CN104774763A - 一种微片式单细胞克隆分离培养板及单细胞克隆分离方法 - Google Patents

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何向锋
施文
王建红
强福林
沈康
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Abstract

本发明公开了一种微片式单细胞克隆分离培养板及单细胞克隆分离方法，培养板包括培养板本体，所述培养板本体上表面设有若干方形培养孔，每个培养孔内放置若干呈矩阵排列的方形培养片，本发明所述方形培养孔的底面和四壁、以及方形培养片的底面、周缘、凸起及顶面的周边均覆盖有超疏水纳米层，细胞只能在方形培养片的上表面经过亲水改性的中心区粘附生长，而不能在覆盖有超疏水纳米层其它部位粘附生长，经过有限稀释的细胞粘附于方形培养片的上表面经过亲水改性的中心区后，只要每个方形培养片只有一个细胞克隆生长，即可根据编号，用镊子夹住相应方形培养片的凸起，可方便的进行单细胞克隆的分离操作。

Description

一种微片式单细胞克隆分离培养板及单细胞克隆分离方法
技术领域
本发明涉及单细胞克隆的培养分离，特别涉及一种微片式单细胞克隆分离培养板及单细胞克隆分离方法。
背景技术
单细胞克隆指的是分离单个细胞，其增殖产生的后代都是来源于同一个细胞，即为单细胞克隆。传统的单细胞克隆分离可采用有限稀释法或克隆环法。
有限稀释法：即把细胞稀释到理论上的5~10μl培养液中含1个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液至96孔板中，每孔补足培养液至200μl，在显微镜下找到有单细胞克隆生长的培养孔，进行单细胞克隆分离。实际的操作中，该法效率不高，大量存在的空白孔和多细胞孔（细胞数大于或等于2）需要研究人员观察排除，费时费力。
克隆环法：在显微镜下找到要挑取的单克隆，用记号笔在培养板的背面标示出来。用镊子夹取克隆环，在环的底部均匀的涂上凡士林，扣在标记的单克隆上，形成相对封闭的空间，然后在克隆环内滴入适量的胰酶，细胞消化下来后用枪头吸出，放到新的培养板中培养。该方法对操作技巧要求较高，初学者不易掌握。
发明内容
为克服上述现有方法的缺陷与不足，本发明提供一种微片式单细胞克隆分离专用培养板及单细胞克隆分离方法。
本发明的技术方案是：
一种微片式单细胞克隆分离培养板，包括培养板本体，所述培养板本体上表面设有若干方形培养孔，每个培养孔内放置若干呈矩阵排列的方形培养片，培养板本体上方盖有培养板盖。
优选的，所述培养板本体为聚苯乙烯板。
优选的，所述方形培养片上表面边角处设有凸起。
优选的，所述方形培养片的上表面中心区为细胞贴壁培养区，细胞贴壁培养区聚苯乙烯表面进行过改性处理，接枝羟基、羧基或氨基等亲水基团。
优选的，所述方形培养孔的底面和四壁以及方形培养片的细胞贴壁培养区以外的表面覆盖有超疏水纳米层。
优选的，所述超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯层、聚L-乳酸层、聚四氟乙烯层、阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜中的一种。
优选的，所述方形培养片底面标有字母和数字组成的组合编号。
一种使用微片式单细胞克隆分离培养板进行单细胞克隆分离的方法，包括步骤：
S1、将细胞悬液浓度稀释至30~50 cells/ml，在培养板的方形培养孔内加入定量的细胞稀释液，细胞只能在方形培养片上表面的经过表面亲水改性处理的细胞贴壁培养区粘附生长，而不能在其它经过超疏水处理的部位粘附生长；
S2、每天在显微镜下观察方形培养片内的细胞，选择有单细胞克隆生长的方形培养片，根据其编号，用镊子夹起方形培养片上的凸起，无菌转移至24孔板的培养孔中；
S3、将生长有单细胞克隆的方形培养片依次在3个培养孔中用PBS轻柔漂洗3次，转移至第四个孔中，加入0.25%的胰酶消化细胞；
S4、收集消化好的单细胞悬液，经PBS重悬，在1000rpm转速下离心10min，获取细胞沉淀，再次在1000rpm转速下离心10min，获取细胞沉淀，用完全培养基重悬，将细胞转移至新的24孔板中，继续扩大培养，所得即为单细胞克隆。
优选的，所述方形培养片预先通过可溶性生物材料粘附在方形培养孔内，可溶性生物材料在加入培养液后可溶解，使方形培养片与方形培养孔分开。
优选的，所述可溶性生物材料包括胶原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白和小牛血清蛋白。
本发明的优点是：
本发明所述的微片式单细胞克隆分离专用培养板及单细胞克隆分离方法，培养板本体上表面设有若干个方形培养孔，每个培养孔内放置呈矩阵排列的方形培养片，所述方形培养孔的底面和四壁、以及方形培养片的底面、周缘、凸起及顶面的周边均覆盖有超疏水纳米层，细胞只能在方形培养片的上表面经过亲水改性的中心区粘附生长，而不能在覆盖有超疏水纳米层其它部位粘附生长，经过有限稀释的细胞粘附于方形培养片的上表面经过亲水改性的中心区后，只要每个方形培养片只有一个细胞克隆生长，即可根据编号，用镊子夹住相应方形培养片的凸起，可方便的进行单细胞克隆的分离操作。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为本发明所述的微片式单细胞克隆分离培养板的培养板本体的俯视图；
图2为本发明所述的方形培养片的结构示意图；
图3为本发明所述的方形培养片的俯视结构示意图；
图4为本发明所述的微片式单细胞克隆分离培养板盖上培养板盖的整体结构示意图。
具体实施方式
如图1和4所示，本发明所揭示的微片式单细胞克隆分离培养板，包括由聚苯乙烯制成的培养板本体1，所述培养板本体上表面设有6个方形培养孔2，每个培养孔内放置10×10（方形培养片的矩阵排列方式也可以为7×7、8×8、9×9或其它组合方式）呈矩阵排列的方形培养片3，培养板本体上方盖有培养板盖4。
如图2和3所示，所述方形培养片3上表面右上方的边角设有凸起31，方便用镊子夹起，方形培养片底面标有字母和数字组成的组合编号，字母代表该方形培养片所在行，数字代表该方形培养片所在列，方便区分。
所述方形培养片的上表面中心区为细胞贴壁培养区32，将细胞贴壁培养区聚苯乙烯表面进行改性处理，接枝羟基（OH），或者羧基（COOH），或者氨基（NH或NH2）等亲水基团。所述方形培养片除上表面中心区为细胞贴壁培养区外，其它部位的聚苯乙烯区表面覆盖有超疏水纳米层。超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料，超疏水纳米层还可以为超疏水的阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜，上述超疏水纳米层的制作方法为现有技术采用的方法，例如在聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料表面蚀刻具有一定粗糙度的微观结构从而构建超疏水表面，采用气相沉积的方法制备超疏水的阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。
本发明的使用微片式单细胞克隆分离专用培养板进行单细胞克隆分离的方法，包括步骤：
S1、将细胞悬液浓度稀释至30~50 cells/ml，在培养板的方形培养孔内加入2 ml的细胞稀释液，细胞只能在方形培养片上表面的经过表面亲水改性处理的细胞贴壁培养区粘附生长，而不能在其它经过超疏水处理的部位粘附生长；
S2、每天在显微镜下观察方形培养片内的细胞，选择有单细胞克隆生长的方形培养片，根据其编号，用镊子夹起方形培养片上的凸起，无菌转移至24孔板的培养孔中；
S3、将生长有单细胞克隆的方形培养片依次在3个培养孔中用PBS轻柔漂洗3次，转移至第四个孔中，加入0.25%的胰酶消化细胞；
S4、收集消化好的单细胞悬液，经PBS重悬，在1000rpm转速下离心10min，获取细胞沉淀，再次在1000rpm转速下离心10min，获取细胞沉淀，用完全培养基重悬，将细胞转移至新的24孔中，继续扩大培养，所得即为单细胞克隆。
所述方形培养片预先通过可溶性生物材料粘附在方形培养孔内，可溶性生物材料在加入培养液后可溶解，使方形培养片与方形培养孔分开。所述可溶性生物材料包括胶原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白和小牛血清蛋白。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微片式单细胞克隆分离培养板，其特征在于：包括培养板本体，所述培养板本体上表面设有若干方形培养孔，每个培养孔内放置若干呈矩阵排列的方形培养片，培养板本体上方盖有培养板盖。
2.根据权利要求1所述的微片式单细胞克隆分离培养板，其特征在于：所述培养板本体为聚苯乙烯板。
3.根据权利要求1所述的微片式单细胞克隆分离培养板，其特征在于：所述方形培养片上表面边角处设有凸起。
4.根据权利要求1所述的微片式单细胞克隆分离培养板，其特征在于：所述方形培养片的上表面中心区为细胞贴壁培养区，细胞贴壁培养区聚苯乙烯表面进行过改性处理，接枝羟基、羧基或氨基等亲水基团。
5.根据权利要求4所述的微片式单细胞克隆分离培养板，其特征在于：所述方形培养孔的底面和四壁以及方形培养片的细胞贴壁培养区以外的表面覆盖有超疏水纳米层。
6.根据权利要求5所述的微片式单细胞克隆分离培养板，其特征在于：所述超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯层、聚L-乳酸层、聚四氟乙烯层、阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜中的一种。
7.根据权利要求1所述的微片式单细胞克隆分离培养板，其特征在于：所述方形培养片底面标有字母和数字组成的组合编号。
8.一种使用微片式单细胞克隆分离培养板进行单细胞克隆分离的方法，其特征在于，包括步骤：
S1、将细胞悬液浓度稀释至30~50 cells/ml，在培养板的方形培养孔内加入定量的细胞稀释液，细胞只能在方形培养片上表面的经过表面亲水改性处理的细胞贴壁培养区粘附生长，而不能在其它经过超疏水处理的部位粘附生长；
S2、每天在显微镜下观察方形培养片内的细胞，选择有单细胞克隆生长的方形培养片，根据其编号，用镊子夹起方形培养片上的凸起，无菌转移至24孔板的培养孔中；
S3、将生长有单细胞克隆的方形培养片依次在3个培养孔中用PBS轻柔漂洗3次，转移至第四个孔中，加入0.25%的胰酶消化细胞；
S4、收集消化好的单细胞悬液，经PBS重悬，在1000rpm转速下离心10min，获取细胞沉淀，再次在1000rpm转速下离心10min，获取细胞沉淀，用完全培养基重悬，将细胞转移至新的24孔板中，继续扩大培养，所得即为单细胞克隆。
9.根据权利要求8所述的使用微片式单细胞克隆分离培养板进行单细胞克隆分离的方法，其特征在于，所述方形培养片预先通过可溶性生物材料粘附在方形培养孔内，可溶性生物材料在加入培养液后可溶解，使方形培养片与方形培养孔分开。
10.根据权利要求8所述的使用微片式单细胞克隆分离培养板进行单细胞克隆分离的方法，其特征在于：所述可溶性生物材料包括胶原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白、小牛血清蛋白。
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