KR20200049122A

KR20200049122A - 기능성 펩타이드와 발효물을 포함하는 피부노화 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20200049122A
Application number: KR1020180132019A
Authority: KR
Inventors: 강상문; 이기영; 신은진; 김진우; 차상주
Original assignee: 에이앤펩주식회사
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-05-08
Also published as: KR102139472B1

Abstract

본 발명은 기능성 펩타이드와 발효물로 이루어진 피부노화 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라게나제 활성을 저해하고 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과를 나타내는 트헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5 및 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 화장료 조성물 및 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 피부노화 개선용 조성물은 피부 세포 내 콜라겐을 분해하여 피부노화생성에 영향을 주는 콜라게나제의 활성을 억제시키고 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과를 나타내어 피부 피부노화 개선용 화장료 조성물 또는 기능성 식품 조성물 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

기능성 펩타이드와 발효물을 포함하는 피부노화 개선용 조성물{Anti-aging composition comprising functional peptides and fermented products}

본 발명은 기능성 펩타이드와 발효물로 이루어진 피부노화 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라게나제 활성을 저해하고 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과와 보습 효과, 진피의 친밀도(Dermal compactness) 및 피부 탄력 증가 효과를 나타내는 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 화장료 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

화장료의 가장 큰 관심 분야 중 하나는 노화와 관련된 주름, 색소침착, 탄력감소, 피부건조화, 탈모, 모발의 윤기 부족 등이다. 피부는 노화를 통해 다양한 변화를 맞게 된다. 먼저 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고 피부에 탄력을 주는 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM) 성분이 변화하게 되는데 그 중 세포외 기질의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 주름 생성과 밀접한 관계를 가지게 되고, 피부결합조직을 이루고 있는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 프로티오글리칸(proteoglycans), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 등은 산화되어 그 기능을 잃어버림으로써 피부가 탄력을 잃고 주름이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화되어 간다.

세포외 기질의 결합조직섬유에는 아교섬유(교원섬유, collagen fiber), 세망섬유(reticular fiber), 탄력섬유(탄성섬유, elastic fiber)가 있으며, 이 중 피부결합조직의 70% 정도를 차지하고 있는 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 대부분 형성된다. 나이가 들면서 피부결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는데 이는 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부주름 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다.

콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 해독 후 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 인자(Factor)들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라게나아제(Collagenase)와 같은 기질금속단백질 분해효소들(Matrix metalloproteases; MMP)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 주름이 많아지고 깊어지게 된다. 결과적으로 피부노화 현상은 세포의 비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타난다. 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있고, 피부의 주름개선 효과는 일부에서 가시적인 성과를 보이고 있다. 예컨대, 피부주름 및 기미, 색소침착 개선을 위해 널리 사용되고 있는 레티노이드류, 그 중에서도 레티놀(retinol)에 대한 피부주름 제거 임상 결과들이 다양하게 보고되고 있고, 레티놀을 함유한 화장료는 일광에 의해 형성된 피부주름살이나 피부처짐, 탄력감소 등을 효과적으로 개선하였다. 레티놀은 주름 기능성 고시원료로 등재될 정도로 효과에 대해 검증이 된 원료이나 특유의 피부자극 문제, 안정성 문제에 대해서는 끊임없이 제기가 되어 오고 있으며 높은 가격으로 고가의 제품군에서 활용이 되며 보편적 소재로 활용하기 어려운 부분이 존재한다.

피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선하기 위해서는, 효능이 정확하게 검증된 원료를 이용한 신규 피부노화 개선 조성물 개발이 필요하며 효능의 검증은 분자생물학적 메카니즘으로 규명되고 인체 대상 임상시험으로 검증하는 것이 중요하다.

이에, 본 발명자들은 피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선할 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과, 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 콜라게나제의 활성을 저해하고 세포 내 콜라겐의 생성을 촉진하는 효과가 매우 우수하다는 것을 확인함과 동시에 피부 보습 효과, 주름 개선, 피부 탄력 개선 및 진피 치밀도 개선효과가 있음을 확인하고 이를 인체 적용 시험을 통해 검증하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 화장료 조성물로서, 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로 발효된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전체 조성물 대비 상기 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8 및 아세틸 테트라펩타이드-5는 각각 0.005 내지 0.5%(w/v)으로 포함되며, 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 1 내지 10%(v/v)로 포함된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 아이스 플랜트 및 콜라겐이 혼합된 배지에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 10⁷~10¹⁰cfu/㎖의 균수로 상기 배지 100중량부에 대하여 0.5~5중량부 접종한 후, 발효하여 저분자화 된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물은 2종 이상의 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 미생물로 발효된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물은 콜라게나제(Collagenase)의 활성 및 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물은 세포 내 콜라겐 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물은 진피 치밀도 개선, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선 및 보습 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물은 피부세포 생장을 촉진하여 피부세포의 재생속도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양에센스, 영양크림, 마사지크림, 바디크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더 또는 팩의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 기능성 식품 조성물로서, 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로 발효된 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 트헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 이전 발명을 통해 우수한 피부노화 방지 및 피부노화 개선 효능을 가지면서 특히 피부투과율이 월등히 향상되도록 하는, 특정 미생물을 이용하여 제조되는 발효 콜라겐을 개발하여 이에 대한 특허를 등록한 바가 있다(한국특허 등록 제10-1895174호). 또한 콜라겐과 아이스플랜트를 동시에 발효한 발효물의 주름 개선효과와 보습효과에 대한 개량 특허를 출원한 바가 있다(한국 특허 출원 제 10-2017-0163753호). 본 발명에서는 상기 선행 특허를 통해 그 효과를 확인한 콜라겐과 아이스플랜트의 혼합 발효물, 레몬 과피와 오렌지 과피의 혼합 발효물 및 전통적으로 피부 피부노화 개선에 효과가 알려져 있어 많이 활용되어 온 펩타이드를 포함한 조성물을 개발하여 그 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 상기 한국 특허 등록 제10-1895174호 및 한국특허 출원 제10-2017-0163753호에 개시된 내용은 모두 본 발명을 위한 참고자료가 될 수 있다.

본 발명의 피부 피부노화 개선용 화장료 조성물을 구성하는 기능성 원료들은 서로 다른 메카니즘을 통해 피부에 작용하여, 피부 피부노화 개선에 도움을 주는 원료이며, 따라서 이들을 조합하여 사용할 경우 각각의 원료들은 단독으로 사용하는 것과 비교하여 그 효과가 더욱 증강될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 콜라게나제, MMP-1과 같은 콜라겐 분해 효소의 활성을 저해하거나 생성량을 감소시키는 효과가 매우 우수한 것으로 확인이 되었으며, 또한 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과도 매우 우수한 것으로 확인이 되어 피부노화 개선용 기능성 화장료 조성물 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부세포 생장을 촉진하여 피부세포의 재생속도를 증가시키는 것으로 확인이 되어 피부노화 개선용 기능성 화장료 조성물 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 조성물은 진피 치밀도 개선, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선 및 피부 보습 효과가 매우 우수한 것으로 확인이 되어 피부노화 개선용 기능성 화장료 조성물 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 바람직한 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 사람 유래의 세포에 독성을 나타내지 않아 피부 피부노화 개선용 조성물로서 활용도가 매우 높다.

본 발명에 따르면, 100ng/ml ~ 1000μg/ml의 농도로 HaCat 세포 및 NIH3T3 세포에 해당 조성물을 처리한 결과, 세포 독성은 측정되지 않았으며 반대로 세포의 증식을 촉진하는 변화를 확인하였으며 육안으로 세포의 형태를 확인하였을 때도 큰 변화는 관찰되지 않았다.

본 발명의 다른 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물은 50℃ 온도에서도 우수한 열 안정성을 나타냈으며, 일광조건에서도 안정함을 확인하였다. 즉, 본 발명의 조성물은 의약품, 의약외품 및 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 다른 일 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물의 임상 효능을 확인하기 위해 공인임상기관에 의뢰하여 본 특허의 조성물이 포함된 크림과 포함되지 않은 크림의 피부노화 개선효과를 비교한 결과, 본 발명에 따른 조성물이 포함된 크림에서 눈가 주름 개선, 진피 치밀도 개선, 피부탄력 개선 및 보습 효능이 현저히 더 우수한 것을 확인하였다.

본 발명에서 상기 “헥사펩타이드-9”은 Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로, 피부 콜라겐의 합성을 촉진하고, 피부의 표피와 진피의 결합을 재생하고 피부세포의 분화를 촉진함으로써 피부 노화와 주름 개선에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 헥사펩타이드-9은 0.005 내지 0.5%(w/v)으로 포함이 될 수 있으며, 바람직하게는 0.005 내지 0.1%(w/v), 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 “아세틸헥사펩타이드-8”은 아르기렐린(Argireline) 또는 아세틸헥사펩타이드-3으로도 알려진 물질로서 주름 개선효과가 매우 우수한 것으로 알려져 있다. 특히, 아세틸헥사펩타이드-8은 보톡스와 유사한 기전으로 근육의 이완작용을 유발하여 주름에 효과를 나타낸다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 아세틸헥사펩타이드-8은 0.005 내지 0.5%(w/v)으로 포함이 될 수 있으며, 바람직하게는 0.005 내지 0.1%(w/v), 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 “아세틸 테트라펩타이드-5”은 눈가 주름 제거와 탄력 강화를 개발된 화장료 펩타이드로 아이세릴 (Eyeseryl)로 알려진 펩타이드이다. 본 펩타이는 주름 개선효과 외에 피부 각질 층의 보습 효과를 발휘하여 피부 내 수분의 유지에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 아세틸 테트라펩타이드-5은 0.005 내지 0.5%(w/v)으로 포함이 될 수 있으며, 바람직하게는 0.005 내지 0.1%(w/v), 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 “헥사펩타이드-11”은 피부 세포 재생 및 상처 치유에 효과가 있는 펩타이드로 진피 세포의 이동 (migration)을 촉진하여 상처가 난 피부가 빠르게 아물 수 있도록 효과를 발휘하며 피부세포의 증식을 촉진하는 효과를 발휘한다. 또한 항산화제로 작용하여 피부세포 노화 방지 효능을 가지고 있는 펩타이드이다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 아세틸테트라펩타이드-5은 0.005 내지 0.5%(w/v)으로 포함이 될 수 있으며, 바람직하게는 0.005 내지 0.1%(w/v), 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 “헥사펩타이드-67 팔미테이트”은 기존 펩타이드인 헥사펩타이드-9의 펩타이드 서열에 지방산인 팔미트 산을 화학적으로 결합한 화장료 펩타이드로, 기존 헥사펩타이드-9의 효능을 배가하며 화학적으로 합성된 팔미트 산이 펩타이드의 제형 적합성과 피부 투과도를 개선시키는 효과를 발휘한 개량형 펩타이드이다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 헥사펩타이드-9은 0.005 내지 0.5%(w/v)으로 포함이 될 수 있으며, 바람직하게는 0.005 내지 0.1%(w/v), 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 “폴리글루탐산”은 Glutamicacid가 amide결합에 의해 중합한 것으로서, PGA로 약칭한다. Glutamicacid는 α위치와 γ위치의 탄소에 carboxyl기를 가져 이들이 아미노기와 결합한다. α위치의 carboxyl기와의 amide 결합에 의해 중합한 것을 α-polyglutamicacid, γ위치의 carboxyl 기의 경우에는 γ-polyglutamicacid라고 부른다.

본 발명에서 상기 “폴리글루탐산”은 바람직하게 칼슘과 결합된 칼슘 폴리글루탐산일 수 있다.

본 발명에서 상기 아이스플랜트는 메셈브리안트뭄(Mesembryanthemum)속의 다육식물로서 발아율이 낮고 성장속도가 느리다. 원산지는 남아프리카의 나미브 사막이며 주요 분포 지역은 아프리카 남부, 동서부, 북부, 오스트레일리아 남서부,아메리카의 서쪽 건조지역이다. 표면에 있는 투명한 결정체(블러더 세포)에는 이노시톨류, 베타카로틴과 같은 인체에 유용한 성분과 각종 미네랄을 함유하고 있다. 줄기와 잎의 블러더 세포는 얼음결정과 같은 모양을 가지고 있어 `아이스플랜트'라 불린다. 특히, 아이스플랜트에는 혈당치를 낮추는 피니톨(pinitol)과 중성지방을 억제하는 마이요이노시톨(myoinosito)을 많이 함유하고 있기 때문에 잎과 줄기를 생식하거나 즙액으로 사용하면 당뇨병 환자에 적합한 힐링 푸드롤 각광을 받고 있다. 특히 사막에 자생하고 있는 식물은 물이 부족한 환경에 적응하기 위해 식물 내부에 수분을 잘 보호 할 수 있는 보습성분을 다량 보유하고 있는데 화장품 업계에서는 이점을 착안하여 다양한 보습 및 항산화 소재로 활용하고 있으며 아이스플랜트 또한 사막에서 자라는 식물로 식물 내부에 다양한 종류의 보습 성분을 함유하고 있다.

본 발명에서 발효 콜라겐 제조에 사용되는 콜라겐은 중량평균분자량이 50,000~500,000인 것이 사용될 수 있고, 활용 미생물을 고려하여 중량평균분자량이 100,000~300,000인 것이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 “아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물”은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로 발효된 아이스플랜트와 콜라겐의 발효물인 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 이전 연구를 통하여 락토바실러스속 미생물을 이용할 경우 저분자화된 콜라겐을 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였으며, 아이스플랜트는 수분 보습인자를 다량 함유하고 있는 나미브 사막 기원 번행초과 식물로 발효를 통해 보습효과가 향상되는 것을 확인하였다(한국 특허 출원 제 10-2017-0163753호).

발효물은 크게 발효 여과물(Ferment Filtrate)과 발효 용해물(Ferment Lysate)로 분류될 수 있는데 발효 여과물은 발효가 완료된 후 여과장치를 통해 미생물을 제거한 상등액(supernatant)을 활용하는 것이고 발효 용해물은 발효 완료 후 미생물을 열, pH, 효소 (Lysozyme) 고압 등을 활용하여 균을 사멸하여 활용하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합발효물은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 발효 여과물일 수 있다.

본 발명에서 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 (1) 아이스플랜트 추출물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합한 후 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효를 진행하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된 것일 수 있다.

본 발명은 상기 (2) 단계 이후에 발효물을 용해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합 발효물 제조방법을 제공할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에서 상기 혼합 발효물은 이러한 용해단계를 거친 발효 용해물일 수 있다.

본 발명에서 상기 아이스플랜트 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6인 알코올, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다. 본 발명의 추출물은 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6인 알코올 및 이들의 혼합용매에서 선택된 용매로 추출한 것일 수 있으며, 또는 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 수용액일 수 있다. 상기 알코올 수용액의 농도는 10 내지 100%(v/v)일 수 있으며, 바람직하게는 70 내지 100%(v/v)일 수 있다.

본 발명의 추출 용매는 가장 바람직하게는 95%(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있다.

본 발명에서의 아이스플랜트 추출방법은 당업계에 공지된 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 냉침, 열수 추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 방법이 있으나 여기에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는 열수 추출일 수 있다.

상기 방법으로 제조된 추출물은 여과하여 여액을 모으고, 다시 잔사에 원료 중량의 4 내지 7배의 추출 용매, 예컨대 물을 가하여 환류냉각 추출 조건으로 4시간 동안 재추출하고 여과하여 이전의 여액과 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 본 발명의 추출물이 추출의 횟수에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같이 추출한 후 합한 여액은 40 내지 60℃에서 감압농축하여 추출물 중에 잔존하는 용매를 제거하고, 감압농축된 농축물 중량의 25 내지 50배의 물로 2 내지 3회 공비 농축한 후 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시킨 후 최종 추출물은 추가적으로 더욱 정제할 수도 있고, 동결건조 등의 방법에 의해 건조시켜 용매를 제거하여 고형화하거나 분말 형태로 제조할 수 있다.

상기 아이스플랜트 추출물을 콜라겐과 혼합한 후 바실러스속 미생물 또는 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효하는 단계를 진행한다. 상기 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합하는 비율은 특별히 제한되지 않으며 1:0.001~5의 비율로 혼합할 수 있다. 또한 상기 미생물을 아이스플랜트 추출물 및 콜라겐 혼합물에 접종하는 농도, 발효온도, 발효시간 등은 당업계에서 공지된 일반적인 방법을 적용할 수 있다.

본 발명의 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물의 발효 과정은 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다: 예컨대, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 배지 100중량부에 10⁷~10¹⁰cfu/㎖의 배양액으로 0.5~5중량부 접종시켜 35~39℃에서 1~5일간 배양하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 10⁸~10⁹cfu/㎖의 배양액으로 0.5~2중량부 접종시켜 36~38℃에서 2~4일간 배양하여 수행될 수 있다. 이때 배양에 사용되는 배지는 펩톤, 아세트산 나트륨 수화물, 황산 마그네슘 수화물, 황산 망간 수화물, 트윈 80, 시트르산 아암모늄, 인산 이칼륨 및 증류수를 포함하여 구성될 수 있고, 여기에 상기 배지 100중량부에 대하여 1~10중량부, 바람직하게는 2~5중량부의 아이스플랜트 추출물과 콜라겐을 혼합하여 사용될 수 있다. 배양 완료 후 배양액을 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리함으로써 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물이 제조될 수 있다.

이와 같이 제조된 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 미생물로서 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 및/또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 이용함으로써 타 유산균 균주를 이용할 경우에 비해 콜라겐 저분자화가 매우 우수하여 콜라겐 발효에 가장 적합하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 콜라게나아제 활성 저해율이 20% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 35% 이상인 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물을 얻을 수 있었다.

본 발명에서 상기 “오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물”은 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다: (a) 레몬 및 오렌지의 과피를 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 과피 추출물에 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 이루어진 군에서 선택된 2종의 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효시키는 단계.

상기 (a) 단계에서 오렌지 및 레몬의 과피를 혼합하는 비율은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 동일한 비율로 혼합된 과피 혼합물의 추출물일 수 있다.

또한, 오렌지 및 레몬 과피를 추출하기 위한 용매로서 가장 바람직한 것은 70% 에탄올일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (b) 단계는, 상기 (a) 단계에서 제조된 과피 추출물에 락토바실러스속 균주 2종을 선택하여 접종함으로써 발효시키는 단계이며, 보다 구체적으로는 예컨대, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)와 락토바실러스 엑시도필러스 (Lactobacillus Acidophillus)를 배지 100중량부에 10⁷~10¹⁰cfu/㎖의 배양액으로 0.5~5중량부로 동시에 접종시켜 35~39℃에서 1~5일간 배양하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 10⁸~10⁹cfu/㎖의 배양액으로 0.5~2중량부 접종시켜 36~38℃에서 2~4일간 배양하여 수행될 수 있다. 이때 배양에 사용되는 배지는 펩톤, 아세트산 나트륨 수화물, 황산 마그네슘 수화물, 황산 망간 수화물, 트윈 80, 시트르산 아암모늄, 인산 이칼륨 및 증류수를 포함하여 구성될 수 있고, 여기에 상기 배지 100중량부에 대하여 1~10중량부, 바람직하게는 2~5중량부의 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 추출물을 혼합하여 사용될 수 있다. 배양 완료 후 배양액을 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리함으로써 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물이 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 상기 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물은 전체 조성물 대비 1 내지 10%(v/v), 바람직하게는 1 내지 8%(v/v), 가장 바람직하게는 2 내지 5%(v/v)로 포함이 될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 2 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성되어 매우 분자량이 작고, 상기 발효물도 미생물에 의한 발효로 인해 저분자화되어 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 높은 피부 침투율로 인해 우수한 피부 주름 개선 효과를 달성할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 콜라게나제를 억제하므로 주름 개선에 효과가 있으며 피부 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하여 안티에이징 에도 효과적이다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양에센스, 영양크림, 마사지크림, 바디크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더 또는 팩의 제형을 갖을 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등으로 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.

상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제주 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.

상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.

상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부노화 개선 성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 피부 주름개선 성분으로는 비타민 C, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 기능성 식품 조성물로서, 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로 발효된 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 기능성 식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 기능성 식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 기능성 식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 기능성 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 기능성 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 기능성 식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 기능성 식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서 제조된 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등의 의약 조성물 및 화장료 조성물에 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 피부노화 개선용 조성물은 피부 세포 내 콜라겐을 분해하여 주름생성에 영향을 주는 콜라게나제의 활성을 억제시키고 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과를 나타내고, 진피 치밀도 개선, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선 및 피부 보습효과를 나타내어 피부 노화 개선용 화장료 조성물 또는 기능성 식품 조성물 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 피부노화 개선용 조성물의 MMP-1 발현 저해능을 확인한 그래프,
도 2은 본 발명에 따른 피부노화 개선용 조성물의 콜라겐 생성 촉진효과를 확인한 그래프,
도 3은 및 도 4는 본 발명에 따른 피부노화 개선용 조성물의 열 안정성 및 광안정성을 측정한 결과를 나타내는 그래프,
도 5 및 도 6은 본 발명에 따른 피부노화 개선용 조성물의 피부 세포 증식능을 NIH3T3 세포 및 HACAT 세포에서 MTT assay를 통해 확인한 그래프이다.
도 7a는 임상시험을 통해 확인된 좌측 눈가 주름 개선 주름 개선 효과를 나타내는 비교사진,
도 7b는 임상시험을 통해 확인된 우측 눈가 주름 개선 주름 개선 효과를 나타내는 비교사진,
도 8a는 임상시험을 통해 확인된 좌측 눈가의 진피 치밀도 개선 효과를 나타낸 비교사진,
도 8b는 임상시험을 통해 확인된 우측 눈가의 진피 치밀도 개선 효과를 나타낸 비교사진,
도 9은 임상시험을 통해 확인된 피부 탄력 개선 효과를 나타내는 그래프,
도 10은 임상시험을 통해 확인된 피부 수분 함량 개선 주름 개선 효과를 나타내는 그래프이다.

이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

<제조예>

1-1. 펩타이드 제조

헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8 및 아세틸 테트라펩타이드-5는 ㈜에이앤펩에서 solid phase 합성법을 통한 합성을 통해 확보하였으며, 각각의 펩타이드 분자량은 370(헥사펩타이드-9), 285(헥사펩타이드-11), 583(헥사펩타이드 팔미테이트-67), 889(아세틸헥사펩타이드-8) 및 492(아세틸 테트라펩타이드-5)이다.

1-2. 아이스플랜트 및 콜라겐의 혼합 발효물 제조

아이스플랜트 열수 추출물과 고분자 콜라겐(Mw 100,000~300,000)을 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)를 사용하여 발효하였으며, 상기 락토바실러스 파라카제이는 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였다.

구체적으로, 상기 락토바실러스 파라카제이 균주를 선택 배지에 순수 배양하여 균수가 10⁸내지 10⁹cfu/ml정도 되는 배양액 1%를 접종하고, 37℃ 인큐베이터에서 72 시간 동안 배양하여 진행하였다. 배양에 사용한 배지는 펩톤 5g, 아세트산 나트륨 3 수화물 2.5g, 황산 마그네슘 7 수화물 0.5ml, 황산 망간 4 수화물 0.5ml, 트윈 80 5ml, 시트르산 이암모늄(diammonium citrate) 1g, 인산 이칼륨(dipotassium phosphate) 1g, 및 증류수 480ml로 구성된 최소 배지에 아이스플랜트 열수 추출물과 15g의 콜라겐을 혼합하여 사용하였다.

배양이 완료된 후 배양액을 4000rpm, 10분 동안 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리한 후 배양액을 수득하여 발효 혼합물을 제조하였다.

1-3. 오랜지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물 제조.

레몬과 오렌지 과피(썬키스트사, 시중에서 구매)의 1:1 혼합물을 70% 에탄올로 추출하고(과피:용매 중량비는 1:9) 상기 추출물에 락토바실러스 악시도필러스와 락토바실러스 파라카제이의 혼합균주 배양액을 첨가하되, 혼합균주의 배양액을 10⁹cfu/ml로 조절한 후 상기 추출액 100 중량부 대비 3 중량부로 첨가한 후 37℃에서 3일간 발효시켜 제조하였다.

상기 락토바실러스 악시도필러스와 락토바실러스 파라카제이는 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였다.

<실시예 1>

피부노화 기능성 원료들의 조합 선정 및 조성물의 제조

상기 제조예에서 제조된 오랜지 과피와 레몬 과피 혼합 발효물, 아이스 플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물과 피부노화 개선에 효과가 있다고 알려진 5종의 펩타이드 및 폴리글루탐산(바이오리더스)을 칼슘과 결합시킨 칼슘 폴리글루탐산과의 조합을 통한 우수한 항-피부노화용 조성물을 제조하고자 하였다.

헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 칼슘 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 하기 표 1의 성분 비로 12종의 조합을 선정하였다.

상기 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8 및 아세틸 테트라펩타이드-5는 하기 표 1에 기재된 농도로 물에 용해하였으며(w/v), 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물도 하기 표 1에 기재된 농도로 물에 첨가하여(v/v) 조성물을 제조하였다.

[표 1]

<실시예 2>

조성물의 콜라게나제 활성 저해 효과 확인

상기 실시예 1에서 제조한 피부노화 개선 조성물의 피부 주름 개선효과를 확인하기 위해 상기 표 1에 열거한 조합의 조성물을 하기 방법에 따라 생체 외(In vitro) 콜라게나아제(collagenase) 활성 제해 실험을 진행하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

콜라게나아제(collagenase) 활성 저해 시험 방법은,

(1) 콜라겐을 인산 완충액에 녹여 준비한다(100ppm). 이때 양성 대조군으로 아데노신을 같은 농도로 준비한다.

(2) 100mM Tris-cl buffer, 100mM CaCl₂ 및 0.25mg/ml 콜라게나제가 포함된 mixture를 준비하고, 상기 표 1에 따라 제조된 각각의 시험물질 및 양성대조군을 상기 mixturedp 5%(v/v)의 농도로 첨가하여 반응을 진행시킨다.

(2) 25mM 시트르산을 400㎕/tube 첨가하여 반응을 종료시킨다.

(3) 이후 에틸아세테이트를 1.5㎖/tube 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)한 후 상등액을 취하여 황산나트륨 150mg/ep-tube에 옮기고, 볼텍싱 후 원심분리(10,000rpm, 3분)한다.

(4) 상등액 300㎕/ep-tube를 취하여 석영 96well 플레이트에 옮긴 후 320nm에서 흡광도를 측정한다.

측정 결과 하기 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 대부분의 조합에서 대조군인 아데노신에 비해 우수한 콜라게나제 억제능을 확인하였다.

[표 2]

<실시예 3>

MMP -1(Matrix Metalloproteinase - 1) 생성 저해 실험

Matrix methaloprotease-1(MMP-1, collagenase) 생성을 저해하는 물질은 콜라겐을 보호하여 피부조직의 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지하기 때문에 원료에 대한 MMP-1 생성을 저해하는 활성을 측정하여 활성을 갖는 원료는 주름을 개선하고 탄력 있는 피부를 위한 화장품 개발에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 평가 할 수가 있다. 이에, 상기 실시예 2에서 우수한 콜라게나제 생성 억제 효과를 나타낸 5종의 조합(조합 1, 4, 6, 8, 9)을 선택하여 MMP-1 생성 저해능 시험을 진행 하였다.

사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 2 X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 선정된 상기 5종의 조합의 실험군과 대조군으로 레티놀을 10 ug/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Matrix Metalloproteinase-1(MMP-1),Human,biotrak,ELISA kit (GE healthcare RPN2610)을 통해 MMP-1의 생성 저해능을 측정하였고, 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하면, 세포내에서 생성되는 MMP-1의 발현양이 대부분의 실험군에서 대조군인 레티놀에 비해 줄어드는 것을 확인하였으며 실험군 내에서도 조성물 내 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 차이가 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 피부에 MMP-1생성을 유발하는 UV가 요인으로 적용되었을 때, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 다양한 조합물을 혼합하여 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내어 MMP-1생성을 저해하여 피부의 피부노화을 억제 할 수 있을 것으로 사료된다.

<실시예 4>

세포 내 콜라겐 생성능 평가

MMP-1 저해능 시험에서 가장 우수한 효과를 나타낸 2종의 조합(조합 4, 8)에 대해 세포 내 collagen 생성능 시험을 진행하였다. 시험에 사용할 사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 Medium 106 (cascade biologics, M-106-500) 에 1X LSGS(Low Serum Growth Supplement, cascade biologics S-003-10)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 1X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 2종의 실험군과 대조군으로 TGF를 10μg/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Procollagen Type I C-peptide(이하 PIP) EIA kit (takara MK101) 을 통해 Collagen 생성량을 측정하였고, 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 2종의 실험군을 농도별로 처리한 뒤 collagen 생성량을 측정한 결과 콜라겐의 양이 모든 실험군에서 대조군인 TGF에 비해 콜라겐 생성량이 증가하는 것을 확인하였으며 실험군 내에서도 조성물 내 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 차이가 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 피부에서의 collagen 생성을, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 다양한 조합물을 혼합하여 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내어 collagen 생성을 증가시켜 피부의 피부노화를 억제 할 수 있을 것으로 사료된다.

<실시예 5>

피부 노화 개선용 조성물의 안정성 확인 실험

본 발명의 피부노화 개선 조성물의 열 및 광 안정성을 확인하기 위하여, 피부노화 개선 조성물이 10 mg/mL이 되도록 조성물을 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 용해하여 유리 바이알에 분주하여 넣은 후 50 ℃ 에서 7, 14, 21, 28, 35, 42 및 60일 보관하며 열에 의한 조성물 내 펩타이드 성분의 손실을 측정하고 동일한 방법으로 일광 조건에서 안정성 여부를 측정하였고, 이에 대한 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.

도 3 및 4를 참조하면, 열에 의한 펩타이드 손실을 측정하고 일광 조건에서 안정성 여부를 측정한 결과, 60일까지 단지 10% 미만의 펩타이드 손실을 나타내어 열 및 보관기간에 있어 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인하였다.

<실시예 6>

세포 증식능 실험

본 발명의 조성물이 각질세포에 대해 세포의 증식능을 향상시킬 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 세포 증식능 실험은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. HACAT세포와 3T3세포를 24 well plate에 각 well당 4 X 10⁴ cells/24well의 세포수가 되도록 seeding 한 후 24h 동안 37℃, 5% CO₂조건으로 항온 배양하였다. PBS로 2회 세척 후 배양 후 합성 tranexamic acid dipeptide를 농도별(1mg~1ug/mL)로 처리하여 24h 동안 항온 배양하였다. 배양 후 MTT 0.5% in DPBS를 배양배지와 1:9(v/v)로 혼합하여 첨가한 후 2h 동안 CO₂ incubator에서 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 ELISA를 이용하여 570 nm에서 측정하였고, 이에 대한 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.

도 5 및 6을 참조하면, 각질세포주의 일종인 HaCat 세포, 섬유아세포의 일종인 NIH3T3 세포에 대하여, 저농도에서 고농도까지 처리한 조성물에 의한 세포수의 감소는 관찰되지 않았으며, 농도 의존적으로 세포의 증식이 활성화되며 세포들의 현미경적인 관찰에서도 별다른 변화가 관찰되지 않았다. 이를 통해 본 발명의 피부노화 개선 조성물은 피부 관련 세포에 독성이 전혀 없음을 알 수 있으며, 피부세포 증식을 활성화 하는 것을 보아 본 피부노화 개선 조성물을 피부에 처리하여도 큰 영향을 끼치지 않으리라는 것을 예측할 수 있다.

<실시예 7>

눈가 주름 개선 임상시험

본 피부노화 개선용 조성물의 임상 효과를 확인하기 위해 공인 인증기관에 의뢰하여 조성물이 처방된 화장품 제형의 피부노화 개선 효과를 확인하였다.

In vitro 에서 피부 피부 노화 개선 효능이 높았던 상기 표1 의 조합 8 화장료 조성물을 하기 표 12에서 제시한 크림의 조성에 넣은 크림을 제조하였으며 만 30~50세의 성인 여성을 대상으로 실험을 수행하였다. 시험 제품은 안면 부위에 사용방법에 따라 사용하도록 하였으며, 눈가 주름 개선에 대한 효과를 평가하였다. 평가는 센터 내부 지침서(SOP)에 준하여 수행하였으며, 식품의약품안전처 고시에 규정하지 않은 사항은 참고 문헌을 참조하여 수행하였다.

주름 측정은 PRIMOS(Phaseshift Rapid In-vivo Measurement Of Skin)를 이용하여 눈가 부위를 측정하였고, 시험 부위에 대한 정확한 재현성을 위해 기존 측정부위와 새로운 측정부위가 동일할 수 있도록 overlay 기능을 사용하여 측정하였다. PRIMOS는 미세주름을 측정하기 위한 장비로 DMD(Digital Micromirror Device)에서 만들어진 미세한 줄무늬(fringe fraction)가 피부에 투영된다. 투영된 영상은 3차원 profile 정보로 나타나며 필터과정을 통해 PRIMOS프로그램(GFM, Germany)으로 분석하였다. PRIMOS 분석 변수로는 Ra와 R3z를 선정하였다.

Ra(Arithmetic roughness average)는 PRIMOS로 측정된 주름의 거칠기 단면 peak에 대한 산술 평균값으로 Ra값이 작아질수록 피부 주름의 깊이가 낮아져 주름이 개선됨을 의미하며, 단위는 ㎛이다.

R3z(Base roughness depth)는 R3z1부터 R3z5까지 5가지의 단일 거칠기 깊이에 대한 산술 평균으로 나타낸다. 단일 거칠기 깊이는 거칠기 단면의 단일 평가 거리(Ir)에서 세번째로 높은 단면 peak과 세번째로 깊은 곡선 사이의 수직거리를 의미한다. R3z의 값이 작아질수록 피부의 주름 깊이가 낮아짐을 의미하며 주름 개선이 되었음을 의미한다.

하기 표 3, 4, 5 도 7a 및 7b을 참조하면, 두 군 간의 눈가 주름 변화 분석 결과, Ra, R3z에서 제품 사용 8주 후 통계적으로 유의한 수준의 눈가 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다(p <0.05).

[표 3]

시험군의 눈가 주름 변화량 측정 결과(단위: ㎛)

[표 4]

대조군의 눈가 주름 측정 결과(단위: ㎛)

[표 5]

<실시예 8>

진피 친밀도 임상시험

본 피부노화 개선용 조성물의 진피 친밀도에 대한 임상 효과를 확인하기 위해 공인 인증기관에 의뢰하여 조성물이 처방된 화장품 제형의 피부노화 개선 효과를 확인하였다.

In vitro 에서 피부 피부노화개선 효능이 높았던 상기 표 1의 조합 8 화장료 조성물을 선정하여 하기 표 12 에서 제시한 크림의 조성에 화장료 조성물을 넣은 크림을 제조하였으며 만 30~50세의 성인 여성을 대상으로 실험을 수행하였다.

대조군은 하기 표 12에서 피부노화 조성물을 물로 대체하여 동일하게 크림을 제조하여 사용하였다.

시험 제품은 안면 눈가 부위에 사용방법에 따라 사용하도록 하였으며, 눈가 주름 개선에 대한 효과를 평가하였다. 평가는 센터 내부 지침서(SOP)에 준하여 수행하였으며, 식품의약품안전처 고시에 규정하지 않은 사항은 참고 문헌을 참조하여 수행하였다.

진피 치밀도 측정을 위해 사용한 장비는 DERMA SCAN^ⓡ C Ver 3. Program (CORTEX TECHNOLOGY, Denmark)이며, Scannig head가 장착된 Water chamber 내부에 증류수를 주입하여 측정 부위에 밀착시켜 scan하고 이를 영상화 시키는 방식이다. 증류수는 초음파의 매질 역할을 한다.

진피 치밀도 측정 결과 분석을 위해 Derma scan C 기기적 평가는 DERMA SCANⓡ C Ver 3. Program을 이용하여 B-scan measurements의 Intensity를 가지고 비교하였으며, 그 값이 높을수록 진피가 치밀한 것을 의미한다. 진피 치밀도 분석값은 프로그램에 의해서 계산된 값으로 백분율 단위(Percentage Unit, %)이다. 치밀도 측정은 제품 사용 전(0주), 제품 사용 4주 후, 제품 사용 8주 후에 측정하였다.

통계분석은 시험군과 대조군의 진피 치밀도 변화량에 대한 측정 결과를 독립검정(Independent t-test)법으로 분석하였다. 모든 통계 결과는 생물학적 통계분석에서 가장 많이 사용하는 유의차 5%(p<0.05) 일 때 통계적 유의성이 있다고 간주하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0 software를 사용하였다.

[표 6]

시험군의 진피 치밀도 변화량 분석 결과(단위: %)

[표 7]

대조군의 진피 치밀도 변화량 분석 결과(단위: %)

상기 표 6 및 7과 도 8a 및 8b를 참조하면 두 군 간의 눈가 주름 변화 분석 결과. 진피 치밀도 분석 결과, 대조군과의 비교에서 시험군은 진피 치밀도의 변화량이 증가되는 것을 볼 때 진피 치밀도의 개선 효과를 나타내었다(p<0.05).

<실시예 9>

피부탄력 임상시험

시험 제품은 안면 눈가 부위에 사용방법에 따라 사용하도록 하였으며, 피부 탄력에 대한 효과를 평가하였다. 평가는 센터 내부 지침서(SOP)에 준하여 수행하였으며, 식품의약품안전처 고시에 규정하지 않은 사항은 참고 문헌을 참조하여 수행하였다.

피부 탄력 측정은 Cutometer(MPA 580, Courage and Khazaka Electronic Co.,Germany)를 이용하여 눈가에서 3cm 떨어진 부위를 측정하였다. Cutometer는 피부 표면에 음압을 가하여 피부가 탐침기 안으로 흡입되는 정도를 피부를 통과할 수 있는 광학시스템을 이용하여 측정한다. 이 때 사용되는 빛은 적외선으로 피부를 통과하면서 감소되는 빛의 세기와 피부를 통과하지 않는 빛의 세기의 비율로 탄력의 정도를 측정한다. 탄력 평가의 측정계수는 arbitrary unit(A.U.)이다.

피부 탄력 측정 결과 분석을 위해 탄력 측정은 눈가에서 3cm떨어진 부위에 Cutometer(MPA 580, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 사용하여 측정하였다. 평가는 3회 실시하였으며, 3개의 값에 대한 평균을 사용하였다. 변수로는 R2값을 선정하였으며, 값이 높아질수록 피부 탄력이 개선됨을 의미한다. 이번 시험에서는 변수 R2에 관하여 제품 사용 전(0주)과 제품 사용 4주 후, 제품 사용 8주 후에 값을 측정하였으며, 측정계수는 arbitrary unit(A.U.)이다.

[표 8]

시험군의 피부 탄력 변화량 결과(단위: A.U.)

[표 9]

대조군의 피부 탄력 변화량 결과(단위: A.U.)

상기 표 8 및 9와 도 9를 참조하면, 두 군 간의 피부 탄력 변화 분석 결과. 진피 치밀도 분석 결과, 대조군과의 비교에서 시험군은 대조군과 비교하여 피부탄력의 변화량이 증가되는 것을 볼 때 피부 탄력도의 개선 효과를 나타내었다(p<0.05).

<실시예 10>

피부보습 임상시험

시험 제품은 안면 눈가 부위에 사용방법에 따라 사용하도록 하였으며, 피부 보습에 대한 효과를 평가하였다. 평가는 센터 내부 지침서(SOP)에 준하여 수행하였으며, 식품의약품안전처 고시에 규정하지 않은 사항은 참고 문헌을 참조하여 수행하였다.

수분 측정은 Corneometer(CM825, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 안면 부위를 3회 측정하였으며, 3개의 값을 이용해 평균값을 구하였다. 측정은 제품 사용 전(0주), 제품 사용 4주 후와 제품 사용 8주 후에 실시하였다. Corneometer는 피부에 접촉하는 probe를 통해 전달되는 전류의 정전부하용량 (capacitance) 계측으로 이루어진다. 수분의 함량과 정전부하용량은 서로 비례하는 성질이 있어 수분이 높을수록 측정 수치가 높아지며, 측정 계수는 Arbitrary unit(A.U.)이다.

피부 수분 측정 결과 분석을 위해 Corneometer(CM825, Courage and Khazaka Electronic Co.,Germany)를 이용하여 측정하였다.

측정은 제품 사용 전(0주), 제품 사용 4주 후, 제품 사용 8주 후에 측정하였으며, Corneometer로 측정한 3개의 값을 이용해 평균값을 구하였다. 수분량이 높을수록 측정 수치가 높아지며, 측정 계수는 Arbitrary unit(A.U.)이다.

[표 10]

시험군의 피부 수분 변화량 결과(단위: A.U.)

[표 11]

대조군의 피부 수분 변화량 결과(단위: A.U.)

상기 표 10 및 11과 도 10을 참조하면, 두 군 간의 피부 수분 변화 분석 결과 대조군과의 비교에서 에서 볼 수 있는 바와 같이 시험군은 대조군과 비교하여 피부 수분량이 증가되는 것을 볼 때 수분 개선 효과를 나타내었다(p<0.05).

< 적용예 >

피부노화 개선 조성물이 함유된 크림 타입 조성물의 제조

하기 표 12에 기재된 각각의 성분들을 조성물 100 중량부에 대하여 하기 기재된 비율에 따라 첨가하였으며, “피부노화 조성물”은 상기 표 1에 기재된 각각의 구성성분 비율에 따라 크림 타입 조성물에 첨가하였다.

[표 12]

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 화장료 조성물로서,
상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로 발효된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
전체 조성물 대비 상기 헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8 및 아세틸 테트라펩타이드-5는 각각 0.005 내지 0.5%(w/v)으로 포함되며, 상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 1 내지 10%(v/v)로 포함된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 아이스 플랜트 및 콜라겐이 혼합된 배지에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 10⁷~10¹⁰cfu/㎖의 균수로 상기 배지 100중량부에 대하여 0.5~5중량부 접종한 후, 발효된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물은 2종 이상의 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 미생물로 동시에 발효된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 콜라게나제(Collagenase)의 활성 및 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 세포 내 콜라겐 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 진피 치밀도 개선, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선 및 보습 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부세포 생장을 촉진하여 피부세포의 재생속도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양에센스, 영양크림, 마사지크림, 바디크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더 또는 팩의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
헥사펩타이드-9, 헥사펩타이드-11, 헥사펩타이드 팔미테이트-67, 아세틸헥사펩타이드-8, 아세틸 테트라펩타이드-5, 폴리글루탐산, 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물 및 오렌지 과피와 레몬 과피의 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 기능성 식품 조성물로서,
상기 아이스플랜트와 콜라겐의 혼합 발효물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로 발효된 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.