CN102575276A - 延缓细胞衰老的组合物 - Google Patents

Abstract

此处披露了用于延缓细胞衰老的组合物，其包括占该组合物总重量约0.01wt％至约5wt％的六肽-11(苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸)，和皮肤病学可接受的肽载体，该载体选自水、油、醇、硅酮和它们的混合物。

Description

延缓细胞衰老的组合物

技术领域

本发明总体上涉及用于延缓细胞衰老的组合物；尤其是包含能有效延缓皮肤细胞自然衰老或者应激诱导(stress-induced)细胞衰老的六肽-11的化妆品组合物。本发明还涉及用于延缓皮肤细胞衰老的方法。

背景技术

大多数细胞因为复制衰老或细胞衰老而不能无限地分裂。大约30年前Hayflick和Moorhead首次发现了复制衰老或细胞衰老现象并提出了在细胞水平上的衰老模型。他们取得了重大的发现，即体外培养的细胞的群体倍增数往往只能增长到50-60倍，接着它们就到达一个称为复制衰老的点，在该点它们不再产生新的DNA，但是它们会继续进行新陈代谢和产生ATP。进入复制衰老的细胞，通常会在经历一系列统称为细胞凋亡的破坏性事件后，最终死亡。

细胞会因为诸如毒素、紫外线辐射或其他氧化事件等应激事件而提前开始衰老。这种现象称为应激诱导早衰或者SIPS。

因为据信细胞衰老是老化的一个重要因素，已经开始投入精力研发延缓细胞衰老的方法。例如，公开的美国专利申请2002/0123526披露了维甲酸在延缓角化细胞的细胞衰老中的用途。

公开的美国专利申请2009/0075902披露了延缓细胞衰老的方法，该方法利用了能作用于核转录因子κβ(Nuclear Factor Kappa Beta)(NF-κβ)以抑制NF-κβ蛋白活性的尼莫结合域(Nemo Binding Domain)(NBD)蛋白，使这种关键细胞转录因子基本上处于失活状态。

最近公开的世界专利申请WO2009/046436公开了局部应用药物雷帕霉素(rapamycin)能通过抑制mTOR(雷帕霉素哺乳动物靶标)基因和途径从而延缓细胞衰老。

Won等人批露，标记为CGK733的药物，市售合成的乙酰胺类似物，能够真正扭转“衰老时钟”，从而把复制性衰老细胞，特别是成纤维细胞，逆转回到有复制活性的细胞。参见Nat.化学.生物学.2(7)：369-374(2006)(Nat.Chem.Biol.2(7)：369-374(2006))。Won等人在以后的出版物中撤回了衰老逆转的说法。参见Won等人.Nat化学生物学2006(Won et al.NatChem Biol 2008)。

迄今为止，在现有技术中，用于延缓细胞衰老的材料，例如NBD蛋白，其合成是昂贵的。因此，它们作为治疗性局部应用是不理想的。

肽的局部应用和在化妆品中的应用是众所周知的。例如，美国专利US 6,492,326披露了五肽可用于刺激产生胶原蛋白表达，从而影响皮肤外观。片山等人批露同样的五肽可用来促进伤口愈合。参见片山等人，生物化学杂志，268，9941-9944(1993)(Katayama et al，JBiol Chem.，268，9941-9944(1993))。类似地，已公开的美国专利申请2004/0141939披露了用于护肤的肽，这些肽显示能够促进皮肤细胞之间的附着。美国专利5,554,375公开了一种含有铜的肽，该肽显示了能改善受损皮肤和伤口，并刺激毛发的生长。

在文献中提到有六肽的局部应用。例如，莱因哈特(Reinhart)等人的美国专利US20070202216揭示了使用结构为丝氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸的六肽来改善老化皮肤的外观。莱因哈特的美国专利US2008152606介绍了结构为乙酰-谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酸-精氨酸-精氨酸的乙酰化的六肽，用于改善老化皮肤的外观。Laloeuf的IE20060154公开了结构为甘氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺用于改善老化皮肤外观的六肽。

同样地，根据宾利等人，Arch Surg，第125卷，1990，641(Bentley et al.，Arch Surg，vol.125，1990，641)，酵母提取物的衍生肽，尤其是酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)又称面包酵母菌的提取物，可以局部起作用改善伤口愈合和皮肤外观。含有苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸(INCI命名：六肽-11)的氨基酸序列的肽是从酵母酵素中分离出来的，据称能使老化皮肤变得坚实。参见卢波等，皮肤科治疗，第20卷，2007，343(Lupo et al，Dermatol Therapy，vol.20，2007，343)。该文献没有披露该肽用于伤口愈合目的的用量。

但是，这些专利和论文都没有表明，任何所列的肽能够延缓细胞复制衰老。因此，仍然需要有成本效益的能延缓细胞衰老的活性试剂。本发明对这种需求提供了一个答案。

发明内容

在一个方面，本发明涉及延缓细胞衰老的组合物，其包括：占该组合物总重量的约0.01wt％至约5wt％的六肽-11，和皮肤病学可接受的肽载体，该载体选自水、油、醇、硅酮和它们的混合物。

在另一个方面，本发明涉及用于延缓诸如皮肤成纤维细胞、表皮角化细胞(epidermal keratinocyte)和真皮乳头细胞等细胞的自然衰老和应激诱导早衰的方法。该方法包括用组合物接触细胞，该组合物含有占所述组合物总重量约0.01wt％至约5wt％的六肽-11和皮肤病学可接受的肽载体，所述载体选自水、油、醇、硅酮和它们的混合物。

附图说明

图1是一个柱状图，显示了用SA-β-Gal的表达测定的自然老化的皮肤成纤维细胞的衰老的延缓。

图2是一个柱状图，显示了用ATM测定的表皮角化细胞H₂O₂应激诱导早衰的延缓。

图3是一个柱状图，显示了用p53表达测定的表皮角化细胞H₂O₂应激诱导早衰的延缓。

图4是一个柱状图，显示了用SA-β-Gal表达测定的真皮乳头细胞UV应激诱导早衰的延缓。

图5是一个柱状图，显示了六肽对细胞DNA修复酶Oggl的细胞表达的影响。

具体实施方式

令人吃惊地发现，根据SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)表达的测定、ATM或p53的抑制作用的测定、或者通过用例如MTT法等细胞活性检测测定的细胞活力增加的测定，纯度至少为50％的、浓度为约0.01％到约5％的六肽，优选是六肽-11，表现出了能延缓皮肤细胞的自然衰老或者应激诱导早衰的能力。

本领域一般技术人员所知晓的是，延缓衰老，可以通过多个体外检测试验来测定。尤其是SA-β-半乳糖苷酶、ATM、ATR、p53、p21和p16的表达以及用MTT法测定的细胞活力增加，都可以用来表征细胞衰老的延缓。

也可以通过已进入衰老状态的细胞的形态变化来观察细胞衰老。最主要的是观察SA-β-半乳糖苷酶表达的减少，SA-β-半乳糖苷酶已知是一种在自然衰老细胞或者应激诱导衰老细胞中被细胞表达的独特细胞标记物。

细胞衰老标记的表达可通过多种体外实验方法检测，但两种非常实用的方法是人类基因微阵列法和酶联免疫吸附试验(ELISA)法。第一种技术采用基因芯片(genomic microchips)，例如那些由Affymetrix(SantaClara，CA)提供的产品，来检测特定的处理是否会影响成纤维细胞通过增加或减少RNA的表达来合成蛋白质和酶的遗传倾向。第二种检测方法通过使用荧光标记的对相关的蛋白质有特异性的抗体测定所需衰老蛋白质的实际表达。

通过广泛和深入的研究，首次发现六肽，尤其是六肽-11，能够有效延缓例如成纤维细胞和真皮乳头细胞等皮肤细胞的自然细胞衰老或者应激诱导细胞衰老。例如，研究表明，六肽可以抑制某些关键细胞蛋白的表达，例如SA-β-半乳糖苷酶、ATM、或p53细胞蛋白表达。还发现六肽能够提高一些诸如DNA修复酶，Oggl等重要细胞标记物的表达。

因此，在一个实施例中，本发明提供了组合物，其含有占该组合物总量的约0.01wt％至5wt％，优选是约0.01至约2％，更优选是约0.1至约1％的六肽，和皮肤病学可接受的载体。优选的六肽是具有纯度至少50％的，优选至少75％的，更优选至少90％的或更高的六肽-11(苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸(Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro))。该组合物能够有效延缓皮肤细胞的自然细胞衰老或者应激诱导细胞衰老，尤其是能够有效延缓成纤维细胞，角化细胞和真皮乳头细胞的衰老。

成纤维细胞在皮肤的真皮层中生长，负责表达进入皮肤的新的胶原蛋白和弹性蛋白。角化细胞在皮肤表皮层中生长，负责皮肤中角质层和脂质的形成。真皮乳头细胞也是在皮肤的真皮层中生长，负责表达毛发纤维。这种细胞可以在体外条件下在培养皿中生长，用于测定局部处理的有利影响。

本发明的组合物可用于局部应用和调节皮肤老化的迹象，尤其是与老化相关的可见的和/或触觉可感知的皮肤纹理的间断。“调节皮肤老化的迹象”包括预防性调节和/或治疗性调节一个或多个这样的迹象(同样地，调节特定的皮肤老化的迹象，例如，皱纹和褶子或毛孔，包括预防性调节和/或治疗性调节该迹象)。此处使用的预防性调节这样的迹象，包括延缓，最大限度地减少和/或预防皮肤老化的迹象。此处使用的治疗性调节这样的迹象包括改善，例如减少，最大限度地减少和/或消除皮肤老化的迹象。

“皮肤老化迹象”，包括但不限于，所有外在可见的和触觉可感知的表现，以及由于皮肤老化导致的任何其他宏观或微观的影响。这种迹象可因内在因素或外在因素诱发或造成，这些因素如，年代老化和/或环境损伤(例如，阳光、紫外线、烟雾、臭氧、污染物、压力等)。这些迹象可能由一些进程导致，其包括，但不仅限于，纹理间断的发展，例如，皱纹，包括细浅的皱纹和粗深的皱纹，皮肤纹路，面部皱眉线，表情纹，皱纹，皮肤晒伤(dermatoheliosis)，光损伤，皮肤早衰，裂痕，肿胀，凹痕，毛孔粗大(例如，与诸如汗腺导管、皮脂腺或者毛囊等皮肤附属器相关)，皮肤外观为“橘皮”，干燥，鳞状，片状和/或其他形式皮肤不平整或粗糙；例如皮脂产生过多，皮肤油腻，面部油光，粉底突破(foundation breakthrough)等皮肤油脂分泌过多的问题；诸如鳞状，片状，角化，过度角化等异常脱皮(或脱落)或异常表皮分化(例如，异常皮肤更新时间(abnormal skinturnover))；如皮肤屏障破坏，环境干燥等引起的皮肤湿润(或水化)不足；皮肤弹性蛋白丢失(功能性皮肤弹性蛋白缺失和/或失活)，例如，弹性蛋白组织变性，下垂(包括在眼睛周围和下颌浮肿)，肌肤坚实性的缺失，皮肤紧致性的缺失，皮肤变形后回复能力缺失；非黑色素相关的色素沉着，例如，眼袋(undereye circles)，斑点(例如，由于如酒糟鼻等引起的分布不均的红着色)，面色蜡黄(苍白色)，由毛细血管扩张引起的疹斑；皮肤区域黑色素相关的过度色素沉着(或不均匀色素沉着)；炎症后过度色素沉着，例如，继炎症事件后发生(如痤疮损害，向内生毛，昆虫/蜘蛛叮咬或螫伤，划伤，切伤，伤口，擦伤，等等)的过度色素沉着；萎缩，例如，但不仅限于，与老化，使用类固醇或使用昆虫、蛇或细菌毒素(例如肉毒杆菌毒素)相关的萎缩；皮肤成分的其他组织学或镜下改变，如基质(如透明质酸，粘多糖等)，胶原蛋白的分解和结构改变或变异(例如，角质层，真皮层，表皮层，皮肤血管系统的改变，如毛细血管扩张)；对诸如疥疮或瘙痒等损害的皮肤神经系统、组织反应；和皮下组织改变(例如，皮下脂肪，脂肪团，肌肉，小柱(trabeculae)，分隔(septae)，等等)，尤其是那些最靠近皮肤的。

可以理解的是，本发明不仅限于调节上面提到的由于与皮肤老化相关的机制引起的“皮肤老化迹象”，还包括调节不论何种起源机制的迹象。此处所用的“调节皮肤状况”意在包括调节不论何种起源机制的迹象。

本发明对于治疗性调节哺乳动物皮肤纹理的可见的和/或触觉可感知的间断，包括与皮肤老化相关的纹理间断，是特别有用的。此处使用的治疗性调节这些间断包括改善，例如，减少，最大限度地减少和/或消除哺乳动物皮肤纹理的可见的和/或触觉可感知的间断，从而提供改善的皮肤外观和/或感觉，例如，更光滑，甚至更平滑的外观和/或感觉。这种皮肤纹理的可见的和/或触觉可感知的间断，包括裂痕，肿胀，毛孔粗大，细纹，皱纹，鳞状，片状和/或与皮肤老化相关的其他形式的纹理不匀或粗糙。例如，纹路和/或皱纹的长度，深度，和/或其他尺寸的减少，毛孔的直径明显减小，或者毛孔开口周围组织的外表高度接近皮肤附属器(interadnexal skin)的高度。

本发明对预防性调节哺乳动物皮肤可见的和/或触觉可感知的纹理间断，包括与皮肤老化相关的纹理间断，也特别有用。此处使用的预防性调节这种间断，包括延缓，最大限度地减少和/或预防哺乳动物皮肤可见的和/或触觉可感知的纹理间断，从而提供改善的皮肤外观和/或感觉，例如，更光滑，甚至更平滑的外观和/或感觉。

本发明的组合物，包括必要组分和可选组分，在下文详细描述。

本发明的组合物用于治疗秃顶也可能是有效的。Bahta AW等人披露，相较于从非秃顶个体分离的真皮乳头细胞，从秃顶的或正在秃顶的个体分离的真皮乳头细胞中发现了更严重的细胞早衰。参见Bahta AW等人，J.投资皮肤科128(2009)1088-1094(Bahta AW et al.，J.Invest Dermatol128(2009)1088-1094)。作者用ATM和SA-β-半乳糖苷酶测量法来说明他们的研究成果。因此，本发明组合物对于通过抑制细胞衰老治疗秃头可能是有效的。

必要组分

肽

本发明一个必要组分是，通过诸如发酵等生物手段或诸如固相或液相合成化学方法等传统手段分离的肽。更特别的是，对于本发明来说的很重要是实质上包含6个氨基酸的肽，统称为六肽。六肽的氨基酸，可以是自然形成的任何氨基酸，或者它可含有通过非自然的合成方法形成的氨基酸。

本发明的肽能用本领域一般技术人员所知的方法做进一步的化学衍生，所述方法包括，但不限于，形成盐，酯，酰胺及类似物。

肽也可以并入到传递系统，其能够提高肽在皮肤的局部渗透。这种传递系统在本领域是众所周知，其包括但不限于，脂质体，非离子脂质体，微胶囊(nanosomes)及类似物。

根据本发明优选的六肽，是最初从酵母酵素中分离的六肽，称为六肽-11。(化学结构：苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸)[卢波等，皮肤科治疗学2007(Lupo et al.，Dermatol Therapy 2007)]。六肽-11的结构的示意图如下：

六肽-11

本发明的六肽-11，也可以是通过本领域普通技术人员所公知的标准方法制成的合成肽。其纯度至少为50％，优选是75％，更优选是90％。测量肽的纯度可用本领域普通技术人员所公知的各种方法，例如NMR，HPLC或GC/MS。本发明最优选的是用HPLC测纯度。

载体

本发明的另一个必要组分是皮肤病学可接受的载体。此处所用的术语“皮肤病学可接受的载体”，是指适用于皮肤局部应用、具有良好的美学特性、与本发明的活性成分和任何其他组分相兼容、并不会造成任何不利的安全或毒性问题的载体。

载体可以是各种各样的形式。例如，可在此处使用的乳剂载体，包括但不限于，水包油，油包水，水包油包水(water-in-oil-in-water)，水硅油(oil-in-water-in-silicone)乳液。这些乳剂，可以有很大的粘度范围，例如，约100cps至约200,000cps。这些乳剂也可以用任何机械泵的容器或使用常规推进剂的加压气雾剂容器，以喷雾的形式使用。这些载体也可以以摩丝的形式使用。其他适合局部用药的载体包括无水液体溶剂，例如油、醇、硅酮(例如矿物油、乙醇、异丙醇、二甲基硅油、环甲硅油、及类似物)；水基单相液体溶剂(例如，水醇溶剂系统)；和这些无水和水基单相溶剂加稠形式(例如，通过添加合适的树胶、树脂、蜡、聚合物、盐等等增加溶剂的粘度以至于形成固体或半固体)。本发明有用的局部用药载体系统的例子在以下四个参考文献中有描述：“日晒产品名册”化妆品及盥洗用品，第105卷，第122-139页(1990年12月)(″Sun Products Formulary″Cosmetics& Toiletries，vol.105，pp.122-139(December 1990))；“日晒产品名册”，化妆品及盥洗用品，第102卷，第117-136页(1987年3月)(″Sun ProductsFormulary″，Cosmetics & Toiletries，vol.102，pp.117-136(March 1987))；Figueroa等人的授权日为1990年10月2日的第4,960,764号美国专利；Fukuda等人的授权日为1981年3月3日的第4,254,105号美国专利。

本发明的载体可占本发明组合物重量的约50％到约99％，优选是约75％到约99％，以及最优选是约85％至约95％。

优选的化妆品上和/或药学上可接受的可局部用药的载体包括水醇系统和水包油型乳剂。当载体是水醇系统，该载体可以包括约0％到约99％的乙醇，异丙醇，或其混合物，约1％到约99％的水。更优选的是，载体包括约5％到约60％的乙醇，异丙醇，或其混合物，约40％到约95％的水。尤其优选的是载体包括约20％到约50％的乙醇，异丙醇，或其混合物，和约50％至约80％的水。当载体是水包油乳剂时，该载体可以包括用于制备这些乳液的任何普通的赋形剂成分。关于合适载体的更详细讨论，可以在Blank等人的第5,605,894号美国专利和Bissett等人的第5,681,852号美国专利中发现。

可选组分

本发明的组合物可以选择性地包括额外的皮肤活性成分。该等皮肤活性成分的非限制例子包括，例如1997年10月30日公布的Oblong等人的PCT申请WO 97/39733中描述的维生素B3；诸如水杨酸等羟基酸；诸如两性离子表面活性剂等脱落剂或如脱皮剂(exfoliation or desquamatoryagents)；诸如2-乙基己基-p-甲氧基肉桂酸、4，4′-t-丁基-甲氧基联苯甲酰-甲烷、奥克立宁、苯基苯并咪唑磺酸等遮光剂；诸如氧化锌和二氧化钛等防晒剂(sun-blocks)；抗炎剂；诸如维生素E及其酯等抗氧化剂/自由基清除剂；金属螯合剂，尤其是铁螯合剂；诸如维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯、维生素A丙酸酯和视黄醛等维甲酸；N-乙酰-L-半胱氨酸及其衍生物；诸如乙醇酸等羟基酸；诸如丙酮酸等酮酸；苯并呋喃衍生物；脱毛剂(例如，巯基化合物)；美白剂(例如，熊果苷、曲酸、氢醌、抗坏血酸以及诸如抗坏血酸磷酸盐类、胎盘提取物等衍生物)；抗脂肪剂(例如，咖啡因、茶碱)；保湿剂；抗微生物药物；抗雄激素；和皮肤防护剂。也可以使用上述皮肤活性成分的任何混合物。这些活性成分的详细说明可以在Blank等人的U.S.Pat.No.5,605,894美国专利中找到。优选的皮肤活性成分包括诸如水杨酸等羟基酸、遮光剂、抗氧化剂及其混合物。

本发明的组合物也可以包括其他的传统护肤品添加剂。例如，尿素、胍、甘油、凡士林、矿物油、糖酯(sugar esters)和聚酯、聚烯烃、异硬脂酸甲酯、异硬脂酸乙酯、鲸蜡蓖麻醇酸酯(cetyl ricinoleate)、异壬酸异壬酯、异十六烷、羊毛脂、羊毛脂酯(lanolin esters)、胆固醇、吡咯烷酮羧酸/盐(PCA)、三甲基甘氨酸(甜菜碱)、氨甲环酸、氨基酸(例如，丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、组氨酸)和/或它们的盐类、泛酰醇及其衍生物、胶原蛋白、透明质酸、弹性蛋白、水解物、月见草油、荷荷巴油、表皮生长因子、大豆皂甙、粘多糖、及其混合物也可以使用。其他合适的添加剂或皮肤活性成分在Oblong等人的1997年10月30日公布的PCT申请WO 97/39733中进一步讨论了细节问题。

其它组分

在制剂中还可以包含其他组分，其选择取决于载体、可选组分或制剂之目的用途。额外的组分包括，但不限于，抗氧化剂(例如BHT)；乳化稳定剂(例如卡波姆)；防腐剂(例如苯氧基乙醇)；芳香剂(例如蒎烯)；湿润剂(例如甘油)；防水剂(例如Fomblins全氟醚(perflouorethers))；水溶性膜剂(water-soluble film former)(例如羟丙基甲基纤维素)；油溶性膜剂(oil-soluble film former)(例如氢化C-9树脂)；保湿剂(例如胆固醇)；阳离子聚合物(例如聚季铵盐-10)；阴离子聚合物(例如黄原胶)；维生素(例如维生素E)；以及类似物。

该组合物还可以包含一个或多个额外的活性成分，并且该等活性成分既可以是化妆品组合物也可以是药物组合物。有用的活性成分的例子包括，但不限于，改善或消除老年斑、角化和皱纹，镇痛剂，麻醉剂，抗痤疮药物，抗菌剂，抗真菌，抗病毒剂，去头屑剂，抗皮炎剂，止痒剂，止吐剂，抗过度脱皮剂(antihyperkeratolytic)，抗皮肤干燥剂，止汗剂，抗银屑病药，抗皮脂溢剂，抗老化剂，抗皱剂，抗组织胺剂，遮光剂，去色素沉着剂(depigmentating agents)，伤口愈合剂，抗炎剂，鞣剂，或者激素。

本发明制剂尤其优选的实施例是作为抗衰老产品的护肤乳液或霜剂。为此，该制剂结合有保湿剂、润肤剂或湿润剂。有用的组合物的例子是油、油脂、蜡、酯类、脂肪酸醇类、脂肪酸乙氧基酯类、乙二醇类、糖类、透明质酸和透明质酸盐类、二甲基硅油、环甲基硅酮、及类似物。进一步的例子可以在国际化妆品成分字典CTFA，第十版，2004年(InternationalCosmetic Ingredient Dictionary CTFA，Tenth Edition，2004)中找到。

本发明还考虑，在局部应用的组合物应用的同时和/或按顺序地(例如，在10分钟内)把能量传递到皮肤，以通过传递增强设备提高本发明的必要组成部分到角质组织的效果。该能量传递设备，可以各种形式传递能量，包括但不限于，光、热、声波(包括超声波)、磁能量、电磁能量(包括射频和微波)、机械能(去皮或微晶磨皮设备)，及其组合等形式的能量。

组合物的制备

本发明的组合物一般用常规方法制备，例如制备局部使用的组合物领域中所公知的方法。该等方法通常涉及在一个或多个步骤中把各成分混合到一个相对统一的状态，带或不带加热、冷却、应用真空、等等。

调节皮肤状况的方法

调节皮肤状况，包括对局部皮肤使用安全和有效量的本发明的组合物。所使用组合物的用量、使用频率和周期会根据给定组合物中肽和/或其他组分的水平和所希望调节的水平而大大不同，该所希望调节的水平例如是根据主体中皮肤老化的程度和皮肤进一步老化速率而定。

在优选的实施例中，组合物在皮肤上长期使用。“长期局部使用”是指在主体的生命周期中一段延长的时间段内，连续地局部使用该组合物，优选是至少约一个星期的时间段内，更优选是至少约1个月的时间段内，甚至更优选是至少约3个月，甚至更优选是至少约6个月，和还更优选是至少约一年。虽然经过各种最长的使用期间(例如，五年，十年，二十年)，可以获得效果，优选是主体在整个生命周期中连续使用。通常，常规的使用是在该延长的时间段内每天一次，但是，使用频率是可变的，约每周一次至每天约3次或更多。

使用本发明的组合物以提供皮肤的外观和/或感觉效果的用量范围非常广。本发明组合物通常每次的用量是，以毫克组合物/平方厘米皮肤计，从约0.1mg/cm²到约10mg/cm²。特别有效的用量约2mg/cm²。

优选地，调节皮肤状况是通过皮肤乳剂、霜、凝胶、乳液、喷雾、调节剂、化妆品、唇膏、粉底、指甲油、或者为美学、预防、治疗或其他效用的目的而驻留在皮肤上的类似物(即“驻留型”组合物)等形式，使用本发明的组合物。在皮肤上使用组合物后，优选在皮肤上停留至少约15分钟的时间，更优选至少约30分钟，甚至更优选是至少约1小时，最优选是至少几个小时，例如，长达约12小时。

可以对脸部、头发、和/或指甲的任何外表部分进行处理，例如，脸部、嘴唇、眼睛下方区域、眼睑、头皮、颈部、躯干、胳膊、手、腿、指甲、脚趾甲、头皮头发、睫毛、眉毛，等等。

能确保把皮肤连续曝露在至少最低水平的本发明肽的另一种方法，是通过使用敷贴(patch)来施用六肽，例如，在脸上使用敷贴。这种做法对于需要更深入治疗的皮肤有问题的区域特别有效。该敷贴可以是闭塞的(occlusive)，半闭塞的或不闭塞的。该肽组合物可以包含在敷贴中或者在使用敷贴之前施用到皮肤。该敷贴还可以包括额外的活性成分，例如在Burkett等人的PCT申请WO 9701313中描述的那些放热反应的化学引发剂。该敷贴留在皮肤上优选是至少约15分钟时间，更优选是至少约30分钟，甚至更优选是至少约1小时，最优选是在晚上作为夜间治疗的形式。

使用本发明组合物的另一种方法是通过冲洗(rinse-off)组合物，但不限于，洗发水、护发素、浴用品、面部磨砂膏(facial scrub)、面膜(facial peel)等等。

下面的例子进一步描述和演示了本发明范围内实施例。给出的例子仅用于说明目的，不应被解释为对本发明的限制，因为在不偏离本发明精神和范围的情况下，它们可有许多种变化。此处所用的所有百分比和比率是基于组合物总重量，并且所有测量是在25℃下进行，除非另有说明。

实施例

实施例1.通过发酵从酿酒酵母菌中分离六肽

根据Jazwinski SM.酶学方法182(1990)154-174(Jazwinski SM.Methods in Enzymology 182(1990)154-174)中所列的条件培养酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。发酵过程完成后，过滤分离酵母并把它重新悬浮在PBS中。通过微射流处理混合物破裂微生物，以提供破裂的酵母细胞和细胞质内容物的混合物。通过过滤去除主要包含细胞壁成分的未溶解成分，以提供含有肽、寡肽、聚合糖类及其它成分的水溶性物质的混合物。

所得酵母提取物首先采用3000道尔顿公称截留分子量的滤膜对分子量分布进行切向流过滤分离。由此产生的低分子量部分被进一步使用高效液相色谱法在下列条件进行分离：色谱柱：C18(1.0×250毫米)，流动相：0.1％三氟乙酸水溶液和含于70％乙腈(acetonitrile)中的0.0075％三氟乙酸(trifluoroacetic acid)的混合物中的5％至80％。分离来自层析柱的部分，并且浓缩最大部分中组分，以提供含有六肽-11(苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸)的部分，通过厄尔德曼降解法(ErdmanDegradation)测定氨基酸序列从而确定结构。

实施例2.通过化学合成法分离六肽

实施例1中描述的六肽还通过本领域技术人员公知的固相肽合成技术合成。分离通过固相合成法合成的肽至HPLC色谱法测定纯度大于95％。

实施例3.通过SA-β-Gal的表达测定自然老化的皮肤成纤维细胞中的衰老延缓

实施例2中分离的肽通过一系列群体倍增数用于研究肽延缓老化的皮肤成纤维细胞衰老的能力。

培养成纤维细胞

人类新生儿成纤维细胞在原代培养后(1传代)获得并将其植入成组的T-75烧瓶中的3毫升/瓶的成纤维细胞生长介质(FGM)中，并且在37±2℃和5±1％二氧化碳的条件下培养。细胞通过6传代的扩增(细胞一直增长到烧瓶汇合称为1传代，然后把细胞一分为二(1∶2)，因此，1传代大致相当于一个群体倍增)。到了6传代之后，成纤维细胞被分成不同的治疗组，并通过各种测试物质处理至18传代。在18传代，一部分成纤维细胞用于检测衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的变化，而剩下的成纤维细胞在没有测试物质的情况下再培养一个星期(约2额外的传代)。

SA-β-Gal染色

在染色之前，用PBS洗涤成纤维细胞一次，然后在固定溶液(含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS)中固定约6分钟。固定后，用PBS洗涤细胞三次，接着添加染色溶液(150mM氯化钠，2mM氯化镁，40mM柠檬酸(pH值6.0)，12mM磷酸钠，5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，和400微克/毫升X-gal)。细胞然后在37℃的无二氧化碳的培养箱中培养过夜。翌日去除染色溶液，并用PBS代替。细胞然后用显微镜拍照，并且对各个视野中的染色细胞数量(SA-β-Gal阳性)进行计数。

图1提供了实验结果。这些结果表明，经过18代群体倍增后，在未处理的细胞中的SA-β-Gal表达在统计学上要高于用0.5或1.0％六肽处理过的细胞。这表明了，六肽能够延缓这些自然老化皮肤成纤维细胞衰老的启动。清除六肽后一个星期，除了1％处理之外，所有处理中SA-β-Gal表达回到正常，在1％的处理中，肽清除一个星期后，有增加但尚未恢复到正常水平。这些数据表明，肽对延缓衰老的影响不是永久性的，在培养基上清除肽后是可逆转的。

实施例4.通过ATM和p53表达测定表皮角化细胞过氧化氢应激诱导早衰的延缓

来自于实施例2的六肽被用来证明表皮角化细胞过氧化氢应激诱导早衰的延缓。

培养人类角化细胞

人类表皮角化细胞接种到培养瓶中，使用根据制造商推荐添加的无血清Epilife培养基，并在37±2℃和5±1％二氧化碳的条件下培养。当培养出足够数量的细胞，它们被转移到96孔板并且至少培养24小时，以使细胞附着在孔板上。经过最初的24小时孵育后，改变培养基，以清除任何没有附着的细胞，培养剩余的细胞直到汇合，根据需要，每48至72小时更换培养基。

用测试物质处理角化细胞

过氧化氢处理

用过氧化氢处理角化细胞诱导细胞早衰老。为了进行过氧化氢处理，细胞培养基用磷酸盐缓冲液(PBS)辅以150μM过氧化氢代替。细胞在过氧化氢溶液中孵育两个小时，之后他们用PBS洗涤一次，然后给细胞使用带有测试物质的或者未带有测试物质的新鲜培养基。在这些程度上，没有观察到过氧化氢处理对细胞活力的影响。

ATM/p53表达的分析

ATM和p53表达量的相对变化是在角化细胞中通过基于酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确定的。在处理期间结束时，细胞培养基被清除并换成100μl/孔的冰冷甲醇固定细胞。固定后，细胞用PBS洗涤两次，在0.5％过氧化氢中培育，以抑制任何内源性过氧化物酶的活性，然后再在PBS中洗涤两次。洗涤后，每孔加入封闭液(blocking solution)300μl(在PBS中加入1.5％正常山羊血清)并且板在室温下孵育一个小时。封闭后，加入100μl含有抗ATM或抗-p53抗体的新鲜封闭溶液，并且孔板在室温下孵育1小时。用PBS辅以0.05％Tween 20洗涤孔三次后，每孔中加入100μl含有HRP标记的抗山羊二级抗体的封闭溶液。板在室温下孵育1小时，然后，用PBS辅以0.05％Tween 20洗涤孔三次。在最后一次洗涤之后，每孔加入200μl HRP基质溶液(substrate solution)(0.4mg/ml的邻苯二胺盐酸盐，0.4mg/ml的尿素过氧化氢和0.5M磷酸盐-柠檬酸盐[pH值5.0])，板在室温下孵育15至30分钟。达到足够的着色程度后，使用读板仪在460nm处读板。图2和3提供了测试结果。

该数据表明，当用ATM和p53蛋白表达减少来测定，六肽在1％的处理水平局部应用，相较于未经处理的角化细胞早衰，在统计学上可延缓表皮角化细胞早衰。

实施例5.用SA-β-Gal表达来测定延缓的真皮乳头细胞紫外线应激诱导早衰

来自实施例2的六肽被用来证明有延缓用紫外线辐射处理诱导进入早衰的真皮乳头细胞的衰老的能力。

培养真皮乳头细胞

人真皮乳头细胞接种到12孔板，在真皮乳头生长培养基中(DPGM)和在37±2℃和5±1％的二氧化碳的条件下培养直到汇合，根据需要，每48至72小时更换培养基。一旦细胞汇合，把细胞培养基用PBS替换，并且用20毫焦耳/厘米的UVB照射细胞。UVB照射之后，PBS被清除，取而代之的是辅以各种测试物质的细胞培养基。无添加的DPGM被用来作为未经处理的对照组。一组细胞未暴露于UVB并且用于未经UVB处理的对照组。在添加培养基之后，细胞组培养48小时。在孵育期结束时，获取细胞并用于检测SA-β-Gal活性的变化。

在第二组研究中，如上所述，培养真皮乳头细胞并置于多孔板上。该第二组的细胞用同样的测试物质处理，只是它们没有暴露于UVB的辐射。这完了以后在该研究中测定的标志物上单独确定测试物质的效果。

SA-β-半乳糖苷酶分析

经过48小时的孵育，用PBS洗涤细胞，然后快速在固定缓冲液(含2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS)中固定6-7分钟。然后细胞用PBS洗涤三次，洗涤之后，把染色溶液添加到孔中(5mM的铁氰化钾，5mM的亚铁氰化钾，1mg/ml X-gal，在磷酸盐缓冲液中，pH值6.0)，并且多孔板在37℃(不含二氧化碳)条件下孵育(incubate)过夜。翌日，孔用显微镜检查和拍照，以便于能够对每个视野下的染色细胞数量进行计数。对在每个视野下的阳性细胞数量进行计数。然后对每次处理的平均细胞计数用ANOVA进行比较。

图4显示了真皮乳头细胞UV应激诱导的早衰的衰老延缓的试验结果。结果表明，真皮乳头细胞暴露于UV辐射导致指示细胞处于早衰的SA-β-Gal表达的增加。使用0.5％和1.0％的六肽显示了有统计学意义的SA-β-Gal表达减少，表明接受处理细胞衰老被延缓了。

实施例6.六肽对细胞DNA修复酶Oggl表达的影响。

下面实施例演示来自于实施例2的六肽上调Oggl表达的能力，Oggl是一种DNA损伤修复酶，已知其通过在细胞进入衰老以前修复受损的关键DNA能够延缓DNA受损细胞的衰老。

培养人类成纤维细胞

人类成纤维细胞接种到培养瓶中，并用FGM在37±2℃和5±1％的二氧化碳的条件下培养。当生长有足够数量的细胞，将它们转移到24孔板上并且培养至少24小时以使得细胞附着到孔板上。然后细胞生长一直到汇合，每48至72小时更换培养基。

处理成纤维细胞

FGM中备有测试物质。然后从培养板移除该培养基并且用0.5毫升辅以测试物质的培养基取代，对每处理一式三份进行测试。FGM单独作为未经处理的对照。在应用该细胞培养基之后，板在37±2℃和5±1％二氧化碳的条件下孵育24小时。孵育期结束时，移除培养基并且细胞用磷酸盐缓冲液洗涤一次。移除洗液之后，把200μl裂解缓冲液(在磷酸盐缓冲液备有1mM EDTA，0.5％Triton X-100，10mM NaF，150mM NaCL，20mM β-甘油磷酸，1mM的DTT，10μg/ml亮抑酶肽，10μg/ml胃酶抑素，3μg/ml抑肽酶)加入到孔中，并将它们放在摇动平台(rocking platform)上在冰点(onice)孵育15分钟以裂解细胞。然后把细胞裂解物转移到1.5ml试管中，用最大速度(4℃)离心5分钟。保留上清液，并在-75℃保存。使用BCA蛋白检测方法测定上清液中的蛋白浓度。

OGG1：细胞裂解的微滤印迹和免疫检测

对于每一个细胞裂解液样本，10μg蛋白与100μl三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris Buffered Saline)(TBS：20mM Tris，pH值7.5，150mM氯化钠)相结合。PVDF膜在甲醇中预湿，用TBS平衡并且装入Bio-Dot微滤装置中。装入以后，100μl TBS加入到Bio-Dot的孔中，施用负压以确保所有孔都有足够的流量通过。接下来，上述制备的每个细胞裂解液样本被分配到装置的孔中，并且该样本加入到合适的孔中。所有样本都加入后，对装置施用负压使得样本流过膜，而蛋白质留在膜上。TBS添加到无样本的孔中，以确保膜在操作过程中不会变干。在印迹过程结束时，膜从Bio-Dot装置移除，用TBS洗涤5-10分钟取出，然后放入封闭液(含1％脱脂肪奶粉的TBS)并且在摇动平台上在室温下孵育至少1小时。

抗体孵育和检测

封闭后，膜被转移到20毫升含有抗Oggl抗体的合适稀释液的TBST(含0.1％Tween-20的TBS)和0.1％脱脂奶粉，并在4℃摇动平台上孵育过夜。孵育后，该膜在TBST中洗涤3次(15分钟1次和5分钟2次)。然后，次级抗体(用荧光共轭)和该膜在15毫升含有0.1％脱脂肪奶粉的TBST中在室温下孵育1小时，然后用TBS洗涤3次(15分钟1次和5分钟2次)。

最后一次洗涤之后，该膜被放置进入伯乐分子成像系统(BioRad Molecular Imager FX)并且使用适于荧光团的激发激光和发射滤波器的组合进行扫描。然后用ImageJ图像分析软件对扫描仪产生的图像进行分析。

计算

图像分析

荧光强度的衡量用相对荧光单位(RFU)表示。然后计算每次处理的RFU平均值，并且采用单向方差分析(ANOVA)比较各次处理。图5显示了所得的Oggl检测结果。

这个检测结果表明，在0.1％的处理水平六肽能从统计角度增加对于Oggl的表达。这项研究的结果表明，通过增加细胞中重要的DNA修复酶，六肽可能能够延缓细胞衰老。Oggl能够取代受损DNA中的氧化鸟嘌呤的残留物，从而延缓衰老，因此，可以延缓起因于DNA受损这种特定形式的衰老的启动。

实施例7.含六肽的水包油型乳剂

来自于实施例2的六肽-11使用下面的配方和工艺配制成水包油型乳剂：

含六肽的水包油型乳剂

步骤：

1.混合相A并且加热至75℃。搅拌至均匀。

2.混合相B并且加热至75℃。搅拌至均匀。

3.在缓慢搅拌的情况下，把相B加到相A中。搅拌20分钟。

4.加入预混合的相C，并且搅拌至均匀。停止加热。

5.在边釜(side kettle)中预混合相D，并且在40℃以下加入到该批中，搅拌至均匀。

6.加入Mikrokill COS和相E芳香剂，并且搅拌至均匀。

实施例8.含有六肽的油包水型乳剂

来自于实施例2的六肽使用下面的配方和工艺配制成油包水型乳剂：

含六肽的油包水型乳剂

步骤：

1.把相A中的所有成分混合在一起。

2.把相B中的成分以所示顺序加入，在加入下一成分之前，充分搅拌每一种成分直到成为均质。

3.在充分搅拌的情况下缓慢地把相A加到相B中。当混合物变稠时逐渐把搅拌提高到高剪切。继续搅拌10分钟。

实施例9.含有六肽脂质体的眼胶

把来自于实施例2的六肽包封到脂质体组合物中，然后使用下面的配方和工艺把包封的六肽并入到眼胶组合物中：

含六肽脂质体的眼胶

步骤：

1.把聚羧乙烯Ultrez 21在50℃下分散在水中，并且加入Keltrol CG-SFT。搅拌至均匀。

2.加入丁二醇、Mikrokill COS、AMP、EDTA和硅树脂193。搅拌至均匀。

3.在40℃充分搅拌(sweep agitation)下加入六肽脂质体。搅拌至均匀。

5.如果需要的话，把pH值调整到5.5。

实施例10.六肽的包封

使用专利号为2003/0198682 A1的美国专利所述的技术把从实施例2提取的六肽包封入聚合物基质。

实施例11.唇膏组合物

来自于实施例2的六肽使用下面的配方和工艺配制成唇膏：

含有六肽的唇膏

步骤：

1.把蜡、油和防腐剂(相A)混合物，并且加热到83-87℃。

2.保持温度并且搅拌至均匀。

3.把温度降至75-80℃，并加入相B；搅拌至均匀。

4.加入珍珠、六肽和抗坏血酸棕榈酸酯(相C)。

5.倒入模具中。

实施例12.色粉(toner)组合物

来自于实施例2的六肽使用下面的配方和工艺配制成水醇色粉(aqueous alcoholic tonic)：

含六肽的色粉

步骤：

1.充水并加入Betafin BP-20和六肽。搅拌至均匀。

2.加入金缕梅和Mikrokill COS，搅拌至均匀。

实施例13.浴用品组合物

实施例2的六肽使用下面的配方和工艺配制成浴用品：

含六肽浴用品

步骤：

1.把水加热到70℃并加入乙二胺四乙基二钠、甘油，并且搅拌至均匀。

2.保持温度70℃以上，并且加入Standapol WAQ Special，Standapol ES-2，Cerasynt IP，Cocamide MEA，Velvetex BA-35，在并且搅拌至均匀。

3.把温度降至45℃，并加入Mikrokill COS和六肽。

4.搅拌至均匀。

实施例14.六肽的发酵

来自于实施例2的六肽作为含有酿酒酵母菌的发酵培养基的一部分。

来自于实施例2的肽样本放入到获自红星酵母菌(Red StarYeast)(Milwaukee，WI)的面包酵母培养基水性混合物中。该培养基接种了也是获自红星酵母菌的活性酿酒酵母菌培养物，并且该混合物在受控制的有氧条件下进行发酵以使用如美国专利2,239,345所述的压力条件提供活酵母细胞衍生物(LYCD)。

实施例15.浓缩亚微米级乳剂

该实施例显示了含有如实施例2制备的六肽的亚微米级乳剂浓缩物。

Claims (20)

1.用于延缓细胞衰老的组合物，其包括占该组合物总重量约0.01wt％至约5wt％的六肽-11(苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸)，和皮肤病学可接受的肽载体，该载体选自水、油、醇、硅酮和它们的混合物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述油选自矿物油、植物油和它们的混合物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述载体是乳剂，其选自油包水、水包油、水包油包水、和水硅油乳液。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述肽是合成的或者是发酵工艺的成分。

5.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述肽是合成的肽。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述六肽的浓度为以重量计占该组合物总重量的约0.01％到约2％。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述六肽的纯度至少为50％。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述六肽的纯度至少为75％。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述六肽的纯度至少为90％。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述六肽被包封入传递载体，该传递载体选自脂质体、非离子脂质体、微胶囊和它们的混合物。

11.根据权利要求1所述的组合物进一步包括由下列物质组成的群组中选出的至少一种成分：羟基酸、脱落剂或如脱皮剂、遮光剂、防晒剂、抗炎剂、抗氧化剂/自由基清除剂、金属螯合剂、酮酸、脱毛剂、美白剂、抗脂肪剂、保湿剂、抗微生物药物、抗雄激素、皮肤防护剂、乳化稳定剂、防腐剂、芳香剂、湿润剂、防水剂、水溶性膜剂、油溶性膜剂、阳离子聚合物、维生素、和它们的混合物。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物能有效抑制SA-β-半乳糖苷酶、ATM或p53细胞蛋白的表达。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物能有效增加DNA修复酶Oggl的表达。

14.用于延缓皮肤细胞衰老方法，该方法包括用组合物接触细胞，该组合物含有占该组合物总重量约0.01wt％至约5wt％的六肽-11和皮肤病学可接受的肽载体，所述载体选自水、油、醇、硅酮和它们的混合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述的皮肤细胞是成纤维细胞、表皮角化细胞和真皮乳头细胞。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述的载体是乳剂，该乳剂选自油包水、水包油、水包油包水、和水硅油乳液。

17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述六肽的浓度为以重量计占该组合物总重量的约0.01％到约2％。

18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述六肽的纯度至少为50％。

19.根据权利要求14所述的方法，其中，所述六肽被包封入传递载体，该传递载体选自脂质体、非离子脂质体、微胶囊和它们中的混合物。

20.根据权利要求14所述的方法，其中，皮肤细胞自然或者应激诱导细胞衰老的延缓是通过SA-β-半乳糖苷酶表达测定的、ATM或p53蛋白的抑制测定的或者由细胞活力试验测定的细胞活力增加检测的。

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