KR20120082888A

KR20120082888A - 세포성 노화를 지연시키기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20120082888A
Application number: KR1020127008424A
Authority: KR
Inventors: 제임스 빈센트 그루버
Original assignee: 아치 퍼스널 케어 프로덕츠, 엘.피.
Priority date: 2009-09-01
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2012-07-24
Also published as: CN102575276A; AU2010289667A1; WO2011028673A9; JP2013503871A; US20110052676A1; WO2011028673A2; EP2473159A2; CA2772856A1

Abstract

본원에서는, 조성물의 총 중량을 기초로 하여 약 0.01 중량% 내지 약 (5) 중량%의 헥사펩티드-11 (Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro), 및 물, 오일, 알코올, 실리콘 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 펩티드용의 피부학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 세포성 노화를 지연시키기 위한 조성물이 개시된다.

Description

세포성 노화를 지연시키기 위한 조성물{A COMPOSITION FOR DELAYING CELLULAR SENESCENCE}

일반적으로, 본 발명은 세포성 노화를 지연시키기 위한 조성물에 관한 것이며; 보다 구체적으로는, 피부 세포에서 고유의 또는 스트레스-유도된 세포성 노화를 지연시키는데 효과적인 헥사펩티드-11 을 함유하는 미용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피부 세포에서 노화를 지연시키는 방법에 관한 것이다.

대부분의 세포는 복제성 또는 세포성 노화로 인해 무기한 분열할 수 없다. 복제성 또는 세포성 노화는, Hayflick 및 Moorhead 에 의해 약 30 년 전 세포 수준에서 노화 모델로서 처음 관찰되고 제안되었다. 이들은, 시험관내에서 세포가 오직 50-60 집단 배가 동안만 성장한 후, 소위 복제성 노화라 불리는 시점에 도달하면 이들이 새로운 DNA 를 생산하는 것을 중지하나 대사 및 ATP 생산은 계속하는 경향이 있다는 심원한 발견을 했다. 복제성 노화에 들어간 세포는 통상적으로, 세포자연사 (apoptosis) 로 알려진 일련의 총체적인 분해 사건을 통해 결국 사멸하게 될 것이다.

세포는, 스트레스성 사건, 예컨대 독소, UV 방사, 또는 기타 산화적 사건의 결과로서 조기 노화를 나타낼 수 있다. 이러한 현상은 스트레스-유도 조기 노화 (Stress-Induced Premature Senescence; SIPS) 로 지칭된다.

세포성 노화가 노화의 필수 원인 요소인 것으로 여겨지기 때문에, 세포성 노화를 지연시키는 방법을 개발하려는 노력이 있어왔다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제 2002/0123526 호는 각질세포 (keratinocyte) 에서 세포성 노화를 지연시키기 위한 레티노산의 용도를 개시하고 있다.

미국 특허 출원 공보 제 2009/0075902 호는, 핵 인자 카파베타 (Nuclear Factor Kappa Beta; NF-κβ) 단백질의 활성하를 저해하기 위해 NF-κβ 에 작용하는 네모 결합 도메인 (Nemo Binding Domain; NBD) 단백질을 사용하여 본질적으로 이러한 핵심 세포성 전사 인자를 불활성화 상태로 유지함으로써, 세포성 노화를 지연시키는 방법을 개시하고 있다.

최근 공개된 세계 특허 출원 제 WO 2009/046436 호는 mTOR (포유동물의 라파마이신에 대한 표적) 유전자 및 경로의 저해를 통해 세포성 노화를 지연시키기 위한 라파마이신 약물의 국소 적용을 개시하고 있다.

Won 등은, 라벨링된 CGK733 약물 (합성 아세트아미드 유사물로 시판됨) 이, "노화 시계 (Senescence Clock)" 에 실제로 역행할 수 있어, 이에 의해 복제성 노화 세포 (특히 섬유아세포에서) 를 다시 활성적으로 복제하는 세포로 전환시킬 수 있었음을 개시하고 있다 (문헌 [Nat. Chem. Biol. 2 (7): 369-374 (2006)] 참조). 노화 역전에 대한 청구는 후의 Won 등의 공보에 의해 철회되었다 (문헌 [Won et al. Nat Chem Biol 2008] 참조).

지금까지, NBD 단백질과 같은 세포성 노화를 지연시키기 위한 당업계의 물질은 합성하는데 고비용이 소요된다. 따라서, 이들은 국소 치료 적용에 바람직하지 않을 수 있다.

국소 적용 및 미용품에서 펩티드의 사용이 공지되어 있다. 예를 들어, US 6,492,326 는, 펜타펩티드를 사용하여 콜라겐 발현 생산을 자극함으로써 피부 외관에 영향을 미칠 수 있음을 개시하고 있다. Katayama 등은, 동일한 펜타펩티드를 사용하여 상처 치유를 개선시킬 수 있음을 개시하고 있다. 문헌 [Katayama et al, J Biol Chem., 268, 9941-9944 (1993)] 을 참조한다. 유사하게, 미국 특허 출원 공보 제 2004/0141939 호는, 피부 세포 사이의 부착을 촉진하기 위해 제안된 피부 케어용으로 의도되는 펩티드를 개시하고 있다. 미국 특허 제 5,554,375 호는 모발 성장을 촉진하고 손상된 피부 및 상처를 개선하기 위해 제안된 구리-함유 펩티드를 개시하고 있다.

국소 적용에 헥사펩티드를 사용하는 문헌을 참조로 한다. 예를 들어, US20070202216 (Reinhart et al) 는 노화되는 피부의 외관을 개선시키기 위해 세린-이소루신-라이신-발린-알라닌-발린 구조의 헥사펩티드를 사용하는 것을 개시하고 있다. US2008152606 (Reinhart) 는 피부 노화의 외관을 개선하기 위해 아세틸-Glu-Glu-Met-Glu-Arg-Arg 구조의 아세틸화된 헥사펩티드를 기술하고 있다. IE20060154 (Laloeuf) 는, 노화되는 피부의 외관을 개선시키기 위해 Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln 구조의 헥사펩티드를 개시하고 있다.

마찬가지로, 이스트 추출물로부터 유래된 펩티드, 특히 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 로부터의 추출물 (빵 이스트 (Bakers Yeast) 로서 알려져 있음) 은 문헌 [Bentley et al., Arch Surg, vol. 125, 1990, 641] 에 따라 피부의 외관 및 상처 치유를 개선시키기 위해 국소적으로 기능할 수 있다. 아미노산 서열 Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro (INCI 명: 헥사펩티드-11) 를 포함하는 펩티드는 이스트 발효물로부터 단리되고 노화되는 피부를 견고하게 하는 것으로 보고되어 있다. 문헌 [Lupo et al, Dermatol Therapy, vol. 20, 2007, 343] 를 참조한다. 이러한 문헌은 상처 치유 목적을 위해 사용되는 펩티드의 양은 개시하고 있지 않다.

그러나, 이들 특허 및 문헌은, 상기 목록의 펩티드 중 어떤 것도 복제성 세포 노화를 지연시킬 수 있다는 것을 제시하는데 실패했다. 따라서, 세포성 노화를 지연시키기 위한 능력을 갖는 효과적인 비용의 활성제가 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 필요성에 대한 하나의 해결책을 제시한다.

발명의 개요

하나의 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 세포성 노화를 지연시키기 위한 조성물에 관한 것이다:

조성물의 총 중량에 기초하여 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%의 헥사펩티드-11, 및

펩티드용의 피부학적으로-허용가능한 담체.

상기 담체는 물, 오일, 알코올, 실리콘, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또다른 양태에서, 본 발명은 세포, 예를 들어, 진피 섬유아세포, 표피 각질세포 및 진피 돌기 세포에서 고유의 세포성 노화 및 스트레스-유도된 조기 노화를 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 세포를, 조성물의 총 중량에 기초하여 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%의 헥사펩티드-11, 및 펩티드용의 피부학적으로-허용가능한 담체를 함유하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 담체는 물, 오일, 알코올, 실리콘 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

도 1 은 SA-β-Gal 발현에 의해 측정된, 고유의-노화된 진피 섬유아세포에서 지연된 노화를 도시하는 그래프이다.
도 2 는 ATM 발현에 의해 측정된, 표피 각질세포에서 지연된 H₂O₂ 스트레스-유도 조기 노화를 도시하는 그래프이다.
도 3 은 p53 발현에 의해 측정된, 표피 각질세포에서 지연된 H₂O₂ 스트레스-유도 조기 노화를 도시하는 그래프이다.
도 4 는 SA-β-Gal 발현에 의해 측정된, 진피 돌기 세포에서 지연된 UV 스트레스-유도 조기 노화를 도시하는 그래프이다.
도 5 는 DNA 수선 효소 Ogg1 의 세포 발현에 미치는 헥사펩티드의 영향을 도시하는 그래프이다.

약 0.01% 내지 약 5% 의 농도로, 50% 이상의 순도의 헥사펩티드, 바람직하게는 헥사펩티드-11 이, SA-β-갈락토시다아제 (SA-β-Gal) 의 발현에 의해 측정시, ATM 또는 p53 의 억제에 의해 측정시, 또는 세포 생존력 검정 예컨대 MTT 검정에 의해 측정시 세포 생존력이 증가된 것을 통해, 피부 세포에서 고유의 또는 스트레스-유도된 조기 세포성 노화를 지연시키는 능력을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

당업자에게 공지된 바와 같이, 노화를 지연시키는 것은 많은 시험관내 검정에 의해 측정될 수 있다. 특히, SA-β-갈락토시다아제, ATM, ATR, p53, p21, 및 p16 의 발현 및 세포 생존력의 증가 (MTT 검정으로 측정시) 는 모두 세포성 노화 지연의 표시가 될 수 있다.

또한, 세포성 노화는 노화로 들어간 세포의 형태학에서의 변화에 의해 인지될 수 있다. 가장 흥미로운 것은, 고유의 또는 스트레스-유도된 세포성 노화에서 세포에 의해 발현되는 것으로 공지된 독특한 세포성 마커인 SA-β-갈락토시다아제의 축소 발현이다.

노화 마커의 세포성 발현은 시험관내 검정을 사용하는 다중 방식으로 측정될 수 있으나, 인간 유전자 마이크로어레이 및 Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) 에 의한 2 가지의 매우 실제적 방법이 있다. 제 1 기술은, 특정 처리가 RNA 발현을 증가시키거나 감소시킴으로써 단백질 및 효소를 창출하기 위한 섬유아세포의 유전적 경향에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, Affymetrix (Santa Clara, CA) 에 의해 제공되는 것과 같은 게놈 마이크로칩을 사용하는 것이다. 제 2 시험법은, 특정 관심 단백질에 대해 특이적인 형광성-라벨링된 항체를 사용함으로써 원하는 노화 단백질의 실제적 발현을 조사하는 것이다.

광범위하고 철저한 연구를 통해, 헥사펩티드, 특히 헥사펩티드-11 이 피부 세포, 예컨대 섬유아세포 및 진피 돌기 세포에서 고유의 또는 스트레스-유도된 세포성 노화를 지연시키는데 효과적인 것으로 처음 밝혀졌다. 예를 들어, 연구에서 헥사펩티드가 특정한 중대 세포성 단백질 발현, 예컨대 SA-β-갈락토시다아제, ATM, 또는 p53 세포성 단백질 발현을 저해할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 헥사펩티드가 중요한 세포성 마커, 예컨대 DNA 수선 효소, Ogg1 의 발현을 증강시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 조성물의 총 중량을 기초로 하여 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 1 중량%의 헥사펩티드, 및 피부학적으로-허용가능한 담체를 함유하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 헥사펩티드는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90% 이상의 순도를 갖는 헥사펩티드-11 (Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro) 이다. 조성물은 피부 세포, 특히 섬유아세포, 각질세포 및 진피 돌기 세포에서 고유의 또는 스트레스-유도된 세포성 노화를 지연시키는데 효과적이다.

섬유아세포는 새로운 콜라겐 및 엘라스틴을 피부로 발현시키는데 책임이 있는, 피부의 진피 층에서 성장하는 세포이다. 각질세포는 피부 표피에서 성장하고 피부에서 각질층 및 지질의 형성에 책임이 있다. 또한, 진피 돌기 세포는 피부 진피에서 성장하고 모발 섬유의 발현에 책임이 있는 세포이다. 그러한 세포는 국소 처리가 이로운 영향을 미치는 지를 조사하기 위해 시험관내에서 공지된 조건 하에서 배양 디쉬에서 성장시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 국소 적용에 유용하고 피부 노화의 신호를 조절하는데 유용하며, 보다 특히 노화와 연계된 피부 텍스쳐에서 가시적이고/이거나 촉감적인 불연속에 유용하다. "피부 노화의 신호를 조절하는 것" 은 하나 이상의 그러한 신호를 예방적으로 조절하고/하거나 치료학적으로 조절하는 것을 포함한다 (유사하게, 피부 노화의 주어진 신호 (예를 들어, 선, 주름 또는 모공) 를 조절하는 것은 그러한 신호를 예방적으로 조절하고/하거나 치료학적으로 조절하는 것을 포함함). 본원에 사용된 바와 같이, 그러한 신호를 예방적으로 조절하는 것은, 피부 노화의 신호를 지연시키고, 최소화하고/하거나 예방하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 그러한 신호를 치료학적으로 조절하는 것은 피부 노화의 신호를 개선시키는 것, 예를 들어, 줄이는 것, 최소화하는 것 및/또는 눈에 띄지 않게 하는 것을 포함한다.

"피부 노화의 신호" 는, 피부 노화로 인한 어떤 다른 거시적 또는 미시적 결과 뿐만 아니라 모든 외부의 가시적 및 촉감적으로 인지할 수 있는 징후를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그러한 신호는 고유 인자 또는 외인자, 예를 들어, 생활 (chronological) 노화 및/또는 환경적 손상 (예를 들어, 햇빛, UV, 연기, 오존, 오염물질, 스트레스, 등) 에 의해 유도되거나 야기될 수 있다. 이들 신호는 하기와 같은 텍스쳐의 불연속이 발전되는 것을 포함하는 (이에 한정되지 않음) 과정으로부터 생성될 수 있다: 주름 (표면상 주름 및 거친 깊은 주름 포함), 피부선, 안면 인상 주름 (facial frown line), 표시선, 리티드 (rhytide), 광노화된 피부 (dermatoheliosis), 광손상, 조기 피부 노화, 균열, 범프, 피트, 큰 모공 (예를 들어, 부속기 구조와 연계된 것, 예컨대 땀샘관, 피지선 또는 모발 모낭), "오렌지 필 (orange peel)" 피부 외관, 건조함, 비늘화, 플레이크화 및/또는 기타 형태의 피부 불균질 또는 거칠기; 과도한 피부 오일 문제, 예컨대 피지, 오일, 얼굴 광의 과대생산, 파운데이션 브레이크쓰로우 (breakthrough); 비정상 박리 (또는 박리작용) 또는 비정상 표피 분화 (예컨대, 비정상 피부 턴오버), 예컨대 비늘화, 플레이크화, 케라토오스, 과케라틴화; 부적절한 피부 모이스쳐화 (또는 수화), 예컨대 피부 장벽 손상으로 인한 것, 환경적 건조함으로 인한 것; 피부 탄력의 손실 (기능적 피부 탄력의 손실 및/또는 불활성화), 예컨대 탄력섬유증, 처짐 (눈 영역 및 아래턱에서 부풀음 포함), 피부 견고함의 손실, 피부 타이트닝의 손실, 변형으로부터 피부 반동의 손실; 비-멜라닌성 피부 변색, 예컨대 눈밑 써클, 부스럼 (예를 들어, 주사비 (rosacea) 에 의한 고르지 못한 홍조), 창백함 (창백한 안색), 모세혈관확장증으로 인한 변색부분; 멜라닌-관련된 과색소침착된 (또는 고르지 못한 색소침착된) 피부 부위; 염증후 과색소침착, 예컨대 염증성 사건 이후 발생하는 것 (예를 들어, 여드름 병변, 안으로 파고드는 모발, 곤충/거미가 물은 자국 또는 자상, 스크래치, 컷, 상처, 찰과상 등); 위축증, 예컨대 노화 연계된 것 (이에 한정되지 않음), 스테로이드 사용 또는 곤충, 뱀 또는 박테리아성 독소의 사용, 예컨대 보툴리늄 독소; 피부 성분에서 다른 조직학적 또는 현미경으로 보이는 변경, 예컨대 기저 물질 (예컨대, 히아루론산, 글리코사미노글리칸 등), 콜라겐 분해 및 구조적 변경 또는 비정상 (예컨대, 각질층, 피부, 표피, 피부 관 시스템에서의 변화, 예컨대 모세혈관확장증); 공격에 반응하는 피부 신경계, 조직, 예컨대 가려움 또는 가려움증; 및 피하 조직에서의 변경 (예컨대, 피하 지방, 셀룰라이트, 근육, 섬유주, 격막 등), 특히 피부에 직접적인 것.

본 발명은, 피부 노화와 연계된 기전으로 인해 발생하는 상기 언급된 "피부 노화의 신호" 의 조절에 한정되는 것이 아니라, 각 기원 기전 신호의 조절을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, "피부 조건을 조절하는 것" 은 기원 기전의 그러한 각 신호의 조절을 포함하나 이로써 한정되지 않는다.

본 발명은, 피부 노화와 연계된 텍스쳐 불연속을 포함하는 포유동물 스킨 텍스쳐에서 가시적으로 및/또는 촉감적으로 불연속인 것을 치료학적으로 조절하는데 특히 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, 그러한 불연속을 치료학적으로 조절하는 것은 포유동물 피부의 텍스쳐에서 가시적이고/이거나 촉감적인 불연속을 개량하는 것, 예를 들어 축소하는 것, 최소화하는 것 및/또는 눈에 띄지 않게 하는 것을 포함하며, 이에 의해 개선된 피부 외관 및/또는 느낌, 예를 들어 보다 부드러워지고, 보다 평편해진 외관 및/또는 느낌이 제공된다. 피부 텍스쳐에서 그러한 가시적이고/이거나 촉감적인 불연속은, 피부 노화와 연계된 균열, 범프, 모공, 미세선, 주름, 스케일, 플레이크 및/또는 기타 형태의 텍스쳐 불균질 또는 거칠기를 포함한다. 예를 들어, 선 및/또는 주름의 길이, 깊이, 및/또는 기타 치수는 감소되고, 모공의 겉보기 직경이 감소되거나, 모공 오프닝에 매우 가까운 조직의 겉보기 높이가 피부 부속간의 그것에 근접하게 된다.

또한, 본 발명은 피부 노화와 연계된 텍스쳐 불연속을 포함하는, 포유동물 피부 텍스쳐에서 가시적이고/이거나 촉감적인 불연속을 예방적으로 조절하는데 특히 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, 그러한 불연속을 예방적으로 조절하는 것은 포유동물 피부의 텍스쳐에서 가시적이고/이거나 촉감적인 불연속을 지연시키고, 최소화하고/하거나 예방하는 것을 포함하며, 이에 의해 피부 외관 및/또는 느낌, 예를 들어 보다 부드럽고 보다 균질한 외관 및/또는 느낌의 개선이 제공된다.

필수 성분 및 임의 성분을 포함하는 본 발명의 조성물이 이하 본원에서 보다 상세히 기술된다.

또한, 본 발명의 조성물은 대머리 치료에 유용할 수 있다. Bahta AW 등은, 대머리 또는 대머리 진행 중인 개인으로부터 단리된 진피 돌기 세포가 대머리가 아닌 개인으로부터 단리된 진피 돌기 세포와 비교시 조기 노화의 진행된 상태인 것으로 밝혀졌음을 개시하고 있다. 문헌 [Bahta AW et al, J. Invest Dermatol 128(2009)1088-1094] 을 참조한다. 이들은 이들의 발견을 입증하기 위해 ATM 및 SA-β-갈락토시다아제의 측정을 사용하고 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 세포성 노화를 저해함으로써 대머리를 치료하는데 효과적일 수 있다.

필수 성분

펩티드

본 발명의 필수 성분은 생물학적 수단을 통해, 예컨대 발효를 통해 또는 보다 통상적인 방법, 예컨대 고체 상태 또는 또는 용액 상 합성 화학을 통해 단리된 펩티드이다. 보다 특히, 본 발명의 중요한 것은 헥사펩티드로서 총체적으로 공지되어 있는 6 개의 아미노산을 본질적으로 포함하는 펩티드이다. 헥사펩티드의 아미노산은, 자연-발생 아미노산 중 임의의 것일 수 있거나, 또는 비자연적 합성 과정을 통해 형성되는 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 염, 에스테르, 아미드, 에테르 등의 형성을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 방법에 의해 화학적으로 추가로 유도체합성될 수 있다.

또한, 펩티드는 펩티드의 피부로의 국소 침투를 증강시킬 수 있는 전달계로 혼입될 수 있다. 그러한 전달계는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 리포좀, 니아좀, 나노좀 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따라 바람직한 헥사펩티드는 헥사펩티드-11 로서 공지된, 이스트 발효물로부터 기원적으로 단리된 헥사펩티드이다 (화학 구조: Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro) [Lupo et al, Dermatol Therapy 2007].

헥사펩티드-11 의 구조를 하기에 구조적으로 나타낸다:

또한, 본 발명의 헥사펩티드-11 은 당업자에게 공지된 표준 방법을 통해 제조된 합성 펩티드로서 제공될 수 있다. 이는 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 90% 의 순도를 갖는다. 펩티드의 순도는, 당업자에게 공지된 다양한 방식, 예컨대 NMR, HPLC 또는 GC/MS 로 측정될 수 있다. 본 발명에서 가장 바람직한 것은 HPLC 에 의한 순도이다.

담체

본 발명의 또다른 필수 성분은 피부학적으로 허용가능한 담체이다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "피부학적으로 허용가능한 담체" 란, 피부에 국소 적용하는데 적합하고, 양호한 심미적 특성을 갖고, 본 발명의 활성성분 및 임의의 다른 성분과 양립될 수 있으며, 어떠한 적당하지 않은 안전성 또는 독성 염려를 야기하지 않을 것인 담체를 의미한다.

담체는 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 에멀젼 담체는 수중유, 유중수, 수중유중수, 실리콘중수중유 에멀젼을 포함하나 이에 한정되지 않으며 이들이 본원에서 유용하다. 이들 에멀젼은 폭넓은 점도 범위, 예를 들어 약 100 cps 내지 약 200,000 cps 를 가질 수 있다. 또한, 이들 에멀젼은 통상적 추진제를 사용하는 기계적 펌핑 용기 또는 가압 에어로졸 용기를 사용하여 스프레이 형태로 전달될 수 있다. 또한, 이들 담체는 무스 형태로 전달될 수 있다. 다른 적합한 국소 담체는 무수 액체 용매, 예컨대 오일, 알코올 및 실리콘 (예를 들어, 미네랄 오일, 에탄올, 이소프로판올, 디메티콘, 시클로메티콘 등); 수성-기재 단일 상 액체 용매 (예를 들어, 히드로알코올성 용매계); 및 이들 무수 및 수성-기재 단일 상 용매의 증점 버젼 (예를 들어, 적당한 검, 수지, 왁스, 폴리머, 염 등의 첨가에 의해 고체 또는 반-고체를 형성하기 위해 용매의 점도가 증가된 경우) 을 포함한다. 본 발명에 유용한 국소 담체계의 예는 하기 4 개의 참조문헌에서 기술되어 있다: "Sun Products Formulary" Cosmetics & Toiletries, vol. 105, pp. 122-139 (1990년 12월); "Sun Products Formulary", Cosmetics & Toiletries, vol. 102, pp. 117-136 (1987년 3월); U.S. Pat. No. 4,960,764 (Figueroa et al., 1990년 10월 2일); 및 U.S. Pat. No. 4,254,105 (Fukuda et al., 1981년 3월 3일).

본 발명의 담체는, 본 발명의 조성물의 약 50% 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 99%, 가장 바람직하게는 약 85% 내지 약 95%를 포함할 수 있다.

바람직한 미용적으로 및/또는 약학적으로 허용가능한 국소 담체는 히드로-알코올성 계 및 수중유 에멀젼을 포함한다. 담체가 히드로-알코올성 계인 경우, 담체는 약 0% 내지 약 99%의 에탄올, 이소프로판올, 또는 이의 혼합물, 및 약 1% 내지 약 99%의 물을 포함할 수 있다. 보다 바람직한 것은 약 5% 내지 약 60%의 에탄올, 이소프로판올, 또는 이의 혼합물, 및 약 40% 내지 약 95%의 물을 포함하는 담체이다. 특히 바람직한 것은, 약 20% 내지 약 50%의 에탄올, 이소프로판올, 또는 이의 혼합물, 및 약 50% 내지 약 80%의 물을 포함하는 담체이다. 담체가 수중유 에멀젼인 경우, 담체는 이들 에멀젼을 제조하기 위한 임의의 통상적인 부형제 성분을 포함할 수 있다. 적합한 담체는 하기에서 보다 상세히 논의되어 있다: U.S. Pat. No. 5,605,894 (Blank et al), 및, U.S. Pat. No. 5,681,852 ( Bissett).

임의 성분

본 발명의 조성물은 부가적인 피부 활성물질을 임의로 포함할 수 있다. 그러한 피부 활성물질의 비제한적 예는 비타민 B3 화합물, 예컨대 PCT 출원 WO 97/39733 (1997년 10월 30일, Oblong et al) 에서 기술된 것; 히드록시산, 예컨대 살리실산; 박리작용 또는 박리성 작용제 예컨대 쌍성이온 계면활성제; 썬스크린, 예컨대 2-에틸헥실-p-메톡시신남메이트, 4,4'-t-부틸 메톡시디벤조일-메탄, 옥토크릴렌, 페닐 벤즈이미다졸 술폰산; 썬블록, 예컨대 산화아연 및 이산화티탄; 소염제; 항산화제/라디칼 스캐빈저, 예컨대 토코페롤 및 이의 에스테르; 금속 킬레이터, 특히 철 킬레이터; 레티노이드, 예컨대 레티놀, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트, 레티닐 프로피오네이트, 및 레티날; N-아세틸-L-시스테인 및 이의 유도체; 히드록시산, 예컨대 글리콜산; 케토산, 예컨대 피루브산; 벤조푸란 유도체; 탈모제 (예를 들어, 술프히드릴 화합물); 피부 미백제 (예를 들어, 아르부틴, 코지산, 히드로퀴논, 아스코르브산 및 유도체, 예컨대 아스코르빌 포스페이트 염, 태반 추출물 등); 항-셀룰라이트제 (예를 들어, 카페인, 테오필린); 습윤제; 항-미생물제; 항-안드로겐; 및 피부 보호제를 포함한다. 또한, 상기 언급된 피부 활성물질 중 임의의 혼합물이 사용될 수 있다. 이들 활성물질은 의 U.S. Pat. No. 5,605,894 (Blank et al) 에 보다 상세히 설명되어 있다. 바람직한 피부 활성물질은 히드록시산, 예컨대 살리실산, 썬스크린, 항산화제 및 이의 혼합물을 포함한다.

또한, 다른 통상적인 피부 케어 제품 첨가제는 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 우레아, 구아니딘, 글리세롤, 페트롤라툼, 미네랄 오일, 당 에스테르 및 폴리에스테르, 폴리올레핀, 메틸 이소스테아레이트, 에틸 이소스테아레이트, 세틸 리시놀레이트, 이소노닐 이소노나노에이트, 이소헥사데칸, 라놀린, 라놀린 에스테르, 콜레스테롤, 피롤리돈 카르복실산/염 (PCA), 트리메틸 글리신 (베테인), 트라넥삼산, 아미노산 (예를 들어, 세린, 알라닌, 트레오닌, 히스티딘) 및/또는 이의 염, 판테놀 및 이의 유도체, 콜라겐, 히아루론산, 엘라스틴, 히드롤리세이트, 프리므로즈 오일, 호호바 오일, 표피 성장 인자, 대두 사포닌, 무코폴리사카라이드, 및 이의 혼합물이 사용될 수 있다. 다른 적합한 첨가제 또는 피부 활성물질은 PCT 출원 WO 97/39733 (1997년 10월 30일, Oblong et al.) 에 논의되어 있다.

기타 성분

또한, 제형은 담체에 따라, 임의 성분 또는 제형의 의도된 사용에 따라 선택될 수 있는 기타 성분을 포함할 수 있다. 추가 성분은 항산화제 (예컨대, BHT); 에멀젼 안정화제 (예컨대, 카보머); 보존제 (예컨대, 페녹시에탄올); 향료 (예컨대, 피넨); 습윤제 (예컨대, 글리세린); 방수제 (예컨대, 폼블린 (Fomblin) 퍼플루오르에테르); 수용성 필름 형성제 (예컨대, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 유용성 필름 형성제 (예컨대, 수소화된 C-9 수지); 모이스쳐라이징제 (예컨대, 콜레스테롤); 양이온성 폴리머 (예컨대, Polyquaternium-10); 음이온성 폴리머 (예컨대, 잔탄 검); 비타민 (예컨대, 토코페롤); 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 조성물은 하나 이상의 추가의 활성 성분을 포함할 수 있고, 그 자체로 미용 또는 약학 조성물일 수 있다. 유용한 활성물질의 예는 노화 스팟, 케라토오스 및 주름을 제거하거나 개선시키는 것, 무통증, 무감각증, 항-여드름제, 항-박테리아제, 항-진균제, 항바이러스제, 항-비듬제, 항-피부염제, 항소양제, 구토억제제, 항-과각질용해제, 항-피부건조제, 발한억제제, 항건선제, 지루성 방지제, 항-노화 작용제, 항-주름제, 항히스타민제, 썬스크린제, 색소제거제, 상처-치유제, 소염제, 태닝제 또는 호르몬을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 제형의 특히 바람직한 구현예는 항-노화 제품으로서 사용되는 피부 케어 로션 또는 크림이다. 이러한 목적을 위해, 본 제형은 모이스쳐라이져, 연화제 또는 습윤제인 작용제와 조합된다. 유용한 조합의 예로는 오일, 지방, 왁스, 에스테르, 지방산 알코올, 지방산 에톡실레이트, 글리콜, 당, 히아루론산 및 히아루로네이트, 디메티콘, 시클로메티콘 등이 있다. 추가의 예는 International Cosmetics Ingredient Dictionary CTFA (10th Edition, 2004) 에 나타난 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 피부에 대한 에너지 전달을 고려하여, 케라틴성 조직으로, 동시에 및/또는 순차적으로 (예를 들어, 10 분 이내) 국소 조성물의 적용으로, 전달 증강 장치를 통해, 본 발명의 필수 성분의 효과를 증강시킨다. 에너지 전달 장치는 다양한 형태로 에너지를 전달할 수 있으며, 빛, 열, 소리 (초음파 소리 포함), 자성 에너지, 전자기 에너지 (무선주파수 및 마이크로웨이브 포함), 기계적 에너지 (박리 또는 미세연마술 장치), 및 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

조성물의 제조

본 발명의 조성물은 통상적인 방법, 예컨대 국소 조성물을 제조하는 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 일반적으로 제조된다. 그러한 방법은, 상대적으로 균일한 상태로, 가열, 냉각, 진공 적용 등의 존재 또는 부재 하에, 하나 이상의 단계로 성분을 혼합하는 것을 전형적으로 포함한다.

피부 상태를 조절하는 방법

피부 상태를 조절하는 것은, 본 발명의 조성물의 안전하고 효과적인 양을 피부에 국소적으로 적용하는 것을 포함한다. 적용되는 조성물의 양, 적용 빈도 및 사용 기간은 주어진 조성물의 펩티드 및/또는 다른 성분의 수준 및 원하는 조절 수준, 예를 들어 대상체에 존재하는 피부 노화 수준의 중증도 및 추가의 피부 노화 속도에 폭넓게 의존적일 것이다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 피부에 만성적으로 적용된다. "만성적 국소 적용" 이란, 대상체의 수명 동안 장기간에 걸쳐, 바람직하게는 약 1 주 이상의 기간, 보다 바람직하게는 약 1 개월 이상의 기간, 심지어 보다 바람직하게는 약 3 개월 이상 동안, 심지어 보다 바람직하게는 약 6 개월 이상 동안, 여전히 보다 바람직하게는 약 1 년 이상 동안 조성물을 지속적으로 국소 적용하는 것을 의미한다. 사용의 다양한 최대 기간 후 (예를 들어, 5년, 10년 또는 20년) 이점을 수득할 수 있는데, 대상체의 일생에 걸쳐 지속적으로 만성 적용하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 적용은 그러한 확장된 기간에 걸쳐 1 일 당 약 1 회로 적용할 수 있으나, 적용율은 1 주 당 약 1 회 초과 내지 1 일 당 약 3 회 이상으로 다양할 수 있다.

본 발명의 조성물의 양의 폭넓은 범위가 피부 외관 및/또는 느낌 이점을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 각 적용 당 적용되는 본 조성물의 양 (조성물mg/피부㎠) 은, 약 0.1 mg/㎠ 내지 약 10 mg/㎠ 이다. 특히 유용한 적용 양은 약 2 mg/㎠ 이다.

피부 상태를 조절하는 것은 바람직하게는, 피부 로션, 크림, 겔, 에멀젼, 스프레이, 컨디셔너, 화장품, 립스틱, 파운데이션, 네일 폴리쉬, 또는 몇몇 에스테틱, 예방적, 치료학적 또는 다른 이점을 위해 피부에 남겨지도록 의도되는 것 (즉, "leave-on" 조성물) 의 형태로 적용됨으로써 실시된다. 조성물을 피부에 적용한 후, 바람직하게는 피부 상에서 약 15 분 이상, 보다 바람직하게는 약 30 분 이상, 심지어 보다 바람직하게는 약 1 시간 이상, 가장 바람직하게는 수 시간 이상, 예를 들어 약 12 시간 이하의 기간 동안 피부에 남겨진다.

얼굴, 모발 및/또는 손발톱의 외부 부분의 임의의 부분은 예를 들어 얼굴, 입술, 언더-아이 영역, 눈꺼풀, 두피, 목, 토르소, 팔, 손, 다리, 손톱, 발톱, 두발, 속눈썹, 눈썹 등은 처리될 수 있다.

피부의 연속적인 노출을 보장하는 또다른 접근법은, 예를 들어 얼굴에 적용되는 패치의 사용에 의해 헥사펩티드를 적용하는 것이다. 그러한 접근법은 보다 집중적인 처리를 필요로 하는 문제 피부 영역에 특히 유용하다. 패치는 폐쇄적, 반-폐쇄적 또는 비-폐쇄적일 수 있다. 펩티드 조성물은 패치의 적용 전에 피부에 적용되거나 패치 내에 함유될 수 있다. 또한, 패치는 추가의 활성물질, 에컨대 발열 반응을 위한 화학적 개시제, 예컨대 PCT 출원 WO 9701313 (Burkett et al) 에서 기술된 것을 포함할 수 있다. 패치는 바람직하게는 약 15 분 이상, 보다 바람직하게는 약 30 분 이상, 심지어 보다 바람직하게는 약 1 시간 이상, 가장 바람직하게는 나이트 요법 형태로 밤새 피부에 남겨진다.

본 발명의 조성물을 적용하기 위한 또다른 접근법은, 헹궈내는 (rinse-off) 조성물을 통한 것이며, 예컨대 샴푸, 컨디셔너, 바디 워시, 훼이셜 스크럽, 훼이셜 필 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 기술하고 본 발명의 범주 내에서 구현예를 입증한다. 하기 실시예는 본 발명의 본 발명을 한정하고자 함이 아니며, 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 제공된 것이며, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않는 이의 많은 변형이 가능하다. 본원에 사용되는 모든 % 및 비는 총 조성물의 중량 기준이고 모든 측정은 달리 명시되지 않는 한 25℃ 에서 측정한 것이다.

실시예

실시예 1. 발효를 통해 사카로마이세스 세레비시아로부터 헥사펩티드의 단리

이스트 (사카로마이세스 세레비시아) 를 문헌 [Jazwinski SM. Methods in Enzymology 182(1990)154-174] 의 개요에 나타낸 조건에 따라 성장시켰다. 이들 발효 과정의 완료시, 이스트를 여과로 단리하고 PBS 중에서 재현탁시켰다. 미생물을 미세유동화기를 통해 혼합물을 흘러보냄으로써 파열시켜, 파열된 이스트 세포 및 세포질 내용물의 혼합물을 제공하였다. 대체로 세포벽 성분을 포함하는 용해되지 않은 성분을 여과에 의해 제거시켜, 다른 성분 중에서 펩티드, 올리고펩티드, 당 및 중합성 당을 함유하는 수용성 물질의 혼합물을 제공하였다.

생성된 이스트 추출물을 300 달톤에서 얼마 안되는 분자량 컷오프 여과막을 사용하여 접선 플로우 여과를 사용하여 분자량 분포에 대해 우선 분획화하였다. 생성된 저분자량 분획을 하기 조건을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography) 를 사용하여 추가로 분획화하였다:

컬럼 : C18 (1.0 X 250 mm),

이동상 (Mobile Phase): 70% 아세토니트릴 중의 0.0075% 트리플루오로아세트산 및 물 중의 0.1% 트리플루오로아세트산 혼합물의 5% 내지 80%.

크로마토그래피 컬럼으로부터 취한 분획을 단리하고 가장 큰 분획의 성분을 농축시켜, 헥사펩티드-11 (Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro) 을 함유하는 분획을 제공하고, 구조를 Erdman Degradation 를 통해 확인하여 아미노산 서열을 결정하였다.

실시예 2. 화학적 합성을 통합 헥사펩티드의 단리

또한, 실시예 1 에 기술된 헥사펩티드를 당업자에게 익히 공지되어 있는 고체 상태 펩티드 합성 기술을 사용하여 합성하였다. 고체 상태 합성을 통해 합성된 펩티드를 HPLC 크로마토그래피에 의해 측정시 95% 초과의 순도로 단리하였다.

실시예 3. SA -β- Gal 발현에 의해 측정된 고유-노화 진피 섬유아세포에서의 지연된 노화

실시예 2 로부터 단리된 펩티드를 사용하여, 일련의 집단 배가를 통해 노화된 진피 섬유아세포에서 노화를 지연시키는 펩티드의 능력을 검사하였다.

섬유아세포 세포 배양

인간 신생아 섬유아세포를 1차 배양 (계대 1) 후 수득하고 3 ml/섬유아세포 성장 배지 (Fibroblast Growth Media; FGM) 플라스크에서 T-75 플라스크 세트로 시딩하고 37+2℃ 및 5+1% C0₂ 에서 성장시켰다. 세포를 6 계대를 통해 확대하였다 (하나의 계대는, 플라스크가 합류될 때까지 세포를 성장시키고 세포를 1:2 로 나누는 것으로 정의되며, 따라서 1 계대는 대략 1 집단 배가에 등가임). 6번째 계대 후, 섬유아세포를 상이한 처리 군으로 나누고 계대 18 을 통해 다양한 시험 물질로 처리하였다. 계대 18 후, 섬유아세포의 일부를 사용하여 노화 관련-β-갈락토시다아제 (Senescence Associated-β-Galactosidase; SA-β-Gal) 에서의 변화를 검정하면서, 잔류하는 섬유아세포를 시험 물질의 부재 하에서 추가의 주 (대략 2 추가의 계대) 동안 배양하였다.

SA -β- Gal 염색

염색 전에, 섬유아세포를 PBS 로 1 회 세척한 후, 고정 용액 (PBS 중에서 0.2% 글루타르알데히드 및 2% 포름알데히드) 으로 대략 6 분 동안 고정하였다. 고정 후, 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, 염색 용액 (150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 40 mM 시트르산 (pH 6.0), 12 mM NaP0₃, 5 mM 칼륨 페로시아나이드, 5 mM 칼륨 페리시아나이드, 및 400 μg/ml X-gal) 을 첨가하였다. 이어서, 세포를 비-C0₂ 인큐베이터에서 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 염색 용액을 제거하고 PBS 로 대체하였다. 이어서, 세포를 현미경 사진을 찍고 각 필드에서 염색된 세포 (SA-β-Gal 양성) 의 수를 계수하였다.

검정 결과를 도 1 에 제시하였다. 이들 결과는, 18 집단 배가 후, 처리되지 않은 세포 중에서 SA-β-Gal 의 발현이 0.5 또는 1.0% 헥사펩티드 처리에서 나타낸 것보다 통계적으로 높았음을 나타낸다. 이는, 상기 헥사펩티드가 이들 고유-노화 진피 섬유아세포에서 노화의 온셋을 지연시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 헥사펩티드의 제거 1 주 후, SA-β-Gal 의 발현은 1% 처리 (펩티드 제거 1 주 후 아직 정상으로 돌아오지 않은 것이 증가한 것으로 나타남) 를 제외한 모든 처리에서 정상으로 돌아왔다. 이러한 데이타는, 노화를 지연시키는 펩티드의 영향이 영구적이지 않고 배양 배지로부터 펩티드의 제거에 따라 역행될 수 있음을 입증하는 것이다.

실시예 4. ATM 및 p53 발현에 의해 측정된 표피 각질 세포에서 지연된 H ₂ O ₂ 스트레스-유도된 조기 노화

실시예 2 로부터 헥사펩티드를 사용하여 과산화수소 스트레스-유도된 조기 노화를 나타내는 표피 각질세포에서 노화 지연을 입증하였다.

인간 각질세포 세포 배양

인간 표피 각질세포를 배양 플라스크에 시딩하고, 제조자에 의해 권고된 바와 같이 혈청-미함유 Epilife 배지를 사용하여 37±2℃ 및 5+1% C0₂ 에서 성장시켰다. 세포의 충분한 수가 성장했을 때, 이들을 96-웰 플레이트로 이동시키고 최소 24 시간 동안 배양하여, 세포를 웰 플레이트에 부착시켰다. 개시 24-시간 인큐베이션 후, 배지를 변화시켜 임의의 비-부착 세포를 제거하고, 합류할 때까지 잔류하는 세포를 배양하고, 매 48 내지 72 시간 필요에 따라 배지를 변경하였다.

시험 물질로 각질세포 의 처리

H ₂ O ₂ 처리

각질세포를 H₂O₂ 로 처리함으로써 조기 세포성 노화를 유도하였다. H₂O₂ 처리를 위해, 세포 배양 배지를 150 μM 의 H₂O₂ 로 보충된 포스페이트 완충된 염수 (PBS) 로 대체하였다. 세포를 H₂O₂ 용액 중에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 이들을 PBS 로 1 회 세척한 후, 시험 물질의 존재 또는 부재 하에서 신선한 배지를 세포에 적용하였다. 이들 수준에서, H₂O₂ 처리는 세포 생존력 상에서 영향을 미치는 것으로 관찰되지 않았다.

ATM / p53 발현의 분석

ATM 및 p53 발현의 양에서의 상대적인 변화를 ELISA 기초한 방법을 사용하여 각질세포에서 측정하였다. 처리 기간 마지막에, 세포 배양 배지를 제거하고 100 ㎕/얼음 냉각 메탄올의 웰로 대체하여 세포를 고정하였다. 고정 후, 세포를 PBS 로 2 회 세척하고, 0.5% H₂O₂ 중에서 인큐베이션하여 임의의 내인성 퍼옥시다아제 활성을 켄칭한 후, PBS 중에서 2 회 이상 세척하였다. 세척 후, 300 ㎕ 의 블로킹 용액 (PBS 중에서 1.5% 정상 염소 혈청) 을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 블로킹 후, 항-ATM 또는 항-p53 를 함유하는 신선한 블로킹 용액의 100 ㎕ 를 첨가하고, 웰 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 웰을 0.05% Tween 20 중에서 보충된 PBS 로 3 회 세척 후, HRP-콘쥬게이션된 항-염소 2차 항체를 함유하는 블로킹 용액 100 ㎕ 을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션 한 다음, 웰을 0.05% Tween 20 으로 보충된 PBS 로 3 회 세척하였다. 최종 세척 후, HRP 기질 용액 (0.4 mg/ml o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드, 0.4 mg/ml 우레아 과산화수소 및 0.5 M 포스페이트-시트레이트 [pH 5.0]) 200 ㎕ 를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 15 분 내지 30 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 색 발전의 충분한 수준이 달성된 후, 플레이트를 플레이트 판독시를 사용하여 460 nm 에서 판독하였다. 검정 결과를 도 2 및 3 에 제시하였다.

데이타는, 조기 노화를 나타내는 표피 각질세포에 헥사펩티드를 국소 적용하는 것이, ATM 및 p53 단백질의 발현에서의 감소에 의해 측정시 조기 노화를 나타내는 비처리된 각질세포와 비교시 1% 처리 수준에서 통계학적으로 노화를 지연시킬 수 있음을 입증한다.

실시예 5. SA-β- Gal 발현에 의해 측정된 진피 돌기 세포에서 지연된 UV 스트레스-유도된 조기 노화

실시예 2 로부터 헥사펩티드를 사용하여, UV 방사로 처리된 조기 노화로 유도된 진피 돌기 세포에서 노화를 지연시키는 능력을 입증하였다.

피부 돌기 세포 배양

인간 진피 돌기 세포를 진피 돌기세포 성장 배지 (Dermal Papillae Growth Medium; DPGM) 중에서 12 웰 플레이트에 시딩하고 합류될 때까지 37+2℃ 및 5+1% C0₂에서 성장시키고, 배지를 매 48 내지 72 시간 마다 필요시 변경하였다. 일단 세포가 합류되면, 세포 배양 배지를 PBS 로 대체하고, 세포를 20 mJ/cm UVB 로 조사시켰다. UAB 조사 후, PBS 를 제거하고 다양한 시험 물질로 보충된 세포 배양 배지로 대체하였다. 보충되지 않은 DPGM 를 처리되지 않은 대조군으로 사용하였다. 세포의 하나의 세트를 UVB 에 노출하지 않고 비-UVB 처리된 대조군으로 제공하였다. 배지의 첨가 후, 세포의 세트를 48 시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 기간 마지막에, 세포를 수득하고 SA-β-Gal 활성에서의 변화에 대해 검정하였다.

제 2 연구 세트에서, 진피 돌기 세포를 성장시키고 상기 기술된 바와 같이 플레이팅하였다. 세포의 이러한 제 2 세트를 동일한 시험 물질로 처리하고, 이들을 단지 UAB 조사에는 노출시키지 않았다. 이러한 연구에서 측정된 마커 상에서 시험 물질 단독의 영향을 결정하기 위해 이를 수행하였다.

SA -β- 갈락토시다아제 검정

48 시간 인큐베이션 후, 세포를 PBS 로 세척하고 고정 완충제 (PBS 중에서 0.2% 글루타르알데히드 및 2% 포름알데히드) 중에서 6-7 분 동안 간단하게 고정하였다. 이어서, 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, 염색 용액을 웰에 첨가하고 (5 mM 칼륨 페리시아나이드, 5 mM 칼륨 페로시아나이드, 1 mg/ml X-gal, 포스페이트 완충제 중에서, pH 6.0), 웰 플레이트를 밤새 37℃ 에서 인큐베이션하였다 (C0₂ 부재). 다음날, 웰을 현미경으로 조사하고 필드 당 염색된 세포의 수를 정량화할 수 있도록 사진을 찍었다. 각각의 필드에서 양성 염색 세포의 수를 계수하였다. 각 처리에 대한 평균 세포 계수치를 ANOVA 를 사용하여 비교하였다.

스트레스-유도된 조기 노화를 나타내는 진피 돌기 세포에서 노화 지연에 대한 검정 결과를 도 4 에 나타냈다. 이들 결과는, UV 방사에 대한 진피 돌기 세포의 노출이, 조기 노화하는 세포를 나타내는 SA-β-Gal 발현에서의 증가를 야기한다는 것을 입증한다. 0.5 및 1.0%의 헥사펩티드의 적용은, 처리된 세포에서 지연된 노화를 입증하는 SA-β-Gal 발현에서의 통계학적으로 현저함 감소를 입증한다.

실시예 6. DNA 수선 효소 Ogg1 의 세포성 발현 상에서 헥사펩티드의 영향

하기 실시예는, 세포가 노화로 들어가기 전에 중대한 DNA 손상을 수선함으로써 DNA-손상된 세포에서의 노화를 지연시키는 것으로 공지된 DNA 수선 효소인 Ogg1 의 발현을 상위조절하는, 실시예 2 로부터 헥사펩티드의 능력을 입증한다.

인간 섬유아세포 세포 배양

인간 섬유아세포를 배양 플라스크에 시딩하고 FGM 을 사용하여 37±2℃ 및 5+1% C0₂ 에서 성장시켰다. 세포의 충분한 수를 성장시켰을 때, 이들을 24-웰 플레이트에 이동시키고 최소 24 시간 동안 배양하여, 세포를 웰 플레이트에 부착시켰다. 이후, 세포를 합류될 때까지 성장시키고, 배지를 매 48 내지 72 시간 마다 변경하였다.

섬유아세포의 처리

시험 물질을 FGM 중에서 제조하였다. 이후, 배지를 배양 플레이트로부터 제거하고 시험 물질로 보충된 배지 0.5 ml 로 대체하고, 각각의 처리를 삼중으로 시험하였다. FGM 단독을 처리되지 않은 대조군으로서 제공하였다. 세포 배양 배지의 적용 후, 플레이트를 24 시간 동안 37±2℃ 및 5±1%C0₂ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 마지막에, 배양 배지를 제거하고 세포를 포스페이트 완충된 염수로 1 회 세척하였다. 세척물을 제거한 후, 200 ㎕ 의 용균 완충제 (1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 10 mM NaF, 150 mM NaCL, 20 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM DTT, 10 μg/ml 루펩틴, 10 μg/ml 펩스타틴, 3 μg/ml 아프로티닌을 포스페이트 완충제 염수 중에서 제조함) 를 웰에 첨가하고, 이들을 록킹 플랫폼 상에서 15 분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하여 세포를 용균시켰다. 이어서, 세포 용균물을 1.5 ml 튜브로 이동시키고 5 분 동안 최대 속도 (4℃) 로 원심분리하였다. 상청액을 보유시키고 -75 ℃ 에서 저장하였다. 상청액의 단백질 농도를 BCA 단백질 검정을 사용하여 측정하였다.

OGG1 : 세포 용균물 및 면역검출의 미세여과 블롯팅

각 세포 용균물 샘플에 대해서, 10 μg 의 단백질을 100 ㎕ 의 Tris 완충된 염수 (TBS: 20 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl) 와 조합하였다. PVDF 막을 메탄올 중에서 예비습윤화하고, TBS 로 평형화시키고 Bio-Dot 미세여과 장치로 어셈블리하였다. 어셈블리 후, TBS 100 ㎕ 를 Bio-Dot 중에서 웰에 첨가하고 모든 웰을 통해 적합한 플로우를 보장하도록 진공을 적용하였다. 다음으로, 상기 제조된 각각의 세포 용균물 샘플을 장치에서 웰을 할당하고 샘플을 적당한 웰에 적용시켰다. 샘플 모두를 첨가한 후, 장치에 진공을 적용하여, 막을 통해 샘플의 플루이드를 빼내, 막에 부착된 단백질을 남겨두었다. TBS 를 샘플로 할당되지 않은 웰에 첨가하여, 막이 과정 동안 건조되지 않는 것을 보장하였다. 블롯팅 과정 마지막에, 막을 Bio-Dot 장치로부터 제거하고, TBS 중에서 5-10 분 동안 세척한 다음 블로킹 용액 (1% 무지방 우유 분말을 갖는 TBS) 에 두고, 록킹 플랫폼 상에서 실온에서 1 시간 이상 동안 인큐베이션하였다.

항체 인큐베이션 및 검출

블로킹 후, 막을 TBST (0.1% Tween-20 을 갖는 TBS) 20 ml 및 항-Ogg1 항체의 적절한 희석액을 갖는 무지방 우유 0.1% 로 이동시키고 록킹 플랫폼 상에서 4℃ 에서 밤새 인큐베이션하였따. 이러한 인큐베이션 후, 막을 TBST 중에서 3 회 세척하였다 (15 분 동안 lx 및 5 분 동안 2x). 이어서, 2차 항체 (플루오로포어로 콘쥬게이션됨) 를 0.1% 무지방 분말 우유를 갖는 TBST 15 ml 중에서 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 다음 TBS 로 3 회 세척하였다(1x 15 분, 2x 5 분).

최종 세척 후, 막을 BioRad Molecular Imager FX 에 두고 플루오로포어에 대해 적절한 여기 레이져 및 방출 여과기 조합을 사용하여 스캔하였다. 이어서, 스캐너에 의해 생산된 이미지를 ImageJ 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

계산

이미지 분석

형광 세기 측정치를 상대적 형광 유닛 (Relative Fluorescence Units; RFU) 으로 표시하였다. 이후, 각 처리에 대한 평균 RFU 값을 계산하고 처리를 한방향 ANOVA 를 사용하여 비교하였다. Ogg1 검정 결과를 도 5 에 나타냈다.

이러한 검정 결과는, 헥사펩티드가 Ogg1 의 발현이 0.1% 처리 수준에서 통계학적으로 증가될 수 있음을 입증한다. 이러한 연구로부터의 결과는, 헥사펩티드가 세포에서 중요한 DNA 수선 효소를 증가시킴으로써 세포성 노화를 지연시킬 수 있음을 입증한다. Ogg1 은 손상된 DNA 에서 산화된 구아닌 잔기를 대체할 수 있고, 이에 의해 DNA 손상의 이러한 특정 형태로 인해 노화의 온셋을 지연시킬 수 있다.

실시예 7. 헥사펩티드를 갖는 수중유 에멀젼

실시예 2 로부터의 헥사펩티드-11 을 하기 제형 및 과정을 사용하여 수중유 에멀젼으로 제형화하였다:

수중유 에멀젼

헥사펩티드 포함

절차:

1. 상 A 를 조합하고 75℃ 로 가열함. 균일해질 때까지 혼합함.

2. 상 B 를 조합하고 75℃ 로 가열함. 균일해질 때까지 혼합함.

3. 느린 혼합으로 상 B 를 상 A 에 첨가함. 20 분 동안 혼합함.

4. 프리믹스 상 C 를 첨가하고 균일해질 때까지 혼합함. 가열 중지.

5. 인 사이드 케틀 (In side kettle) 프리믹스 상 D 및 40℃ 미만에서 배치에 첨가함. 균일해질 때까지 혼합함.

6. Mikrokill COS 및 상 E 의 향료를 첨가하고, 균일해질 때까지 혼합함.

실시예 8. 헥사펩티드를 함유하는 유중수 에멀젼

실시예 2 로부터의 헥사펩티드를 하기 제형 및 절차를 사용하여 유중수 에멀젼으로 제형화하였다:

유중수 에멀젼

헥사펩티드 포함

절차:

1. 상 A 의 성분을 모두 함께 혼합함.

2. 나타낸 순서로 상 B 성분을 조합하고, 다음 성분을 첨가하기 전에 각 성분이 균질해질 때까지 철저히 혼합함.

3. 상 A 를 상 B 로 양호하게 혼합 하에 천천히 첨가함. 점차적으로 교반을 높은 쉬어로 증가시켜 혼합물을 증점시킴. 교반을 10 동안 계속함.

실시예 9. 헥사펩티드 리포좀을 함유하는 아이겔

실시예 2 로부터 헥사펩티드를 리포좀 조성물로 캡슐화한 다음, 캡슐화된 헥사펩티드를 하기 제형 및 과정을 사용하여 아이겔 조성물로 혼입하였다:

아이겔

헥사펩티드 리포좀 포함

절차:

1. 물 중에서 50℃ 에서 Carbopol Ultrez 21 을 분산시키고 Keltrol CG-SFT 를 첨가함. 균일해질 때까지 혼합함.

2. 부틸렌 글리콜, Mikrokill COS, AMP, EDTA 및 실리콘 193 을 첨가함. 균일해질 때까지 혼합함.

3. 헥사펩티드 리포좀을 40℃ 에서 강한 교반하에 첨가함. 균일해질 때까지 혼합함.

5. 필요한 경우 pH 를 5.5 로 조정함.

실시예 10. 헥사펩티드의 캡슐화

실시예 2 로부터 헥사펩티드 추출물을 US Pat No. 2003/0198682 Al 에서 개요된 기술을 사용하여 폴리머 매트릭스로 캡슐화하였다.

실시예 11. 립스틱 조성물

실시예 2 의 헥사펩티드를 하기 제형 및 과정을 이용하여 립스틱으로 제형화하였다:

립스틱

헥사펩티드 포함

절차:

1. 왁스, 오일 및 보존제 (상 A) 를 조합하고 83 내지 87℃ 로 가열함.

2. 온도를 유지하고 균질해질 때까지 교반함.

3. 온도를 75 내지 80℃ 로 감소시키고, 상 B 를 첨가하고; 균질해질 때까지 혼합함.

4. 펄, 헥사펩티드 및 아스코르빌 팔미테이트 (상 C) 를 첨가함.

5. 몰드에 부음.

실시예 12. 토너 조성물

실시예 2 의 헥사펩티드를 하기 제형 및 과정에 따라 수성 알코올 토닉으로 제형화하였다:

토너

헥사펩티드 포함

절차:

물로 충전하고 Betafin BP-20, 및 헥사펩티드를 첨가함. 균일해질 때까지 혼합함.

Witch Hazel 및 MikrokiU COS 을 첨가하고, 균일해질 때까지 혼합함.

실시예 13. 바디 워시 조성물

실시예 2 의 헥사펩티드를 하기 제형 및 과정을 이용하여 바디 워시로 제형화하였다:

바디 워시

헥사펩티드 포함

절차:

1. 물을 70℃ 로 가열하고 이나트륨 EDTA, 글리세린을 첨가하고, 균일해질 때까지 혼합함.

2. 온도를 70℃ 초과로 유지하고 Standapol WAQ Special, Standapol ES-2, Cerasynt IP, Cocamide MEA, Velvetex BA-35 을 첨가하고, 균일해질 때까지 혼합함.

3. 45℃ 로 냉각하고 Mikrokill COS 및 헥사펩티드를 첨가함.

4. 균질해질 때까지 혼합함.

실시예 14. 헥사펩티드의 발효

실시예 2 로부터의 헥사펩티드를 이스트 사카로마이세스 세레비시아를 함유하는 발효 배지의 부분으로서 포함시켰다.

실시예 2 로부터의 펩티드의 샘플을 Red Star Yeast (Milwaukee, WI) 로부터 입수되는 빵 이스트 성장 배지의 수성 혼합물에 두었다. 배지를 활성 사카로마이세스 세레비시아 이스트 배양액 (Red Star 로부터 입수) 으로 접종하고 혼합물을 제어된 호기성 조건 하에서 발효시켜, US 특허 2,239,345 에서 기술된 바와 같은 스트레스 조건을 사용하여 수득되는 생 이스트 세포 유도체 (Live Yeast Cell Derivative; LYCD) 를 제공하였다.

실시예 15. 서브마이크론 에멀젼 농축액

이 실시예는 실시예 2 에 기술된 바와 같이 제조된 헥사펩티드를 함유하는 서브마이크론 에멀젼 농축액을 예시하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> ARCH PERSONAL CARE PRODUCTS, L.P. <120> A COMPOSITION FOR DELAYING CELLULAR SENESCENCE <130> LIP1109 <140> WO 2011/028673 A2 <141> 2010-08-31 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID 1 is hexapeptide-11 <400> 1 Phe Val Ala Pro Phe Pro 1 5

Claims

조성물의 총 중량을 기초로 하여 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%의 헥사펩티드-11 (Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro), 및 물, 오일, 알코올, 실리콘 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 펩티드용의 피부학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 세포성 노화를 지연시키기 위한 조성물.
제 1 항에 있어서, 오일이 미네랄 오일, 식물 오일 및 이의 조합으로부터 선택되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 담체가 유중수, 수중유, 수중유중수 및 실리콘중수중유 에멀젼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 에멀젼인 조성물.
제 1 항에 있어서, 펩티드가 합성적으로 유래된 것이거나 발효 공정의 성분인 조성물.
제 2 항에 있어서, 펩티드가 합성 펩티드인 조성물.
제 1 항에 있어서, 헥사펩티드가 조성물의 총 중량을 기초로 하여 약 0.01% 내지 약 2 중량%의 농도로 존재하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 헥사펩티드가 50% 이상의 순도인 조성물.
제 7 항에 있어서, 헥사펩티드가 75% 이상의 순도인 조성물.
제 8 항에 있어서, 헥사펩티드가 90% 이상의 순도인 조성물.
제 1 항에 있어서, 헥사펩티드가 리포좀, 니아좀, 나노좀 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 비히클 중에서 캡슐화되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 히드록실산, 박피제 또는 박리제, 썬스크린, 썬블록, 소염제, 항산화제/라디칼 스캐빈져, 금속 킬레이터, 케토산, 탈모제, 피부 미백제, 항-셀룰라이트제, 모이스쳐라이징제, 항-미생물제; 항-안드로겐, 피부 보호물질, 에멀젼 안정화제, 보존제, 향료, 습윤제, 방수제, 수용성 필름 형성제, 유용성 필름 형성제, 양이온성 폴리머, 비타민 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, SA-β-갈락토시다아제, ATM 또는 p53 세포성 단백질 발현을 저해하는데 효과적인 조성물.
제 1 항에 있어서, DNA 수선 효소, Ogg1 의 발현을 증강시키는데 효과적인 조성물.
피부 세포를, 조성물의 총 중량을 기초로 하여 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%의 헥사펩티드-11, 및 물, 오일, 알코올, 실리콘 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드용의 피부학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 피부 세포에서 노화를 지연시키는 방법.
제 14 항에 있어서, 피부 세포가 섬유아세포, 각질세포 또는 진피 돌기 세포인 방법.
제 14 항에 있어서, 담체가 유중수, 수중유, 수중유중수 및 실리콘중수중유 에멀젼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 에멀젼인 방법.
제 14 항에 있어서, 헥사펩티드가 조성물의 총 중량을 기초로 하여 0.01 중량% 내지 약 2 중량%의 농도로 존재하는 방법.
제 14 항에 있어서, 헥사펩티드가 50% 이상의 순도인 방법.
제 14 항에 있어서, 헥사펩티드가 리포좀, 니아좀, 나노좀 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 비히클 중에서 캡슐화되는 방법.
제 14 항에 있어서, 피부 세포에서의 고유의 또는 스트레스-유도된 세포성 노화의 지연이, SA-β-갈락토시다아제의 발현, ATM 또는 p53 단백질의 억제, 또는 세포 생존력 검정에 의해 측정된 바와 같은 세포의 생존력 증가를 통해 측정되는 방법.