고속 균질 분쇄기(T25D, IKA, Korea)로 10,000 ~ 13,000 rpm에서 2 분 이상 균질화 하는 단계와; (3) 균질화한 산삼 캘러스를 초고압 유화기(MN400, Micronox, Korea)를 사용하여 1,000 ~ 1,200 bar에서 2 회 분쇄하는 단계와; (3)분쇄한 산삼 캘러스를 5 μm 여과지를 사용하여 1 차 여과한 후 1 μm 여과지를 사용하여 2 차 여과하며 0.22 μm 여과장치(Stericup-GV Filter Unit, Merck Millipore, USA)를 사용하여 3 차 여과하는 단계와; (4) 여과한 산삼 캘러스를 스퀘어 디쉬(square dish, 10245 (245 x 245 x 20 mm), SPL)에 250 g씩 분주한 후, 동결건조기(lyophilization, FDTH-8612, Operon)를 이용하여 약 48 시간 동안 건조하여 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상술한 본 발명의 기술구성에 의해 산삼 캘러스를 대량배양 생산 할 수 있을 뿐만 아니라 이렇게 대량배양 생산 된 산삼 캘러스를 초고압 유화기를 사용하여 폴리페놀 추출 수율을 높여, 자외선 보호, 항염 및 항산화용 화장료 조성물에 이용할 수 있으며 본 발명의 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 샴푸 및 헤어크림 등의 피부 외용제 형태의 화장품 소재로써 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 산삼 캘러스 추출물의 제조방법의 실시예에 의한 공정도.
도 2는 본 발명의 산삼 캘러스의 입자 직경 크기를 측정한 결과(A : 실시예 2의 생물반응기 배양한 산삼 캘러스, B : 실시예 3의 초고압 유화기로 분쇄한 산삼 캘러스).
도 3은 본 발명의 산삼 캘러스를 환경주사전자현미경(Environmental scanning electron microscope, ESEM)을 통하여 확대 촬영한 사진(A : 실시예 1의 고체 배지에 안정화한 산삼 캘러스, B : 실시예 2의 생물반응기 배양한 산삼 캘러스, C : 초고압 유화기로 분쇄한 산삼 캘러스).
도 4는 본 발명의 산삼 캘러스를 광학현미경을 통하여 확대 촬영한 사진(A : 실시예 1의 고체 배지에 안정화한 산삼 캘러스, B : 실시예 2의 생물반응기 배양한 산삼 캘러스).
도 5는 본 발명의 산삼 캘러스 추출물의 폴리페놀 및 진세노사이드 함량을 나타낸 그래프(A : 비교예 1-1과 비교예 1-2의 폴리페놀 및 진세노사이드 함량, B : 비교예 2와 실시예 4의 폴리페놀 및 진세노사이드 함량)
도 6은 본 발명의 인체유래 각질형성 세포(HaCaT) 생존에 미치는 산삼 캘러스 추출물의 효과를 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명의 자외선 B (ultraviolet B, UVB) 조사 후 인체유래 각질형성 세포 생존에 미치는 산삼 캘러스 추출물의 효과를 나타낸 그래프(실험으로부터 얻어진 결과치는 스튜던트 t -검정 실시.^##대조군과 비교하여 P < 0.01, ^*자외선 B 처리군과 비교하여 P < 0.05, ^**자외선 B 처리군과 비교하여 P < 0.01).
도 8은 본 발명의 자외선 B 조사 후 인체유래 각질형성 세포의 인터루킨 6(Interleukin 6, IL-6)의 발현에 미치는 산삼 캘러스 추출물의 효과를 나타낸 그래프(실험으로부터 얻어진 결과치는 스튜던트 t -검정 실시. ^##대조군과 비교하여 P < 0.01, ^*자외선 B 처리군과 비교하여 P < 0.05).
도 9는 본 발명의 산삼 캘러스 추출물의 초과산화물 제거효소(superoxide dismutase, SOD) 활성도를 나타낸 그래프(실험으로부터 얻어진 결과치는 스튜던트 t-검정 실시. ^*아스코르브산(ascorbic acid) 처리군과 비교하여 P < 0.05, ^**아스코르브산 처리군과 비교하여 P < 0.01).

선행기술 1은 발효주정을 이용하여 환류냉각 또는 열수 추출 등의 추출방법을 사용하여 얻은 산삼 줄기세포 및 산삼부정근 추출물의 미백, 자외선 차단 및 항산화 효능에 관한 것으로 본 발명의 조성물의 제조 방법 및 효능과는 차이가 있다.

선행기술 2는 에탄올을 이용하여 추출한 산삼세포의 항산화, 항염 및 미백효과에 관한 것으로 본 발명의 제조 방법 및 조성물의 효능과는 차이가 있다.

선행기술 3은 배양액이 혼합된 녹차 캘러스를 초고압 유화기를 이용하여 추출한 녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것으로 본 발명의 조성물의 제조 방법 및 효능과는 차이가 있다.

본 발명의 조성물은 산삼 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유한 것을 제공한다.

본 발명의 산삼 캘러스 추출물은 산삼 캘러스에서 배양액을 제거하여 물 추출한 것을 제공한다.

본 발명의 산삼 캘러스 추출물은 초고압 유화기를 사용하여 폴리페놀 추출 수율을 증가시킨 것을 제공한다.

본 발명의 산삼 캘러스 추출물은 세포독성이 없는 것을 제공한다.

본 발명의 산삼 캘러스 추출물은 자외선 B (ultraviolet B, UVB) 조사 후 인체유래 각질형성 세포를 보호하는 효과를 나타내는 것을 제공한다.

본 발명의 산삼 캘러스 추출물은 자외선 B 조사 후 인체유래 각질형성 세포의 인터루킨 6(Interleukin 6, IL-6) 발현 억제 효과를 나타내는 것을 제공한다.

본 발명의 산삼 캘러스 추출물은 초과산화물 제거효소(superoxide dismutase, SOD) 활성도가 농도 의존적으로 증가하는 것을 제공한다.

본 발명을 수행하기 위해 산삼 캘러스 배양은,

(1) 산삼 캘러스를 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 1.0 mg/L, 나프탈렌 아세트산(α-naphthalene acetic acid, NAA) 0.1 mg/L, 키네틴(kinetin) 0.25 mg/L, 자당(sucrose) 30 g/L가 첨가된 MS (Murashige & Skoog, 1962) 고체 배지에 접종한 후 25±1℃ 암실 상태에서 2 주 간격으로 동일조건에서 배양하여 안정화시키는 단계; (2) 안정화 된 상기 산삼 캘러스를 2,4-D 1.0 mg/L, 나프탈렌 아세트산 0.1 mg/L, 키네틴 0.25 mg/L, 자당 30 g/L가 첨가된 MS 액체 배지에 접종한 후 25±1℃ 암실 상태에서 2 주 간격으로 현탁배양하는 단계; (3) 현탁배양 된 산삼 캘러스를 공기부양식 생물반응기내에서 상기 MS 액체 배지를 이용하여 대량배양 생산하는 단계;를 거치게 된다.

본 발명을 수행하기 위해 산삼 캘러스 추출물의 제조는,

(1) 산삼 캘러스를 4 주간 MS 액체 배지에서 대량배양 생산한 뒤, 배양액을 제거한 후 수확하는 단계와; (2) 상기 수확한 산삼 캘러스 300 내지 900 g (바람직하게는 600 g)에 3 차 증류수 1,000 내지 1,800 g (바람직하게는 1,400 g)을 혼합하여 고속 균질 분쇄기(T25D, IKA, Korea)로 10,000 ~ 13,000 rpm에서 2 분 이상 균질화 하는 단계와; (3) 균질화한 산삼 캘러스를 초고압 유화기(MN400, Micronox, Korea)를 사용하여 1,000 ~ 1,200 bar에서 2 회 분쇄하는 단계와; (3)분쇄한 산삼 캘러스를 5 μm 여과지를 사용하여 1 차 여과한 후 1 μm 여과지를 사용하여 2 차 여과하며 0.22μm 여과장치(Stericup-GV Filter Unit, Merck Millipore, USA)를 사용하여 3 차 여과하는 단계와; (4) 여과한 산삼 캘러스를 스퀘어 디쉬(square dish, 10245 (245 x 245 x 20 mm), SPL)에 250 g씩 분주한 후, 동결건조기(lyophilization, FDTH-8612, Operon)를 이용하여 약 48 시간 동안 동결 건조하여 추출물을 제조하는 단계;를 거치게 된다.

이하, 본 발명의 구체적인 기술구성을 첨부한 도면을 이용하여 상세하게 기술하면 다음과 같다.

본 발명은 대량생산한 산삼 캘러스를 배양액 제거 후 초고압 유화기를 사용하여 폴리페놀 추출 수율을 증가시켜 추출물을 추출할 수 있을 뿐만 아니라 이로부터 제조된 산삼 캘러스 추출물을 이용하여 자외선 보호, 항염 및 항산화용 화장료 조성물을 제조하였다.

<실시예 1> 산삼 캘러스의 안정화

산삼 캘러스의 배양배지는 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 1.0 mg/L, 나프탈렌 아세트산(α-naphthalene acetic acid, NAA) 0.1 mg/L, 키네틴(kinetin) 0.25 mg/L, 자당(sucrose) 30 g/L, 겔라이트(gelrite) 0.4 g/L, 한천(agar) 6 g/L가 첨가된 MS (Murashige & Skoog, 1962) 고체배지를 사용하였다. 모든 배지의 pH는 고압멸균 전에 1 N 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하여 5.8로 조정하였으며, 각각의 페트리디쉬(petri dish, 10091 (90 x 17 mm), SPL)에 멸균한 배지를 30 mL 씩 분주하였다. 산삼 캘러스는 상기 제조한 MS 고체 배지에 접종한 후 25±1℃ 암실 상태에서 2 주 간격으로 일정한 조건으로 배양하여 안정화하였다.

<실시예 2> 산삼 캘러스의 현탁배양 및 대량배양 생산

2.1 산삼 캘러스로부터 현탁배양계 확립

산삼 캘러스로부터 현탁배양체계를 확립하기 위해 2, 4-D 1.0 mg/L, 나프탈렌 아세트산 0.1 mg/L, 키네틴 0.25 mg/L, 자당 30 g/L가 첨가된 MS 액체 배지 20 mL에 실시예 1의 산삼 캘러스 80 g/L를 접종하였다. 가스교환을 위하여 멤브레인 스크류 캡(membrane screw cap, DU.1183251, Duran)이 있는 1 L 삼각 플라스크에서 배양하였으며, 25±1℃ 암실 상태에서 100 rpm으로 현탁배양 하였다. 안정적인 증식을 확인한 이후, 현탁배양한 캘러스를 약 2 ~ 3 주 간격으로 반복적으로 일정한 조건으로 배양하여 선발하였다.

2.2 산삼 캘러스의 대량배양 생산

산삼 캘러스의 증식을 위해 3 L 공기부양식 생물반응기(삼성과학, Korea)에서 상기 MS 액체 배지 1,000 mL에 현탁배양으로 선발된 산삼 캘러스 80 g/L를 접종하였다. 25±1℃ 암실 상태에서 2 ~ 3 주간 1 차 배양한 후 같은 조성의 배지 1,000 mL를 생물반응기에 추가하여 같은 조건에서 1 ~ 2 주간 2 차 배양하였다. 증식한 산삼 캘러스를 1 L 비이커와 표준망체(체눈 크기 500 μm, 지름 150 mm)를 이용하여 배양액을 제거하여 수확하였다.

비교예 1. 배양액을 제거하지 않은 산삼 캘러스 추출물의 제조

실시예 2의 수확한 산삼 캘러스 300 내지 900 g (바람직하게는 600 g)에 배양액 1,000 내지 1,800 g (바람직하게는 1,400 g)을 혼합하여 고속 균질 분쇄기로 10,000 ~ 13,000 rpm에서 2 분 이상 균질화 하였다.

비교예 1-1. 초고압 유화기로 분쇄하지 않은 산삼 캘러스 추출물의 제조

균질화 한 산삼 캘러스는 5 μm 여과지를 사용하여 1 차 여과한 후 1 μm 여과지를 사용하여 2 차 여과하며 0.22 μm 여과장치(Stericup-GV Filter Unit, Merck Millipore, USA)를 사용하여 3 차 여과하였다. 스퀘어 디쉬(square dish, 10245 (245 x 245 x 20 mm), SPL)에 여과물 250 g씩 분주한 후, 동결건조기(lyophilization, FDTH-8612, Operon)를 이용하여 약 48 시간 동안 건조하여 산삼 캘러스 추출물을 제조하였다.

비교예 1-2. 초고압 유화기로 분쇄한 산삼 캘러스 추출물의 제조

균질화 한 산삼 캘러스는 초고압 유화기(MN400, Micronox, Korea)를 사용하여 1,000 ~ 1,200 bar에서 2 회 분쇄하였고 5 μm 여과지를 사용하여 1 차 여과한 후 1 μm 여과지를 사용하여 2 차 여과하며 0.22 μm 여과장치를 사용하여 3 차 여과하였다. 스퀘어 디쉬에 여과물 250 g씩 분주한 후, 동결건조기를 이용하여 약 48 시간 동안 건조하여 산삼 캘러스 추출물을 제조하였다.

<실시예 3> 산삼 캘러스의 분쇄

실시예 2의 수확한 산삼 캘러스 300 내지 900 g (바람직하게는 600 g)에 3 차 증류수 1,000 내지 1,800 g (바람직하게는 1,400 g)을 혼합하여 고속 균질 분쇄기(T25D, IKA, Korea)로 10,000 ~ 13,000 rpm에서 2 분 이상 균질화한 후, 초고압 유화기(MN400, Micronox, Korea)를 사용하여 1,000 ~ 1,200 bar에서 2 회 분쇄하였다.

<실시예 4> 실시예 3을 사용한 산삼 캘러스 추출물의 제조

실시예 3에 의해 분쇄한 산삼 캘러스는 5 μm 여과지를 사용하여 1 차 여과한 후 1 μm 여과지를 사용하여 2 차 여과하며 0.22 μm 여과장치를 사용하여 3 차 여과하였다. 스퀘어 디쉬에 여과물 250 g씩 분주한 후, 동결건조기를 이용하여 약 48 시간 동안 건조하여 산삼 캘러스 추출물을 제조하였다.

비교예 2. 배양액을 제거하지 않고 초고압 유화기로 분쇄한 산삼 캘러스 추출물의 제조

실시예 2의 수확한 산삼 캘러스 300 내지 900 g (바람직하게는 600 g)에 배양액 1,000 내지 1,800 g (바람직하게는 1,400 g)을 혼합하여 고속 균질 분쇄기로 10,000 ~ 13,000 rpm에서 2 분 이상 균질화한 후, 초고압 유화기를 사용하여 1,000 ~ 1,200 bar에서 2 회 분쇄하였다. 분쇄한 산삼 캘러스는 5 μm 여과지를 사용하여 1 차 여과한 후 1 μm 여과지를 사용하여 2 차 여과하며 0.22 μm 여과장치를 사용하여 3 차 여과하였다. 스퀘어 디쉬에 여과물 250 g씩 분주한 후, 동결건조기를 이용하여 약 48 시간 동안 건조하여 산삼 캘러스 추출물을 제조하였다.

참고예 1. 통계적 처리

실험으로부터 얻어진 결과치는 평균치와 표준편차(mean±SD, n=3)로 표시하였고 실험군간 평균의 차이는 스튜던트 t-검정(Student's t-test)으로 유의성을 확인하였으며, P < 0.01, P < 0.05 수준에서 검증하였다.

실험예 1. 광학현미경 촬영

실시예 1, 실시예 2에 의해 제조된 산삼 캘러스를 마이크로 튜브(micro tube)에 500 μL 취하여 3 차 증류수에 1:1 비율로 희석한 후 1% 아세트산카민(acetocarmine) 용액 500 μL을 첨가하였다. 10 초간 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 사용하여 혼합한 후 실온에서 2 분간 염색하였으며, 증류수를 이용하여 2 ~ 3 회 세척하였다. 세포 100 μL를 슬라이드 글라스(slide glass)에 부착시킨 후 커버글라스(cover glass)를 덮어주었다. 고정시킨 세포는 광학현미경을 이용하여 4 배, 20 배, 40 배에서 관찰한 후 촬영하였다.

산삼 캘러스는 광학현미경을 이용하여 촬영하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에 의해 고체 배지에 안정화한 산삼 캘러스와 실시예 2에 의해 생물반응기 배양한 산삼 캘러스의 직경은 약 50 μm으로 관찰되었다.

실험예 2. 입자 형상 촬영

실시예 1, 실시예 2, 실시예 3에 의해 제조된 산삼 캘러스의 입자 형상 촬영은 한국과학기술연구원(Korea Institute of Science and Technology, KIST) 특성분석센터에 의뢰하여 진행하였다.

산삼 캘러스의 입자 형상은 환경주사전자현미경(Environmental scanning electron microscope (ESEM), FEI (XL-30 FEG), Philips)을 이용하여 측정하였고, 그 측정 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에 의해 고체 배지에 안정화한 산삼 캘러스는 응집 정도가 약하며, 약 100 μm의 응집체를 형성하였으며, 실시예 2에 의해 생물반응기 배양한 산삼 캘러스는 응집 정도가 강하며, 약 500 μm의 응집체를 형성하였다. 실시예 3에 의해 분쇄된 산삼 캘러스는 초고압 유화기에 의해 파쇄 되어 평평한 표면이 관찰되었다.

실험예 3. 입자 직경 크기 측정

실시예 2, 실시예 3에 의해 제조된 산삼 캘러스의 입도 직경 크기 측정은 한국고분자시험연구소(Korea polymer testing and research institute, Koptri)에 의뢰하여 진행하였다.

산삼 캘러스의 입자 직경은 분포는 레이저 회절 입도 분석기(laser diffraction grain size analyzer, LS13320, Beckman coulter)를 이용하여 측정하였고, 그 측정 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 2의 산삼 캘러스의 평균 입자 직경 크기는 559 μm 이상, 최대 크기는 2,000 μm 이상이었으나, 실시예 3의 초고압 유화기로 분쇄한 산삼 캘러스의 평균 입자 직경 크기는 333 μm 이었으며, 최대 크기는 약 1,000 μm로 본 발명의 산삼 캘러스의 직경 크기는 초고압 유화기로 분쇄 후 약 2 배 이상 작아진다는 것을 알 수 있었다.

실험예 4. 폴리페놀 함량 측정

비교예 1, 비교예 2, 실시예 4에 의해 제조된 산삼 캘러스 추출물을 5, 10 mg/mL로 희석하고, 갈산(gallic acid)을 99% 에탄올에 용해한 후 0, 5, 10, 25, 50, 100 mg/L으로 희석하여 표준액을 준비하였다. 준비된 추출물과 표준액은 각각 마이크로 튜브(micro tube)에 100 μL 넣고, 정제수 300 μL를 넣어 10 초간 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 사용하여 혼합하였다. 마이크로 튜브에 폴린 시오칼투 시약(Folin-Ciocalteu reagent) 100 μL를 첨가 한 후, 10 초간 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합하였다. 암 상태에서 6 분간 실온에 반응시킨 후 마이크로 튜브에 20% 탄산나트륨(Na₂CO₃)용액 500 μL를 첨가 하였고 10 초간 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합하였다. 암실 상태에서 30 분간 실온에 반응시킨 후 자외선 분광광도계(UV spectropho- tometer)를 이용하여 760 nm 파장을 3 회 반복 측정하였다.

산삼 캘러스 추출물의 초고압 유화기 처리 유무에 따른 지표물질 함량의 변화를 확인하기 위하여 폴리페놀 함량을 분석하였고, 그 측정결과는 도 5a 에 나타내었다. 도 5a 에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1-1의 폴리페놀 함량은 2.27±0.07 mg/g으로 측정되었으며, 비교예 1-2의 폴리페놀 함량은 3.52±0.07 mg/g으로 측정되었다. 본 발명의 산삼 캘러스 추출물의 폴리페놀 함량은 산삼 캘러스를 초고압 유화기로 분쇄함으로써 세포벽 성분으로 존재하는 폴리페놀이 추출되어, 초고압 유화기로 분쇄하기 전보다 약 1.6 배 증가하는 것을 알 수 있었다.

산삼 캘러스 추출물의 배양액 제거 유무에 따른 지표물질 함량의 변화를 확인하기 위하여 폴리페놀 함량을 분석하였고, 그 측정결과는 도 5b 에 나타내었다. 도 5b 에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 2의 폴리페놀 함량은 3.04±0.87 mg/g으로 측정되었으며, 실시예 4의 폴리페놀 함량은 6.35±0.52 mg/g으로 측정되었다. 본 발명의 산삼 캘러스 추출물의 폴리페놀 함량은 배양액에 잔류하는 당과 무기염류 등의 성분이 제거되어, 배양액을 제거하지 않은 추출물 보다 상대적으로 폴리페놀 순도가 높기 때문에 약 2.1 배 높게 측정됨을 알 수 있었다.

실험예 5. 진세노사이드 함량 측정

비교예 1, 비교예 2, 실시예 4에 의해 제조된 산삼 캘러스 추출물의 진세노사이드 분석을 위한 고체 상 추출(solid phase extraction, SPE) 전처리와 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 분석은 한국기초과학지원연구원(Korea basic science institute, KBSI)에 의뢰하여 진행하였다. 1 mL 카트리지(OASIS 1 cc Vac Cartridge, Waters, USA)는 100% 메탄올 1 mL와 3 차 증류수 1 mL를 각각 용출시켜 세척하였다. 산삼 캘러스 추출물은 10 mg/mL로 희석하여 카트리지에 흡착시키고, 3 차 증류수 1 mL로 용출하여 당류 등을 제거하였다. 카트리지에 흡착된 진세노사이드 성분은 100% 메탄올 1mL를 사용하여 서서히 용출하였다. 용출물은 진공원심농축기(electron corporation, Thermo, USA)를 이용하여 건조시킨 후 20% 메탄올 100 μL에 녹였다. 분석기기는 고성능 액체 크로마토그래피(1290 Infinity Binary LC System, Agilent), 칼럼은 Hypersil Gold C18 (2.1mm, 5 m, Thermo)을 사용하였다. 이동상으로는 0.1% 인산과 아세토니트릴 용액을 사용하고, 유속은 0.7 mL/min로 흘려주었다. 주입량은 10 μL였으며, 204 nm에서 검출하였다.

산삼 캘러스 추출물의 초고압 유화기 처리 유무에 따른 지표물질 함량의 변화를 확인하기 위하여 진세노사이드 함량을 분석하였고, 그 측정결과는 도 5a 에 나타내었다. 도 5 A에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1-1의 진세노사이드 함량은 2.75±0.11 mg/g으로 측정되었으며, 비교예 1-2의 진세노사이드 함량은 2.90±0.11 mg/g으로 측정되었다. 본 발명의 산삼 캘러스 추출물의 진세노사이드 함량은 산삼 캘러스를 고속 균질 분쇄기로 분쇄함으로써 액포에 존재하는 진세노사이드가 추출되어, 초고압 유화기로 분쇄한 후와 유의한 차이가 없는 것을 알 수 있었다.

산삼 캘러스 추출물의 배양액 제거 유무에 따른 지표물질 함량의 변화를 확인하기 위하여 진세노사이드 함량을 분석하였고, 그 측정결과는 도 5b 에 나타내었다. 도 5b 에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 2의 진세노사이드 함량은 1.29±0.50 mg/g으로 측정되었으며, 실시예 4의 진세노사이드 함량은 3.18±0.48 mg/g으로 측정되었다. 본 발명의 산삼 캘러스 추출물의 진세노사이드 함량은 앞서 측정하였던 폴리페놀 함량과 같이 배양액에 잔류하는 당과 무기염류 등의 성분이 제거되어, 배양액을 제거하지 않은 추출물 보다 상대적으로 진세노사이드 순도가 높기 때문에 약 2.5 배 높게 측정됨을 알 수 있었다.

참고예 2. 인체 유래 각질형성세포 배양

세포배양은 인체 유래 각질형성세포에 대한 세포독성, 자외선 보호 효능, 항염 효능 평가를 위해 실시하였으며, 바이오스펙트럼(Biospectrum)社에 의뢰하여 진행하였다. 인체 유래 각질형성세포주(human keratinocyte)인 HaCaT은 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified eagle's media, DMEM, Hyclone, USA)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Hyclone, USA)을 첨가하여 이산화탄소(CO₂) 배양기(UP50H, Forma scientific, USA)에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에 배양하였다.

실험예 6. 세포독성 평가

세포독성 평가는 바이오스펙트럼社에 의뢰하여 진행하였다. 실시예 4에 의해 제조된 산삼 캘러스 추출물은 100 mg/mL 농도로 인산완충액(phosphate buffer saline, PBS, Gibco, USA)에 녹인 후 원심분리로 부유물을 가라앉혀 상등액만 사용하였으며, 최종 농도는 1, 2, 5, 10, 20, 39, 78, 156, 313, 625, 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 μg/mL로 하였다. MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli- um bromide, Sigma, USA) 시약은 인산완충액(pH 7.4)에 1 mg/ml 농도로 녹인 후 0.2 μm 주사기용 여과기(syringe filter)로 여과한 후 냉장 보관하였다. 참고예 2의 인체 유래 각질형성세포주를 24 웰 플레이트(well plate)에 72 시간 동안 배양한 후 무 혈청(serum-free) DMEM으로 바꾸어 주고 각각의 웰(well)에 추출물을 농도 별로 처리하였다. 72 시간 동안 배양한 후 전체 배지의 1/10 되는 양으로 MTT 용액을 넣어주었다. 37℃ 이산화탄소배양기에서 1 시간 반응시킨 후 배지를 모두 제거하였다. 각 웰에 다이메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)을 100 μL씩 넣은 후 570 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Powerwave X, Bio-tek, USA)로 흡광도를 측정하였다.

산삼 캘러스 추출물이 인체 유래 각질형성세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 분석법을 이용하여 세포독성을 관찰하였고, 그 측정결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 산삼 캘러스 추출물은 5,000 μg/mL 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다. 상기와 같은 세포독성 평가를 바탕으로 산삼 캘러스 추출물을 5,000 μg/mL 이하 농도로 설정하여 이하의 실험예 7, 실험예 8에서 자외선 보호 및 항염 효과 관련 평가를 진행하였다.

실험예 7. 자외선 보호 효능 평가

자외선 보호 효능 평가는 바이오스펙트럼社에 의뢰하여 진행하였다. 참고예 2의 인체 유래 각질형성세포주를 60 mm 디쉬(dish, Nunc, USA)에 24 시간 동안 배양한 후 무 혈청 DMEM으로 바꾸어 주었다. 실험은 아무 처리도 하지 않은 대조군, 자외선 B (ultraviolet B, UVB) 20 mJ/cm²를 조사한 군, 실시예 4의 산삼 캘러스 추출물을 1, 10, 100, 1,000, 5,000 μg/mL로 처리한 후 자외선 B 20 mJ/cm²를 조사한 군으로 진행하였으며 24 시간 동안 추가 배양하였다. 처리 기간이 끝난 후 전체 배지의 1/10 되는 양으로 MTT 용액을 넣어주었다. 37℃ 이산화탄소배양기에서 4 시간 반응시킨 후 배지를 모두 제거하였다. 각 웰에 다이메틸설폭시화물을 100 μL씩 넣은 후 570 nm에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다.

산삼 캘러스 추출물의 자외선 보호 효능을 확인하기 위하여 자외선 B 조사 후 인체유래 각질형성 세포의 생존율을 측정하였고, 그 측정결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 자외선을 조사하지 않은 군을 기준으로 자외선만 조사한 군은 세포 생존율이 49%였으나, 산삼 캘러스 추출물 1, 10, 100, 1,000, 5,000 μg/mL 농도로 처리한 군의 세포 생존율은 각각 51, 51, 55, 55, 59, 73%로 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있었다. 또한 추출물 100 μg/mL 이상 농도에서는 자외선만 조사한 군과 유의적인(P < 0.01) 차이를 보여, 자외선으로부터 세포를 보호할 가능성이 있음을 확인하였다.

실험예 8. 인터루킨 6 발현 억제 효능 평가

항염 효능 평가는 바이오스펙트럼社에 의뢰하여 진행하였다. 참고예 2의 인체 유래 각질형성세포주를 60 mm 디쉬에 24 시간 동안 배양한 후 무 혈청 DMEM으로 바꾸어 주었다. 실험은 아무 처리도 하지 않은 대조군, 자외선 B 20 mJ/cm²를 조사한 군, 실시예 4의 산삼 캘러스 추출물을 1, 10, 100, 1,000, 5,000 μg/mL로 처리한 후 자외선 B 20 mJ/cm²를 조사한 군으로 진행하였으며 인터루킨 6(Interleukin 6, IL-6)의 발현을 유도한 후 24 시간 동안 추가 배양하였다. 처리 기간이 끝난 후 세포 배지를 수집하여 원심분리 후 상등액만 취하여 효소 면역분석 키트(enzyme linked immunosorbent assay kit (ELISA kit), R&D system, USA)와 반응시켰다. 제조사의 지시에 따라 효소 면역분석을 시행하고 450 nm에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다.

산삼 캘러스 추출물의 항염 효능을 확인하기 위하여 자외선 B 조사 후 인체유래 각질형성 세포의 인터루킨 6 발현량을 측정하였고, 그 측정결과는 도 8에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 자외선을 조사하지 않은 군보다 자외선을 조사한 군의 인터루킨 6 발현량은 446 pg/mL로 급격히 증가하였으나, 산삼 캘러스 추출물 1, 10, 100, 1,000, 5,000 μg/mL 농도로 처리한 군의 인터루킨 6 발현량은 336, 358, 311, 306, 295 pg/mL로 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 또한 추출물 100 μg/mL 이상 농도에서는 자외선만 조사한 군과 유의적인(P < 0.05) 차이를 보여, 자외선에 의한 피부염증 유도를 억제할 가능성이 있음을 확인하였다.

실험예 9. SOD 활성도 평가

실시예 4에 의해 제조된 산삼 캘러스 추출물의 초과산화물 제거효소(superoxide dismutase, SOD) 활성도는 SOD 측정 키트(SOD determination kit, Sigma, USA)를 이용하였다. 실시예 4에 의해 제조된 산삼 캘러스 추출물은 100 mg/mL 농도로 인산완충액(Elpisbio, Korea)에 녹여 원심분리 후 상등액을 사용하였으며, 최종 농도는 62.5, 125, 250, 500, 1,000, 2,000 μg/mL으로 하였다. 추출물을 농도 별로 96 웰 플레이트에 20 μL씩 분주한 후, WST (water soluble tetrazolium salts) working solution과 enzyme working solution, dilution buffer를 제조사의 지시에 따라 첨가하였다. 이때 대조군으로는 대표적인 항산화제로 알려져 있는 아스코르빈산(L-ascorbic acid, Sigma, USA)을 사용하였으며(Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. 1958), 제조사의 지시에 따라 10 μg/mL 농도로 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 37℃에서 20 분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(Gen5, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm 파장을 측정하였다.

산삼 캘러스 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여 추출물 농도에 따른 SOD 활성도를 측정하였고, 그 측정결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 산삼 캘러스 추출물의 SOD 활성도는 농도 의존적으로 증가하며, 추출물 250 μg/mL 처리 시 아스코르빈산 10 μg/mL와 유사한 SOD 활성도를 나타내었다.

Claims

산삼 캘러스를 2,4-D(dichlorophenoxy acetic acid), 나프탈렌 아세트산, 키네틴, 자당이 첨가된 MS(Murashige & Skoog) 고체 배지를 접종한 후 배양하여 안정화시키는 단계(a); 상기 안정화된 산삼 캘러스를 2,4-D, 나프탈렌 아세트산, 키네틴, 자당이 첨가된 MS 액체 배지에 현탁배양하는 단계(b); 상기 현탁배양 된 산삼 캘러스를 공기부양식 생물반응기내에서 상기 MS 액체배지를 이용하여 대량배양 생산하는 단계(c); 상기 대량배양 생산한 산삼캘러스를 배양액을 제거하고 배양액을 제거한 양만큼 증류수를 혼합한 후 고속 균질 분쇄기를 이용하여 균질화하는 단계(d); 상기 균질화한 산삼 캘러스를 초고압 유화기를 사용하여 분쇄하는 단계(e); 상기 분쇄한 산삼 캘러스를 동결건조기를 사용하여 동결건조(f)하는 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법
제 1항에 있어서, 대량배양 생산한 후 배양액을 제거한 산삼 캘러스 300 내지 900 g을 증류수 1,000 내지 1,800 g과 혼합하여 고속 균질 분쇄기로 2 분 이상 균질화한 후 초고압 유화기를 사용하여 분쇄한 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼캘러스 추출물의 제조방법
산삼 캘러스를 2,4-D, 나프탈렌 아세트산, 키네틴, 자당이 첨가된 MS 고체 배지에 접종한 후 배양하여 안정화시키는 단계(a); 상기 안정화된 산삼 캘러스를 2,4-D, 나프탈렌 아세트산, 키네틴, 자당이 첨가된 MS 액체 배지에 현탁배양하는 단계(b); 상기 현탁배양 된 산삼 캘러스를 공기부양식 생물반응기내에서 상기 MS 액체 배지를 사용하여 대량배양 생산하는 단계(c); 상기 대량배양 생산한 산삼캘러스를 배양액을 제거하고 배양액을 제거한 양만큼 증류수를 혼합한 후 고속 균질 분쇄기를 이용하여 균질화하는 단계(d); 상기 균질화한 산삼 캘러스를 여과지를 사용하여 여과하는 단계(e); 상기 여과된 산삼 캘러스를 동결건조기를 사용하여 동결건조(f)한 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 산삼 캘러스 추출물의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 산삼 캘러스의 폴리폐놀의 농도는 2 내지 7 mg/g인 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 산삼 캘러스 추출물의 진세노사이드의 농도는 1 내지 4 mg/g인 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 산삼 캘러스 추출물의 농도는 100 내지 250 mg/g인 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 산삼 캘러스 추출물은 5,000 μg/mL의 농도까지 세포독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선보호 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 산삼 캘러스 추출물은 자외선을 조사한 후 산삼 캘러스 추출물을 처리하지 않는 군보다 추출물을 처리한 군의 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수유를 높인 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 산삼 캘러스 추출물은 자외선을 조사한 후 산삼 캘러스 추출물을 처리하지 않은 군보다 추출물을 처리한 군의 인터루킨 6 발현량이 감소하는 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선 보호, 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 산삼 캘러스 추출물은 초과산화물 제거효소(SOD) 활성도가 농도 의존적으로 증가하는 것을 특징으로 하여 폴리페놀 추출 수율을 높인 자외선 보호 및 항염 및 항산화 효능을 가지는 산삼 캘러스 추출물의 제조방법