CN113227391A - 激光诱导的细胞转移和分选 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于将物体，优选生物物体，尤其是生物细胞转移到基底上的方法。方法包括提供在储库中的媒介物，其中所述媒介物包含物体；提供具有接收器表面的基底，其中所述接收器表面朝向储库的开口；确定媒介物中的第一目标聚集点；以及产生在第一目标聚集点上聚集的第一激光脉冲或第一激光脉冲串。方法的特征在于选择第一目标聚集点处的第一激光脉冲或第一激光脉冲串的脉冲强度和/或第一激光脉冲或第一激光脉冲串的脉冲持续时间，使得第一激光脉冲或第一激光脉冲串产生从媒介物向接收器表面射出的媒介物的液滴；第一激光脉冲或第一激光脉冲串的中心波长大于500nm，优选地大于650nm，最优选地为0.9μm至1.35μm；至少部分地确定媒介物中至少一个物体的位置；以及相对于至少一个物体的位置确定第一目标聚集点。
Description
技术领域
本发明属于生物和医学技术领域。特别地，本发明涉及将物体，特别是生物物体转移到基底上的方法和装置。
背景技术
生物材料且特别是生物细胞在预定位置处的精确定位，例如用于进一步研究，对于生物和医学应用，例如组织工程、生化研究或医学分析和诊断非常重要。因此，已经开发了多种生物印刷技术，其允许例如用于利用生物材料进行模式的受控印刷、对细胞进行分选，以及甚至将单个细胞从一个位点或位置转移到另一个位点或位置。
例如，这可以使用微流体技术如块状细胞印刷(block-cell printing)或喷墨印刷来实现，参见K.Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.111,2948(2014)和T.Boland etal.,Materials Science and Engineering:C 27,372(2007)。块状细胞印刷依赖于微流体通道和微阵列的网络，以将单个细胞捕获在预定的位置，而喷墨印刷则通过沉积媒介物的单个液滴产生包含例如细胞的媒介物的模式。然而，这些技术具有缺点，因为它们可能需要例如用以产生微流体网络的复杂的制造程序，可能强烈依赖于要印刷的物体的性能，并且可能容易阻塞通道或喷嘴，这可能影响印刷的精度和可靠性。
为了克服这些限制，近年来已经提出并实施了基于激光的技术。一个实例是激光诱导前向转移(LIFT)，其使用紧密聚集的激光脉冲来蒸发无机吸收层，在该无机吸收层上沉积有包含物体，例如生物物体如细胞的媒介物，参见例如A.Piqué et al.,Appl.Phys.A69,279(1999)和L.Koch et al.,BioNanoMaterials 15,71(2014)。通过蒸发吸收层所产生的压力能够产生液滴或从媒介物射出的射流，并可能将物体从媒介物运输到基底上。尽管转移的细胞可以显示出较高的存活率，但是吸收层的蒸发可能导致印刷模式被吸收层的小碎片污染。此外，有效产生液滴所需要的包含物体的媒介物的薄的厚度，使得媒介物本身易于不受控制地蒸发。
其他激光辅助的转移方法使用蛋白质水凝胶作为吸收层，以避免被无机材料污染，参见R.Xiong et al.,Biofabrica-tion 9,24103(2017)。由于蛋白质对紫外光的有效吸收，这有助于使用紫外激光进行物体的转移，但通常限于200nm以下的波长，这可能会造成生物材料，特别是DNA的损伤。
从J.Zhang et al.,PLoS ONE 13(5)(2018)了解到一种无需使用吸收层即可将多个细胞从媒介物随机转移到基底上的方法。近红外飞秒激光脉冲聚集在悬浮在水凝胶储库顶部的细胞层下方，以产生朝基底射出的物质射流。
在T.Kaji et al.,Appl.Phys.Lett.91,023904(2007)、Y.Hosokawa et al.,Biomed.Microdevices 9:105(2017)和Y.Hosokawa et al.,Proc.of SPIE 6854,68541K-4(2008)中描述了在水中进行两个基底之间的生物物体的重力诱导的转移。使用飞秒激光脉冲来从物体最初附着的源基底分离物体。
发明概述
因此，本发明的目标是提供用于将物体，特别是生物物体转移到基底上的方法和装置，而不会发生基底被无机物质污染，也不会对物体造成辐射损伤。
该目标分别通过根据权利要求1和21的方法和装置而达到。本发明的实施方案在从属权利要求中有详述。
用于将物体，优选地生物物体，特别是生物细胞转移到基底上的方法包括以下步骤：(1)提供在储库中的媒介物，其中所述媒介物包含物体；(2)提供具有接收器表面的基底，其中所述接收器表面朝向储库的开口；(3)确定媒介物中的第一目标聚集点；以及(4)产生聚集在第一目标聚集点上的第一激光脉冲或第一激光脉冲串。方法的特征在于：(a)选择第一目标聚集点处的第一激光脉冲或第一激光脉冲串的脉冲强度和/或第一激光脉冲或第一激光脉冲串的脉冲持续时间，以使得第一激光脉冲或第一激光脉冲串产生从媒介物向接收器表面射出的媒介物的液滴；(b)第一激光脉冲或第一激光脉冲串的中心波长大于500nm，优选地大于650nm，最优选地为0.9μm至1.35μm；(c)至少部分地确定媒介物中至少一个物体的位置；以及(d)相对于至少一个物体的位置确定第一目标聚集点。以上步骤的编号仅是为了清楚起见，并不表示一定的执行顺序。在技术上可行的情况下，可以对步骤进行排列，并且可以以这些步骤的任意顺序来执行方法及其任何实施方案。
这种方法提供了一种有效且温和的方式来将物体，例如生物物体，如细胞从媒介物放置到基底上，并且例如允许对单个细胞进行受控转移。与从现有技术中已知的技术相反，该方法不依赖于使用除包含物体本身的媒介物以外的吸收物质，从而降低了污染的风险。相反，将第一激光脉冲或第一激光脉冲串的脉冲强度和/或脉冲持续时间选择得足够大，以使得第一激光脉冲或第一激光脉冲串与媒介物之间的直接相互作用导致产生液滴，其可以将物体输送到接收器表面。此外，由于缺少吸收材料，该方法不需要使用调整至吸收物质的波长。这允许调节第一激光脉冲或第一激光脉冲串的中心波长，以将损坏转移的物体的可能性最小化。通过使用特别是0.9μm-1.35μm的近红外光谱中的波长，与紫外光相比，可以降低生物体对激光的吸收率。此外，通过确定至少一个物体的位置并基于该位置选择第一目标聚集点，可以提高转移效率并且可以实现对转移物体的数量的精确控制。
首先，提供基底和包含物体的媒介物。所述媒介物可以例如是液体或凝胶，特别是包含水溶液和不溶性聚合物的混合物的水凝胶。可以选择媒介物，以使得其可以维持生物物体，例如细胞较长的时期。媒介物可以表现出特定的光吸收特性，例如其可以在可见和/或近红外光谱中是透明的，以避免第一激光脉冲或第一激光脉冲串的共振吸收。可以在将媒介物插入储库中之前或之后将物体添加到媒介物中。物体的尺寸可以例如在每个方向上为0.1μm-200μm。物体可以是生物物体，如细菌、抗体、蛋白质、DNA或其他生物分子。特别地，生物物体可以是生物细胞。在其他实例中，物体可以是无机物体，例如玻璃颗粒。在一个实例中，物体可以是任何前述物体的组合。
通常，将储库定向以使得媒介物的朝向储库开口的表面(其在下文中称为“媒介物的表面”)与重力方向垂直。相应地，与媒介物的表面平行的平面或方向在下文中分别称为水平面或水平方向，而与媒介物的表面垂直的方向称为垂直方向。然而，取决于媒介物的粘度，也可以选择储库的方向，以使得媒介物的朝向储库开口的表面不一定与重力方向垂直，即如上所定义的垂直方向可能未与重力方向对齐，或者储库位于诸如太空的非重力环境中。储库也可以是芯片实验室系统。此外，媒介物的表面可能不是平坦的，在这种情况下，垂直方向由与媒介物的表面的所有法向量的平均值相对应的向量定义，且水平面是与垂直方向垂直的平面。注意，每当相对于除媒介物外的元素，例如储库或基底的运动自由度使用术语“水平”或“垂直”时，技术人员都自然会理解，相应的方向或平面通常相对于相应的元素是固定的，并因此仅对于元素的适当方向而言是水平或垂直的。
基底具有将转移一个或多个物体的接收器表面，并且可以例如是载玻片或培养皿或芯片实验室系统。优选地，基底由透明物质制成，但也可以例如在其他实例中是不透明的。放置或安装基底，以使得接收器表面朝向储库的开口。优选地，接收器表面与通过开口暴露并置于临近该表面，例如距离小于3mm的媒介物表面平行。接收器表面可以是平坦的，或者可以表现出诸如凸起或凹陷的特征，例如凹痕、隆起或凹槽或其模式。接收器表面可以特别地成形为便于物体粘附到接收器表面。
随后，确定第一目标聚集点，其中第一目标聚集点位于储库中所包含的媒介物中。第一目标聚集点的确定包括至少部分地确定媒介物中至少一个物体的位置。在本申请的上下文中，“至少部分地”确定位置是指确定位置的至少两个空间坐标。所述至少一个物体的位置可以例如沿两个或三个正交方向确定。例如，至少一个物体的位置可以沿着与媒介物的接收器表面和/或表面平行的方向来确定，但是不可以沿着正交方向，例如垂直方向来确定。特别地，可以至少部分地确定媒介物中的物体的分布，其中所述分布包括多个物体的位置。至少一个物体的位置可以例如通过对媒介物中的至少一个物体成像和从所述图像提取位置来获得。在另一个实例中，可以预先知道储库中的至少一个物体的位置，例如通过在包含微阱的储库中提供媒介物，每个微阱包含一个物体，并通过确定储库的位置来获得至少一个物体的位置。至少一个物体的位置例如，由自动和和/或模式识别技术手动确定。可以例如手动和/或利用自动化拟合和/或模式识别技术确定至少一个物体的位置。
相对于至少一个物体的位置选择第一目标聚集点。例如，如果确定了一个物体的位置，则第一目标聚集点可以沿着一个方向与物体的位置对准，其中沿着一个方向对准两个点意味着连接两个点的向量与这个方向平行。第一目标聚集点可以例如沿第一激光脉冲或第一激光脉冲串的传播方向或与接收器表面和/或媒介物的表面正交的方向与物体的位置对准。可选地，第一目标聚集点可以沿着一个方向与物体的位置对准直到偏移，该偏移可以基于其他物体的位置被预先定义或确定。另外，可以选择第一目标聚集点，以使得第一目标聚集点位于远离物体或媒介物的表面预定的距离处。第一目标聚集点可以被约束为位于预定平面内，并且仅可以相对于至少一个物体的位置选择平面内的坐标。如果多个物体的位置被至少部分地确定，则可以从多个物体中选择要转移的物体，并且第一目标聚集点可以与所选物体的位置对准。在另一个实例中，第一目标聚集点可以被放置为满足预定条件，例如在预定区域中存在一定数量的物体，或者到相邻物体的距离最小。另外，当例如通过将第一目标聚集点与目标位置附近物体的位置对准或者通过选择第一目标聚集点以使得物体、目标位置和第一目标聚集点位于一条直线上，而确定第一目标聚集点时，接收器表面上将转移一个或多个物体的目标位置可被明确，并且可被考虑。
然后产生第一激光脉冲或第一激光脉冲串，并聚集到第一目标聚集点上。第一激光脉冲可以是单个连续的激光脉冲，例如飞秒激光脉冲。第一激光脉冲串可以由紧密连续的一系列的激光脉冲，例如1μs内10个单独的飞秒激光脉冲组成。为了简单起见，在下文中仅使用术语“第一激光脉冲”，但其应该解释为是指第一激光脉冲或第一激光脉冲串。换言之，每当在本文中提及“激光脉冲”时，这可能涉及单个激光脉冲或紧密间隔的后续脉冲的模式，而无需进一步提及。第一激光脉冲具有的中心波长大于500nm，优选地大于650nm，最优选地为0.9μm至1.35μm，以减少物体的吸收，特别是对于生物物体和其他生物物质。此处，第一激光脉冲的中心波长被定义为具有最大光强度的波长。取决于脉冲持续时间，第一激光脉冲可以具有超过1nm的谱宽，其中所述谱宽被定义为第一激光脉冲的强度光谱的半最大处的全宽。
第一激光脉冲具有在第一目标聚集点处的聚集，即第一激光脉冲的强度在第一目标聚集点处表现出空间中的局部最大值。第一目标聚集点可以对应于在第一激光脉冲的腰部，特别是平均腰部中的局部最小值。当第一激光脉冲通过介质传播时，第一激光脉冲的强度增加直到第一目标聚集点，并随后在通过第一目标聚集点之后再次降低。第一目标聚集点处的第一激光脉冲的最大强度，即在第一激光脉冲通过时在第一目标聚集点处发生的最高强度，在下文中称为第一激光脉冲的峰值强度。所述强度被选择得很高，以使得第一激光脉冲的光和媒介物之间的相互作用产生对媒介物的干扰。另外，第一激光脉冲的持续时间足够长，以使得干扰产生了从媒介物向接收器表面射出的媒介物的液滴。
液滴可以例如是单个液滴，即充满了与储库中所含的媒介物分离的媒介物的连续体积，可以包含多个液滴，或者可以是从储库中的媒介物向接收器表面移动同时仍然与储库中的媒介物连接的媒介物射流。液滴可以包含一个或多个物体，并且可以将它们从储库中的媒介物中去除。优选地，液滴以足以到达接收器表面的速度从媒介物中射出。当液滴到达接收器表面时，液滴中包含的一个或多个物体可以粘附在接收器表面上。
为了产生液滴，第一目标聚集点处的脉冲强度可能会超过媒介物的非线性光化电离阈值。在这种情况下，来自第一激光脉冲的多个光子的吸收可能使来自媒介物的分子或原子电离，这可能导致媒介物的光学击穿。这样的过程可能导致在第一目标聚集点附近形成等离子体，其可以产生快速膨胀的空化气泡。当空化气泡扩展到接近媒介物的表面时，空化气泡的膨胀随后可以产生液滴。在一个实例中，第一激光脉冲的峰值强度约为1015W/cm2。如果电离是通过多光子过程引起的，则电离率随强度呈非线性变化，从而电离主要发生在第一目标聚集点紧密临近处，而其余的媒介物不受第一激光脉冲的干扰。另外地或可选地，其他过程可能有助于该液滴的形成，例如通过吸收和发射过程对媒介物的快速加热或压力波的扩展。
物体可以位于媒介物表面附近的表面层中。这允许将第一目标聚集点定位在靠近表面的位置，并从而可以促进液滴的生成以及通过液滴转移物体。在一个实例中，表面层从媒介物的表面延伸到50μm的深度。表面层可包含媒介物中的所有物体或媒介物中的大部分物体，例如超过80％的物体。为了将物体定位在表面层中，媒介物可以是密度梯度媒介物，其具有大于物体的密度并因此产生浮力。在一个实例中，媒介物可以具有大于1.07g/ml的密度。方法可以包括孵育储库中的媒介物，例如以确保物体上升到密度梯度媒介物的表面。
优选地，第一目标聚集点位于表面层的与接收器表面相对的面上，即第一目标聚集点位于如从接收器表面看到的表面层后面(即通常下面)的平面内。因此，可以增加液滴包含一个或多个物体的可能性。第一目标聚集点可以位于媒介物表面下不到300μm，优选地50μm-100μm。
在优选的实施方案中，方法包括对媒介物中的物体成像，例如以至少部分地确定至少一个物体的位置。物体的成像可以例如用常规的光学显微镜来进行，例如通过利用物镜将媒介物中的图像平面成像到摄像机或共聚焦显微镜的图像传感器上。物体可以用荧光标记物标记，并且可以被照明以进行成像。物体可以通过单光子对比方法来成像，例如通过测量光的传播、反射或散射；通过荧光成像或通过相衬成像。另外或可选地，可以使用超分辨率技术，如光激活定位显微镜(PALM)或随机光学重建显微法(STORM)。在其他实例中，可以采用多光子成像技术，例如双光子荧光、相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)、二次或三次谐波发生或者另一种非线性对比产生方法。从图像中，可以至少部分地确定媒介物中物体的分布，其中可以例如手动和/或使用拟合例程和/或模式识别技术提取所述分布。对物体成像可以包括在不同的时间点采集多个图像，例如以确认物体的分布是平稳的。特别地，可以在产生第一激光脉冲之前和之后采集图像，例如以确认已成功将物体从媒介物中移除。
方法还可以包括从物体的分布中鉴别出单个物体，其中所述单个物体在空间上与其他物体分离，例如如果仅将一个物体转移至接收器表面。例如，如果物体周围50μm半径内没有其他物体，则可以将物体视为在空间上分离的。在另一个实例中，可以相对于媒介物的表面与第一目标聚集点之间的距离确定半径，例如如果将第一目标聚集点设置为距表面固定的距离，则可能需要半径大于该固定的距离。可以至少部分地确定单个物体的位置，并且可以相对于单个物体的位置选择第一目标聚集点。例如，第一聚集点可以沿着一个方向，例如与媒介物表面垂直的垂直方向与单个物体的位置对准，以利用第一激光脉冲选择性地将单个物体转移到接收器表面。
为了将第一激光脉冲聚集在第一目标聚集点上，方法可以包括将第一激光脉冲的聚集与第一目标聚集点对准。第一激光脉冲的聚集可以例如通过物镜产生，第一激光脉冲通过该物镜传播。对准聚集可以包括改变物镜和储库之间的距离，即使物镜和储库相对彼此移动。在一个实例中，储库可以沿着两个正交的方向移动，例如在水平面上，并且物镜可以沿第三方向移动，例如垂直方向。在另一个实例中，只能移动储库，而物镜是固定的。
可选地或另外，对准第一激光脉冲的聚集可以包括改变第一激光脉冲的传播方向，特别是通过物镜之前的传播方向。例如，可以调节第一激光脉冲在物镜上的入射角，即第一激光束在物镜前面的传播方向与物镜的光轴之间的角度，以改变聚集的位置。在另一个实例中，可以改变第一激光脉冲在物镜前面的平行位移，例如以改变第一激光脉冲在媒介物中的传播方向同时保持位置聚集。
对准第一激光脉冲的聚集还可以包括改变第一激光脉冲的空间强度模式和/或空间相模式，例如第一激光脉冲在通过物镜成像在第一媒介物中的平面中的强度分布或第一激光脉冲在物镜前面的平面中的相分布。在一个实例中，对准第一激光脉冲的聚集涉及改变镜头，例如可电力或机械调节的聚集可调镜头的焦距。
在优选的实施方案中，方法另外还包括确定接收器表面上的目标位置和将目标位置与第一目标聚集点沿一个方向对准。目标位置可以指定转移物体的接收器表面上的位置。目标位置可以作为外部输入，例如作为接收器表面上的一组坐标获得。在另一个实例中，确定目标位置可以涉及鉴别接收器表面上的特征，例如物体的位置或集合结构，相对于该特征来选择目标位置。确定目标位置可以涉及采集接收器表面的图像。为了将目标位置与第一目标聚集点对准，可以相对于储库，例如沿与接收器表面平行的两个正交方向移动基底。另外，可以在与接收器表面垂直的方向上移动基底，例如以达到接收器表面与媒介物表面之间的预定距离，例如以产生转移的液体和/或物体的3d模式。
基底的接收器表面可以覆盖有缓冲膜，特别是细胞外基质凝胶。缓冲膜可以抑制降落物体的冲击，促进物体的粘附和/或为接收器表面上的物体提供湿润的环境。涂层的厚度可以例如为50μm至150μm。另外，接收器表面可以被粗糙化、模式化或结构化以促进粘附。在一个实例中，接收器表面可以是芯片实验室系统的一部分。
第一目标聚集点处的第一激光脉冲的直径可以小于5.0μm，优选地小于2.0μm。这可以通过使用具有较大数值孔径，例如超过0.5的数值孔径的物镜，和/或物镜前面较大直径的第一激光脉冲来实现。第一聚集点处的第一激光脉冲的直径可被调整至第一激光脉冲的脉冲能量和/或脉冲持续时间，以在第一目标聚集点处实现足以产生液滴的强度。由于紧密聚集的第一激光脉冲的较强的发散性，在第一目标聚集点处选择较小的直径还可以降低聚集外部的物体位置处的强度。
在优选的实施方案中，第一激光脉冲是具有1fs-1ps，特别是300fs-700fs的脉冲持续时间的飞秒激光脉冲。可选地，第一激光脉冲，即第一激光脉冲串可以是一系列的飞秒激光脉冲，优选地具有300fs-700fs的脉冲持续时间的飞秒激光脉冲。可以基于媒介物选择脉冲持续时间。例如，当使用具有较高非线性光化电离阈值的媒介物时，相比具有较小非线性光化电离阈值的媒介物，可以选择较短的脉冲持续时间以增加第一目标聚集点处的第一激光脉冲的强度。在一些实例中，脉冲持续时间可以长于1ps，例如多达10ns。
第一激光脉冲的中心波长和/或谱宽可以调整至物体的吸收光谱，例如以减小物体被第一激光脉冲损伤的可能性。例如，可以确定吸收光谱中的局部最小值，并且可以将中心波长设置为吸收光谱中出现最小值处的波长。另外，可以选择谱宽，以使得第一激光脉冲的整个波长光谱接近最小值。在另一个实例中，中心波长可以在一定范围内，其中已知生物组织显示很少的吸收并且具有足够大的输出功率的激光源是可用的，例如，在0.9μm-1.35μm的近红外窗中，其中生物组织的吸收系数可比200-400nm的紫外光谱中小超过一个数量级。中心波长还可调整至包含物体的媒介物，例如以避免在UV光谱，例如低于200nm中进行电子激发，以及在1.35μm以上的中红外光谱中共振激发水分子中的振动跃迁。
在一个实例中，媒介物可以包含不同类型的物体，例如第一种和第二种类型的细胞。在这种情况下，确定至少一个物体的位置可以包括确定至少一个物体的类型，即区分所述至少一个物体是否属于第一种类型或第二种类型。可以例如从物体的尺寸和/或形状确定物体的类型。在另一个实例中，可以通过物体类型特异性的标记物标记物体，例如具有不同特征波长的荧光标记，其可以另外被用于确定至少一个物体的位置。为了确定至少一个物体的类型，可以使用上述的任何一种成像方法，例如单光子或多光子对比方法。物体类型的确定可以手动执行，也可以利用可以包括人工智能的图像识别算法自动执行。这可以允许转移某种类型的物体，为此在确定第一目标聚集点时可以考虑至少一个物体的类型。例如，可以从细胞的分布中识别出某种类型的单个细胞，并且可以确定其位置，以相对于该单个细胞的位置设置第一目标聚集点。
储库和/或接收器表面可以是芯片实验室系统，例如配置为提供恒定流动的细胞培养基的芯片实验室系统。激光脉冲可用于鉴别储库中流动的媒介物中特殊类型的物体。可以确定第一目标聚集点，以使得第一激光脉冲将该特殊类型的一个或多个物体转移到接收器表面。也可以在接收器表面上产生细胞媒介物的流动。通过该方式，例如可以进行细胞分选和分离。
方法还可以包括产生第二激光脉冲并将媒介物中的第二激光脉冲聚集在第二目标聚集点上。与第一目标聚集点相似，可以相对于至少一个物体的位置确定第二目标聚集点。在一个实例中，从媒介物中物体的分布中鉴别两个物体，至少部分地确定其位置，并且将第一目标聚集点与一个物体的位置对准，并且将第二目标聚集点与另一物体的位置对准。第一激光脉冲和第二激光脉冲可以同时产生，例如通过分隔单个激光脉冲。可选地，第一激光脉冲和第二激光脉冲可以是由相同激光源发射的单独的激光脉冲。可以针对第一激光脉冲和第二激光脉冲指定接收器表面上不同的目标位置，并且在产生各自的激光脉冲之前与各自的目标聚集点对准。第一激光脉冲和第二激光脉冲可以是相同的，并且特别地可以具有相同的脉冲持续时间、脉冲能量和/或中心波长。第二激光脉冲也可以是第二激光脉冲串。
以类似的形式，方法可扩展至包括任意数量的激光脉冲，其每个可以聚集至不同的目标聚集点。方法也可以例如包括产生聚集在媒介物中的多个目标聚集点上的多个激光脉冲，以产生包括接收器表面上的多个物体的结构。多个激光脉冲和多个聚集点可以例如分别包括超过10个激光脉冲和超过10个聚集点，在一些实例中，分别包括超过100个激光脉冲和超过100个聚集点。可以相对于至少一个物体的位置确定每个目标聚集点。在一个实例中，从媒介物中物体的分布中鉴别多个物体，至少部分地确定多个物体的位置并且将每个目标聚集点与多个物体之一的位置对准。可以针对每个激光脉冲指定接收器表面上不同的目标位置，并且可以在产生各自的激光脉冲之前与各自的目标聚集点对准。这可以例如用于高通量3d生物印刷或细胞分选。可以特别地选择目标位置，以使得在接收器表面上产生包含多个物体的特定结构。该结构可以例如为物体的2d或3d模式，例如周期性模式。
另外，方法可以包括将激光束聚集到媒介物中的第三目标聚集点上。激光束可以是连续波激光束、脉冲激光束或单个激光脉冲。可以从与第一激光脉冲和/或第二激光脉冲相同的激光源产生激光束，或者可以从不同的激光源产生激光束。激光束可以例如用作光镊以捕获物体或作为切割束，例如以将细胞与大块的组织分离。特别地，可以移动第三目标聚集点，同时将激光束聚集在第三目标聚集点上。例如，可以选择最初的第三目标聚集点，例如相对于至少一个物体的位置，并随后可以在打开激光束同时移动至第一目标聚集点或第二目标聚集点。在一些实例中，第三目标聚集点可以位于基底内，或接收器表面上或邻近接收器表面，例如以进行基底或基底上的媒介物的去除式或添加式激光处理，例如通过激光吸收或多光子聚合。
本发明还提供了用于将物体，优选地生物物体，特别是生物细胞转移到基底上的装置，其可以用于实施根据本发明或其实施方案的方法。该装置包括：(1)用于保持媒介物，特别是包含物体的媒介物的储库；(2)基底支撑物，其被配置为保持具有接收器表面的基底，以使得接收器表面朝向储库的开口；(3)被配置为发射激光脉冲的激光源；(4)用于从激光源产生第一激光脉冲的控制单元；以及(5)用于将第一激光脉冲聚集到第一激光脉冲的聚集上的物镜。根据本发明的装置的特征在于：(a)控制单元包括成像模块，其被配置为至少部分地确定媒介物中至少一个物体的位置；(b)控制单元配置为相对于至少一个物体的位置确定第一目标聚集点；(c)控制单元包括聚集模块，其被配置为将第一激光脉冲的聚集与第一目标聚集点对准；(d)第一激光脉冲的中心波长大于500nm，优选地大于650nm，最优选地为0.9μm至1.35μm；以及(e)第一目标聚集点处的脉冲强度和第一激光脉冲的脉冲持续时间足够大，以使得第一激光脉冲产生从媒介物向接收器表面射出的媒介物的液滴。
储库配置为保持包含物体的媒介物，并且可以由不渗透性材料如玻璃或塑料制成。优选地，储库在可见和/或近红外光谱中是透明的，而且能够承受高强度的光。储库的一侧，例如顶部上有开口，并且可以例如形成为类似圆柱形盘、圆柱形实验室烧杯或矩形盒。储库可以整体上或部分地从装置上拆下。储库可以是芯片实验室系统。例如，可以配置芯片实验室系统，以提供恒定流动的新鲜的载有细胞的媒介物，例如用于细胞的高通量3d生物印刷。细胞的高通量3d生物印刷可以例如用于从多个细胞中产生器官或生物结构的一部分。
基底支撑物配置为保持转移物体的基底。为此，配置基底支撑物以用于将基底放置或安装在基底支撑物中，以使得基底的接收器表面朝向储库开口。基底支撑物可作为整体或部分地从装置拆除。此外，基底支撑物可配置为移动基底和/或旋转基底。基底可以是芯片实验室系统。芯片实验室系统可以配置为供应恒定流动的显现的载有细胞的媒介物，例如，用于细胞的高通量3d生物印刷，例如以从多个细胞产生器官或生物结构的一部分。
激光源配置为发射激光脉冲并用作第一激光脉冲的源。激光源可以是脉冲激光，特别是飞秒激光，或者可以可选地是连续波激光，其输出时间被调节以产生脉冲。激光源配置为发射激光脉冲，第一激光脉冲的脉冲能量足够大，以在适当聚集时产生从媒介物射出的液滴。在一个实例中，激光源可以发射脉冲能量大于1μJ，优选地大于5μJ的激光脉冲。激光源配置为发射中心波长为大于500nm，优选地650nm，最优选地0.9μm-1.35μm的激光脉冲。激光源可以具有可调节的波长。
控制单元配置为从激光源产生第一激光脉冲。这里和下文中，“从激光源”“产生”激光脉冲或激光束是指控制激光源或由激光源发射的光以分别从由激光源发射的光产生激光脉冲或激光束。为此，控制单元可以偶联到脉冲成形单元，该脉冲成形单元可以例如配置为传输从激光源发射的一系列激光脉冲的单个激光脉冲，例如响应从控制单元接收到的触发信号。脉冲成形单元可以包括一个或多个光交换元件，例如声光调制器、电光调制器和/或机械快门。脉冲成形单元可以是激光源的一部分。
第一激光脉冲通过物镜，其将第一激光脉冲聚集在第一激光脉冲的聚集上。优选地，放置物镜以使得物镜的聚焦点位于储库内，并且当安装在基底支撑物中时基底位于物镜和物镜的聚焦点之间。选择物镜的有效焦距和/或物镜前面第一激光脉冲的直径，以使得第一激光脉冲的光强度在聚集处足够大，以产生从媒介物射出的液滴。物镜可以是单个镜头，或者可以包括多个镜头。物镜可以是具有超过0.5的数值孔径的高NA物镜，并且可以具有大于3mm的工作距离。在一些实例中，物镜可以是浸没物镜，例如油浸物镜，其数值孔径大于1.0。可以针对物镜和物镜聚焦点之间的元件，例如基底、储库或媒介物至少部分地校正物镜。
控制单元进一步配置为确定第一目标聚集点。为此，控制单元包括成像模块，其配置为至少部分地确定媒介物中至少一个物体的位置。成像模块可以配置为分析媒介物中物体的一张或多张图像，例如以经由拟合和/或利用模式识别技术确定物体的位置。成像模块还可配置为从用户接收输入，例如要确定物体的位置的目标区域。为了确定如上所述的第一目标聚集点，控制单元配置为从成像模块获取至少一个物体的位置。可以以软件、硬件或其组合来实现成像模块。
为了将第一激光脉冲聚集到由控制单元确定的第一目标聚集点上，控制单元包括聚集模块，其配置为控制第一激光脉冲的聚集位置。为此，聚集模块可从控制单元接收第一目标聚集点以及第一激光脉冲的聚集的当前位置。聚集的当前位置对应于第一激光脉冲在装置的当前状态下将聚集的点。聚集模块配置为移动第一激光脉冲的聚集，以使得其与第一目标聚集点对准，即聚集的位置等于第一目标聚集点。聚集模块可以例如配置为调节第一激光脉冲在水平面中的聚集。另外，聚集模块可以配置为调节第一激光脉冲在垂直方向上的聚集。为了移动第一激光脉冲的聚集，聚集单元可以配置为控制一个或多个可移动或可调节的元件，例如储库和/或物镜。为进行对准，聚集模块可以配置为通过持续监视聚集的当前位置，例如，通过产生和成像具有低强度的对准脉冲，而进行主动反馈。聚集模块可以以软件、硬件或其组合来实现。
在优选的实施方案中，装置配置为产生具有超过媒介物的非线性光化电离阈值的脉冲强度的第一激光脉冲。例如，装置可能能够产生在第一聚集点处具有大于1013W/cm2，优选地大于1014W/cm2的峰值强度的第一激光脉冲。
为了将第一激光脉冲的聚集与第一目标聚集点对准，聚集模块可以配置为通过改变物镜与储库之间的距离而控制第一激光脉冲的聚集位置。储库和/或物镜可以安装在由聚焦模块控制的平移台上，并且配置为分别沿至少一个方向移动储库和物镜。储库还可以安装在由聚集模块控制的旋转台上，并且配置为使储库绕至少一个轴旋转。另外或可选地，聚集模块可以配置为改变第一激光脉冲的传播方向。为此，聚集模块可以配置为控制一个或多个可调节的光学元件，例如具有由聚集模块，例如振镜扫描仪或声光偏转器控制的致动器的可调节镜，其中声光偏转器的射频驱动信号的频率由聚集模块设置。聚集模块也可以配置为改变第一激光脉冲的空间强度模式和/或空间相模式，例如经由空间光调制器如数字微镜装置或液晶阵列。此外，聚集模块可以配置为改变镜头，例如电力或机械控制的聚集可调镜头的焦距。
在一个实例中，装置还可以包括用于对媒介物中的物体成像的成像系统和摄像机。成像系统可以配置为例如通过结合物镜一起形成常规的光学显微镜或共焦显微镜，来将储库中的平面成像到摄像机的传感器芯片上。摄像机例如可以是CCD摄像机、CMOS摄像机或光电二极管。另外，装置可以包括用于照亮媒介物中的物体的光源。光源特别地可以是激光源或窄带光源，其配置为驱动单光子效应，例如以激发附着在物体上的荧光标记，或多光子效应。成像系统还可以配置为对基底的接收器表面成像。光源、成像系统和/或摄像机可以配置为通过单光子对比方法对物体成像，例如通过测量光的传播、反射或散射；通过荧光成像或通过相衬成像。在其他实例中，光源、成像系统和/或摄像机可以配置为通过多光子成像技术，例如双光子荧光、相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)、二次或三次谐波发生或另一种非线性对比产生方法来对物体成像。
在优选的实施方案中，成像模块配置为至少部分地确定物体的分布，即以至少部分地确定多个物体的位置。为此，成像模块可以配置为从摄像机中接收媒介物中物体的图像，并从图像中提取物体的位置。成像模块还可以配置为从如上所述的物体的分布中鉴别单个物体，以及至少部分地确定其位置，其中所述单个物体在空间上与其他物体分离。为此，成像模块可以配置为从物体的分布计算物体间的距离，并找到与其附近的最近物体具有最大距离的物体。成像模块还可以配置为例如从用户接收说明，用于鉴别单个物体，例如，单个物体应位于的目标区域或指定到附近的最近物体的最小距离的阈值半径。
控制单元还可以配置以移动基底，特别是以将接收器表面上的目标位置与第一目标聚集点对准。控制单元可以例如经由外部输入或从成像模块接收目标位置，其可以配置为从如上所述的接收器表面的图像鉴别目标位置。基底支撑物可以包括用于使基底沿着至少一个方向移动的平移台和/或用于使所述基板绕至少一个轴旋转的旋转台。
在一个实例中，装置配置为将第一聚集点处的第一激光脉冲聚集至小于5.0μm，优选地小于2.0μm的直径。此外，激光源可以配置为发射飞秒激光脉冲，优选地具有300飞秒-700飞秒的持续时间。激光源可以配置为发射单个脉冲或以固定的重复率，例如以100kHz的重复率周期性发射激光脉冲。
在优选的实施方案中，控制单元配置为调节第一激光脉冲的中心波长、谱宽、脉冲持续时间和/或脉冲能量。为了控制第一激光脉冲的脉冲能量，控制单元可以偶联至激光源以调节由激光源发射的激光脉冲的脉冲能量，或者脉冲成形单元可以配置为调节第一激光脉冲的衰减。为了改变脉冲持续时间，脉冲成形单元可以例如包括分散元件，例如基于棱镜或基于格栅的脉冲延伸器。
成像模块还可以配置为确定媒介物中至少一个物体的类型，例如通过分析从摄像机接收到的图像上物体的颜色、大小和/或形状；通过利用从光源产生的不同波长的激发光采集物体的多个图像，或通过利用多光子效应。
在一个实例中，控制单元配置为相对于如上所述的至少一个物体的位置确定第二目标聚集点和从激光源产生第二激光脉冲。第二激光脉冲可以在空间上和/或时间上与第一激光脉冲分离。脉冲成形单元可以例如配置为在从控制单元接收第一触发信号时传输第一激光脉冲，和在从控制单元接收第二触发信号时传输第二激光脉冲。可选地，控制单元可以配置为空间分割激光源发射的单个激光脉冲，例如使用束分割器、声光调制器或空间光调制器。控制单元可以配置为独立地控制第一激光脉冲和第二激光脉冲的参数，例如脉冲能量和/或脉冲持续时间。此外，聚集模块可以配置为将第二激光脉冲的聚集与第二目标聚集点对准，类似于与第一目标聚集点的对准。
控制单元还可以配置为从激光源产生激光束和确定第三目标聚集点，其中聚集模块可以配置为将激光束的聚集与第三目标聚集点对准。第三聚集点可以例如位于储库中、接收器表面上或邻近接收器表面，或基底中。优选地，聚集模块配置为在激光束打开同时改变激光束的聚集。在另一个实例中，装置可以包括另外的激光源以产生激光束。激光束可以是连续波激光束、脉冲激光束或单个激光脉冲。控制单元可以配置为控制脉冲持续时间、脉冲能量和/或激光束的功率。控制单元和聚集单元可以特别地配置为进行基底或基底上的媒介物的去除式或添加式激光处理，例如通过激光吸收或多光子聚合。
装置还可以包括转移室，转移室包含储库和安装在基底支撑物中的基底。转移室可以特别地是温控的孵育室，其中控制单元可以配置为主动调节孵育室中的温度。在另一个实例中，装置可以包括与转移室分开的温控的孵育室，并且可以配置为将基底从转移室转移至孵育室。
附图说明
在下文中，参考附图给出本发明及其示例性实施方案的详细描述。附图显示了以下的示意性图示：
图1：根据本发明的示例性实施方案的用于将物体转移到基底上的装置；
图2a：根据本发明的实施方案的用以将物体转移到基底上的方法的流程图；
图2b-图2f：根据本发明的实施方案的单个细胞的激光诱导的转移；
图3a：根据本发明的实施方案的使用两个激光脉冲将物体转移到基底上的方法的流程图；
图3b-图3d：根据本发明的实施方案的单个细胞的细胞类型特异性的激光诱导的转移；
图4a：根据本发明的实施方案的使用光钳将物体转移到基底上的方法的流程图；
图4b-图4e：根据本发明的实施方案的利用光钳捕获、移动和转移单个细胞，以及
图5a-图5c：使用根据本发明的示例性实施方案的装置和方法实验获得的细胞转移的显微镜图像。
优选实施方案的描述
图1示出了根据本发明的示例性实施方案的用于将物体102转移到基底104上的装置100。在下文中，描述了多个实例，其中物体102是生物细胞。然而，这并不旨在以任何方式进行限制。在其他实例中，物体102可以是无机物体如玻璃颗粒或生物物体如细胞、细菌、抗体、蛋白质或其他生物分子或以上的组合。装置100包括储库106，其可以例如成形为类似圆柱形盘、圆柱形实验室烧杯或在一侧有开口的矩形盒。储库106可以由不可渗透材料如玻璃或塑料制成，其优选地在可见和近红外光谱中是透明的并且能够承受高光强度。储库106配置为保持包含细胞102的媒介物108。储库可以是芯片实验室系统，例如配置为提供恒定流动的媒介物的芯片实验室系统。储库106整体或部分地可以从装置100上拆卸下来，例如以将媒介物108填充到储库106中。媒介物108可以是液体或凝胶，特别是包含水溶液和不溶性聚合物的混合物的水凝胶。媒介物108可以是密度大于细胞102密度的梯度媒介物，以使细胞102积聚在媒介物108表面附近的表面层中。优选地，媒介物108在可见和近红外光谱中是透明的。
通常，将储库106定向以使得媒介物108被包含在储库106中，并且媒介物108的表面，即媒介物108朝向储库106的开口的表面垂直于重力方向。如上文所定义，在下文中，平行于媒介物108的表面的平面或方向因此分别称为水平面或水平方向，而垂直于媒介物108的表面的方向称为垂直方向。然而，取决于媒介物108的粘度，也可以选择储库106的方向，以使得媒介物108朝向储库106的开口的表面不一定与重力方向垂直，即如上定义的垂直方向可能与重力方向不对齐。
装置100还包括基底支撑物110，其中可以安装基底104，以使得基底104的接收器表面112朝向储库106的开口。基底支撑物110整体或部分地可以从装置100拆卸，例如，以在其上放置或安装基底104。基底支撑物110还可以配置为移动基底104，例如在两个或三个正交方向上，和/或旋转基底104。为此，基底保持器110可以包括平移和/或旋转台(未示出)。
另外，装置100包括配置为发射激光脉冲的激光源114。激光源114可以是脉冲激光，例如调Q激光或锁模的激光，特别是飞秒激光。可选地，激光源114可以是连续波激光，其输出时间被调节以产生脉冲，例如使用声光和/或电光调制器。激光源114的中心波长大于500nm，优选地大于650nm，并且可以例如为0.9μm至1.35μm。中心波长还可以调整至生物细胞的吸收光谱，其中吸收光谱可以将特定类型的生物细胞，例如细胞102，或不同类型的多种生物细胞吸收的光定征为光波长的函数。优选地，选择中心波长，如以将细胞102对激光的吸收最小化，例如通过选择吸收光谱中的最小值处或接近最小值的波长。激光源114可以例如是Ti掺杂的：激光、Yb掺杂的激光或Nd掺杂的激光。激光源114的中心波长可以是可调的，例如通过采用可调的Ti:Sapphire激光或非线性波长产生，例如以促进将中心波长调节至吸收光谱。
激光源114配置为发射具有足够大的脉冲能量和足够短的脉冲持续时间的激光脉冲，以使得激光脉冲在聚集至合适的直径和媒介物108内的适当位置时产生从储库106射出的媒介物108的液滴，如下文中更详细描述的。例如，这可能是由于激光脉冲使媒介物108或媒介物108的成分之一发生光化电离而发生的，这可能导致媒介物108发生光击穿。优选地，激光脉冲通过多光子过程诱导非线性光化电离，以使得光化电离速率非线性地取决于光强度，并因此在激光脉冲聚集附近急剧增加。为此，激光源114的中心波长还可以调整至媒介物108的吸收特性，特别是避免共振的单光子吸收。激光脉冲的脉冲能量可以大于1μJ，优选地大于5μJ，并且激光脉冲的脉冲持续时间可以短于1ps，优选地为300fs至700fs。特别地，可以调节脉冲能量和脉冲持续时间，以使得激光脉冲聚集处的脉冲强度高于媒介物的非线性光化电离阈值。
装置100包括用于将激光源114发射的光聚集到聚集118上的物镜116。沿着激光源114和物镜116之间的光路，可以放置各种光学元件，例如镜120。镜120可以是可调节的，以将光路对准到物镜116上。可选地或另外，装置100可以包括其他可调节的光学元件，例如检流计扫描仪、声光偏转器或电光偏转器。另外，折射元件如透镜可以用于调节由激光源114发射的脉冲的直径，例如以获得物镜116前面的准直束。选择物镜116的有效焦距和物镜116前面的激光脉冲的直径，以使得具有由激光源114提供的脉冲能量和脉冲持续时间的激光脉冲的光强度在聚集118处足够大，以产生如上所述的媒介物的液滴。物镜116可以例如具有大于0.4，例如0.6的数值孔径。在一些实例中，物镜116可以是浸没物镜，例如油浸物镜，其具有大于1.0的数值孔径。通过物镜116聚集在聚集118上的激光脉冲的大小可以例如为1μm至2μm，具体取决于中心波长、物镜的焦距和物镜116前面的激光脉冲的直径。优选地，物镜116位于储库106上方，以使得物镜116的光轴垂直于媒介物108的表面，即物镜116的光轴与垂直方向平行。然而，在其他实例中，物镜116的光轴可以相对于垂直方向倾斜，例如，倾斜小于10°的角度。可选地，物镜116也可以以倒置显微镜配置放置在储库106的下方，或者可以朝向储库106的一侧，特别是垂直侧，其中物镜116的光轴可以与水平面平行。这可能例如有利于促进安装和拆卸基底。
此外，装置100包含控制单元122，其配置为从激光源114产生第一激光脉冲，即以控制激光源114或激光源114发射的光，以产生第一激光脉冲。第一激光脉冲可以是单个连续的激光脉冲或紧密间隔的连续的多个激光脉冲，即第一激光脉冲串。为了做到这一点，控制单元122可以耦合到脉冲成形单元124，其可以配置为从激光源114发射的连续的激光脉冲流产生第一激光脉冲，例如通过仅传送包括多个连续脉冲的单个激光脉冲或脉冲串。脉冲成形单元124可包括一个或多个光交换元件如声光调制器、电光调制器和/或机械快门。在一个实例中，脉冲成形单元124可以被集成到激光源114中，例如以调制连续波激光束或作为主动调Q。脉冲成形单元124可以配置为在从控制单元122接收到触发信号之后产生第一激光脉冲。另外，脉冲成形单元124可以配置为改变激光源114发射的激光脉冲的时间轮廓和/或脉冲持续时间，以产生第一激光脉冲，例如利用分散元件。控制单元122可以配置为控制第一激光脉冲的脉冲能量，例如通过经由脉冲成形单元124控制第一激光脉冲的衰减或通过控制激光源114的输出功率。
控制单元122可以配置为从激光源114产生另外的激光脉冲，例如第二激光脉冲，和/或激光束，其可以是连续波激光束或脉冲激光束。脉冲激光束可以包括一系列的激光脉冲，其可以与第一和/或第二激光脉冲相同。优选地，控制单元122配置为控制激光束的平均功率，例如通过脉冲成形单元124，特别地以使得激光束的平均功率比第一激光脉冲的平均功率小得多。例如，激光束可以包括脉冲，其具有的脉冲能量小于第一激光脉冲的脉冲能量的10％，优选地小于1％。
控制单元122还包括聚集模块126，其配置为控制位置聚集118。为此，聚集模块126可以配置为移动储库106和/或物镜116，例如通过控制其上安装有储库106和/或物镜116的平移台(未示出)。在一个实例中，储库106可以放置在能够在如图1中通过水平箭头所示的水平面内移动储库106的两轴平移台上，并且物镜116可以安装在提供如图1中通过垂直箭头所示的垂直行程的线性平移台上。可选地，储库106和/或物镜116可以在三个正交方向上移动。在另一个实例中，聚集模块126可以在通过物镜116之前通过改变第一激光脉冲的传播方向来控制聚集118的位置。为此，聚集模块126可以例如控制可调节的镜，例如利用压电致动器、振镜扫描仪、声光偏转器或电光偏转器，其可使得能够快速定位聚集118。可选地或另外，聚集模块126可以配置为更改第一激光脉冲的空间强度模式和/或空间相模式以定位聚集118，例如通过空间光调制器如数字微镜装置或液晶阵列。在这种情况下，聚集模块126可以配置为同时将一个或多个激光脉冲聚集到不同的焦点上。在另一个实例中，聚集模块126可以配置为调节镜头的焦距，例如物镜116的有效焦距或物镜116前面的光路中放置的聚集可调镜头的焦距。聚集模块126还可以配置为控制基底104的移动，例如用于将其相对于聚集118定位。
控制单元122包括成像模块128，其配置为至少部分地确定媒介物108中的至少一个细胞102的位置，特别是细胞102的分布。成像模块128可以与摄像机130，例如CCD摄像机或CMOS摄像机连接，其配置为通过成像系统132对细胞102成像。成像系统132可以例如是连同物镜116一起将储库106内的图像层成像到摄像机130的图像传感器上的镜头。成像系统132可以包括另外的光学元件。此外，成像系统132可以配置为在没有移动物镜116的情况下成像储库内的不同平面，并且可以配置为成像不包含聚集118的平面，例如包含细胞102的表面层中的平面或接收器表面112上的平面或邻近其的平面。为了对细胞102的分布成像，装置100还可以包括光源134以照亮图像平面。来自光源134的光可以通过物镜116或沿不通过物镜的光路，例如相比物镜116从储库106的相对侧，指向图像平面。光源134可以是宽带光源，例如卤素灯或发光二极管，或者可以是单色光源如激光。特别地，光源134可以发射适合于激发附着到细胞102上的光学标签，例如荧光团、量子点或氮空位中心的波长处的光。可以使用镜136，特别是二向色镜，将光源134发射的光与成像系统132的光路重叠。相应地，镜120也可以是二向色镜，例如配置为传送与成像相关的一个或多个波长和反射激光源114的中心波长的二向色镜。
摄像机130、成像系统132和光源134可以例如配置为进行对比成像方法，例如线性对比方法、非线性对比方法或超分辨率技术如光激活定位显微镜(PALM)或随机光学重建显微法(STORM)。线性对比方法包括例如单光子吸收成像、单光子传送成像和单光子荧光成像。非线性对比方法包括例如双光子荧光成像、二次或三次谐波发生和相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)。
成像模块128可以配置为从摄像机130获取细胞102的分布的图像，并且可以配置为分析该图像，例如以鉴别一个或多个单个细胞并确定它们的位置。为此，成像模块128可以配置为执行模式识别算法和/或拟合程序。成像模块128可以配置为区分不同类型的生物细胞，并单独确定它们的分布，例如通过确定图像中细胞102的大小和/或形状，或通过检测细胞类型特异性的标志物，例如荧光标记。成像模块128还可以配置为将图像提供给外部装置，例如计算机、显示器和/或数据存储装置(未示出)。成像模块128还可以配置为接收目标区域，例如经由输入从用户，其中要鉴别单个细胞。成像模块128还可以配置为获取接收器表面112的图像，例如以确定被转移到接收器表面112的细胞的分布或鉴别或选择接收器表面112上的目标位置。此外，成像模块128可以配置为确定储库106、基底104和/或聚集118的位置，并将该位置提供给聚集模块126。
除了图1所示的组件外，装置100还可具有另外的组件。储库106和基底104可以例如被容纳在转移室160中，转移室160被示出在例如图2b-图2f中。转移室160可以特别地是孵育室，其可以是温度受控的。为此，装置100可以包括一个或多个温度传感器、加热元件、冷却元件和/或温度控制单元(未示出)。装置100还可以与光学显微镜，例如共聚焦显微镜或荧光显微镜(未示出)组合。
图2a显示了根据本发明的实施方案的用于将物体，特别是生物物体如生物细胞转移到基底上的方法140的流程图。图2b-图2f示意性地示出了方法140的一些步骤。在下文中，方法140是参照如图1中描绘的装置100及其组件来描述的，其中物体102是生物细胞，但是方法140也可以使用根据本发明的各种实施方案的其他装置和/或其他物体来实现。
在步骤142中，在储库106中提供媒介物108，其中媒介物108包含细胞102。可以在将媒介物108填充到储库106中之前或之后将细胞102添加到媒介物108中。步骤142可以包括孵育期，在该孵育期中在储库106中孵育媒介物108，例如当使用密度梯度媒介物以使细胞102积聚在媒介物108的表面层中或以实现细胞102在整个媒介物108中或在表面层中的均匀分布时。在一些实例中，提供媒介物108可以包括在储库106中产生媒介物108的流动，例如使用芯片实验室系统作为储库106，例如用于细胞分选。
在步骤144中，通过将基底104安装或放置在基底支撑物110中来提供基底104，以使得接收器表面112朝向储库106的开口。该步骤可以包括利用媒介物涂覆接收器表面112，所述媒介物可以与媒介物108相同。在另一个实例中，接收器表面112可能已经预先涂覆。特别地，接收器表面112可以涂有缓冲膜，以减轻对转移到接收器表面112的细胞的影响。缓冲膜还可以为转移的细胞提供合适的环境，并且可以含有细胞外基质蛋白质，例如以保护细胞免于干燥和/或增强细胞对基底的粘附。在一些实例中，基底104可以是芯片实验室系统，例如配置为产生细胞待转移的接收器媒介物的流动的芯片实验室系统，例如用于细胞分选。
随后，在步骤146中至少部分地确定媒介物108中至少一个细胞102的位置，优选地媒介物108中细胞102的分布。这可以例如通过利用摄像机130获取细胞102的一张或多张图像来完成，所述图像可以通过成像模块128自动分析或有用户手动分析，例如以确定一个或多个细胞102的位置或以确定至少一部分媒介物108中细胞102的空间密度。
在步骤148中，相对于如图2b中所示的至少一个细胞的位置确定第一目标聚集点162。第一目标聚集点162可以例如通过鉴别单个细胞164和至少部分地确定单个细胞164的位置，例如通过确定单个细胞164在水平面，即与媒介物108的表面平行的平面中的位置来确定。可以使用作为参考的单个细胞164的位置来选择第一目标聚集点162。特别地，可以将第一目标聚集点162与单个细胞164在水平面中的位置对准，例如通过沿垂直方向将第一目标聚集点162放置在单个细胞164后面，如从接收器表面112看到的。可以相对于储库106的位置将第一目标聚集点162沿垂直方向的位置保持在固定的位置。优选地，第一目标聚集点162的垂直位置设置在与媒介物108的表面，即媒介物108朝向储库106的开口的表面，并因而接收器表面112预定的距离处，以促进通过第一激光脉冲产生媒介物108的液滴。该预定距离可以大于细胞102与媒介物108的表面的平均距离，以确保第一目标聚集点162位于细胞102的后面，并且特别是如从接收器表面112看到的细胞164的后面。预定距离可以小于300μm，优选小于100μm。步骤148可以包括确定媒介物108的表面的位置以在垂直方向上适当地定位第一目标聚集点162。
方法140还可以包括在步骤150中确定接收器表面112上的目标位置166。目标位置166可以例如由用户指定，例如通过提供分别的坐标或某些边界条件，或者可以通过鉴别接收器表面112上的一个或多个特征来确定。这可以例如是接收器表面112上的凹痕、隆起、凹槽和/或另一细胞，可以相对于其选择目标位置166。可选地，可以不指定目标位置166，而仅选择目标位置166作为接收器表面112上的与细胞164相对的位置。
随后，在步骤152中可以将聚集118与第一目标聚集点162对准，以使得聚集118位于第一目标聚集点162的位置处。如上所述，这可以例如通过使用如通过图2b中储库106下方的箭头所示的平移台移动储库106和/或物镜116来完成。可选地或另外，可以通过在通过物镜116之前调节第一激光脉冲的传播方向；通过第一激光脉冲的调节空间强度模式和/或空间相模式和/或通过改变镜头的焦距，来移动聚集118。为了促进对准，控制单元122可以配置为产生对准束，例如从激光源114或光源134，以指示聚集118的当前位置，其可以例如利用摄像机，例如摄像机130成像，并且可以用作对准过程的主动反馈。在对准程序中，可以监测细胞102的分布，特别是细胞164的位置，并且可以相应地更新第一目标聚集点162，例如以在对准聚集118同时调节细胞102的移动。在一个实例中，可以通过改变第一激光脉冲的传播方向在水平面上对准聚集118，例如利用可调节的镜120、检流计扫描仪、声光调制器或电光调制器，以及通过改变第一激光脉冲的分散在垂直方向对准聚集118，例如通过移动镜头或通过改变镜头的焦距。
步骤152还可以包括将接收器表面112上的目标位置166与第一目标聚集点162在水平面中对准，例如移动基底104以使得目标位置166在垂直方向上位于第一目标聚集点162上方。在对准步骤152后，接收器表面112和储库106可以例如如图2c中所示定位，即二者可以相对于物镜116的光轴水平移位。
在步骤154中，然后通过控制单元122从激光源114产生第一激光脉冲，并通过物镜116聚集在聚集118上，其与第一目标聚集点162重叠。由于在第一目标聚集点162处的第一激光脉冲的高强度，在第一目标聚集点162附近可以形成空化气泡168。例如，可以通过光化电离过程产生空化气泡168，这可能导致媒介物108的光学击穿，特别是非线性光化电离过程，其中来自第一激光脉冲的多个光子使媒介物108中的分子或原子电离。光化电离可能导致高压等离子体的形成和第一目标聚集点162附近温度的快速升高，这可能驱动相转变为气相，并从而产生空化气泡。在另一个实例中，媒介物中分子或原子对多个光子的非线性吸收可能导致第一目标聚集点162附近的温度快速升高，这可能驱动相转变为气相，并从而产生空化气泡。
空化气泡168随后可以如图2d所示迅速膨胀。当空化气泡168接近媒介物108的表面时，如图2e所示，媒介物108的液滴170可以从表面射出。液滴170可以是如图2e所示的单个液滴，但也可以是媒介物108的射流和/或由多个液滴或多股射流组成。如果第一目标聚集点162位于一个或多个细胞的下方，则可以将细胞与液滴170一起从媒介物108射出，例如细胞164。液滴170可以朝接收器表面112射出，并且，如果适当地选择了媒介物108和接收器表面112之间的距离，则可以击中接收器表面112。这所需要的媒介物108和接收器表面112之间的距离可以例如小于3mm。当液滴170击中接收器表面112时，细胞164可以粘附在接收器表面112上。为了增加射出的细胞164保留在接收器表面112上的可能性，可通过合适的媒介物，优选地包含如上所述的细胞外基质蛋白的媒介物，将接收器表面112模式化或结构化和/或涂覆。
为了允许单个细胞的受控转移，可以从多个细胞102中挑选细胞164，以使得到相邻细胞的距离尽可能大或至少足够大以避免转移其他细胞。另外，可以基于细胞102的分布来确定第一目标聚集点162，以使得转移其他细胞的可能性最小。例如，如果在细胞164的相对面附近有两个其他细胞，则可以选择第一目标聚集点162，以使得其位于水平面中两个其他细胞之间的中心，这与将其放置在直接位于细胞164的位置下方相反。在第一激光脉冲已经聚集到第一目标聚集点162上之后，方法140还可以包括采集接收器表面112的图像以确认细胞164已经被成功地转移和/或确定细胞164在接收器表面112上的位置。
图3a示出了根据本发明的实施方案的使用两个激光脉冲将物体，特别是生物物体如生物细胞转移到基底上的方法180的流程图。利用装置100将两个不同类型的单个细胞转移到接收器表面112的该方法180的示例性实施方式示出在图3b-图3d中，但是也可以使用根据本发明的各种实施方案的其他装置和/或其他物体实施方法180。
通过提供类似于图2a中的步骤142和144的媒介物108和基底104来开始方法180，为清楚起见在图3a的流程图中将其省略。如图3b所示，媒介物108可以包含不同类型的细胞，例如，第一类型的细胞200和第二类型的细胞202。可以通过细胞类型特异性标志物，例如具有不同特征波长的荧光标记，来标记细胞200、202。
在步骤182中，类似于上文关于步骤146所描述的那样，确定媒介物中的至少一个细胞的位置。另外，步骤182可以包括确定媒介物中确定了位置的至少一个细胞的类型，例如通过细胞类型特异性的标志物。可选地，细胞200、202可以不被标记，但是可以通过其他特征来区分，例如它们的大小和/或形状。在一个实例中，鉴定第一类型的细胞204和第二类型的细胞206，并确定它们的位置。另外，可以确定其他细胞的位置和类型，并且细胞204和206可以是与其他细胞在空间上分离的单个细胞。
随后，选择媒介物中的第一目标聚集点162，产生第一激光脉冲并聚集到第一目标聚集点162上，例如类似于方法140的步骤148-154。例如，可以将第一类型的细胞204转移到接收器表面112上的第一目标位置166，如上文所述。
另外，可以在步骤184中确定第二目标聚集点208，例如相对于第二类型的细胞206的位置，以将细胞206也转移到接收器表面。可以与第一目标聚集点162同时确定第二目标聚集点208。可以类似于如步骤148的第一目标聚集点162选择第二目标聚集点208。另外，当确定第二目标聚集点208时，可以考虑第一目标聚集点162、第一目标位置166和/或接收器表面112上其他细胞的位置。例如，可以从第二类型的细胞202中选择细胞206，因为它是最接近接收器表面112上的细胞204的位置的细胞，例如以简化对准程序。在另一个实例中，可以选择细胞206，因为它远离第一目标聚集点162，并因此不太可能被第一激光脉冲移动和/或损坏。如果在执行步骤184之前产生了第一激光脉冲，则步骤184可另外包括重复步骤182以确定至少一个细胞的更新位置。
此外，在步骤186中可以选择接收器表面112上的第二目标位置210。可以类似于如步骤150中的第一目标位置166的确定，来确定第二目标位置210。第二目标位置210的确定可以考虑第一目标位置166和/或接收器表面112上其他细胞的位置。例如，可以指定接收器表面112上细胞204和206之间的目标距离，并且在转移至接收器表面112后在距细胞204位置相应的距离处选择目标位置210。可选地，可以同时确定第一目标位置166和第二目标位置210。
在步骤188中，可以类似于上述步骤152的程序将聚集118与第二目标聚集点208对准。在步骤190中产生第二激光脉冲并聚集到第二目标聚集点208上，其中第二激光脉冲可以与第一激光脉冲具有相同的脉冲能量和/或脉冲持续时间。相应地，第二激光脉冲可以产生类似于第一激光脉冲产生的空化气泡168的空化气泡212。空化气泡212可以随后膨胀并产生液滴214，该液滴214是从媒介物108朝向接收器表面112射出的，并且可以包括一个或多个细胞。例如，如果第二目标聚集点208被选择为位于细胞206下方，则液滴214可以将细胞206转移到接收器表面。
可以同时或紧密连续地产生第一激光脉冲和第二激光脉冲。例如，激光源114发射的激光脉冲可被分割以产生第一和第二激光脉冲，例如使用束分割器或空间光调制器。可选地，可以使用激光源114发射的两个单独的脉冲来产生第一和第二激光脉冲。方法140和/或180可以被扩展以执行多个转移过程，例如通过至少部分地重复步骤146-154和/或步骤184-190。特别地，可以紧密连续地执行多个转移，例如用于高通量3d生物印刷或细胞分选。转移过程可以例如以1kHz至1MHz的重复率来执行。这可以例如用于在接收器表面112上产生3d模式的细胞或用于快速细胞分选，例如通过使用芯片实验室系统作为储库106和/或基底104。
在图4a中，示出了方法220的流程图，该方法另外采用根据本发明的实施方案的光钳。方法220可以例如用类似于装置100的装置来实现，并且可以在施加如图4b-图4e所示的第一激光脉冲之前用于用光钳移动细胞164。
类似于方法140和180，方法220包括提供媒介物108和基底104，其在图4a的流程图中未示出。之后，类似于上述程序，在步骤222中确定媒介物108中至少一个细胞102的位置。特别地，可以确定多个细胞的位置以至少部分地获得媒介物108中的细胞102的分布。
在步骤224和226中，确定第一目标聚集点162和目标位置166。目标位置166可以以与上述步骤150类似的方式获得。可以基于在步骤222中确定的细胞102的分布来选择第一目标聚集点162。例如，可以选择第一目标聚集点162，以使得其位于具有少量细胞区域中，和/或以使得与第一目标聚集点162附近的细胞的距离最大化，例如以减少意外转移非选择的细胞的可能性。与图2b和图3b所示的实例不同，第一目标聚集点162可以不与细胞164的位置对准，细胞164可以被选择以转移到接收器表面112。细胞164可以例如被选择为最接近第一目标聚集点162和/或目标位置166的细胞，或者可以由于其属性而被选择。
在步骤228中，确定第三目标聚集点242，在步骤230中将激光束聚集在其上。激光束可以是激光脉冲、一系列的激光脉冲或连续波激光束，并且可以从激光源114或从不同的激光源产生。在一个实例中，激光束是来自激光源114的脉冲激光束，其以固定的重复率连续地发射脉冲，其中每个脉冲具有与第一激光脉冲相同的持续时间。激光束可以例如用作切割工具，例如以切割组织和/或分离目标细胞。在另一个实例中，激光束可用作光钳，其可以例如用于定位和/或移动媒介物108中的细胞102。在这种情况下，激光束的脉冲可以具有比第一激光脉冲低得多的脉冲能量，例如第一激光脉冲的脉冲能量的1％，以避免损伤细胞或干扰媒介物。这可以通过减弱激光源114的输出来实现。
例如，通过选择第三目标聚集点242，以使得其与第一目标聚集点162重叠，可以将光钳用于相对于第一目标聚集点162定位细胞164。当将激光束聚集到第三目标聚集点242上时，它可以产生针对细胞102的限制电位，其具有的形状由激光束的强度分布决定，并且在第三目标聚集点242的位置处具有最小值。因此，单元164可以被捕获在某一位置处，例如以确保细胞164的位置保持与第一目标聚集点162对准。取决于激光束的强度，细胞164仅能被捕获在水平面内，例如，如果由限制电位产生的偶极力不足以克服细胞164在媒介物108中经历的浮力。
在另一个实例中，如果细胞164的位置未与第一目标聚集点162对准，则可以使用光钳将细胞164移动到第一目标聚集点162。可以选择第三目标聚集点242以与细胞164的位置对准或位于细胞164的位置附近。在打开激光束后，可以将细胞164拖向水平面中激光束的中心，如图4b中通过箭头所示的。随后，可以在步骤232中移动第三目标聚集点242，同时打开激光束并聚集到第三目标聚集点242上。如果细胞164被捕获在激光束中并且限制电位足够强，则细胞164可以跟随第三目标聚集点242的移动。激光束的聚集可以通过如上所述的聚集模块126移动，例如通过改变如图4b-图4d中所示的目标前面的激光束的传播方向。如果第三目标聚集点242移动到第一目标聚集点162，则细胞164的位置由此可以与第一目标聚集点162对准，如图4d所示。一旦细胞164与第一目标聚集点162对准，就可以在步骤234中产生第一激光脉冲并将其聚集到第一目标聚集点162上，例如以将细胞164转移到接收器表面112上的目标位置166。
在施加第一激光脉冲之前，光钳还可以以其他方式用于改变媒介物108中的细胞102的分布。例如，多个细胞可以被移动到相同的位置，以使得可以利用第一激光脉冲将多个细胞转移到接收器表面112。在另一个实例中，选择细胞164用于转移，并采用光钳用于从细胞164附近去除其他细胞。聚集模块126也可以配置为将激光束的聚集与位于接收器表面112上或其附近的第三目标聚集点对准，例如以在转移后移动接收器表面112上的细胞。
在一些实例中，第三目标聚集点242可以被选择为与接收器表面112相邻或在其上，例如以对基底104、接收器表面112和/或接收器表面112上的媒介物执行去除式或添加式激光处理，例如通过激光消融或多光子聚合。从而，可以在接收器表面112上形成结构如3d模式、支架或细胞外基质结构。可以例如通过待结构化的媒介物，例如包含核黄素或具有温度依赖性粘度的聚合物凝胶的媒介物涂覆接收器表面112。
图2a、图3a和图4a中所示的流程图仅构成根据本发明的方法的实施方式的特定实例，可以以许多方式对其进行改变。特别地，步骤的顺序仅是示例性的，并且在技术上可行的情况下，可以对步骤进行排列，并且可以以任意顺序执行方法。例如，可以在提供媒介物108之前提供基底104，或者可以在确定第一目标聚集点162和/或确定至少一个细胞的位置之前选择接收器表面112的目标位置166。
图5a-图5c描绘了使用根据本发明的示例性实施方案的装置和方法从实验获得的细胞转移的显微图像。在每个实验中，产生的飞秒激光脉冲波长为1030nm，脉冲持续时间为450fs，并且脉冲能量为2μJ，并聚集到1.6μm的聚集直径，这对应于约2·1014W/cm2的峰值强度，在储库中媒介物表面以下约40μm的深度处。
在图5a中，分别显示了单个细胞(A-C)和一簇多个细胞(D-F)的受控转移。比例尺为20μm。箭头分别指示选择用于转移的细胞和细胞簇。该细胞和细胞簇与储库中的其他细胞在空间上分离。叉号表示激光脉冲聚集的第一目标聚集点的水平位置。第一目标聚集点分别相对于细胞和细胞簇的位置确定。如在图像B、C和E、F中可以看出的，激光脉冲将细胞和细胞簇从储库选择性地转移到基底上，而其他细胞则保留在储库中。
图5b显示了具有和不具有细胞的液滴产生的示例性时间轨迹。每行包含在发射相应的激光脉冲后的固定时间采集的一系列时间分辨的荧光图像。右图显示了发射激光脉冲后3μs采集的图像的放大型式。比例尺为50μm。在各种情况下，激光脉冲都会产生从媒介物(Alexa Fluor532NHS酯染色的Histopaque)射出的射流。上行显示了仅包含纯液体而不包含细胞的射流的实例。中心的行显示了包含单个Alexa Fluor 532NHS酯染色的B16F1细胞的射流的实例。下行显示了包含单个未染色的B16F1细胞的射流的实例。
图5c描绘了不同类型的细胞的受控分选的图像。白色虚线圆圈标记了标记有绿色荧光蛋白(GFP)的SCP1细胞，且白色虚线矩形标记了标记有红色荧光蛋白(RFP)的鼠成纤维细胞。第一栏显示明场显微镜图像，第二栏和第三栏显示在不同波长下采集的荧光图像，且第四栏显示两个相应的荧光图像的合并图像。比例尺为50μm。如上行所示，SCP1细胞和成纤维细胞最初提供在同一媒介物中。基于荧光标记，可以区分两种类型的细胞，并且可以通过相应地选择目标聚集点将其选择性地转移到基底上。通过相对于目标聚集点移动基底，可以将细胞转移到基底上的预定目标位置。这允许在基底上产生细胞模式，例如，如图5c所示，将细胞排列成规则的阵列。
本文公开的本发明的实施方案仅构成了用于说明目的的特定实例。本发明可以以各种方式实现，并且具有许多修改，而不改变基本的基础特性。因此，本发明仅由如下所述的权利要求书限定。
参考标记列表
100–用于将生物细胞转移到基底上的装置
102–生物细胞
104–基底
106–储库
108–媒介物
110–基底支撑物
112–接收器表面
114–激光源
116–物镜
118–聚集
120–镜
122–控制单元
124–脉冲成形单元
126–聚集模块
128–成像模块
130–摄像机
132–成像系统
134–光源
136–镜
140–用于将生物细胞转移到基底上的方法
142–提供媒介物的步骤
144–提供基底的步骤
146–确定至少一个细胞的位置的步骤
148–确定第一目标聚集点的步骤
150–确定目标位置的步骤
152–将聚集与目标位置对准的步骤
154–产生第一激光脉冲的步骤
160–用于将生物细胞转移到基底上的装置的转移室
162–第一目标聚集点
164–单个细胞
166–目标位置
168–空化气泡
170–射出的液滴
180–使用两个激光脉冲将生物细胞转移到基底上的方法
182–确定至少一个细胞的位置的步骤
184–确定第二目标聚集点的步骤
186–确定第二目标位置的步骤
188–将聚集与第二目标位置对准的步骤
190–产生第二激光脉冲的步骤
200–第一类型的细胞
202–第二类型的细胞
204–第一单个细胞
206–第二单个细胞
208–第二目标聚集点
210–第二目标位置
212–空化气泡
214–射出的液滴
220–使用光钳将生物细胞转移到基底上的方法
222–确定至少一个细胞的位置的步骤
224–确定第一目标聚集点的步骤
226–确定目标位置的步骤
228–确定第三目标聚集点的步骤
230–产生激光束的步骤
232–移动第三目标聚集点的步骤
234–产生第一激光脉冲的步骤
240-用于将生物细胞转移到基底上的另一装置的转移室
242–第三目标聚集点
Claims (33)
1.用于将物体，优选生物物体(102)，尤其是生物细胞转移到基底(104)上的方法，所述方法包括：
提供在储库(106)中的媒介物(108)，其中所述媒介物(108)包含物体(102)；
提供具有接收器表面(112)的基底(104)，其中所述接收器表面(112)朝向所述储库(106)的开口；
确定所述媒介物(108)中的第一目标聚集点(162)；以及
产生在所述第一目标聚集点(162)上聚集的第一激光脉冲或第一激光脉冲串，
其中，
选择所述第一目标聚集点(162)处的所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的脉冲强度和/或所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的脉冲持续时间，使得所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串产生从所述媒介物(108)向所述接收器表面(112)射出的所述媒介物(108)的液滴(170)；
所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的中心波长大于500nm，优选地大于650nm，最优选地为0.9μm至1.35μm；
至少部分地确定所述媒介物(108)中至少一个所述物体(102)的位置；以及
相对于所述至少一个物体的位置确定所述第一目标聚集点(162)。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一目标聚集点(162)处的脉冲强度超过所述媒介物(108)的非线性光化电离阈值。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述物体(102)位于所述媒介物(108)朝向所述接收器表面(112)的表面附近的表面层中。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述媒介物(108)是密度梯度媒介物，并且所述方法还包括孵育在所述储库(106)中的所述媒介物(108)。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述第一目标聚集点(162)位于所述表面层的与所述接收器表面(112)相对的面上。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一目标聚集点(162)位于所述媒介物(108)朝向所述接收器表面(112)的表面以下不到300μm，优选地以下50μm至100μm。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述媒介物(108)中的所述物体(102)成像，以至少部分地确定所述物体(102)的分布。
8.如权利要求7所述的方法，还包括以下步骤：
从所述物体(102)的分布中鉴别单个物体(164)，其中所述单个物体(164)在空间上与其他物体分离；以及
至少部分地确定所述单个物体(164)的位置；
其中相对于所述单个物体(164)的位置确定所述第一目标聚集点(162)。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过以下至少一种方式将所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的焦点(118)与所述第一目标聚集点(162)对准：
改变物镜(116)与所述储库(106)之间的距离；
改变所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的传播方向；
改变所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的空间强度模式和/或空间相模式；以及
改变镜头的焦距。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：
确定所述接收器表面(112)上的目标位置(166)；以及
将所述目标位置(166)与所述第一目标聚集点(162)沿一个方向对准。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接收器表面(112)覆盖有缓冲膜，特别是细胞外基质凝胶。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一目标聚集点(162)处的所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的直径小于5.0μm，优选地小于2.0μm。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一激光脉冲是飞秒激光脉冲，优选地具有300fs-700fs的脉冲持续时间。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一激光脉冲串是一系列的飞秒激光脉冲，优选地具有300fs-700fs的脉冲持续时间的飞秒激光脉冲。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的中心波长和/或谱宽被调整至所述物体(102)的吸收光谱。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述媒介物(108)包含两种或更多种类型的物体(200、202)，并且确定所述至少一个物体的位置包括确定所述至少一个物体的类型。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括产生在所述媒介物(108)中的第二目标聚集点(208)上聚集的第二激光脉冲，其中相对于所述至少一个物体的位置确定所述第二目标聚集点(208)。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括产生在所述媒介物(108)中的多个目标聚集点上聚集的多个激光脉冲，以产生包含所述接收器表面(112)上的多个物体的结构。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将激光束聚集在所述媒介物(108)中的第三目标聚集点(242)上。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述方法还包括移动所述第三目标聚集点(242)，尤其是至所述第一目标聚集点(162)或所述第二目标聚集点(208)，同时将所述激光束聚集在所述第三目标聚集点(242)上。
21.用于将物体，优选生物物体(102)，尤其是生物细胞转移到基底(104)上的装置(100)，所述装置(100)包括：
储库(106)，其用于保持媒介物(108)，尤其是包含物体(102)的媒介物；
基底支撑物(110)，其被配置为保持具有接收器表面(112)的基底(104)，以使得所述接收器表面(112)朝向所述储库(106)的开口；
激光源(114)，其被配置为发射激光脉冲；
控制单元(122)，其用于从所述激光源(114)产生第一激光脉冲或第一激光脉冲串；以及
物镜(116)，其用于将所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串聚集在所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的焦点(118)上；
其中，
所述控制单元(122)包括成像模块(128)，其被配置为至少部分地确定所述媒介物(108)中至少一个所述物体(102)的位置；
所述控制单元(122)被配置为相对于所述至少一个物体的位置确定第一目标聚集点(162)；
所述控制单元(122)包括聚集模块(126)，其被配置为将所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的焦点(118)与所述第一目标聚集点(162)对准；
所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的中心波长大于500nm，优选地大于650nm，最优选地为0.9μm至1.35μm；以及
所述第一目标聚集点(162)处的脉冲强度和所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的脉冲持续时间足够大，使得所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串产生从所述媒介物(108)向所述接收器表面(112)射出的所述媒介物(108)的液滴(170)。
22.如权利要求21所述的装置(100)，其中所述脉冲强度超过所述媒介物(108)的非线性光化电离阈值。
23.如权利要求21或22所述的装置(100)，其中所述聚集模块(126)被配置为通过以下至少一种来控制所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的焦点(118)位置：
改变所述物镜(116)与所述储库(106)之间的距离；
改变所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的传播方向；
改变所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的空间强度模式和/或空间相模式；以及
改变镜头的焦距。
24.如权利要求21-23中任一项所述的装置(100)，其还包括用于对所述媒介物(108)中的所述物体(102)成像的成像系统(132)和摄像机(130)。
25.如权利要求24所述的装置(100)，其中所述成像模块(128)被配置为：
至少部分地确定所述物体(102)的分布；
从所述物体(102)的分布中鉴别单个物体(164)，其中所述单个物体(164)在空间上与其他物体分离；以及
至少部分地确定所述单个物体(164)的位置。
26.如权利要求21-25中任一项所述的装置(100)，其中所述控制单元(122)被配置为移动所述基底(104)，特别是将所述接收器表面(112)上的目标位置(166)与所述第一目标聚集点(162)对准。
27.如权利要求21-26中任一项所述的装置(100)，其中所述第一目标聚集点(162)处的所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的直径小于5.0μm，优选地小于2.0μm。
28.如权利要求21-27中任一项所述的装置(100)，其中所述激光源(114)被配置为发射飞秒激光脉冲，优选地具有300fs-700fs的持续时间。
29.如权利要求21-28中任一项所述的装置(100)，其中所述控制单元(122)被配置为调节所述第一激光脉冲或第一激光脉冲串的中心波长、谱宽、脉冲持续时间和/或脉冲能量。
30.如权利要求21-29中任一项所述的装置(100)，其中所述成像模块(128)被配置为确定所述媒介物(108)中至少一个所述物体(102)的类型。
31.如权利要求21-30中任一项所述的装置(100)，其中
所述控制单元(122)被配置为从所述激光源(114)产生第二激光脉冲并相对于所述至少一个物体的位置确定第二目标聚集点(208)；并且
所述聚集模块(126)被配置为将所述第二激光脉冲的焦点(118)与所述第二目标聚集点(208)对准。
32.如权利要求21-31中任一项所述的装置(100)，其中
所述控制单元(122)被配置为从所述激光源(114)产生激光束和确定第三目标聚集点(242)；并且
所述聚集模块(126)被配置为将所述激光束的焦点(118)与所述第三目标聚集点(242)对准。
33.如权利要求21-32中任一项所述的装置(100)，还包括控温的孵育室。
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