CN106754439A - 一种分离单细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请单细胞分离技术领域，具体涉及一种分离单细胞的方法。本发明所提供的方法可通过调节激光能量大小、激光光斑直径和光解材料层厚度从而准确控制单个液滴的尺寸大小，使得每个液滴中只包裹一个细胞，大大提高了单细胞的分离精度；而且，激光能量并非直接作用于目标细胞，不会导致细胞功能不完整，保持了细胞的活性；同时，也无需采用荧光蛋白或磁性颗粒来对细胞进行标记，无需手动操作，大大提高了分离效率。
Description
技术领域
本发明属于单细胞分离技术领域，具体涉及一种分离单细胞的方法。
背景技术
单细胞技术以单细胞为研究方向，研究单细胞细胞的生长、代谢、凋亡。最近，单细胞在个性化治疗、肿瘤、心脑血管疾病、生育能力和艾滋病等生物医疗领域已有着广泛应用。单细胞分离技术可为单细胞研究提供研究样本，是实现单细胞技术至关重要的一步。
传统分离单细胞的方法主要包括有限稀释法、荧光活化细胞分选法(FACS)、磁性活化细胞分选法(MACS)和光镊子法等。有效稀释法主要为人工操作，过程复杂，分离效率低；荧光活化细胞分选法需要采用流式细胞仪进行分选细胞，花费昂贵，而且耗费时间长；光镊子法采用激光束捕获目标细胞，光源直接作用于细胞，容易对细胞的活性产生破坏。因此，提供一种能有效分离单细胞的方法，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离单细胞的方法，用于解决现有单细胞分离技术分离效率低以及在分离过程中细胞容易失活的问题。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种分离单细胞的方法，包括：
在光解材料层的表面涂布细胞培养液，培养；
所述光解材料层接收光能发生降解，诱导产生高压脉冲波；
所述高压脉冲波作用于所述细胞培养液，使其液面发生溅射生成液滴，所述液滴包裹细胞，使得单细胞分离。
优选的，所述光能的来源为激光。
优选的，所述激光光能为0.5μJ～200mJ。
优选的，所述细胞培养液的细胞密度为7×105个/mL-7×106/mL。
优选的，所述培养为在37℃和体积浓度为5％CO2的条件下进行培养。
优选的，所述培养的时间为0.5～12h。
优选的，所述光解材料层包含三氮类化合物；
所述三氮类化合物包括：三氮烯类化合物和三氮盐。
与现有技术相比，本发明所提供的一种分离单细胞的方法可通过调节激光能量大小、激光光斑直径和光解材料层厚度从而准确控制单个液滴的尺寸大小，使得每个液滴中只包裹一个细胞，大大提高了单细胞的分离精度；而且，激光能量并非直接作用于目标细胞，不会导致细胞功能不完整，保持了细胞的活性；同时，也无需采用荧光蛋白或磁性颗粒来对细胞进行标记，无需手动操作，大大提高了分离效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为传送细胞的数量与激光脉冲能量的变化关系曲线图；
图2为激光能量为3μJ时传送液滴的光学显微镜照片；
图3为激光能量为9μJ时传送液滴的光学显微镜照片；
图4为激光光斑直径为40μm时传送液滴的光学显微镜照片；
图5为激光脉冲能量对传送细胞活性的影响关系曲线图。
具体实施方式
本发明所提供的一种分离单细胞的方法，包括：
在光解材料层的表面涂布细胞培养液，培养；
所述光解材料层接收光能发生降解，诱导产生高压脉冲波；
所述高压脉冲波作用于所述细胞培养液，使其液面发生溅射生成液滴，所述液滴包裹细胞，使得单细胞分离。
进一步的，所述光能的来源为激光。本发明对激光的来源没有特别限制，采用本领域技术人员熟知的激光发射设备作为激光来源即可。本发明中，所述激光发射的设备优选为532nm纳秒激光器。
更进一步的，所述激光光能为0.5μJ～200mJ，优选为1-15μJ，更优选为1～7μJ。
更进一步的，所述激光频率优选为1-10Hz，所述激光光斑优选为40μm。
在本发明中，所述液滴尺寸和所述光能能量大小互相关联；通过调整所述光能能量，调节所述液滴尺寸，使得每个液滴中包含单个细胞，从而实现单细胞分离。为了满足多层次的实用需求，随着细胞培养液或者待分离细胞的不同，还可以根据实际情况调整激光的光能或其频率。
在一些实施例中，光解材料层为涂布于载玻片一侧表面的一层光解材料。
在其他一些实施例中，光解材料层一层固态光解材料。
进一步的，所述光解材料优选为三氮类化合物，更优选为三氮烯类化合物和三氮盐。
更进一步的，所述光解材料层厚度优选为0～100nm。
当激光透过载玻片射到光解材料层上时，其光解材料接受高能激光热作用后发生降解，诱导产生高压脉冲波作用于涂布于其表面的细胞培养液，使其液面发生溅射形成液滴，液滴包裹细胞，从而实现分离单细胞。
本发明对所要分离的细胞种类和培养液没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的细胞和培养液即可。在本发明的一些实施例中，所述细胞优选为酵母细胞，所述培养液为YPD培养基，将酵母细胞添加到YDP培养基中，旋转振荡使细胞均匀分布在培养基中，得到复合要求的细胞培养液。
进一步的，所述细胞培养液的细胞密度为7×105个/mL-7×106/mL。
进一步的，所述培养为在37℃和体积浓度为5％CO2的条件下进行培养。
进一步的，所述培养的时间为0.5～12h。
在本发明优选实施例中，因为细胞在液体培养液中生长时其位置会发生移动，导致细胞培养液中细胞分布不均匀，影响单细胞的分离效果，甚至导致分离过程无法进行。因此，为了使得细胞培养液中的细胞位置相对固定，在涂布所述细胞培养液之前，采用多聚赖氨酸或聚乙烯亚胺对所述光解材料层的表面进行改性处理，使得所述细胞培养液中的细胞位置固定。
进一步的，所述多聚赖氨酸的质量百分比浓度为5％；所述聚乙烯亚胺的质量百分比浓度为0.05％。
更进一步的，为将细胞更好的贴附于光解材料层表面，在涂布所述细胞培养液之后，将其移至37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，使得细胞培养液中的细胞着陆于牺牲层一侧，当发生液滴溅射时，细胞能更好地融进所述液滴中，从而实现分离单细胞的目的。
下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
实施例1
本实施例以酵母细胞为例，进行单细胞分离的具体步骤如下：
1、将实验器材放入高压蒸汽灭菌器中，在高压蒸汽内121℃灭菌20min。
2、酵母细胞在细胞培养液中生长时，细胞位置不固定，容易影响单细胞的分离精度。为此，本实验采用5％的多聚赖氨酸(PLL)对光解材料层的一侧进行处理，使得酵母细胞不进行自由游动。
3、采用刮涂技术在光解材料层的表面涂覆一层厚约40μm、细胞密度为3×106个/mL的细胞培养液，然后置于37℃、5％CO2的细胞培育箱中静置30min，使得酵母细胞着陆，固定在光解材料层的表面。
4、采用532nm纳秒激光器发射激光，调整激光脉冲能量和激光光斑直径，然后将激光照射到光解材料层，作为光解材料的三氮类化合物受到激光光能的作用发生降解，诱导产生高压脉冲波，高压脉冲波作用于细胞培养液，使其液面发生溅射生成液滴，所述液滴包裹细胞，从而实现单细胞的分离。其中，每个细胞培养液样本设25个传送点。
5、将分离得到的细胞样本通过微流道检测系统，获得细胞尺寸分布，并对细胞样本进行染色，计算细胞的存活率。
如图1所示，传送的细胞数量和激光能量成正比。当激光能量为1μJ时，约一半的传送点上没有成功分离细胞；当激光能量小于7μJ时，仍存在部分传送点无法成功传送细胞；当激光能量为7μJ时，全部传送点成功传送细胞。然而，当激光能量大于7μJ时，单个传送点中又同时包含2-3个细胞，而且激光能量越大，出现这种现象的几率越大。
如图2和图3所示，当激光能量为3μJ时所分离液滴的体积直径为4μm，其直径仅与细胞直径相当；当激光能量为9μJ时所分离液滴的体积直径为11μm，液滴中同时包含2个细胞，为非单细胞分离。如图4所示，当激光能量设为7μJ、光斑直径为40μm时，所获得的液滴直径为8μm，液滴中仅包含一个细胞，实现了单细胞分离。图1至图3共同说明了激光能量越大，生成的液滴越大，因此，结合图4说明在YPD培养液中的酵母细胞要实现单细胞分离，光解材料层所接受的激光能量应小于7μJ，最优值为7μJ，光斑直径最优为40μm。
为考察激光脉冲对分离细胞活性的影响关系，本实施例将无受到任何激光照射的酵母细胞作为控制组，并将其细胞生长率与所分离细胞的生长率作进行对比，评估激光脉冲对分离新报活性的影响关系。如图5所示，横坐标为酵母细胞的体外培养时间，纵坐标为酵母细胞的生长率。控制样本组的酵母细胞的培养时间为4h时，其生长率为2。与控制样本组相比，采用本发明方法分离得到的酵母细胞的生长率都受到影响。激光光能范围设置在1～15μJ内的细胞培养4h后，其生长率均约为1.1上下，说明此时进行分裂繁殖的细胞数量较少，只有约为10％的传送细胞完成了繁殖。当激光光能小于7μJ时，酵母细胞的生长率在培养4h之后可逐渐恢复到正常的繁殖速度，尤其是激光光能设置为1μJ和3μJ时所分离的酵母细胞在培养8小时后的生长率大于2，即其分裂繁殖周期比4小时略短。当激光光能大于9μJ时，传送细胞的生长率也呈现出增长的趋势，但增长缓慢，即细胞出现了大损伤。说明当激光脉冲能量低于7μJ时，酵母细胞的活性几乎不受到损伤或者损伤很小，表明该条件下细胞的功能较完整。
Claims (8)
1.一种分离单细胞的方法，其特征在于，包括：
在光解材料层的表面涂布细胞培养液，培养；
所述光解材料层接收光能发生降解，诱导产生高压脉冲波；
所述高压脉冲波作用于所述细胞培养液，使其液面发生溅射生成液滴，所述液滴包裹细胞，使得单细胞分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光能的来源为激光。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述激光光能为0.5μJ～200mJ。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液的细胞密度为7×105个/mL-7×106/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养为在37℃和体积浓度为5％CO2的条件下进行培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为0.5～12h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光解材料层包含三氮类化合物；
所述三氮类化合物包括：三氮烯类化合物和三氮盐。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光解材料层厚度为0～100nm。
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