JP6427890B2 - 検出装置、顕微鏡および処理装置 - Google Patents

Description

本発明は、検出装置、顕微鏡および処理装置に関する。

非線形光学効果を利用した観察装置がある（特許文献１参照）。
特許文献１ 特開２０１１−２５７６９１号公報

非線形光学効果を励起する励起光が観察対象およびそれを支持する容器等に照射されることによって熱的な励起が観察対象およびその容器等に生じることにより、それらの品質が変わる場合がある。

本発明の第１態様においては、対象物において非線形光学効果を生じさせる励起光を照射した場合にアブレーションが発生したことを検出する検出部を備える検出装置が提供される。

本発明の第２態様においては、上記検出装置を備え、励起光を照射された対象物から射出された散乱光を検出して、当該対象物を観察する顕微鏡が提供される。

本発明の第３態様においては、上記検出装置を備え、検出装置が検出したアブレーションにより損傷を受けた対象物を除去する除去部を備える観察対象処理装置が提供される。

上記の発明の概要は、本発明の必要な特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションも発明となり得る。

評価装置１０１の構造を示す模式図である。 サンプル２００の断面図である。 観察部１００におけるサンプル２００の状態を示す模式図である。 観察部１００の動作を説明する図である。 焦点１４５付近の状態を説明する模式図である。 検出部３００のブロック図である。 サンプル２００への書き込み例を示す図である。 評価装置１０１の動作手順を示す流れ図である。

以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、下記の実施形態は特許請求の範囲に係る発明を限定するものではない。実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。

図１は、細胞シートの品質を評価する評価装置１０１の構造を示す模式図である。評価装置１０１は、観察部１００および検出部３００を含む。

観察部１００は、ステージ１１０、レーザ装置１２０、走査系１３０、光学系１４０、検出系１５０および制御系１６０を備える。なお、制御系１６０の一部は、検出部３００が共用する。

観察部１００において、ステージ１１０は、搬入されたサンプル２００を観察する場合に支持する観察領域と、観察結果を書込装置３７０がサンプル２００に記入する場合にサンプル２００を支持する処理領域とを有する。処理領域には、書込装置３７０および搬送装置３８０が設けられる。

書込装置３７０は、インクジェット方式、インクペン方式等、サンプル２００の品質に影響を与えない方法で、サンプル２００に情報を書き込む。搬送装置３８０は、ステージ１１０上でサンプル２００を移動させると共に、ステージ１１０からサンプル２００を搬出する場合にも使用される。しかしながら、ステージ１１０におけるサンプル２００は、ユーザの手によって移動してもよい。

レーザ装置１２０は、複数のレーザ光源１２２、１２４と、コンバイナ１２６とを有する。レーザ光源１２２、１２４は、ＣＡＲＳ光検出による観察に用いられるパルスレーザを発生する。また、レーザ光源１２２、１２４が発生するパルスレーザは、互いに異なる波長λ_Ｐ、λ_Ｓを有する。

レーザ光源１２２、１２４としては、例えば、モードロックピコ秒Ｎｄ：ＹＶＯ_４レーザ、モードロックピコ秒イットリビウムレーザー等を用いることができる。なお、レーザ光源１２２、１２４の一方を、他方のレーザ光源１２２、１２４が発生したパルスレーザの波長を変換する光パラメトリック発振器に置き換えてもよい。

レーザ光源１２２、１２４により発生した２波長のピコ秒パルスのうち、短い方の波長λ_Ｐを有するパルスレーザは、ＣＡＲＳ光観察におけるポンプ光として利用される。また、レーザ光源１２２、１２４の発生するピコ秒パルスのうち、長い方の波長λ_Ｓ有するパルスレーザは、ＣＡＲＳ光観察におけるストークス光として利用される。

コンバイナ１２６は、複数のレーザ光源１２２、１２４が発生したレーザ光を統合して単一の光路上に励起光として射出する。これにより、ポンプ光とストークス光とを併せた励起光をサンプル２００に照射して、サンプル２００においてＣＡＲＳ光を発生させることができる。

なお、レーザ装置１２０には、レーザ光源１２２、１２４が発生するポンプ光のパルスとストークス光のパルスとを同期させる目的で遅延光路を設けてもよい。遅延光路は、互いの間隔を変更できる複数の反射鏡により形成できる。また、レーザ装置１２０においては、フォトニック結晶ファイバを用いてストークス光を広帯域化してもよい。

走査系１３０は、ガルバノスキャナ１３２およびスキャンレンズ１３４を有する。ガルバノスキャナ１３２は、互いに向きが異なる２軸の周りを揺動する反射鏡を備え、入射した励起光の光路を、光軸と交差する方向に二次元的に変位させる。

スキャンレンズ１３４は、ガルバノスキャナ１３２から射出された励起光を、予め定められた一次像面１３６上に合焦させる。これにより、レーザ装置１２０から射出された励起光は、サンプル２００の観察領域において焦点を結ぶ。また、ガルバノスキャナ１３２が動作した場合は、図中に矢印ｘ−ｙで示す平面と平行に励起光の焦点を走査させて、予め定められた広さを有する観察領域に励起光を照射して、ＣＡＲＳ光を発生させることができる。

光学系１４０は、ステージ１１０に対して検出系１５０側に配された対物レンズ１４２と、ステージ１１０に対してレーザ装置１２０側に配された下側の対物レンズ１４４およびコンデンサレンズ１４６とを有する。下側の対物レンズ１４４は、サンプル２００に向かって照射される励起光を、サンプル２００における観察領域内で合焦させる。また、一対の対物レンズ１４２、１４４は、互いに同じ開口数（ＮＡ）を有する。

光学系１４０の入射端側において、レーザ装置１２０と対物レンズ１４２との間の励起光の光路上には、反射鏡１４８が配される。反射鏡１４８は、励起光の光路を折り曲げて、観察部１００の構造物が過剰に高くなることを防止する。反射鏡１４８としては、全反射プリズムではなく、入射光を表面で反射させる金属鏡を用いてもよい。光学系１４０から射出された光の伝搬光路には検出系１５０が配される。

検出系１５０は、集光レンズ１５２、リレーレンズ１５４、光電子増倍管１５６およびダイクロイックミラー１５８を有して、サンプル２００から射出されたＣＡＲＳ光の検出に用いられる。ダイクロイックミラー１５８は、サンプル２００から射出された光からＣＡＲＳ光を分岐させて、集光レンズ１５２およびリレーレンズ１５４を通じて光電子増倍管１５６に導入する。よって、ＣＡＲＳ光は、光量を低下することなく、光電子増倍管１５６に効率よく受光される。

制御系１６０は、制御部１６２、キーボード１６４、マウス１６６および表示部１６８を有する。制御部１６２は、汎用パーソナルコンピュータに後述する制御手順を実行させるプログラムを実装することにより形成できる。

キーボード１６４およびマウス１６６は、制御部１６２に接続され、制御部１６２にユーザの指示を入力する場合に操作される。表示部１６８は、キーボード１６４およびマウス１６６によるユーザの操作に対してフィードバックを返すと共に、制御部１６２が生成した画像または文字列をユーザに向かって表示する。

また、制御部１６２は、レーザ装置１２０、検出系１５０および走査系１３０の各々に接続され、それぞれの動作を制御する。更に、制御部１６２は、検出系１５０の検出結果に基づいて、サンプル２００の観察画像を生成して、表示部１６８に表示する。また更に、制御部１６２は、検出部３００の動作を制御すると共に、検出部３００による検出結果に応じた観察部１００の制御を実行する。

観察部１００は、ＣＡＲＳ（コヒーレント反ストークスラマン散乱）、ＳＲＳ（誘導ラマン散乱）等の非線形光学効果を利用して、培養した細胞、組織および微生物等を生かしたまま観察することができる。非線形光学効果は、観察対象に対して励起光を照射することにより発生する。検出系１５０は、励起光が照射された側と反対の側から射出されるＣＡＲＳ光を検出して観察画像を形成する。

更に、評価装置１０１は、検出部３００を備える。検出部３００は、撮像部３１０および記録媒体３６０を有する。撮像部３１０は、ステージ１１０に置かれたサンプル２００を表裏から撮像して、観察部１００により観察されるサンプル２００の状態を示す画像を生成する。記録媒体３６０は、検出部３００による検出結果を記録する。なお、検出部３００は、撮像部３１０および記録媒体３６０の他に、制御部１６２の一部も含むが、これについては他の図を参照して後述する。

図２は、評価装置１０１の検査対象であり、観察部１００の観察対象となるサンプル２００の断面図である。サンプル２００は、検査の対象である細胞シート２０１と、細胞シート２０１を収容した培養容器２１０とを含む。

細胞シート２０１は、被検者から採取した細胞を培養して作成された、薄いシート状をなす生きた細胞組織であり、培養液に浸漬された状態で取り扱われる。培養された細胞シートは、最終的に、生きた状態のまま被検者の生体組織に付着させる。

培養容器２１０は、保持枠２１２および透過部２１４を有する。保持枠２１２は、樹脂等の成形し易いにより形成され、短い円筒形の形状を有する。培養容器２１０において、保持枠２１２は円筒形の側壁を形成し、当該側壁の下端面においてステージ１１０等の上面に接する。保持枠２１２は、下面に開口部２１１を有する。

なお、培養容器２１０は、細胞シート２０１を支持する支持体の一例に過ぎない。細胞シート２０１は、観察に要する短時間の間であれば、培養液から取り出してスライドガラス等の平坦な支持体により支持して搬送することもできる。また、ステージ１１０が無菌操作環境にある場合は、ステージ１１０に直接支持させることもできる。

透過部２１４は、保持枠２１２により保持され、保持枠２１２の開口部２１１を液密に封止して、培養容器２１０の底面を形成する。これにより、培養容器２１０は、培養液２２０を漏らすことなく収容できる。また、透過部２１４により形成された培養容器２１０の底面は光学的に透明になる。

保持枠２１２は、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコーンポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等の高分子材料により形成できる。透過部２１４は、例えば、カバーガラス等の透明な無機材料により形成できる。

培養容器２１０において、透過部２１４の上面、即ち、培養容器２１０の内側の底面には、温度応答性ポリマー層２１６が配される。温度応答性ポリマー層２１６は、透過部２１４にグラフトされて、培養容器２１０に対して固定される。温度応答性ポリマー層２１６は、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等の高分子材料により形成できる。

ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等の温度応答性ポリマーは、予め設定された臨界温度を境として水和力が変化する。また、この臨界温度は、細胞シート２０１にダメージを与えない摂氏３０度前後に設定できる。一方、細胞シート２０１は、疎水性を示す温度応答性ポリマー層２１６に対して接着し、親水性を示す温度応答性ポリマー層２１６からは容易に剥離できる。このような性質を利用して、培養容器２１０に配された温度応答性ポリマー層２１６を加熱または冷却することにより、酵素処理等によるダメージを与えることなく、細胞シート２０１を培養容器２１０の底面に固定または開放できる。

なお、温度応答性ポリマー層２１６の材料はポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに限られるわけではなく、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−（またはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体およびビニルエーテル誘導体のいずれか、または、２種以上を組み合わせて使用できる。また、上記以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、ポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。更に、所与の温度応答性を喪失しない範囲で架橋させて使用することもできる。

図３は、観察部１００におけるサンプル２００の状態を示す模式図である。ステージ１１０に置かれたサンプル２００において、細胞シート２０１は温度応答性ポリマー層２１６の表面に接着されている。

ステージ１１０には、ステージ１１０上に置かれた培養容器２１０の底面を露出させる観察窓１１４が設けられている。これにより、ステージ１１０に置かれた培養容器２１０は、底面側からも、上面側からも観察することができる。また、ステージ１１０に置かれた培養容器２１０に対しては、底面側からも、上面側からも励起光を照射できる。

ステージ１１０に置かれた培養容器２１０の透過部２１４には、観察窓１１４を通じて下側の対物レンズ１４４が臨んでいる。また、ステージ１１０の上方から、ステージ１１０上の培養容器２１０に収容された細胞シート２０１に対しては、上側の対物レンズ１４２が上方から臨んでいる。一対の対物レンズ１４２、１４４は、共通の焦点を有する。

なお、下側の対物レンズ１４４と培養容器２１０の透過部２１４との間隙は、水１４３により充填される。これにより、下側の対物レンズ１４４の実効的な開口数が増加し、対物レンズの実効的な倍率を大きくできる。

図４は、観察部１００において細胞シート２０１に照射された励起光の焦点においてＣＡＲＳ光が発生するＣＡＲＳ過程を説明する模式図である。ＣＡＲＳ過程は、互いに異なる光周波数ω_１、ω_２を有するポンプ光およびストークス光の二つのレーザ光を含む励起光を被観察物に照射して、ポンプ光の光周波数ω_１とストークス光の光周波数ω_２との差［ω_１−ω_２］が、被観察物に含まれる分子の固有振動の角振動数ω_０と一致した場合に発生する。

ＣＡＲＳ過程により、被観察物に含まれる特定の分子構造の振動モードが励振されると、分子振動が光周波数ω_３を有する第３のレーザ光であるプローブ光と相互作用することにより、三次の非線形分極に由来するＣＡＲＳ光がラマン散乱光として発生する。

更に、ポンプ光はプローブ光としても利用できるので、［ω_１＝ω_３］という条件の下で、ＣＡＲＳ光が発生する。被観察物において発生するＣＡＲＳ光は、［ω_ＣＡＲＳ＝ω_１−ω_２＋ω_３］を満たす光周波数を有する。

よって、被観察物から射出されたＣＡＲＳ光を検出することにより、被観察物に含まれる特定の分子構造、例えば官能基の存在を検出できる。また、励起光を被観察物に照射する位置を変えながら繰り返しＣＡＲＳ光を検出することにより、被観察物における特定の分子構造の分布を画像化することができる。

ＣＡＲＳ光は自発ラマン散乱光等に比べると光強度が高いので、光電気変換素子を用いた場合に短時間で検出できる。よって、検出に要する時間が単に短くなるばかりではなく、ビデオレートでの観察もできる。

これにより、特定分子構造の分布だけではなく、分布の変化も検出することができる。また、被観察物に照射する励起光の帯域を、生細胞に与えるダメージが少ない赤外帯域とすることにより、被観察物の生細胞を生かしたまま観察することができる。

更に、非線形効果により生じるＣＡＲＳ光は、下側の対物レンズ１４４により励起光が絞り込まれた極めて狭い領域において発生する。このため、ＣＡＲＳ光検出の対象となる領域は、照射光の光軸に交差する方向と、光軸と平行な方向の両方に関して狭い領域となる。よって、ＣＡＲＳ光による被観察物の観察は、立体的に高い解像度を有する。

よって、赤外帯域または近赤外帯域の照射光を用いて、観察平面を被観察物の内部に形成してもよい。また、観察平面を、被観察物の深さ方向に順次移動させることにより、特定の分子構造の三次元的な分布を反映した画像を生成できる。

また更に、被観察物の特定の位置に照射する照射光の光周波数を変化させることにより、当該照射位置から射出されたラマン散乱光の周波数分布を示すスペクトル画像が得られる。また、照射光の光路に対して交差する方向に被観察物を移動させながら照射光を繰り返し照射することにより、上側の対物レンズ１４２の焦点を含む観察平面における特定の分子の分布を画像化して検出画像を生成できる。

図５は、観察部１００において細胞シート２０１を観察している状態を示す模式図である。図５に示す部分は、図３において点線Ａにより囲んだ領域に相当する。

細胞シート２０１を観察する場合に、対物レンズ１４４により結ばれる励起光の焦点は、細胞シート２０１の内部に位置する。これにより、観察部１００の検出系１５０は、細胞シート２０１において発生したＣＡＲＳ光を検出して、細胞シート２０１の観察画像を生成する。

ここで、ＣＡＲＳ光を生じる光線形効果は、励起光の焦点の直近において発生する。このため、細胞シート２０１の下面近傍を観察する場合は、ステージ１１０および光学系１４０の少なくとも一方を移動させて、焦点を細胞シート２０１の下面近傍に移動させる。

一方、励起光は、光学的な励起と共に、熱的にも照射対象を励起する。励起光による熱的な励起は焦点１４５の周囲にも及ぶ。図中には、熱的な励起が生じ得る熱励起圏１４７を点線により示す。

熱励起圏１４７は、光学的な励起が生じる範囲よりも広いので、焦点が細胞シート２０１の下面近傍に位置する場合は、熱励起圏１４７が細胞シート２０１の外側まで拡がる。このため、サンプル２００において細胞シート２０１を固定している温度応答性ポリマー層２１６が、励起光により熱的に励起される場合がある。

温度応答性ポリマー層２１６は、高分子材料により形成されているので熱の影響を受け易い上に、固体なので熱の拡散が相対的に遅い。このため、励起光が温度応答性ポリマー層２１６に照射されたり、温度応答性ポリマー層２１６が熱励起圏１４７に入ったりすると、温度応答性ポリマー層２１６の分子が吸収した光エネルギーの一部が熱エネルギーに変換されるいわゆる熱的励起が生じることにより、温度応答性ポリマー層２１６の温度が所定の温度以上に上昇したり、局所的に高温になった表面層が蒸発することで原子、分子、プラズマおよびそれらのクラスターが放出するいわゆるアブレーションが温度応答性ポリマー層２１６に生じる可能性がある。

例えば、温度応答性ポリマー層２１６の温度が上昇すると、温度応答性ポリマー層２１６から細胞シート２０１に熱が伝わり、細胞シート２０１の細胞が死亡または変性する虞がある。細胞が死亡または変性する可能性がある温度は例えば３７℃以上である。また、温度応答性ポリマー層２１６にアブレーションが生じると細胞シート２０１が破損する虞がある。

温度応答性ポリマー層２１６が所定の温度以上に上昇したりアブレーションを生じたりした場合、温度応答性ポリマーは急速に気化またはプラズマ化する。このため、温度応答性ポリマー層２１６がダメージを受けるにとどまらず、細胞シート２０１もダメージを受ける場合がある。

なお、上記のような観察に伴って発生するアブレーションの他に、何らかの理由で焦点１４５が培養容器２１０の保持枠２１２に移動した場合も、保持枠２１２において温度上昇やアブレーションが生じる場合がある。更に、レーザ装置１２０の出力が過剰に高い場合には、細胞シート２０１そのものにおいても温度上昇やアブレーションが生じる可能性がある。

図６は、検出部３００のブロック図である。検出部３００は、撮像部３１０の他に、判定部３２０、特定部３３０、計数部３４０および記録部３５０を有する。これら判定部３２０、特定部３３０、計数部３４０および記録部３５０は、制御部１６２の一部として形成される。

撮像部３１０は、ステージ１１０に置かれたサンプル全体を撮像する。撮像部３１０は、観察部１００よりも解像度は低いが、可視光帯域から赤外帯域までに高い感度を有し、サンプル２００から発生する光および熱を映像化する。このような撮像部３１０は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳセンサ等の固体撮像素子を有するカメラにより形成できる。

判定部３２０は、撮像部３１０が生成した画像から輝点を抽出して、当該輝点がアブレーションによるものか否かを判定する。例えば、輝点の輝度が予め定めた閾値を超えた場合に、当該輝点をアブレーションの発生によるものと判定できる。また、輝点のスペクトルがピークを持たないブロードな形状になったときにアブレーションが発生したと判定してもよい。判定結果は、検出部３００の特定部３３０、計数部３４０および記録部３５０に受け渡されると共に、制御部１６２の判断部１６１に通知される。

特定部３３０は、判定部３２０がアブレーションの発生により生じたと判定した輝点が、サンプル２００におけるどの部分で発生したかを特定する。特定部３３０は、例えば、アブレーションにより生じた輝点の輝度、スペクトル等により判明した材料に基づいて、アブレーションを生じた部材を特定してもよい。アブレーションを生じた材料は、予め、記録しておいた各部材のスペクトルパターンとのマッチングにより特定できる。

これにより、特定部３３０は、サンプル２００においてアブレーションを発生した部分が、細胞シート２０１であるのか、培養容器２１０の保持枠２１２、透過部２１４または温度応答性ポリマー層２１６であるのかを特定する。また、特定部３３０は、各要素においてアブレーションが発生した位置を更に特定してもよい。また、特定部３３０は、各要素においてアブレーションが発生した位置を更に特定してもよい。アブレーションの発生位置は、撮像部３１０の映像に基づいて、器の破損および容器の破片の散乱等の映像から特定できる。特定部３３０による特定結果は、検出部３００の計数部３４０および記録部３５０に受け渡されると共に、制御部１６２の判断部１６１に通知される。

特定部３３０による特定は、例えば、撮像部３１０が生成した画像における輝点の輝度によっても特定できる。例えば、温度応答性ポリマーのようにアブレーションが生じやすい材料の場合には、輝点の輝度が著しく高くなるので、アブレーションを生じたものを特定できる。

また、特定部３３０による特定は、例えば、撮像部３１０が生成した画像における輝点のスペクトルによっても特定できる。即ち、サンプル２００の構成要素のスペクトルを予め格納しておくことにより、輝点の波長からアブレーションを生じたものを特定することができる。

計数部３４０は、判定部３２０がアブレーションであると判定した回数をサンプル２００毎に計数する。また、計数部３４０は、特定部３３０が特定した対象毎にアブレーションの発生回数を計数してもよい。これにより、停止条件を満たさない軽微なアブレーションが何度も発生した場合に、サンプル２００が受けるダメージを推定できる。計数結果は、記録部３５０に受け渡されると共に、制御部１６２の判断部１６１に通知される。

記録部３５０は、判定部３２０の判定結果、特定部３３０の特定結果および計数部３４０の計数結果を、記録としてサンプル２００毎に蓄積する。蓄積された記録は、判断部１６１から参照される。

判断部１６１は、検出部３００が検出したアブレーションの情報を取得して、評価装置１０１全体の動作を制御する。即ち、発生したアブレーションが観察部１００、サンプル２００等に深刻な影響を及ぼすと考えられる停止条件を満たした場合、判断部１６１は、発令部１６３を通じて、観察部１００における励起光の照射を抑制または停止する指令を発生する。

停止条件を満たすような場合としては、例えば、培養容器２１０におけるアブレーションが特定された場合を例示できる。そのような場合は、当該培養容器２１０に収容されている細胞シート２０１も損傷を受けている可能性が高い。

励起光の抑制は、例えば、レーザ装置１２０の出力を低下させる、走査系１３０により照射位置を変更する、光学系１４０により焦点位置を変化させる等、様々な対応をとり得る。発生したアブレーションの影響が大きいと判断した場合は、遮光板を光路に装入する、レーザ装置１２０を停止するなどして、サンプル２００の観察を終了してもよい。

一方、発生したアブレーションが停止条件を満たさない軽微なものであると判断した場合、判断部１６１は、発生したアブレーションについての記録を保持するものの、観察部１００による観察自体はそのまま継続すると判断してもよい。ただし、個々のアブレーションの影響が軽微であっても、アブレーションの発生回数が増加した場合、判断部１６１は、アブレーションの影響が深刻になると考えられる停止条件を満たした場合、観察部１００による観察を終了する。

更に、アブレーションを発生した箇所が保持枠２１２の外側であるような場合、判断部１６１は、細胞シート２０１にはダメージがないが、観察部１００自体がダメージを受けていると判断して、観察部１００による観察を終了すると判断をする場合もある。

また更に、判断部１６１は、検出系１５０における観察結果も参照して判断を下してもよい。検出系１５０からの観察結果の取得は、画像処理等による自動処理であってもよいし、検出系１５０によりサンプル２００を観察したユーザが制御部１６２に入力した観察結果であってもよい。

このように、評価装置１０１においては、励起光を照射するサンプル２００の観察と並行して、検出部３００によりアブレーションの発生を検出する。これにより、観察部１００によりサンプル２００がダメージを受けることを抑制できると共に、細胞シート２０１等の検査対象の品質を評価して、生産性と品質とをバランスさせることができる。

更に、判断部１６１は、検出部３００における検出結果、特定結果および計数結果をサンプル２００に記録する指令を、発令部１６３を通じて書込装置３７０に送ってもよい。これにより、サンプル２００毎に、品質評価結果が表示されているので、後の工程において検出結果を容易に利用できる。後の工程としては、例えば、下記の修復部３８４における細胞シート２０１の修復を例示できる。

また更に、判断部１６１は、発令部１６３を通じて搬送装置３８０に支持することにより、サンプル２００を評価結果に応じた搬送先に搬送させてもよい。例えば、評価の結果、高品質と評価されたサンプルは、回収部３８２に搬送され、治療等に使用するまで培養環境において保存される。

また、評価の結果、一部が損傷を受けるにとどまっているサンプル２００は、修復部３８４に搬送され、特定部３３０により特定された損傷箇所を取り除いた上で培養を継続することにより、再び、損傷のない細胞シートとして出荷できる。更に、評価の結果、修復することができないと評価されたサンプル２００は、破棄部３８６に搬送されて破棄される。ただし、破棄されるサンプル２００においても、損傷を受けていない培養容器２１０等は、再利用に向けて回収してもよい。

なお、上記の例では、判断部１６１が、観察の終了、励起光の抑制等を自動的に実行している。しかしながら、観察を終了すべき旨、励起光を抑制すべき旨のメッセージを表示部１６８に出力して、停止等の操作はユーザに委ねてもよい。

図７は、書込装置３７０によるサンプル２００への書込例を示す図である。図示の例においては、培養容器２１０の側面に、検出結果がバーコードにより記載されたラベル２５０が貼付されている。

このラベル２５０は、例えば感熱紙により形成されており、当初は白紙状態であったものに対して、書込装置３７０のサーマルヘッドが検出結果を書き込む。これにより、後工程においてバーコードをリーダで読み取ることにより、アブレーションによるダメージを後工程で知ることができる。よって、例えば、細胞シート２０１を用途に応じて選別した上で出荷し、あるいは、品質が低いものを出荷前に破棄することができる。

なお、記録の記載方法が上記の方法に限られないことはいうまでもなく、先に印字したラベル２５０を培養容器２１０に貼り付けてもよいし、ラベル２５０を用いることなく、インクジェットプリンタ、スタンプ等により培養容器２１０に直接に書き込んでもよい。また、記載形式もバーコードに限られず、文字、アイコン等により記載してもよい。

図８は、上記のような検出部３００を備えた評価装置１０１の動作手順を示す流れ図である。評価装置１０１においては、まず、観察対象となる細胞シート２０１を含むサンプル２００が、ステージ１１０に搬入される（ステップＳ１０１）。

次に、制御部１６２は、対物レンズ１４２、１４４の焦点を、細胞シート２０１における初期位置、例えば、細胞シート２０１の表面に合わせて励起光の照射を開始する。更に、ガルバノスキャナ１３２により焦点１４５を走査させて（ステップＳ１０２）、細胞シート２０１の表面における一定の領域から発生したＣＡＲＳ光に基づいて二次元的な観察画像を生成する。

細胞シート２０１を含むサンプル２００に対して励起光の照射を開始すると、制御部１６２は、細胞シート２０１の観察と並行して、検出部３００がアブレーションを検出したか否かを監視する（ステップＳ１０３）。

ステップＳ１０３においてアブレーションの発生が通知された場合、制御部１６２における判断部１６１は、発生したアブレーションが停止条件を満たしたか否かを調べ（ステップＳ１０４）、アブレーションの停止条件が満たされない場合は、ステップＳ１０２により開始された観察を継続する（ステップＳ１０４：ＮＯ）。一方、発生したアブレーションが停止条件を満たす場合、判断部１６１は、励起光を抑制し、観察部１００による観察を終了する（ステップＳ１０４：ＹＥＳ）。

ステップＳ１０３においてアブレーションの発生が通知されなかった場合（ステップＳ１０３：ＮＯ）、あるいは、ステップＳ１０４において発生したアブレーションが停止条件を満たさないことが判明した場合（ステップＳ１０４：ＮＯ）、制御部１６２は、ステップＳ１０２における走査が完了したか否かを調べる（ステップＳ１０５）。ここで、走査が完了していない場合は、制御をステップＳ１０２に戻して走査を継続する（ステップＳ１０５：ＮＯ）。

ステップＳ１０５において走査が完了したことが判り（ステップＳ１０５：ＹＥＳ）、ステップＳ１０２における走査により最初の平面における観察画像が生成されると、制御部１６２は、対物レンズ１４２、１４４の焦点を、図１に矢印ｚで示す細胞シート２０１の厚さ方向に移動させる（ステップＳ１０５）。ここで、制御部１６２は、対物レンズ１４２、１４４の焦点が、細胞シート２０１の外に出ていないかどうかを調べる（ステップＳ１０６）。

ステップＳ１０４において、焦点が細胞シート２０１の厚さの内で移動したことが判った場合（ステップＳ１０６：ＮＯ）、制御部１６２は、細胞シート２０１の厚さ方向に異なる次の観察平面においてＣＡＲＳ光による観察画像を生成する。以下、制御部１６２は、焦点の位置が細胞シート２０１の厚さ内にある限り、ｚ方向の移動と観察画像の生成を繰り返して、細胞シート２０１の立体的な観察画像を生成する。

一方、ステップＳ１０６において、焦点が細胞シート２０１の厚さを超えて移動したことが判った場合（ステップＳ１０６：ＹＥＳ）、制御部１６２は、焦点の位置をｚ方向についてリセットして、再び細胞シート２０１の表面に戻す（ステップＳ１０７）。次に、制御部１６２は、細胞シート２０１の面方向について、全域の観察画像が生成されたか否かを調べる（ステップＳ１０８）。

なお、「全域」とは、細胞シート２０１の全面積を意味するとは限らない。ＣＡＲＳ光による観察の解像度は高いので、細胞シート２０１を隈なく観察すると、観察に膨大な時間を要する。よって、「全域」といった場合は、細胞シート２０１において観察することを予め選択された部分的な領域の全てを意味する。

ステップＳ１０８において、細胞シート２０１の全域がまだ観察されていない場合（ステップＳ１０８：ＮＯ）、制御部１６２は、図１中に矢印ｘ−ｙで示す細胞シート２０１の面方向に焦点の位置を移動させる（ステップＳ１０９）。次に、制御部１６２は、制御を再びステップＳ１０２に戻してＣＡＲＳ光による細胞シート２０１の観察画像の生成を繰り返す。ステップＳ１０６において細胞シート２０１の全領域が観察されたことが判った場合（ステップＳ１０８：ＹＥＳ）、制御部１６２は、観察部１００による観察を終了する。

上記した例では、細胞シート２０１、培養容器２１０または温度応答性ポリマー層２１６にアブレーションが生じたことを検出する例を示したが、これらの温度が前記した所定の温度以上に上昇したか否かを上記した例と同様の方法によって検出することにより、細胞シート２０１に損傷が生じたか否かを検出してもよい。また、細胞シート２０１への励起光の照射を妨げることなく温度を検出するために、例えばサーモグラフィを用いてもよい。

上記の例では、制御部１６２として汎用の上方処理装置を用いた場合には、検出部３００の一部をなす判定部３２０、特定部３３０、計数部３４０および記録部３５０を、記録媒体または通信回線を通じて実装するプログラムにより形成することもできる。また、判定部３２０、特定部３３０、計数部３４０および記録部３５０の一部を、観察部１００等の評価装置１０１の他の部分と共用することもできる。

本実施例では、励起対象として、被観察物である細胞シートを用いた例を示した。しかしながら、光線形効果を利用したレーザ顕微鏡は、細胞シートに代えて、シート状をなさない細胞、例えば皮膚の断片のような組織、細菌のような微生物等の観察に、本発明を用いることができる。細胞の種類も、人工多機能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等を用いてもよい。

以上、実施の形態を用いて本発明を説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。

特許請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。特許請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。

１００ 観察部、１０１ 評価装置、１１０ ステージ、１１４ 観察窓、１２０ レーザ装置、１２２、１２４ レーザ光源、１２６ コンバイナ、１３０ 走査系、１３２ ガルバノスキャナ、１３４ スキャンレンズ、１３６ 一次像面、１４０ 光学系、１４２、１４４ 対物レンズ、１４３ 水、１４６ コンデンサレンズ、１４５ 焦点、１４７ 熱励起圏、１４８ 反射鏡、１５０ 検出系、１５２ 集光レンズ、１５４ リレーレンズ、１５６ 光電子増倍管、１５８ ダイクロイックミラー、１６０ 制御系、１６１ 判断部、１６２ 制御部、１６３ 発令部、１６４ キーボード、１６６ マウス、１６８ 表示部、２００ サンプル、２０１ 細胞シート、２１０ 培養容器、２１１ 開口部、２１２ 保持枠、２１４ 透過部、２１６ 温度応答性ポリマー層、２２０ 培養液、２５０ ラベル、３００ 検出部、３１０ 撮像部、３２０ 判定部、３３０ 特定部、３４０ 計数部、３５０ 記録部、３６０ 記録媒体、３７０ 書込装置、３８０ 搬送装置、３８２ 回収部、３８４ 修復部、３８６ 破棄部

Claims (24)

1. 対象物において非線形光学効果を生じさせる励起光を照射した場合に前記対象物が損傷した可能性があるか否かを検出する検出部を備え、
   前記検出部は、前記対象物および前記対象物を支持する支持体の少なくとも一方の温度が予め定められた温度以上になったか否かを検出することにより前記対象物の損傷の可能性を検出する検出装置。
2. 対象物において非線形光学効果を生じさせる励起光を照射した場合に前記対象物が損傷した可能性があるか否かを検出する検出部を備え、
   前記検出部は、前記励起光の焦点を含む領域を撮像する撮像部を有する検出装置。
3. 前記撮像部は、可視光帯域から近赤外帯域において感度を有する請求項２に記載の検出装置。
4. 前記検出部は、前記撮像部の撮像画像における輝点の輝度が予め定めた閾値を超えた場合にアブレーションが発生したと判定する判定部を有する請求項２または３に記載の検出装置。
5. 前記検出部は、前記撮像部の撮像画像における輝点のスペクトルパターンのピーク幅が拡がった場合にアブレーションが発生したと判定する判定部を有する請求項２から４のいずれか一項に記載の検出装置。
6. 前記検出部は、前記撮像部の撮像画像における輝点の位置に基づいてアブレーションの発生位置を特定する特定部を備える請求項２から５のいずれか一項に記載の検出装置。
7. 前記検出部は、前記撮像部の撮像画像における輝点の輝度に基づいてアブレーションの発生位置を特定する特定部を備える請求項２から６のいずれか一項に記載の検出装置。
8. 前記検出部は、前記撮像部の撮像画像における輝点のスペクトルパターンと予め格納されているパターンとのマッチングに基づいて、当該輝点に対応するアブレーションの発生位置を特定する特定部を備える請求項２から６のいずれか一項に記載の検出装置。
9. 前記対象物は、細胞、生体組織および微生物のいずれかを含む請求項１から８のいずれか一項に記載の検出装置。
10. 前記検出部がアブレーションの発生を検出した場合に、当該アブレーションの発生位置を特定する特定部を更に備える請求項１に記載の検出装置。
11. 前記検出部は、前記対象物および前記対象物を支持する支持体の少なくとも一方において発生したアブレーションを検出することにより前記対象物の損傷の可能性を検出する請求項１から１０のいずれか一項に記載の検出装置。
12. 前記対象物は、細胞シートを含む請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出装置。
13. 前記対象物は、高分子材料により形成された部分を含む支持体により支持された状態で前記励起光を照射される請求項１から１２までのいずれか一項に記載の検出装置。
14. 前記検出部がアブレーションの発生を検出した場合に、前記対象物がアブレーションにより受けた損傷の程度を推定する推定部を更に備える請求項１から１３のいずれか一項に記載の検出装置。
15. 前記推定部は、一の前記対象物についてアブレーションの発生回数を計数して、当該発生回数が予め定めた閾値を超えた場合に、当該対象物が損傷を受けたと推定する請求項１４に記載の検出装置。
16. 前記推定部は、前記対象物を支持する支持体においてアブレーションが発生した場合に、当該支持体により支持された前記対象物が損傷を受けたと推定する請求項１４または１５に記載の検出装置。
17. 前記推定部が推定した前記対象物の損傷の程度が予め定めた閾値を超えるまで、当該対象物に対する検出を継続する請求項１４から１６のいずれか一項に記載の検出装置。
18. 請求項１から１７までのいずれか一項に記載の検出装置を備え、
    前記励起光を照射された前記対象物から射出された散乱光を検出して、当該対象物を観察する顕微鏡。
19. 前記検出装置がアブレーションを検出した場合に、前記対象物に照射する前記励起光の強度を抑制する抑制部を備える請求項１８に記載の顕微鏡。
20. 請求項１から１７までのいずれか一項に記載の検出装置を備え、前記検出装置が検出したアブレーションにより損傷を受けた前記対象物を除去する除去部を備える処理装置。
21. 前記検出部がアブレーションの発生を検出した場合に、当該アブレーションの発生位置を特定する特定部を更に備え、
    前記除去部は、前記特定部が特定したアブレーションの発生箇所を、前記対象物から部分的に除去する請求項２０に記載の処理装置。
22. 前記検出部がアブレーションの発生を検出した場合に、前記対象物がアブレーションにより受けた損傷の程度を推定する推定部を更に備え、
    前記除去部は、前記推定部が損傷を受けたと推定した前記対象物を除去する請求項２０または２１に記載の処理装置。
23. 前記推定部が推定した前記対象物の損傷の程度を、記録する記録部を更に備える請求項２２に記載の処理装置。
24. 前記記録部は、前記対象物を支持する支持体に記録する請求項２３に記載の処理装置。

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